JPH07184644A - 血管内皮細胞培養方法および血管内皮細胞用培地 - Google Patents
血管内皮細胞培養方法および血管内皮細胞用培地Info
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 細胞培養容器への細胞接着活性を有する高分
子等の被覆が不要であり、培地中の血清成分を減らすこ
との可能な血管内皮細胞培養方法および当該方法に使用
する低血清の培地を提供することを目的とする。 【構成】 少なくともトランスフェリン、インスリンを
含有する培地を用い、細胞接着性を改善するための被覆
を有していない培養容器内で血管内皮細胞を培養するこ
とに特徴付けられる血管内皮細胞培養方法、および少な
くともインスリン、トランスフェリンを含有し、血清を
０．１〜１.０％含有する血管内皮細胞用培地。
子等の被覆が不要であり、培地中の血清成分を減らすこ
との可能な血管内皮細胞培養方法および当該方法に使用
する低血清の培地を提供することを目的とする。 【構成】 少なくともトランスフェリン、インスリンを
含有する培地を用い、細胞接着性を改善するための被覆
を有していない培養容器内で血管内皮細胞を培養するこ
とに特徴付けられる血管内皮細胞培養方法、および少な
くともインスリン、トランスフェリンを含有し、血清を
０．１〜１.０％含有する血管内皮細胞用培地。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は動物、特にヒトの血管内
皮細胞を培養するための方法および当該方法に用いる培
地に関する。より詳しくは、本発明は培養容器内部に細
胞接着性タンパク質等を細胞接着性を改善するために被
覆する必要のない、低血清条件下で血管内皮細胞を培養
するための培地に関する。
皮細胞を培養するための方法および当該方法に用いる培
地に関する。より詳しくは、本発明は培養容器内部に細
胞接着性タンパク質等を細胞接着性を改善するために被
覆する必要のない、低血清条件下で血管内皮細胞を培養
するための培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】血管内皮細胞は動脈硬化症などの血管病
変や癌の転移時の血管新生等に関与し、その増殖や分化
の研究が盛んに行われている。さらに、血管内皮細胞が
産生する生理活性物質であるインターロイキン１やプロ
スタサイクリン、血小板由来類似増殖因子、腫瘍壊死因
子、エンドセリン等の研究も活発に行われている。
変や癌の転移時の血管新生等に関与し、その増殖や分化
の研究が盛んに行われている。さらに、血管内皮細胞が
産生する生理活性物質であるインターロイキン１やプロ
スタサイクリン、血小板由来類似増殖因子、腫瘍壊死因
子、エンドセリン等の研究も活発に行われている。
【０００３】血管内皮細胞などの接着性動物細胞は、培
養容器の器壁等、担体表面へ接着しないと増殖しないた
め、現在該細胞の培養には通常、ウシ胎児血清あるいは
仔牛血清を１０％以上含有する培地が用いられている。
養容器の器壁等、担体表面へ接着しないと増殖しないた
め、現在該細胞の培養には通常、ウシ胎児血清あるいは
仔牛血清を１０％以上含有する培地が用いられている。
【０００４】さらに使用する培地によっては細胞を安定
化させるため、あらかじめ天然高分子等の細胞接着性タ
ンパク質あるいは細胞接着活性を有するペプチドを導入
した高分子等を培養容器内部に被覆する必要もある。
化させるため、あらかじめ天然高分子等の細胞接着性タ
ンパク質あるいは細胞接着活性を有するペプチドを導入
した高分子等を培養容器内部に被覆する必要もある。
【０００５】しかしながら、血清は大量生産ができず、
非常に高価である上に、その組成は固体差（ロット差）
が大きく、１ロットの量が限られているため、ロット変
更のたび毎にロットチェック、培養条件の調整や管理等
に煩雑な操作を必要とする。さらに血清は、血液細胞や
血管内皮細胞等の産生する生理活性物質を含む様々な成
分の混合物であり、未知の成分が培養細胞の産生物の分
析、アッセイ等で問題となる。このため、培地中に含ま
れる血清量は可能な限り少なくするべきである。
非常に高価である上に、その組成は固体差（ロット差）
が大きく、１ロットの量が限られているため、ロット変
更のたび毎にロットチェック、培養条件の調整や管理等
に煩雑な操作を必要とする。さらに血清は、血液細胞や
血管内皮細胞等の産生する生理活性物質を含む様々な成
