JPH07188034A - エンドセリン変換酵素阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アクラルビシンまたはその薬理学的に許容し
うる塩を含有してなるエンドセリン変換酵素阻害剤。 【効果】 このエンドセリン変換酵素阻害剤は、エンド
セリン変換酵素のみを特異的に阻害し、さらには血管内
皮細胞のエンドセリン産生を抑制する。そのためエンド
セリンが関与する疾患、例えば高血圧、くも膜下出血後
の脳血管れん縮、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、心不
全、喘息等の治療薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用範囲】本発明はアンスラサイクリン系化
合物またはその薬理学的に許容される塩からなるエンド
セリン変換酵素阻害剤、およびこのエンドセリン変換酵
素阻害剤を有効成分とする高血圧などの各種疾患の治療
薬に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】エンドセリン（以下ＥＴと略す）は１９
８８年柳沢らによって発見された内皮細胞の産生する血
管平滑筋収縮因子で２１アミノ酸残基からなるペプチド
である（Nature，３３２，４１１−４１５（１９８８）
参照）。ＥＴは強い血管収縮作用、細胞増殖作用を有
し、血管など各種臓器で生産され、生理的に重要な役割
を果たしていると考えられている。またＥＴはその作用
から高血圧、クモ膜下出血後の脳血管れん縮、心筋梗
塞、動脈硬化、腎不全、心不全、喘息等の疾患の成立に
関わっていると考えられている。また、レイノー患者、
パージャー病患者、高安病患者、川崎病患者、シスプラ
チン投与時の腎障害患者の血中などにおいてＥＴ濃度が
正常人に比して有為に高いことが知られている。

【０００３】ＥＴはその生合成において、活性の低い前
駆体であるビッグエンドセリン（以下ｂＥＴと略す）か
ら特異的プロテアーゼであるＥＴ変換酵素（以下ＥＣＥ
と略す）により生成される。従ってＥＣＥを阻害しＥＴ
の生合成を抑えることは上記の各種疾患の治療及び予防
に有効であると考えられ、特異的なＥＣＥ阻害剤の解明
が求められている。これまでにＥＣＥを阻害する化合物
としてはスプレプトマイセス・タナシエンシス等の放線
菌によって生産されるホスホラミドンが知られていた。
しかしながらホスホラミドンは多くの金属プロテアーゼ
を阻害しＥＣＥに特異的な阻害剤ではない。実際にホス
ホラミドンはＥＣＥよりもアンジオテンシン変換酵素や
中性エンドプロテアーゼ、コラゲナーゼ、サーモリシン
を強く阻害しＥＣＥ阻害剤としての望ましい性質を有し
ていない。そしてＥＣＥに特異的な阻害剤の存在は知ら
れていなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】かかる状況から、ＥＣ
Ｅのみを特異的に阻害する物質の解明が求められるとこ
ろであり、そしてこのＥＣＥのみを特異的に阻害する物
質の解明によって、ＥＴにより起因する、または起因す
ると考えられる各種疾患、例えば高血圧、くも膜下出血
後の脳血管れん縮、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、心不
全、喘息、等の治療薬のあらたな開発の可能性が開かれ
ることになる。すなわち本発明は、ＥＣＥのみを特異的
に阻害する物質の解明と、このＥＣＥの特異的阻害物質
に基づいた上記各種疾患の治療剤の開発とを課題とする
ものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＥＣＥに
特異的な阻害剤を見いだすべく種々の化合物を検索した
結果アンスラサイクリン系化合物がＥＣＥを特異的に阻
害することを見いだし、またアンスラサイクリン系化合
物が培養血管内皮細胞のＥＴ産生を抑制することを見い
だして本発明を完成したのである。すなわち本発明によ
れば、アンスラサイクリン系化合物が著しいＥＣＥ阻害
効果を有することおよびこの阻害効果はＥＣＥに対して
特異的であることから、このアンスラサイクリン系化合
物がＥＣＥ阻害剤として有用であることが分かった。ま
た本発明によればアスラサイクリ系化合物は細胞内にお
いてＥＴの産生をも抑制するものである。

【０００６】したがって本発明は、アンスラサイクリン
系化合物またはその薬理学的に許容し得る塩からなるエ
ンドセリン変換酵素阻害剤に関する。また本発明は、ア
ンスラサイクリン系化合物またはその薬理学的に許容し
得る塩からなるエンドセリン変換酵素阻害剤を有効成分
とする高血圧、くも膜下出血後の脳血管れん縮、心筋梗
塞、動脈硬化、腎不全、心不全、喘息、レイノー患者、
パージャー病患者、高安病患者、川崎病患者、シスプラ
チン投与時の腎障害患者の治療薬にも関する。

