JPH0322972A - 無血清培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 く産業上の利用分野〉 本発明は、遺伝子組換えチャイニーズハムスター卵巣由
来細胞（以下ＣＨＯ細胞と略する）を培養する培地に関
するものである。

く従来の技術〉 近年、インターフェロン等の有用な生理活性物質が数多
く発見され、医薬品としての応用が期待されている．こ
れらの複雑な構造の生理活性蛋白質を取得する手段とし
て動物細胞培養が注目されるようになってきた。そして
大量の物質を得るためには、遺伝子工学の手法を用い、
目的の外来遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞の培養が
重要となってきた。現在、この遺伝子組換えの宿主とな
る動物細胞として最も広く用いられている細胞の１つに
４ＣＨＯ細胞テのジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＰＲ）欠
損株（Ｃ　Ｈ　Ｏｄｈｆｒ−）がある。しかしこのＣ　
Ｈ　Ｏｄｈｆｒ一細胞を宿主とした遺伝子組換え細胞は
、培地に牛胎児血清〈以下ＦＣＳと略す〉等の血清を１
０％程度添加する必要があった。これらの血清は、非常
に高価である上原因不明のロソト差があり、大量かつ多
種類の異種蛋白を含んでいるため培養上清中の生理活性
蛋白を精製する際において大変困難を生じる。従って培
地中より血清を除く必要がある。現在、血清の代替とし
てインシュリン、トランスフエリン等のホルモンや血清
アルブミン等既知の物質を加えた無血清培地が開発され
、市販の無血清培地も数多く存在する．しかしながら、
これらの無血清培地において遺伝子組換えＣ　Ｈ　Ｏ細
胞は良好な増殖が得られず、今までに目的の無血清培地
は存在していない。

〈本発明の解決しようとする課題〉 本発明の目的は、遺伝子組換えＣＨＯ細胞の良好に増殖
しうる新規な無血清培地を得ることにある。

く課題を解決するための手段〉 本発明者らは、前述の課題を解決すべ＜　Ｃ　Ｈ　０細
胞の増殖を支持する物質を探索した結果、目的の無血清
培地を調製することができた。

本発明は、通常の実質的に血清を含まない動物細胞培養
用無血清培地に、１）ベプヂド性細胞戒長因子、２）ホ
ルモン、３）脂質、及び４）接着因子の内いずれかｌつ
以上を添加してなる、ｉｆｆ（ｉ子組換えＣＨＯ細胞培
養用無血清培地である。

さて、本発明において実質的に血清を含まない培地とは
、通常のローズウエル・パーク・メモリアル・インステ
ィテユート１６４０　（　Ｒ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０）
培地を単独または混合した培地に、インシュリン、トラ
ンスフェリンや、アルブミン等の血清蛋白威業基盤技術
チシンポジウム予稿集５３〜６６頁，（１９８Ｂ））、
ＨＢ１０２培地（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社製）
など及びこれらを改変したものである。