分の混合物であり、未知の成分が培養細胞の産生物の分
析、アッセイ等で問題となる。このため、培地中に含ま
れる血清量は可能な限り少なくするべきである。
【０００６】血清濃度の低い培地としては血管内皮細胞
用に開発された基礎培地に各種成長因子および２％の牛
胎児血清を加えた低血清培地（Ｅ−ＧＭ ＵＶ：倉敷紡
績社製）を用いれば血管内皮細胞の培養が可能である。
しかし、２％以下の低血清条件下で血管内皮細胞を培養
する場合には、細胞の接着性を改善するために、培養容
器内側等の培養担体を天然高分子等の細胞接着性タンパ
ク質あるいは細胞接着活性を有するペプチドを導入した
高分子等で被覆等の処理を施す必要があり、手間がかか
っていた。
用に開発された基礎培地に各種成長因子および２％の牛
胎児血清を加えた低血清培地（Ｅ−ＧＭ ＵＶ：倉敷紡
績社製）を用いれば血管内皮細胞の培養が可能である。
しかし、２％以下の低血清条件下で血管内皮細胞を培養
する場合には、細胞の接着性を改善するために、培養容
器内側等の培養担体を天然高分子等の細胞接着性タンパ
ク質あるいは細胞接着活性を有するペプチドを導入した
高分子等で被覆等の処理を施す必要があり、手間がかか
っていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題を
解決するため細胞培養容器への細胞接着性を改善するた
めの被覆が不要であり、培地中の血清成分を減らすこと
の可能な血管内皮細胞培養方法および当該方法に使用す
る低血清の培地を提供することを目的とする。
解決するため細胞培養容器への細胞接着性を改善するた
めの被覆が不要であり、培地中の血清成分を減らすこと
の可能な血管内皮細胞培養方法および当該方法に使用す
る低血清の培地を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決する手段】すなわち本発明は、少なくとも
インスリン、トランスフェリンを含有する培地を用い、
細胞接着性を改善するための被覆を有していない培養容
器内で血管内皮細胞を培養することに特徴付けられる血
管内皮細胞の培養方法に関する。
インスリン、トランスフェリンを含有する培地を用い、
細胞接着性を改善するための被覆を有していない培養容
器内で血管内皮細胞を培養することに特徴付けられる血
管内皮細胞の培養方法に関する。
【０００９】さらに本発明は少なくともインスリン、ト
ランスフェリンを含有し、血清を０.１〜１.０％含有す
る血管内皮細胞用培地に関する。
ランスフェリンを含有し、血清を０.１〜１.０％含有す
る血管内皮細胞用培地に関する。
【００１０】本発明の培養方法に用いる培地には、イン
スリンおよびトランスフェリンを添加する。インスリン
およびトランスフェリンを添加することにより、従来の
培地にくらべて非常に低い血清濃度で、細胞接着性を改
善するための被覆を有さない通常の培養器内での血管内
皮細胞の接着、維持、増殖が可能となる。
スリンおよびトランスフェリンを添加する。インスリン
およびトランスフェリンを添加することにより、従来の
培地にくらべて非常に低い血清濃度で、細胞接着性を改
善するための被覆を有さない通常の培養器内での血管内
皮細胞の接着、維持、増殖が可能となる。
【００１１】インスリンおよびトランスフェリンは基礎
培地中にそれぞれ０.１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、好
ましくは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ添加する。な
お、インスリンはインスリン様増殖因子ＩまたはIIと交
換してもよい
培地中にそれぞれ０.１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、好
ましくは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ添加する。な
お、インスリンはインスリン様増殖因子ＩまたはIIと交
換してもよい
【００１２】本発明の培養方法においては、インスリン
およびトランスフェリンを含有する培地に血清を０.１
〜１.０％添加した培地を用いて培養する。血清はウ
シ、ウマ、ヒト等いずれを用いてもよいが、入手のしや
すさや経済性の観点から牛胎児血清が好適に用いられ
る。血清濃度が０.１％未満では血管内皮細胞が増殖し
ないばかりでなく、血管内皮細胞の接着、維持も不可能
となる。
およびトランスフェリンを含有する培地に血清を０.１