【０００７】本発明でいうアンスラサイクリン系化合物
とは、下記のアンスラサイクリノン骨格

【化１】 を持つ化合物を指し、種々の置換基を持つすべてのアン
スラサイクリン骨格を持つ誘導体が本発明のアンスラサ
イクリン系化合物に含まれるものである。例えばアクラ
ルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビ
シンなどの抗生物質及びアクラルビノン等それらのアグ
リコンがあげられる。これらのアンスラサイクリン系化
合物がＥＣＥを特異的に阻害することはこれまでに知ら
れておらず、本発明者らがその作用をはじめて見いだし
たものである。

【０００８】本発明のアンスラサイクリン系化合物はそ
の置換基の種類により必要に応じて薬理学的に許容され
うる酸との付加塩または金属等の陽イオンとの塩に変換
することができ、これらの塩も本発明の範囲内に含まれ
る。酸付加塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫
酸、リン酸などの無機酸との塩類、酢酸、コハク酸、シ
ュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸などの有機酸との
塩類が、陽イオンの塩としてはナトリウム、カリウム、
マグネシウム、カルシウムなどの金属塩、またはアンモ
ニウム塩、有機及び無機の四級アンモニウム塩、ピリジ
ニウム塩、ピペリジニウム塩などがあげられる。本発明
のアンスラサイクリン系化合物を医薬として使用する場
合には種々の投与形態の製剤とすることができる。すな
わち、経口的投与の場合に、錠剤、硬カプセル剤、軟カ
プセル剤等の固形製剤、溶液、エマルジョンまたはサス
ペンジョンなどの液剤の形態で投与することができる。
また、非経口的投与の場合に、注射溶液、貼付剤、坐剤
などの形態で投与される。

【０００９】これらの製剤の調製にあたっては製剤化の
ための慣用の添加剤、例えば賦形剤、安定剤、防腐剤、
溶解剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味剤、着色剤、着
色剤、香味剤、張度調製剤、緩衝剤、酸化防止剤などを
用いて製剤化することができる。本発明のアンスラサイ
クリン系化合物またはその薬理学的に許容しうる塩の投
与量は患者の年齢、体重、性別、症状、投与形態などに
応じて変化しうるが、一般に成人一人当たり経口投与で
は０.５〜５００mg／kgである。モルモットにアクラル
ビノンを１００mg／kgの投与量で単回静脈投与をしたと
ころ外見上何等変化は見られなかった。以下実施例によ
り本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は本発明
を説明するためのものであって本発明を限定するものと
解すべきではない。

【００１０】実施例１ アンスラサイクリン系化合物の
ＥＣＥ阻害作用 ヒト胎盤ＥＣＥの調製とＥＣＥ活性の測定は以下の方法
で行なった。ヒト胎盤組織を０.２５Ｍスクロース、１m
M フッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）、１
mM Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、０.１mM Ｅ−６
４、０.０１mMペプスタチンＡを含む２５mMヘペス緩衝
液（pH７.４）中で低温下ガラスホモゲナイザーでホモ
ゲナイズした。１,０００×Ｇで２０分間遠心し、その
上清を１００,０００×Ｇ ３０分間超遠心し膜画分を沈
殿として得た。膜画分に２％ルブロールを加えＥＣＥを
可溶化し１００,０００×Ｇ超遠心した上清をヒト胎盤
ＥＣＥとした。ヒト胎盤ＥＣＥ１０μｇと０.４４μｇ
ヒトｂＥＴ−１（ペプチド研製）を１mM ＰＭＳＦ、０.
１mMチオルファン、０.０１mMペプスタチンＡ、０.０１
mMベスタチンを含む０.１mMトリス−塩酸緩衝液（pH７.
０）中で混合し全量１００μｌとし３７℃３時間インキ
ュベートした。ＥＤＴＡを終濃度５mMに加え反応を停止
した後、変換されたＥＴ−１を定量しＥＣＥ活性を測定
した（特開平５−１９９８７４号参照）。

【００１１】ラット肺ＥＣＥの調製とＥＣＥ活性の測定
は以下の方法で行なった。すなわち、ラット肺を０.１m
M Ｅ−６４、０.１mM フッ化４−（アミジノフェニル）
メタン−スルフォニル（ｐ−ＡＰＭＳＦ）、０.１mM キ
モスタチン、０.１mM ＮＥＭ、５mM ＭｇＣｌ₂を添加し
た２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７.２）中で低温下ガ
ラスホモゲナイザーでホモゲナイズした。６００×Ｇで
１０分間遠心し、その上清を１０５,０００×Ｇで３０
分間超遠心した上清をラット肺ＥＣＥとした。ラット肺
ＥＣＥ１０μｇと０.１μｇブタｂＥＴ−１（ペプチド
研製）を０.１mM Ｅ−６４、０.１mM ｐ−ＡＰＭＳＦ、
０.０１mMペプスタチンＡ、０.０１mMベスタチン、２μ
Ｍキモスタチンを含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH６.５）中で混合し全量１００μｌとし３７℃３時
間インキュベートした。１０分間煮沸し反応停止後、変
換されたＥＴ−１を定量しＥＣＥ活性を測定した（BIOC
HEMISTRY INTERNATIONAL，２５(４)，６９７−７０４
（１９９１）参照）。

