JPH07184698A - 標識用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 核酸フラグメントを標識するための組成物を
提供する。 【構成】 本発明の標識用組成物は、架橋鎖ならびにこ
の架橋鎖に隣接してハイブリダイズした第一及び第二の
鎖を含み、第一の標識鎖が目的の二重鎖ＤＮＡ配列また
は標識を提供し、前記架橋鎖にハイブリダイズしている
第二のアダプター鎖が前記架橋鎖と共に付着末端または
ブラント末端を提供する。 【効果】 制限二重鎖ＤＮＡフラグメントにバインディ
ングしてその制限認識部位を欠損させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸フラグメントを標
識するための組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】現在、
生物学は、多くの点で、蛋白質および核酸科学といえ
る。核酸は、全ての生体中に見い出される。それぞれの
種または宿主には、特定の宿主の遺伝子型および表現型
を与える独自の核酸配列が存在する。多くの場合に、大
多数の系統は、他の系統または種と異なるような共通の
核酸配列を共有するので、それらのあるもので特定の系
統だけを検出することはできないが、必要により、亜
種、種または属を検出することはできる。その上、その
ものは特定の遺伝子が発現されているか否か、１以上の
対立遺伝子が存在するか否かおよび発現の程度がどうで
あるか等を決定するようなＲＮＡまたはＤＮＡ間の識別
をすることができる。Ｂ細胞およびＴ細胞のような細胞
がゲノム再配列物を含む場合、その核酸配列は、プロー
ブを利用することにより前述の再配列物の有無を検出す
ることができる。従って、特定の核酸配列の検出は、疾
病状態の診断、セットもしくはサブセット細胞の存在、
細菌もしくは原生生物もしくはウイルスなどのような特
定の病原体の種もしくは株の検出にとって有力な手段で
ある。

【０００３】配列の検出および固定は、また、分子生物
学分野で重要である。従って、プローブの使用は、構造
遺伝子、調節配列、イントロン、エキソン、リーダー配
列ならびに翻訳されるものおよび翻訳されないもののい
かんを問わず、いろいろな目的配列の検出を可能にす
る。また、遺伝子工学の分野では配列の検出に実質的な
目的が存在する。転写程度のモニター、完全な状態の構
成物の検出、変異もしくは切除の程度のモニターまたは
マッピングなどは、核酸のスクリーニングおよび検出の
機会をも与る。

【０００４】多くの場合、目的の配列は、核酸の総量が
単に非常に小さな分画として、そして／または非常に少
量、例えば、アト（１０^-18 ）モル量で存在している可
能性がある。さらに、目的の配列は、その配列と実質的
に相同性を有する多くの配列を伴っているかも知れな
い。従って、さらに目的の配列の有効濃度を限定し得る
好ましくないヘテロ二重鎖が存在しないことを確認する
にはかなり高い厳密性が要求されるであろう。

【０００５】その上、同一または類似配列がいろいろな
大きさの核酸フラグメント上に発現する可能性があり、
特定の大きさの断片上でのある配列の発現は特定の表現
型の存在と相関し得る。また、技術者に要求される時間
およびエネルギーの極小化ならびに手動操作に帰因する
誤差を極小化するように、自動化することができる分析
系の開発にも興味が存在する。ほとんどの系では、配列
の検出を可能にする目的で試料が標識されている。標識
することは、放射性ヌクレオチド三リン酸を用いるニッ
ク・トランスレーションのように時間がかかりそして標
識の種類を限定する可能性がある。別の場合にも、ター
ミナルデオキシトランスフェラーゼを使用するときのよ
うに、特定の種類の標識に限定され得る。他の方法は、
一貫性のない置換をもたらす。従って、標識成分が市場
で入手可能であり、そして必要であるとすれば、試料を
標識するために用いられる技術的熟練度の必要性が少な
いような、核酸試料の迅速かつ簡潔で制御された標識方
法に対する要望が存在する。