〜１.０％添加した培地を用いて培養する。血清はウ
シ、ウマ、ヒト等いずれを用いてもよいが、入手のしや
すさや経済性の観点から牛胎児血清が好適に用いられ
る。血清濃度が０.１％未満では血管内皮細胞が増殖し
ないばかりでなく、血管内皮細胞の接着、維持も不可能
となる。
【００１３】本発明の培養方法においては、インスリ
ン、トランスフェリンおよび０.１〜１.０％の血清を含
有する培地にさらに血清アルブミンを添加してもよい。
血清アルブミンとしては、ウシ、ウマ、ヒト、ブタ、ラ
ット、ウサギ等由来のものが用いられるが、経済性、入
手しやすさ等から牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が特に好
適に用いられる。ＢＳＡの濃度は１μｇ／ｍｌ〜１００
μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌで
ある。
ン、トランスフェリンおよび０.１〜１.０％の血清を含
有する培地にさらに血清アルブミンを添加してもよい。
血清アルブミンとしては、ウシ、ウマ、ヒト、ブタ、ラ
ット、ウサギ等由来のものが用いられるが、経済性、入
手しやすさ等から牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が特に好
適に用いられる。ＢＳＡの濃度は１μｇ／ｍｌ〜１００
μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌで
ある。
【００１４】本発明の培養方法においては、インスリ
ン、トランスフェリンおよび０.１〜１.０％の血清を含
有する培地にさらに高密度リポプロテイン（ＨＤＬ）を
添加してもよい。ＨＤＬの濃度は１μｇ／ｍｌ〜１０ｍ
ｇ／ｍｌ、より好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／
ｍｌである。
ン、トランスフェリンおよび０.１〜１.０％の血清を含
有する培地にさらに高密度リポプロテイン（ＨＤＬ）を
添加してもよい。ＨＤＬの濃度は１μｇ／ｍｌ〜１０ｍ
ｇ／ｍｌ、より好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／
ｍｌである。
【００１５】血清アルブミンまたはＨＤＬを添加するこ
とにより、血管内皮細胞の増殖性が向上し、さらに効率
の良い培養が可能となる。
とにより、血管内皮細胞の増殖性が向上し、さらに効率
の良い培養が可能となる。
【００１６】本発明の方法において、基礎培地としては
栄養分を多く含有し、各種添加物の濃度の高い血管内皮
細胞培養用基礎培地を用いる。具体的には基礎倍地には
以下のアミノ酸、ビタミン類、ミネラルを含有し、さら
に以下に例示する成長因子やホルモン等のその他の添加
物を含有する。
栄養分を多く含有し、各種添加物の濃度の高い血管内皮
細胞培養用基礎培地を用いる。具体的には基礎倍地には
以下のアミノ酸、ビタミン類、ミネラルを含有し、さら
に以下に例示する成長因子やホルモン等のその他の添加
物を含有する。
【００１７】本発明に用いる基礎培地中のアミノ酸とし
ては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギ
ン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メ
チオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−
セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チ
ロシン、Ｌ−バリンが挙げられる。本発明に用いる基礎
培地中、アミノ酸の濃度は特に限定的ではないが、通常
それぞれ１ｍｇ／ｍｌ〜１５００ｍｇ／ｍｌである。
ては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギ
ン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メ
チオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−
セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チ
ロシン、Ｌ−バリンが挙げられる。本発明に用いる基礎
培地中、アミノ酸の濃度は特に限定的ではないが、通常