【００１２】ＥＣＥ阻害試験は試験化合物存在下または
非存在下でＥＣＥ活性測定を行ない、試験化合物のＥＣ
Ｅ阻害活性を評価した。表１および表２に示すようにア
ンスラサイクリン系化合物はＥＣＥを阻害した。また表
２に示すようにアクラルビシンのアグリコンであるアク
ラビノンも同様にＥＣＥを阻害した。

【００１３】

【表１】

【００１４】

【表２】

【００１５】実施例２ ＥＣＥ阻害様式 アクラルビシンのラット肺ＥＣＥに対する阻害様式はラ
インウィーバー・バーグのプロットから、基質に対し拮
抗的であった（図１）。ラット肺ＥＣＥのミカエリスの
定数Kmは４.７μＭ、アクラルビシンのＫｉは７.８μＭ
であった。

【００１６】実施例３ アクラルビシンの酵素阻害特異
性試験 アクラルビシンのキモトリプシン、サーモリシン、アン
ジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、中性エンドペプチダ
ーゼ（ＮＥＰ）に対する阻害作用を調べた。キモトリプ
シン活性の測定は以下のように行なった。すなわちスク
シニル−アラニル−プロリル−フェニルアラニル−ｐ−
ニトロアニリドを０.５Ｍ塩化ナトリウム、１０％ＤＭ
ＳＯ、０.１％トリトンＸ−１００を含む０.１Ｍヘペス
緩衝液（pH７.５）に０.５mMに溶解し基質液とした。基
質液１００μｌに精製ウシキモトリプシン０.５μｇを
加えて全量１２０μｌとし、室温５分間反応し４０５nm
の吸光度をモニターしその増加速度を酵素活性とした。

【００１７】サーモリシン活性の測定は以下の方法で行
なった。３−（２−フリルアクロイル）−グリシル−Ｌ
−ロイシンアミドを、１０mM塩化カルシウムを含む５０
mMトリス−塩酸緩衝液（pH７.２）に１mMに溶解し基質
液とした。基質液２００μｌにサーモリシン０.１nmol
を加え全量２５０μｌとし室温２０分間反応し、３４０
nmの吸光度をモニターしその減少速度を酵素活性とした
（J．Biochem., ９３，４７−５３（１９８３）参
照）。

【００１８】アンジオテンシン変換酵素の測定は以下の
方法で行なった。ヒップリル−ヒスチジル−ロイシンを
０.６mM塩化ナトリウム、０.１％トリトンＸ−１００を
含む８０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８.３）に３.７５
mMに溶解し基質液とした。基質液４００μｌにμｌに精
製ウサギ肺アンジオテンシン変換酵素５ｍＵを加え全量
５００μｌとし３７℃３０分間反応した。１０分間煮沸
後０.２Ｍリン酸カルシウム緩衝液（pH８.３）３ml、３
％塩化シアヌルを含むジオキサン１.５mlを加え強く撹
拌した。１,０００×Ｇ １０分間遠心し、上清の３８２
nmの吸光度を測定した。酵素を含まない反応液（盲検）
との差を酵素活性とした（Anal．Biochem., ８４，３６
１−３６９（１９７８）参照）。

【００１９】中性エンドペプチダーゼ活性の測定は以下
の方法で行なった。６２.５mMトリス−塩酸緩衝液（pH
７.６）に精製ラット腎臓中性エンドペプチダーゼ０.０
８μｇとアミノペプチダーゼＭ２０ｍＵおよびグルタリ
ル−アラニル−フェニルアラニル−β−ナフチルアミド
（終濃度０.４mM）を加え全量１００μｌとし２５℃９
０分間インキュベートした。１０％トリクロロ酢酸１０
μｌを加え反応を停止し、０.０５％ファーストガーネ
ット、０.２％ブリジ３５液を加え２５℃３０分間イン
キュベートし、５２５nmの吸光度を測定した。盲検の５
２５nmの吸光度との差を酵素活性とした。試験化合物存
在下および非存在下で各酵素活性の測定を行ない、試験
化合物の阻害活性を評価した。表３に示すようにアクラ
ルビシンはこれらの酵素を阻害せずＥＣＥに対し特異的
であった。