【０００６】〔関連した文献〕ケンプ（Ｋｅｍｐｅ）
ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８５）１
３：４５〜５７ページは、リガーゼによってＤＮＡ断片
とビオチン化オリゴヌクレオチドの連結を記載する。ゲ
ンパー（Ｇａｍｐｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．（１９８５）１４：９９４３〜９９５４ページは、
ハイブリッド化および光化学的架橋が生じる場合の標的
ＤＮＡを標識するプローブとしてプソラレンで機能化し
たオリゴマーを利用している。ザポルスキー（Ｚａｐｏ
ｌｓｋｉ）ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９
８７）８：２５５〜２６１ページは、自動的なサザーン
型の核酸ハイブリッド化分析用の自動装置を検討してい
る。ゴールドコーン（Ｇｏｌｄｋｏｒｎ）およびプロコ
ップ（Ｐｒｏｃｋｏｐ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．（１９８６）１４：９１７１〜９１９１ページは、
ハイブリッド化制限分析用のセルロース系担体にＤＮＡ
プローブを共有結合せしめる方法を記載する。シバネン
（Ｓｙｖａｎｅｎ）ら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
（１９８６）１４：５０３７〜５０４８は、アフィニテ
ィー塩基ハイブリッドコレクションにより核酸ハイブリ
ッドを修飾している。フォースター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）
ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８５）１
３：７４５〜７６１ページは、ビオチンと核酸を光化学
的に共有結合標識している。

【０００７】

【課題を解決するための手段】二重鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤ
ＮＡ」という）フラグメントを、標識される前記二重鎖
ＤＮＡフラグメントの少なくとも一の末端と相補的な末
端を有し、検出し得る二重鎖核酸で標識する。標識二重
鎖配列は、その後検出するかまたは単離することができ
る標識または配列のいずれかが含まれる。標識化反応
は、相補的末端どうしを連結するリガーゼ、ならびにＤ
ＮＡフラグメント上に相補的末端を供給し、かつ相互に
それらのフラグメントの意図しない連結を防せぐ制限酵
素を使用して行われる。前記ｄｓＤＮＡへの核酸標識セ
グメントの結合は、制限酵素の認識配列の欠損をもたら
す。

【０００８】本発明の組成物は、試料中の核酸フラグメ
ントを標識するために提供される。この組成物は、制限
酵素の存在下で前記フラグメント上に標識を連結するこ
とができ、そしてこの連結は制限酵素の認識配列の欠損
をもたらす。本発明の組成物は、多種多様な態様での使
用が見い出される。一の適用例は、ＤＮＡ試料の検出に
用いるものであって、固体支持体に標識した試料の核酸
配列を連結するために役立つようにプローブが標識され
るものである。他の態様は、制限配列に特定の配列を付
加する場合であって制限配列のオリゴメリ化を防ぎ、同
時に目的の配列を含有する実質的に化学量論的量の前記
成分を使用するものである。前記配列は、鋳型もしくは
プロモーターで配列、検出用もしくはＤＮＡの増幅系で
使用されるような、例えばポリメラーゼ連鎖反応におけ
る使用などを目的とする特殊な配列であることができ
る。

【０００９】他の使用は、制限部位を除去すると同時
に、その末端の性質を変化せしめるものである。この標
識用組成物は、また、ＤＮＡ領域をマッピングするため
に大きさが調整されそして検出され得るＤＮＡ制限フラ
グメントを標識するためにも有用である。通常、用いら
れる試料は、複数の異なる制限フラグメント、一般に少
なくとも２種のフラグメントを、より一般的には５種以
上のフラグメントを含むゲノムまたはｃＤＮＡであり、
また、５０個以上または数千もしくは数万のフラグメン
トであってもよい。制限酵素と組み合わせてリガーゼを
使用し、リガンドで二重鎖ＤＮＡを標識するための方法
は、非常に普遍的であり、ｄｓＤＮＡにリガンドを共有
結合する必要があるときは、すべての方法に使用するこ
とができる。リガンドとは、関連のある全ての成分を意
図し、検出に使用できる標識、目的の機能を提供する核
酸配列、カップリング分子などであってもよい。本明細
書では、前述のような配列に対するプローブを使用し
て、特定の核酸配列を検出するためのアッセイに、前述
の標識用組成物がどのように適用されるかが記載され
る。種々の色または蛍光発光波長を有する種々の検出可
能な標識の使用は、大きさの標準および同一もしくは異
なる制限酵素により切断されるような他の１種（もしく
は１種を越える）の試料に結合される一の色を使用する
ことにより、高い効率で生ずるマッピングを可能にす
る。従って、この連結反応／制限標識化方法は、以下の
いずれかの鎖長分析用の標識フラグメントの調製に有用
である。