それぞれ１ｍｇ／ｍｌ〜１５００ｍｇ／ｍｌである。
【００１８】本発明に用いる基礎培地中のビタミン類と
してはＤ−ビオチン、フォリニック酸、ＤＬ−α−リポ
酸、ニコチンアミド、Ｄ−パントテン酸、ピリドキシ
ン、リボフラビンン、チアミン、シアノコバラミン（ビ
タミンＢ12）、アデニン、コリン、ｍｙｏ−イノシトー
ル、プトレッシン、ピルビン酸、チミジンが例示され
る。本発明に用いる基礎培地中、ビタミン類の濃度は特
に限定的ではないがそれぞれ０.５μｇ／ｍｌ〜１５０
ｍｇ／ｍｌである。
してはＤ−ビオチン、フォリニック酸、ＤＬ−α−リポ
酸、ニコチンアミド、Ｄ−パントテン酸、ピリドキシ
ン、リボフラビンン、チアミン、シアノコバラミン（ビ
タミンＢ12）、アデニン、コリン、ｍｙｏ−イノシトー
ル、プトレッシン、ピルビン酸、チミジンが例示され
る。本発明に用いる基礎培地中、ビタミン類の濃度は特
に限定的ではないがそれぞれ０.５μｇ／ｍｌ〜１５０
ｍｇ／ｍｌである。
【００１９】ミネラル類としては、カルシウム、カリウ
ム、マグネシウム、リン、ナトリウム、銅、鉄、セレ
ン、マンガン、ケイ素、モリブデン、バナジウム、ニッ
ケルおよび亜鉛が例示される。本発明に用いる基礎培地
中、ミネラル類の濃度は特に限定的ではないが、通常そ
れぞれ０.０５μｇ／ｍｌ〜１００００ｍｇ／ｍｌであ
る。
ム、マグネシウム、リン、ナトリウム、銅、鉄、セレ
ン、マンガン、ケイ素、モリブデン、バナジウム、ニッ
ケルおよび亜鉛が例示される。本発明に用いる基礎培地
中、ミネラル類の濃度は特に限定的ではないが、通常そ
れぞれ０.０５μｇ／ｍｌ〜１００００ｍｇ／ｍｌであ
る。
【００２０】基礎培地に添加する成長因子またはホルモ
ンとしては、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、内皮細胞
増殖因子（ＥＣＧＳ）、内皮細胞由来成長因子（ＥＣＤ
ＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長
因子（acidic ＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（b
asic ＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−
１）、マクロファージ由来成長因子（ＭＤＧＦ）、血小
板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（ＴＡ
Ｆ）、ウシ脳抽出液（ＢＢＥ）、ウシ脳下垂体抽出液
（ＢＰＥ）、糖質コーチコイド（ハイドロコーチゾン、
コーチゾン、コーチコステロン、デキサメサゾン、トリ
アムシノロン、プレドニゾロン等）、コレステロール、
各種ビタミン等が挙げられる。これらの成長因子または
ホルモン類は単独で、あるいは適宜混合して添加すれば
よい。
ンとしては、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、内皮細胞
増殖因子（ＥＣＧＳ）、内皮細胞由来成長因子（ＥＣＤ
ＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長
因子（acidic ＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（b
asic ＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−
１）、マクロファージ由来成長因子（ＭＤＧＦ）、血小
板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（ＴＡ
Ｆ）、ウシ脳抽出液（ＢＢＥ）、ウシ脳下垂体抽出液
（ＢＰＥ）、糖質コーチコイド（ハイドロコーチゾン、
コーチゾン、コーチコステロン、デキサメサゾン、トリ
アムシノロン、プレドニゾロン等）、コレステロール、
各種ビタミン等が挙げられる。これらの成長因子または
ホルモン類は単独で、あるいは適宜混合して添加すれば
よい。
【００２１】基礎培地には、さらに抗生物質を添加す
る。抗生物質はゲンタマイシン、アンフォテリシン、ア
ンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリ
ン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オ
ーレオマイシン等通常の動物細胞の培養に用いられるも
