JPH07188A

JPH07188A - 新規微生物及びそれを用いるｄ−リンゴ酸の製造法

Info

Publication number: JPH07188A
Application number: JP14307693A
Authority: JP
Inventors: Tadaatsu Nakahara; 忠篤中原; Makoto Kakishima; 眞柿嶌
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1993-06-15
Filing date: 1993-06-15
Publication date: 1995-01-06

Abstract

(57)【要約】【構成】Ｄ−リンゴ酸生成能を有するウスチラゴ属、
ロドトルーラ属又はサッカロミコプシス属に属する微生
物あるいはそれらの処理物を、マレイン酸水性溶液に作
用させて反応液中にＤ−リンゴ酸を生成させ、該反応液
からＤ−リンゴ酸を採取することを特徴とするＤ−リン
ゴ酸の製造法。【効果】本発明によれば、高光学純度のＤ−リンゴ酸
を効率よく、安価に製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｄ−リンゴ酸生成能力
を有する真核微生物及びそれを用いるＤ−リンゴ酸の製
造法に関するものである。本発明によれば、高光学純度
のＤ−リンゴ酸を高収率で安価に製造することができ
る。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】光学純
度の高いリンゴ酸は、生理活性物質などの種々の不斉合
成化合物の原料として有用である。Ｄ−リンゴ酸の製造
法としては、化学合成法(A. Bernardiら、Tetrahedron,
Vol.46, p.1987-1998(1990)) 、マレイン酸を原料とし
て細菌を作用させる方法（特開平３−５３８８８；浅野
ら、日本生物工学会１９９２年度大会講演要旨集、p.22
3; J. Marietら、Appl. Environ. Microbiol., Vol.58,
No.9, p.2854-2960(1992)) などが知られているが、い
ずれも光学純度および生成量とも工業化する上では不十
分であり、真核微生物を用いたＤ−リンゴ酸の製造法に
ついては未だ知られていない。本発明者らは、真核微生
物である酵母、糸状菌について鋭意検討を重ねた結果、
マレイン酸からＤ−リンゴ酸を生成する能力を有する微
生物を見出し、これを利用することにより高収率で高光
学純度のＤ−リンゴ酸を安価に製造し得ることを見出
し、本発明を完成するに至った。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明は、リンゴ酸生成
能を有するウスチラゴ(Ustilago)属、ロドトルーラ(Rho
dotorula) 属又はサッカロミコプシス(Saccharomycopsi
s)属に属する真核微生物の菌体あるいはそれらの処理物
を、マレイン酸水性溶液に作用させて反応液中にＤ−リ
ンゴ酸を生成させ、該反応液からＤ−リンゴ酸を採取す
ることを特徴とするＤ−リンゴ酸の製造法である。

【０００４】本発明のＤ−リンゴ酸の製造法に用いるこ
とができる微生物としては、ウスチラゴ(Ustilago)属に
属する微生物、好ましくはウスチラゴ・スファエロジー
ナ(Ustilago sphaerogena)Ｓ４０２株；ロドトルーラ(R
hodotorula) 属に属する微生物、好ましくはロドトルー
ラ・ミヌタ・ｖ・テキセンシス(Rhodotorula minutav.
texensis)ＩＦＯ１１０２株；サッカロミコプシス(Sacc
haromycopsis)属に属する微生物、好ましくはサッカロ
ミコプシス・リポリチカ(Saccharomycopsis lypolytic
a) ＩＦＯ１５４２株などが挙げられる。

【０００５】上記微生物のうち、ウスチラゴ・スファエ
ロジーナＳ４０２株は新菌株であって、本発明者により
イヌビエ(Echinochloa crus-galli(L. Beauc. var. cur
s-galli)) の子房に生じた胞子堆内の胞子を発芽させる
ことにより分離され、以下の菌学的性質を有する。

【０００６】１．顕微鏡的性質胞子の形状及び大きさ：胞子堆内に多量のクロボ胞子を
形成する。クロボ胞子は球形ないしは楕円形であり、被
膜は褐色で表面には刺を有する。大きさ９〜１３μm 。２．各培地における生育状態麦芽エキス寒天培地：良好バレイショ・ブドウ糖寒天培地：良好３．生理的、生態的性質クロボ胞子を発芽させると担子器を生じ、担子胞子を形
成する。担子胞子は上記培地上にて発芽し、容易に生育
する。

【０００７】以上の性質から、本菌株はウスチラゴ・ス
ファエロジーナと同定されたが、これまでに知られてい
るウスチラゴ属に属する微生物については、Ｄ−リンゴ
酸生成能を有していないことから、本菌株は新種と考え
られた。なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術
研究所に受託番号：ＦＥＲＭＰ−１３５８４として寄
託されている。

【０００８】本発明に用いる上記Ｄ−リンゴ酸生成菌
は、実質的にＤ−リンゴ酸生成能を有していれば、自然
界から分離された菌株のみならず、変異、遺伝子組換
え、細胞融合などの手法により得られる、該酵素活性を
向上させた微生物であってもよい。