【００１０】他方、同じ連結反応／制限標識化方法を使
用して検出される成分を付加する代りに、ＤＮＡフラグ
メントの末端に与えたオリゴヌクレオチド配列またはそ
の配列類を付加することができる。かかるオリゴヌクレ
オチド配列は、例えば、挿入ＤＮＡフラグメントを転写
または再生するためのプライマー配列のように、非常に
役立つことが判明するであろう。かかる態様では、ＤＮ
Ａフラグメントをプライマーに連結することができ、次
いでポリメラーゼ連鎖反応により増幅することができる
〔Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：
１３５０ページ〕。これらの付加した特定の配列領域
は、また、挿入フラグメントの固定または引き抜きに使
用されるプローブに対する標的配列としても使用するこ
とができる。このものおよび他のすべての実施例の連結
反応／制限方法において添加される連結した二重鎖フラ
グメントは、有機化学的に、酵素的に、生物学的にまた
はそれらの組み合わせ方法で合成され得る。

【００１１】本発明の組成物の使用は、第一に診断系に
おいて説明され、そこではＤＮＡ試料をエンドヌクレア
ーゼ開裂（制限反応）を用いてフラグメント化し、次い
で標識される。試料源としては、核酸を含んでなるいず
れの材料または物質であってもよい。核酸は、天然の核
酸である必要はなく、化学的、酵素的または生物学的に
合成されたものであってもよく、さらに天然のプリンお
よびピリミジン以外のものを含んでいてもよい。試料源
は、細胞質または非細胞質であってもよく、臨床試料ま
たは単離物であってもよく、それらの生理媒体（例え
ば、血液、血清、血漿、便通、膿、擦過、洗液もしくは
尿など）であってもよく、さらに、新生物細胞、リンパ
球（例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞）、単球、好中球の
ようなセットもしくはサブセット細胞、あるいはウイル
ス、細菌、マイコプラズマ、カビ、原生生物などを含む
病原体であってもよく、また、プラスミド、ウイルスま
たはＤＮＡもしくはＲＮＡフラグメントなどを含む構成
物が包含され得る。核酸試料には、染色体もしくは染色
体外に存在し得るＤＮＡ、例えば、プラスミド、ウイル
ス、もしくは合成構成物など、またはｄｓＤＮＡに転写
されるＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、転移Ｒ
ＮＡ、リボソームＲＮＡ、もしくはウイルスが包含され
得る。核酸配列には、構造遺伝子、翻訳されない領域、
調節領域、イントロンまたはエキソンなどが包含され得
る。

【００１２】この測定は、多様な目的に向けることがで
きる。測定には、植物または動物の疾病状態の診断、例
えば、新生もしくは異所性の細胞状態、セットもしくは
サブセット細胞、例えば、分化のいろいろな段階におけ
る白血球の測定、病原体の種もしくは株の測定、および
遺伝子工学のモニターなどが包含される。本発明で試料
を使用する前に、その試料を種々の化学的または物理的
処理、例えば、タンパク質の加水分解、抽出、沈殿、他
成分（例えば、脂質、または蛋白質など）からの核酸の
分離、ＲＮＡの加水分解、ヌクレアーゼの不活化、濃
縮、クロマトグラフィー、脱水、加熱など、にかけても
よい。試料は、種々の目的、例えば、防害物の除去、貯
蔵もしくは輸送、濃縮など、に応じて処理してもよい。

【００１３】通常、組成物は、制限酵素を利用してフラ
グメント化される。この制限酵素は、一般に４〜８bpの
認識部位を有するその部位を開裂する。ここでは、試料
の性質に応じて１種以上の制限酵素を利用することがで
き、フラグメントは５０bp〜２００kbp またはそれ以
上、より一般的には約０．５〜２５kbp の多様なものが
供給され得る。３′または５′のいずれかに張り出すフ
ラッシュ末端または付着端をもたらすような種々の制限
酵素を使用することができる。ある状況下では、連結用
の特異的部位として付着端の存在が望まれるかも知れな
い。ある状況下では２種以外の酵素が使用され得るとは
いえ、殆んどただ１種の制限酵素が使用されるだろう。