また添加するベプチド性威長因子であるＦＧＦ濃度は、
培地あたり０．　１　　１　０　０ｎｇ／＠Ｊの範囲が
好ましい。

ホルモンとして用いるＤＸＩＩ度は、培地あたり０．０
　５　　１　０　０ｎｇ／ｍｌの範囲が、Ｔ３の濃度は
、０．　１　　１　０　０ｎｇ／＋ｎ１の範囲が好まし
い。

脂質として用いるＬＤＬの濃度は、培地あたり０．　１
−２　０　０ｎｇ／ｍ１の範囲が好ましい。

接着因子として用いるファイブロネクチンの濃度は、培
地あたり１５０μｇ　／　ｖａ　１の範囲が望ましい。

さて、本発明のＣＨＯ細胞培養用無血清培地は、上記の
物質の内１種類以上を含有することを特徴とするもので
ある。

本発明の遺伝子組換えＣＨＯ細胞とは、何らかの外来遺
伝子を導入した遺伝子組換えＣＨＯ細胞で、Ｃ　Ｈ　Ｏ
ｄｈｆｒ一株を宿主とした細胞を含む。

〈本発明の効果〉 本発明の無血清培地を用いて遺伝子組換えＣＨＯ細胞を
培養すると充分な細胞増殖が認められる。

もちろん、本発明に係る無血清培地はＣＨＯ細胞以外の
動物細胞の培養にも使用できる。以下、本発明を実施例
に従って説明する。

実施例１） 表１の無血清培地（Ａ）を基礎培地として、ＦＮ（ヒト
由来ファイブロネクチン）５μｇ　／　＋ｎ　ｌを添加
し、無血清培地（Ｂ）をつくり培養を実施した。細胞は
、Ｃ　Ｈ　Ｏｄｈｆｒ−を宿主とし、Ｅｒｙ　ｔｈｒｏ
ｉｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｉｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏ
ｒ　（以下ＥＤＦと略す）遺伝子を導入した遺伝子組換
えＣＨＯ綱胞（以下ＥＤＦ産生ＣＨＯ細胞、ＬＦＤ−５
　０　１　４　６）（Ｉｌｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎ
ｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｎ
ｉｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，　　１　５　１　（　１　
）　２　３　０　）を使用した。初発細胞密度Ｉ　Ｘ　
１　０’　／ｃ４にてシャーレに播種し、付着増殖させ
４日後にトリブシン処理にて細胞を剥し検鏡により生細
胞数を測定した。無添加区（無血清培地（Ａ）〉及び対
照培地として１０％ＦＣＳ添加したアルファ一最小基本
培地（肝門−α）（以下単に１０％ＦＣＳ添加培地と略
す）において同時に培養を行った。その結果を１０％Ｆ
ＣＳ添加培地における細胞数を１００％として比較し示
した（第１図）。この結果よりＦＮ添加培地において無
添加区の約５％の細胞数の増加、また、明かな付着性の
向上が認められた。

第ｌ表　無血清培地（Ａ）Ｍｉ成 実施例２） 前述の実施例１）の無血清培地（Ｂ）に、ＦＧＦ（ウシ
脳由来Ｆ　Ｇ　Ｆ　：　Ｊｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２　５　３　．　
３　７　３　６　）を１０ｎｇ／ｍｊ！の濃度で添加し
、実施例１）と同様の方法にて培養を実施した。５日間
培養した後の生細胞数測定結果を１０％ＦＣＳ添加培地
を１００％として表した（第２図）。

この結果より、培地（Ｂ）と比較すると、ＦＧＦ添加で
は約２２％の細胞数の増加が認められた。

実施例３） 無血清培地（Ｂ）に、ＤＸを５ｎｇ／ｍｌ．及び、Ｔ３
を０．２ｎｇ／僧ｌ０）濃度で各々添加し実施例１）と
同様の方法で培養を行った。５日間培養を行った後、生
細胞数測定結果を実施例２）と同扛に比較した（第３図
）。

この結果より、ＤＸ添加で約１２％、］゛３添力■で１
２％の細胞数の増加が認められた。

実施例４） 無血清培地（Ｂ）に、ＬＤＬ（鶏卯黄山来ＬＤＬ　：ｊ
Ｕ織培養研究，６．７０）５０μｇ／ｍＡの濃度で添加
し実施例１）と同様に培養な行い４日間培畏後、生細胞
を測定した。測定結果を実施例２）と同様に比較した結
果、２６％の細胞数の増加がｌ２、められた（第４図）
。

実施例５） ＦＮ５ｔＪＦ！，／ｍｌ，ＦＧＦ　１　０ｎｇ／ｍｊＬ
　ＤＸ５ｎｇ／ｎｊ！，　Ｔ３　０．　２ｎｇ／ｍｊｌ
！，　Ｌ　Ｄ　Ｌ　５　０　１ｔＢ／ｍｌ！、の全てを
同時に添加した無血清培地（Ｃ）をつくり、実施例１）
と同様の方法にて４日間培養を行った。その結果、この
培地において無添加区（無血清培地（Ａ））の約５３％
の細胞数の増加が認められその数は１０％ＦＣＳ添加培
地に匹敵するも第１図は遺伝子組換えＣＨ○細胞の増殖
に及ぼすＦＮの効果を調べたものである。

第２図は遺伝子組換えＣ　Ｈ○細胞の増殖に及ぼすＦＧ
Ｆの効果を調べたものである。

第３図は遺伝子Ｍｉ換えＣＨＯ細胞の増殖に及ぼすＤＸ
およびＴ，の効果を調べたものである。

第４図は遺伝子組換えＣ　Ｈ　Ｏ細胞の増殖に及ぼずＬ
ＤＬの効果を調べたものである。

第５図は遺伝子ｍ換えＣＩ−１０１）１胞用無血清培地
（無血清培地（Ｃ））を用いたときの遺伝子組換えＣＨ
○細胞の増殖を調べたものである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）実質的に血清を含まない動物細胞培養用無血清培
   地に１）ペプチド性細胞成長因子、２）ホルモン、３）
   脂質、及び４）接着因子のうちいずれか１つ以上を添加
   してなる遺伝子組換えＣＨＯ細胞培養用無血清培地。
2. （２）ペプチド性細胞成長因子が、ファイブロブラスト
   ・グロース・ファクター（以下ＦＧＦと略す）である、
   請求項（１）記載の遺伝子組換えＣＨＯ細胞培養用培地
   。
3. （３）ホルモンがデキサメサゾン（以下ＤＸと略す）、
   トリヨウドチロニン（以下Ｔ＿３と略す）である請求項
   （１）記載の遺伝子組換えＣＨＯ細胞培養用培地。
4. （４）脂質がローデンシティー・リポプロテイン（以下
   ＬＤＬと略す）である請求項（１）記載の遺伝子組換え
   ＣＨＯ細胞培養用培地。
5. （５）接着因子が、ファイブロネクチン（以下ＦＮと略
   す）である請求項（１）記載の遺伝子組換えＣＨＯ細胞
   培養用培地。