のがいずれも好適に用いられる。抗生物質は培地中に
０.１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは
０.２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ添加する。
る。抗生物質はゲンタマイシン、アンフォテリシン、ア
ンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリ
ン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オ
ーレオマイシン等通常の動物細胞の培養に用いられるも
のがいずれも好適に用いられる。抗生物質は培地中に
０.１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは
０.２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ添加する。
【００２２】上述の基礎培地として具体的にはＭＣＤＢ
１０７（極東製薬工業社製）、ＭＣＤＢ１３１（Knedle
r, A and Ham R.G., In vitro Cellular & Development
al Biology 23, 7 481〜491(1987)）に各種ホルモン類
および成長因子類を添加した培地が挙げられる。表１お
よび２にＭＣＤＢ１０７およびＭＣＤＢ１３１の組成を
示す。
１０７（極東製薬工業社製）、ＭＣＤＢ１３１（Knedle
r, A and Ham R.G., In vitro Cellular & Development
al Biology 23, 7 481〜491(1987)）に各種ホルモン類
および成長因子類を添加した培地が挙げられる。表１お
よび２にＭＣＤＢ１０７およびＭＣＤＢ１３１の組成を
示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】通常の動物細胞培養用に用いられる培地、
例えばＤ−ＭＥＭ、Ｆ−１０、ＭＣＤＢ１５３等の培地
にインスリン、トランスフェリンを添加しても、血清濃
度が１.０％以下の低血清条件では血管内皮細胞の増殖
性が悪い。
例えばＤ−ＭＥＭ、Ｆ−１０、ＭＣＤＢ１５３等の培地
にインスリン、トランスフェリンを添加しても、血清濃
度が１.０％以下の低血清条件では血管内皮細胞の増殖
性が悪い。
【００２６】本発明の培養方法によって、様々な動物種
由来、様々な部位由来の血管内皮細胞を低血清条件下に
おいて効率的に培養することが可能である。特に、従来
困難であったヒト由来の血管内皮細胞の低血清条件下に
おける培養を、細胞接着性を改善するための被覆を有し
ていない培養容器、すなわち培養容器の内壁への細胞接
着性タンパク質あるいは細胞接着活性を有するペプチド
を含む高分子等による被覆を有していない培養容器内で
培養することができる。一般的な培養条件は、培養する
細胞の種類によって従来用いられている条件を適宜選択
すればよい。
由来、様々な部位由来の血管内皮細胞を低血清条件下に
おいて効率的に培養することが可能である。特に、従来
困難であったヒト由来の血管内皮細胞の低血清条件下に
おける培養を、細胞接着性を改善するための被覆を有し
ていない培養容器、すなわち培養容器の内壁への細胞接
着性タンパク質あるいは細胞接着活性を有するペプチド
を含む高分子等による被覆を有していない培養容器内で
培養することができる。一般的な培養条件は、培養する
細胞の種類によって従来用いられている条件を適宜選択
すればよい。
【００２７】以下実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。
明する。
【実施例１】培地 表１に示した組成のＭＣＤＢ１０７培地（極東製薬工業
社製）および表２に示した組成のＭＣＤＢ１３１培地
（Knedler, A and Ham R.G., In vitro Cellular& Deve
lopmental Biology 23, 7 481〜491(1987))を基礎培地
として用いた。両方の基礎培地に添加物として上皮成長
因子（ＥＧＦ：１０ｎｇ／ｍｌ、倉敷紡績社製）、牛脳
抽出液（ＢＢＥ：０.４％（ｖ／ｖ）、倉敷紡績社
製）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ、シグマ社製）を添
加した。ここへ、牛胎児血清（ＦＢＳ）をそれぞれ２.