【００１４】ある場合には、メッセンジャーＲＮＡの逆
転写産物を試料は含む可能性があり、そのときは、相対
的に小さなＤＮＡおよびＲＮＡ配列が混合物に存在し得
る。必要に応じて、このＲＮＡを加水分解してＤＮＡ配
列だけを残こしてもよい。こうして、混合物は、単に一
重鎖ＤＮＡ成分だけを有することになる。この一重鎖Ｄ
ＮＡは、その後ＤＮＡポリメラーゼのような酵素を用い
て、ｄｓＤＮＡに転化することができる。

【００１５】試料が、消化または適当な方法で処理され
目的の末端を供給すると、ｄｓＤＮＡは標識することが
できる。末端およびすぐ隣接するヌクレオチド類以外の
配列の選択は、一般に、恣意的であり得る。制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位（例えば、相補ブラント末端、付
着端または突出部分）の部分以外の標識成分は、通常、
少なくとも３個の塩基対（bp）および５０個以上、より
一般的には約２００bp未満かそれ以上を有するであろ
う。標識成分の末端は、リン酸が欠損している可能性が
あるので、標識成分はオリゴメリ化ができず、リン酸化
した試料についてだけ連結能が存在する。

【００１６】標識には、相補末端を有する種々の成分を
使用することができ、例えば、短い二重鎖配列、より具
体的には、二重鎖に連結しかつ一の鎖または両方の鎖の
いずれかに標識するように、制限酵素により生ずる付着
端またはブラント末端のいずれかの末端を有する分子を
使用することができる。この二重鎖配列は、一対のオリ
ゴヌクレオチドのハイブリッド化から、配列内部に相補
性を有する一本鎖オリゴヌクレオチド配列のスナップ・
バック（ｓｎａｐ−ｂａｃｋ）またはヘアーピン構造か
ら、または相互に隣接して位置し、そして前述のような
二重鎖を創製するように相互に交差するような直線状で
相互にハイブリッドする３つ以上のオリゴヌクレオチド
のハイブリッドからでさえも創製することができる。こ
れらの二重鎖配列は、また、それら自体が制限フラグメ
ントであるか、または配列としての必要な条件を満たし
そして標識されている末端に付着端が存在する末端を有
する誘導した制限フラグメントであってもよい。制限酵
素の存在下で標識成分の連結反応を実施することによ
り、標識成分が過剰になることを避けることができる。

【００１７】本発明の標識用組成物は、３本のオリゴヌ
クレオチド鎖を有する。三本鎖のうち、１本は鎖の架橋
に利用し、そして２本の残りの鎖は、１本が架橋鎖（標
識鎖）の３′端に近いほうでそして他の１本が架橋鎖
（アダプター鎖）の５′端に近いほうで、架橋鎖の隣接
部とそれぞれハイブリッドする。この標識鎖は、標識ま
たは目的の配列（例えば、プロモーター）を供給し、前
記アダプター鎖は、通常、同じ５′−３′方向を有する
フラグメント鎖にその他端で隣接するであろう。

【００１８】このアダプター鎖は、リン酸化されている
その５′端を有し、目的とする制限酵素の認識部位を破
壊するのに必要な特殊な配列を含むにちがいない。リガ
ーゼの導入により、前記標識鎖は、そのアダプター鎖お
よび前記フラグメントに対するアダプターに連結される
ようになる。三本鎖を使用することによって、各制限部
位に対して一本の鎖を変化させるだけでよい実質的に万
能型の配列を得ることができる。このように、標識鎖を
変えずに相補末端を提供するのに関与するアダプター鎖
のみを変化させればよい。架橋鎖にハイブリダイズする
アダプター鎖は、アダプター鎖が突出部であるかまたは
架橋鎖が突出部である付着末端を、或いはフラッシュ末
端を提供することで、フラグメントへの連結を提供する
ことができる。

【００１９】以下に示される具体例では、核酸試料に添
加される、少なくとも１つの標識（ここでは染料）を含
む２つのオリゴヌクレオチドが合成される。この例で
は、５′の突出付着端を伴うフラグメントを調製する目
的で制限酵素ＨｉｎｄIII が使用された。