【００２０】

【表３】

【００２１】実施例４ アクラルビシンのｂＥＴ−１、
ＥＴ−１に対する作用 １nmolのｂＥＴ−１、ＥＴ−１と６０nmolのアクラルビ
シンを５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH６.５）１ml
中で３７℃３０分間インキュベートした。反応液中のｂ
ＥＴ−１、ＥＴ−１を免疫測定法で定量した。ｂＥＴ−
１、ＥＴ−１の量に変化はなかった。また反応液中のｂ
ＥＴ−１、ＥＴ−１を文献記載の方法でＨＰＬＣで定量
を行なった。（Biochem．Biophys．Res．Commun., １６
６，４３６（１９９０）参照）。ｂＥＴ−１、ＥＴ−１
のカラム保持時間およびピーク面積に変化はなかった。
このことからアクラルビシンのＥＣＥ活性阻害作用はＥ
ＣＥそのものに対する作用である事が示された。

【００２２】実施例５ 培養血管内皮細胞のＥＴ産生に
対する作用 摘出したウシ新鮮頚動脈から内皮細胞を調製し常法にし
たがい細胞培養した。試験化合物存在下、非存在下で培
養し、培地へ分泌されるＥＴ−１量を測定した。表４に
示すようにアクラルビシンは内皮細胞のＥＴ産生を抑制
した。

【００２３】

【表４】

【００２４】次に本発明のＥＣＥ阻害剤を有効成分とす
る治療薬について、その製剤例を説明する。 各成分を均一に混合し、直打用粉末とする。これをロー
タリー式打錠機で直径７mm、重量１５０mgの錠剤に成形
する。

【００２５】製剤例２ 顆粒剤（１分包あたり） Ａ．アクラルビノン １０mg 乳糖 ９０mg トウモロコシデンプン ５０mg 結晶セルロース ５０mg Ｂ．ヒドロキシプロピルセルロース １０mg エタノール ９mg Ａの成分を均一に混合した後、Ｂの溶液を加えて練合
し、押出造粒法で整粒し、ついで５０℃の乾燥機で乾燥
する。乾燥上がり顆粒を粒度２９７μｍ〜１４６０μｍ
にふるい分けたものを顆粒剤とする。１分包量を２００
mgとする。

【００２６】

【発明の効果】本発明のアクラルビシンまたはその薬理
学的に許容しうる塩を含有してなるエンドセリン変換酵
素阻害剤はエンドセリン変換酵素のみを特異的に阻害
し、さらには血管内皮細胞のエンドセリン産生を抑制す
る。そのためエンドセリンが関与する疾患、例えば高血
圧、くも膜下出血後の脳血管れん縮、心筋梗塞、動脈硬
化、腎不全、心不全、喘息等の治療薬として有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】アクラルビシンのラット肺ＥＣＥに対する阻害
をラインウィーバー・バーグのプロットによって示す
図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/65 ＡＢＮ ＡＣＦ ＡＣＪ ＡＧＺ (72)発明者 中田 文久 埼玉県入間郡大井町鶴ヶ岡５丁目３番１号 日清製粉株式会社医薬研究所内 (72)発明者 白根 克則 埼玉県入間郡大井町鶴ヶ岡５丁目３番１号 日清製粉株式会社医薬研究所内 (72)発明者 北條 直美 埼玉県入間郡大井町鶴ヶ岡５丁目３番１号 日清製粉株式会社医薬研究所内 (72)発明者 藤巻 寿美 埼玉県入間郡大井町鶴ヶ岡５丁目３番１号 日清製粉株式会社医薬研究所内 (72)発明者 小松 宏彦 東京都中央区日本橋小網町19番12号 日清 製粉株式会社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アンスラサイクリン系化合物またはその
   薬理学的に許容し得る塩からなるエンドセリン変換酵素
   阻害剤。
2. 【請求項２】 化合物がアクラルビシンまたはその薬理
   学的に許容し得る塩である請求項１記載のエンドセリン
   変換酵素阻害剤。
3. 【請求項３】 化合物がアクラルビシンのアグリコンの
   アクラビノンまたはその薬理学的に許容し得る塩である
   請求項１記載のエンドセリン変換酵素阻害剤。
4. 【請求項４】 請求項１記載のエンドセリン変換酵素阻
   害剤を有効成分とする高血圧、くも膜下出血後の脳血管
   れん縮、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、心不全、喘息、
   レイノー患者、パージャー病患者、高安病患者、川崎病
   患者、シスプラチン投与時の腎障害患者の治療薬。