０％（ｖ／ｖ）（Ａ）、１.０％（ｖ／ｖ）（Ｂ）、０.
５％（Ｖ／ｖ）（Ｃ）、０.３％（ｖ／ｖ）（Ｄ）、０.
１％（ｖ／ｖ）（Ｅ）を加えた低血清培地、および上記
培地に血清を全く添加しない無血清培地（Ｆ）を調製し
て培養に用いた。
社製）および表２に示した組成のＭＣＤＢ１３１培地
（Knedler, A and Ham R.G., In vitro Cellular& Deve
lopmental Biology 23, 7 481〜491(1987))を基礎培地
として用いた。両方の基礎培地に添加物として上皮成長
因子（ＥＧＦ：１０ｎｇ／ｍｌ、倉敷紡績社製）、牛脳
抽出液（ＢＢＥ：０.４％（ｖ／ｖ）、倉敷紡績社
製）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ、シグマ社製）を添
加した。ここへ、牛胎児血清（ＦＢＳ）をそれぞれ２.
０％（ｖ／ｖ）（Ａ）、１.０％（ｖ／ｖ）（Ｂ）、０.
５％（Ｖ／ｖ）（Ｃ）、０.３％（ｖ／ｖ）（Ｄ）、０.
１％（ｖ／ｖ）（Ｅ）を加えた低血清培地、および上記
培地に血清を全く添加しない無血清培地（Ｆ）を調製し
て培養に用いた。
【００２８】細胞 正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は低血清
血管内皮細胞増殖培地（Ｅ−ＧＭ ＵＶ、倉敷紡績社
製）で２次培養された正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞培
養キット（エンドセル、倉敷紡績社製）を用いた。ま
た、正常ヒト大動脈血管内皮細胞（ＨＡＥＣ）はＥ−Ｇ
Ｍ ＵＶで４次培養された正常ヒト大動脈血管内皮細胞
培養キット（エンドセル−ＡＯ、倉敷紡績社製）を用い
た。なお、Ｅ−ＧＭ ＵＶは血管内皮細胞基礎培地（Ｅ
−ＢＭ）にＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ハイドロコーチ
ゾン（１μｇ／ｍｌ）、抗菌剤（ゲンタマイシン：５０
μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ：０.２５μｇ／ｍ
ｌ）、ＢＢＥ（０.４％（ｖ／ｖ））およびＦＢＳ（２
％（ｖ／ｖ））を添加したものである。
血管内皮細胞増殖培地（Ｅ−ＧＭ ＵＶ、倉敷紡績社
製）で２次培養された正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞培
養キット（エンドセル、倉敷紡績社製）を用いた。ま
た、正常ヒト大動脈血管内皮細胞（ＨＡＥＣ）はＥ−Ｇ
Ｍ ＵＶで４次培養された正常ヒト大動脈血管内皮細胞
培養キット（エンドセル−ＡＯ、倉敷紡績社製）を用い
た。なお、Ｅ−ＧＭ ＵＶは血管内皮細胞基礎培地（Ｅ
−ＢＭ）にＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ハイドロコーチ
ゾン（１μｇ／ｍｌ）、抗菌剤（ゲンタマイシン：５０
μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ：０.２５μｇ／ｍ
ｌ）、ＢＢＥ（０.４％（ｖ／ｖ））およびＦＢＳ（２
％（ｖ／ｖ））を添加したものである。
【００２９】培養 上記方法で調製した低血清培地（Ａ〜Ｅ）および無血清
培地（Ｆ）を市販のポリスチレン製細胞培養用３５ｍｍ
ディッシュ（細胞培養用シャーレ、住友ベークライト社
製）に２ｍｌずつ添加し、３７℃に設定した５％濃度炭
酸ガス雰囲気のインキュベーターであらかじめ１時間イ
ンキュベートした。Ｅ−ＧＭ ＵＶで２次培養したＨＵ
ＶＥＣおよび４次培養したＨＡＥＣを基礎培地に４.６
×１０5個／ｍｌの濃度に懸濁し、各培地に細胞の播種
密度が５０００個／ｃｍ2となるように１００μｌずつ
播種した。４日間培養後、トリプシン処理をして細胞を
剥離させ、細胞数の計測を行った。なお、比較としてイ
ンスリン、トランスフェリンを添加せず、ＦＢＳを１.