【００２０】

【化１】

【００２１】前記オリゴヌクレオチドは、相互に相補的
になるように、そして相互にハイブリッドする場合に
は、標識される試料核酸フラグメントの付着端に対して
相補的な突出端を有するように合成される。他方、合成
オリゴヌクレオチドは、フラッシュ末端フラグメントに
連結し得ることでハイブリッドする場合には、フラッシ
ュ末端を有してもよい。従って、連結酵素が添加された
場合には、試料核酸フラグメントに標識オリゴヌクレオ
チドが共有結合することになる。

【００２２】前述の例におけるオリゴヌクレオチド配列
は、正しい連結が生じた後、前記酵素の認識部位が破壊
されるように選ばれた。この選択は、連結標識を使用す
る上で特殊な利点を提供する。すなわち、連結反応の間
に認識制限酵素が存在しそして機能し得るならば、試料
核酸同士の連結すべて再切断される。この特性は、２つ
の主要な利点を与える。第１点は同一容器中で制限活性
および連結標識化を同時に生じさせるので取扱いや操作
を最小限にできること、そして第２点は、試料核酸同士
の連結を防止するために標識部分を大過剰に使用する必
要がなくなることである。例に示した標識は、合成オリ
ゴヌクレオチドが開裂制限酵素部位に連結され得る場合
には、すべての制限酵素に普遍化でき、そしてこのオリ
ゴヌクレオチドは、その酵素の認識部位が破壊されてい
る配列を含む。かかる配列は、１個の塩基の変化、例え
ば、シトシンからチミジンを伴うか、あるいは、おそら
く５−メチルシトシンもしくは３−メチルアデノシンの
ような誘導した塩基で置換するか、またはイノシン様ア
ナログの置換による変化であってもよい。

【００２３】前記および下記の例では、特定の認識配列
において核酸鎖を切断するために制限酵素が使用される
が、天然のアナログ、金属イオン複合体およびペプチド
フラグメントなど配列特異的ＤＮＡ開裂分子をも使用す
ることができる〔例えば、ＭｏｓｅｒおよびＤｅｒｖａ
ｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３８：６４５〜６５
０ページ、参照〕。

【００２４】標識化は、直接的である必要はなく、間接
的であってもよい。すなわち、前記核酸配列は、その
後、検出可能なシグナルまたは他の望ましい性質を供給
し得る第２の分子に結合し得る分子により変性されてい
てもよい。例えば、核酸配列はビオチンで変性され、続
いてこの核酸配列は、種々の検出可能な標識に対して接
合され得るアビジンまたはストレプトアビジンと組み合
わされてもよい。他方、前記リガンドに対するそれらの
天然の受容体または特異的免疫グロブリンとの接合で
は、ビオチン以外の種々のリガンドを使用してもよい。

【００２５】多種多様な検出できる標識、特に、簡潔な
検出を可能とするものが使用され得る。検出は、結果物
として、電子磁気照射、例えば、紫外部もしくは可視領
域の吸収、蛍光、または化学発光、あるいは検出し得る
生成物もしくは検出し得る基質の分解を惹起する酵素、
安定フリーラジカルなどであってもよい。これらの性質
を示す種々の分子が、個々の標識の状態に応じて、直接
的または間接的ないずれかの常法に従い前記配列に結合
され得る。

【００２６】検出し得る標識としては、種々の放射活性
元素（例えば、³²Ｐ， ¹²⁷Ｉ，¹⁴Ｃ， ³Ｈ，³⁵Ｓ）が使
用でき；蛍光体（例えば、フルオレセイン、ローダミ
ン、フィコビリタンパク、希土類キレート、これらの誘
導体など）であって、この蛍光体は、単独分子またはタ
ンデム（ｔａｎｄｅｍ）において核酸もしくは非−（核
酸骨格）と結合しているものであってもよく；酵素（例
えば、ワサビペルオキシダーゼ、それ自体またはグルコ
ースオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、もしくはグルコース−６−フォスフ
ェートデヒドロゲナーゼなどとの組み合せ物）、そして
一般に、蛍光または光吸収生成物を生成する基質と反応
する酵素を利用したもの；特異的バインディング成分−
受容体対の構成成分（例えば、ビオチン−アビジンもし
くはストレプトアビジン、または相補的核酸配列）；な
らびに検出用として提供され本発明において使用し得る
他のすべての標識を挙げることができる。