０％添加した培地（Ｇ）、ＭＣＤＢ１０７およびＭＣＤ
Ｂ１３１の各基礎培地にＥＧＦ、ハイドロコーチゾン、
ＢＢＥを添加せず、上記実施例と同じ濃度で抗菌剤、イ
ンスリン、トランスフェリンおよび１.０％ＦＢＳのみ
を添加した培地（Ｈ）、およびＥ−ＧＭ ＵＶ（Ｉ）培
地を用いて同様の培養を行った。結果を表３に示す。
培地（Ｆ）を市販のポリスチレン製細胞培養用３５ｍｍ
ディッシュ（細胞培養用シャーレ、住友ベークライト社
製）に２ｍｌずつ添加し、３７℃に設定した５％濃度炭
酸ガス雰囲気のインキュベーターであらかじめ１時間イ
ンキュベートした。Ｅ−ＧＭ ＵＶで２次培養したＨＵ
ＶＥＣおよび４次培養したＨＡＥＣを基礎培地に４.６
×１０5個／ｍｌの濃度に懸濁し、各培地に細胞の播種
密度が５０００個／ｃｍ2となるように１００μｌずつ
播種した。４日間培養後、トリプシン処理をして細胞を
剥離させ、細胞数の計測を行った。なお、比較としてイ
ンスリン、トランスフェリンを添加せず、ＦＢＳを１.
０％添加した培地（Ｇ）、ＭＣＤＢ１０７およびＭＣＤ
Ｂ１３１の各基礎培地にＥＧＦ、ハイドロコーチゾン、
ＢＢＥを添加せず、上記実施例と同じ濃度で抗菌剤、イ
ンスリン、トランスフェリンおよび１.０％ＦＢＳのみ
を添加した培地（Ｈ）、およびＥ−ＧＭ ＵＶ（Ｉ）培
地を用いて同様の培養を行った。結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
【００３１】ＭＣＤＢ１０７、１３１のいずれの培地を
用いても、低い血清濃度で異なる組織由来の正常ヒト血
管内皮細胞の培養が可能であった。インスリン、トラン
スフェリンを添加することによってＦＢＳの濃度が１.
０％の培地（Ｂ）であっても２％のＦＢＳが添加されて
いるＥ−ＧＭ ＵＶ培地（Ｉ）の増殖性に匹敵する細胞
数が得られた。さらに血清濃度を０.１％にまで低下さ
せても少なくとも細胞を維持することは可能であった。
一方、インスリン、トランスフェリンを添加していない
培地（Ｇ）ではＦＢＳを１.０％添加しても培養２日目
には細胞が剥離し、細胞を維持することができなかっ
た。
用いても、低い血清濃度で異なる組織由来の正常ヒト血
管内皮細胞の培養が可能であった。インスリン、トラン
スフェリンを添加することによってＦＢＳの濃度が１.