【００２７】以下の実施例は、本発明を具体的に説明す
るためのものであって、限定するためのものでない。

【００２８】

【実施例】例１．リガンドビオチンによるプローブ標識化への連結
反応の使用 １．構造ＩおよびIIを有するオリゴデオキシヌクレオチ
ドは、製造業者の指示に従って、アプライド・ビオシス
テム・モデル３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｍｏｄｅｌ ３８１Ａ
ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）により合成した。
構造Ｉは、示されるＸ位にＣ（シトシン）を有するよう
に合成した。次に、アミノ基転移反応〔Ｄｒａｐｅｒ，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９
８４）１２：９８８ページ、参照〕にかけ、続いて製造
業者（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏ
ｃｋｆｏｌｄ，ＩＬ）の指示に従って長鎖アームビオチ
ンと反応せしめて、前記ＣをＸで以下に示される構造の
化合物に転化した。

【００２９】２．反応混合物は、次の試薬の組合せによ
り調製した。 −１０mMのトリスＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、pH８．０
（ＴＥ）中、１ピコモル／μｌのｐＳＰ６４プラスミド
（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）１μｌ、 −１０ｘメディウム・サルト（Ｍｅｄｉｕｍ ｓａｌ
ｔ）緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前述）１μｌ、 −１０mMのＡＴＰ１μｌ、 −１単位／μｌのＴ４リガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉ
Ｎ）１μｌ、 −ビオチン化オリゴヌクレオチド（構造Ｉを、ＴＥ中
２．５ピコモル含有）１μｌ、 −相補オリゴヌクレオチド（構造IIを、ＴＥ中２．５ピ
コモル含有）１μｌ、−水３μｌ、 −１０単位／μｌ ＨｉｎｄIII 制限酵素（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ
ｉｓ，ＩＮ）１μｌ。

【００３０】３．前記化合物を３７℃で１時間インキュ
ベーションした。 ４．反応は、０．２ＭのＥＤＴＡ１μｌを添付すること
により停止した。

【００３１】

【化２】

【００３２】

【化３】

【００３３】例２．蛍光染料による試料核酸標識化への
連結反応の使用 １．アプライド・ビオシステム・モデル３８１Ａ ＤＮ
Ａシンセサイザーを使用して、１８塩基のヌクレオチド
オリゴマーを合成し、次いで製造業者の指示に従って精
製した。５′端をアミノリンク（ＡｍｉｎｏＬｉｎ
ｋ^TM）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用
いてアミノ基を有する末端とした。再び製造業者（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の指示に従い、こ
のアミノ基をフルオロセインＮ−ヒドロキシスクインイ
ミドと連結した。

【００３４】２．アプライド・ビオシステム・モデル３
８１ＤＮＡシンセサイザーを使用して、２０塩基のヌク
レオチドオリゴマーを合成し、次いで製造業者の指示に
従い精製した。こうして合成した配列は、 ５′AGC TAC AAC GTC GTG ACT GG３′ であった。

【００３５】この配列は、最初の１４塩基のヌクレオチ
ド（５′端から）がフルオレセイン標識１８塩基のオリ
ゴマーの３′端に相補的であり、かつ１８塩基のオリゴ
マーの３′端における４塩基のヌクレオチドが、制限酵
素ＨｉｎｄIII により生じる５′付着端の突出し部に相
補的になるように選んだ。この選ばれた特異的な配列
は、１８塩基のオリゴマー／２０塩基のオリゴマーの二
重鎖が形成され、その後ＨｉｎｄIII 制限酵素に切断さ
れた標的ＤＮＡの付着末端に連結されたとき、Ｈｉｎｄ
III の認識配列が破壊される。

【００３６】３．反応混合物は、次の試薬と混合するこ
とにより調製した。 −ＴＥ１μｌ中のλファージ標的ＤＮＡ１μｇ、 −１０ｘＨｉｎｄIII 反応緩衝液（ＢＲＬ Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）０．９μｌ： −ＴＥ中１８塩基のオリゴマー３．０μｌ（モル数は、
ＨｉｎｄIII が標的ＤＮＡ１μｇを消化した場合に生ず
る予期される付着末端数の２倍にした）、 −ＴＥ中２０塩基のオリゴマー２．０μｌ（モル数は、
１８個のオリゴマーのそれと同一にした）、 −１０mMのジチオスレイトール１．０μｌ、 −３mMのリボースＡＴＰ１．０μｌ、 −ＨｉｎｄIII 酵素（１２単位／μｌ）０．５μｌ、 −リガーゼ酵素（０．５単位）０．５μｌ。

【００３７】４．３７℃で１時間インキュベーションし
た。 ５．０．２ＭのＥＤＴＡおよび２０μｇ／μｌ（水中グ
リコーゲン）１．０μｌを添加した。 ６．フェノール／クロロホルム抽出を２度行い、混合物
を浄化した。フェノールとクロロホルムはそれぞれ１０
μｌ添加した。混合しそして遠心した。下相を除去およ
び廃棄した。繰り返した（前述のＭａｎｉａｔｉｓら、
参照）。

【００３８】７．３ＭのＮａＡｃ（pH５．５）１μｌ以
上および９５％のエタノール２５μｌを添加した。混合
し、３０分間静置した。次に、遠心した。 ８．７０％のエタノール５００μｌで沈殿を洗浄した。 ９．減圧遠心を使用し、試料を乾燥した。 １０．１０mMのトリス５０μｌ、１mMのＥＤＴＡ（pH
８．０）中に再懸濁した。

【００３９】１１．０．６％のアガロースゲルに反応混
合物の既知小量をかけ、１ｘＴＢＥ（トリス−硼酸ＥＤ
ＴＡ）緩衝液中、３ボルト／cmで４時間流がした。アプ
ライド・ビオシステム３７０Ａ ＤＮＡシーケンサーで
ゲルを通して移動する蛍光吸収帯を検出し、水平アガロ
ースゲルの読みに適合させた。蛍光ピークは、Ｈｉｎｄ
III 切断λＤＮＡにおける５６０，２０２７，２３２
２，４３６１，６５５７，９４１６および２３，１３０
塩基対に相当するものが検出された。

【００４０】前記結果から、二重鎖ＤＮＡの末端の標識
化または変性のための簡潔で効果的な方法が提供される
ことが明らかである。少量の標識成分で足り、その上試
料のオリゴメリ化は実質的に防がれる。同一の反応容器
中で制限反応または特異的なフラグメント化が実施さ
れ、標識化を生ぜしめることができる。従って、精確な
大きさ、検出およびさらなる操作の容易さを提供する均
質な生成物が得られる。

【００４１】本明細書に記載されるすべての刊行物およ
び特許出願が、本発明の属する当業者の技術水準を示
す。すべての刊行物および特許出願は、それぞれが明確
かつ個別に引用により本明細書の内容となると示されて
いるのと同じように、引用により本明細書の内容とな
る。前述した本発明は、理解を明瞭にする目的で具体的
かつ例示によりかなり詳細に記載されているが、一定の
変更および改良を本発明の範囲内で実施し得ることは自
明であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｄ (72)発明者 メル エヌ．クロニック アメリカ合衆国，カリフォルニア 94301, パロ アルト，フォレスト アベニュ 1156 (72)発明者 リンカーン ジェー．マクブライド アメリカ合衆国，カリフォルニア 94062, レッドウッド シティ，アイリス ストリ ート 311 (72)発明者 ノーマン エム．ホワイトレイ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94070, サン カルロス，ハイランド アベニュ 151

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 制限二重鎖ＤＮＡフラグメントにバイン
   ディングしてその制限認識部位を欠損せしめる標識用組
   成物であって、 架橋鎖ならびにこの架橋鎖に隣接してハイブリダイズし
   た第一及び第二の鎖を含み、第一の標識鎖が目的の二重
   鎖ＤＮＡ配列または標識を提供し、前記架橋鎖にハイブ
   リダイズしている第二のアダプター鎖が前記架橋鎖と共
   に付着末端またはブラント末端を提供する前記標識用組
   成物。