０％の培地（Ｂ）であっても２％のＦＢＳが添加されて
いるＥ−ＧＭ ＵＶ培地（Ｉ）の増殖性に匹敵する細胞
数が得られた。さらに血清濃度を０.１％にまで低下さ
せても少なくとも細胞を維持することは可能であった。
一方、インスリン、トランスフェリンを添加していない
培地（Ｇ）ではＦＢＳを１.０％添加しても培養２日目
には細胞が剥離し、細胞を維持することができなかっ
た。
【００３２】
【実施例２】実施例１のＭＣＤＢ１０７培地を基礎培地
として用いた用いた低血清培地（Ａ〜Ｅ）および無血清
培地（Ｆ）に牛血清アルブミン（ＢＳＡ：１０μｇ／ｍ
ｌ、シグマ社製）または高密度リポプロテイン（ＨＤ
Ｌ：１０μｇタンパク質／ｍｌ、ベーリンガーマンハイ
ム社製）を添加し、実施例１と同じ条件でＨＵＶＥＣの
培養を行った。結果を表４に示す。
として用いた用いた低血清培地（Ａ〜Ｅ）および無血清
培地（Ｆ）に牛血清アルブミン（ＢＳＡ：１０μｇ／ｍ
ｌ、シグマ社製）または高密度リポプロテイン（ＨＤ
Ｌ：１０μｇタンパク質／ｍｌ、ベーリンガーマンハイ
ム社製）を添加し、実施例１と同じ条件でＨＵＶＥＣの
培養を行った。結果を表４に示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】ＢＳＡまたはＨＤＬの添加により、血管内
皮細胞の細胞増殖性がさらに向上した。
皮細胞の細胞増殖性がさらに向上した。
【００３５】
【発明の効果】本発明により、細胞接着性タンパク質、
あるいは細胞接着活性を有するペプチド等の高分子等で
培養容器を被覆せずに従来の血管内皮細胞用培地より低
血清条件下で血管内皮細胞を効率的に培養することが可
能となった。
あるいは細胞接着活性を有するペプチド等の高分子等で
培養容器を被覆せずに従来の血管内皮細胞用培地より低
血清条件下で血管内皮細胞を効率的に培養することが可
能となった。
Claims (7)
- 【請求項１】 少なくともインスリン、トランスフェリ
ンを含有する培地を用い、細胞接着性を改善するための
被覆を有していない培養容器内で血管内皮細胞を培養す
ることに特徴付けられる血管内皮細胞培養方法。 - 【請求項２】 培地がさらに血清アルブミンを含有して
いる請求項１記載の血管内皮細胞培養方法。 - 【請求項３】 培地がさらに高密度リポプロテイン（Ｈ
ＤＬ）を含有している請求項１記載の血管内皮細胞培養
方法。 - 【請求項４】 血管内皮細胞がヒト由来である請求項１
記載の方法。 - 【請求項５】 少なくともインスリン、トランスフェリ
ンを含有し、血清を０.１〜１％含有する血管内皮細胞
用培地。 - 【請求項６】 さらに血清アルブミンを含有する請求項
５記載の血管内皮細胞用培地。 - 【請求項７】 さらに高密度リポプロテインを含有する
請求項５記載の血管内皮細胞用培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5331358A JPH07184644A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 血管内皮細胞培養方法および血管内皮細胞用培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5331358A JPH07184644A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 血管内皮細胞培養方法および血管内皮細胞用培地 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07184644A true JPH07184644A (ja) | 1995-07-25 |
Family
ID=18242794
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5331358A Pending JPH07184644A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 血管内皮細胞培養方法および血管内皮細胞用培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07184644A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115466712A (zh) * | 2022-09-27 | 2022-12-13 | 细新(上海)医疗科技有限公司 | 一种原代大血管内皮细胞的培养体系和应用 |
| CN120536355A (zh) * | 2025-07-28 | 2025-08-26 | 海南大学三亚研究院 | 一种五指山猪二尖瓣体外模型的构建方法与应用 |
-
1993
- 1993-12-27 JP JP5331358A patent/JPH07184644A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115466712A (zh) * | 2022-09-27 | 2022-12-13 | 细新(上海)医疗科技有限公司 | 一种原代大血管内皮细胞的培养体系和应用 |
| CN120536355A (zh) * | 2025-07-28 | 2025-08-26 | 海南大学三亚研究院 | 一种五指山猪二尖瓣体外模型的构建方法与应用 |
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