【０００９】上記の微生物を培養するための培地として
は、炭素源としてグルコース、シュークロース、グリセ
ロール、マレイン酸またはその塩（例えばマレイン酸ナ
トリウム）、リンゴ酸またはその塩（例えばリンゴ酸ナ
トリウム）、フマル酸またはその塩（例えばフマル酸ナ
トリウム）、コハク酸またはその塩（例えばコハク酸ナ
トリウム）等、好ましくはグルコース、マレイン酸また
はその塩を、窒素源として塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、アンモニアのような無機
窒素源、ペプトン、麦芽エキス、肉エキス、コーンステ
ィープリカー、カザミノ酸のような有機窒素源等を、無
機物としてリン酸カリウム、リン酸一水素カリウム、リ
ン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等を、また必要
に応じて各種ビタミン等の栄養素を含有する培地が好適
に使用される。

【００１０】培養は、通気攪拌、振とう等の好気的条件
下で行い、培養温度は通常２０〜４０℃、好ましくは２
５〜３０℃である。培養途中のpHは通常５〜９、好まし
くは６〜８付近であり、培養中のpHの調整は、酸、アル
カリを添加して行うことができる。なお、培養期間は通
常１〜７日間、好ましくは１〜２日間である。

【００１１】このようにして得られた培養物から濾過ま
たは遠心分離により集めた菌体を、水または適当な緩衝
液で洗浄し、本発明の酵素反応に使用する。本発明の方
法においては、これらの菌体をそのまま用いることがで
きるが、超音波処理等を加えた菌体破砕物またはそれか
ら分離された粗酵素もしくは精製酵素として、あるいは
適当な担体に固定化して用いることもできる。菌体、菌
体破砕物または粗もしくは精製酵素の固定化手段は、特
に制限されるものではなく、例えばポリアクリルアミ
ド、アルギン酸、κ−カラギーナン等による包括法等が
好適に用いられる。以上に述べた如き菌体の破砕物、粗
もしくは精製酵素、固定化物等を、本明細書においては
まとめて「菌体処理物」という。

【００１２】上記のように調製した微生物菌体またはそ
の処理物の存在下、マレイン酸を含有する水溶液に酵素
反応させて、Ｄ−リンゴ酸を製造することができる。本
発明のＤ−リンゴ酸製造法における酵素反応系には、少
なくともマレイン酸が含まれていればよく、その濃度
は、例えば反応の開始時に通常０．０１〜３０重量％、
好ましくは０．１〜１０重量％程度であり、これを逐次
もしくは連続的に反応液中へ添加してもよい。

【００１３】本発明方法における微生物菌体またはその
処理物の使用量は、特に限定されるものではないが、通
常０．１〜５０重量％、好ましくは１〜１０重量％程度
である。この反応は、通常４〜１０、好ましくは６〜８
のpHで行われ、反応温度は通常５〜５０℃、好ましくは
２０〜４０℃である。反応は、通常約１０〜７２時間行
う。

【００１４】酵素反応に用いる反応溶媒としては、水ま
たはリン酸もしくはトリス塩酸等の緩衝液が好ましい。
なお、反応に微生物菌体をそのまま使用する場合には、
菌体の膜透過性を向上させるため、非イオン性界面活性
剤、例えばトリトンＸ−１００（商標）等、または有機
溶媒、例えばトルエン等の添加剤を用いることができ
る。添加剤の種類および使用量は、特に限定されるもの
ではないが、反応液中の濃度としては、通常０．０１〜
５％程度が好ましい。

【００１５】この反応終了液からのＤ−リンゴ酸の分離
・精製は、それ自体既知の方法、例えばイオン交換樹脂
処理法、濃縮、晶析等により行うことができる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限する
ものではない。

【００１７】以下の実施例において％と表示したもの
は、特に説明しない限り重量％を意味する。異性体過剰
率(enantiomer excess) は以下の式で求めた。

【００１８】

【数１】

【００１９】実施例１下記培地組成Ａの培地３０mlを３００ml容三角フラスコ
に分注して、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに、
ウスチラゴ・スファエロジーナＳ４０２を一白金耳量接
種し、２５℃にて２４時間振とう培養した。培養終了液
を遠心分離（１０，０００rpm 、１０分、４℃）して菌
体を集め、該集菌体を蒸留水５０mlに懸濁後、再び遠心
分離（１０，０００rpm 、１０分、４℃）して得た菌体
をＤ−リンゴ酸生成酵素源とした。

【００２０】培地組成Ａグルコース１％ペプトン０．５％酵母エキス０．３％麦芽エキス０．３％マレイン酸二ナトリウム０．１％蒸留水（pH６．０）

【００２１】反応液（マレイン酸二ナトリウム０．３
％、トリトンＸ−１００１％）３mlに上記で調製した
Ｄ−リンゴ酸生成酵素源１ml（１０mg乾燥菌体／ml）を
加え、３０℃にて４８時間反応させた。反応液中に生成
したリンゴ酸は、酵素法（Ｆ−キットＤ−，Ｌ−リン
ゴ酸、ベーリンガー・マンハイム・山之内製）によりＤ
−，Ｌ−体をそれぞれ別々に測定した。この時の生成Ｄ
−リンゴ酸は４０．８mg/ml であり、光学純度は９８．
９％ｅ．ｅ．であった。

【００２２】実施例２上記培地組成Ａの培地３０mlを３００ml容三角フラスコ
に分注して、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに、
ロドトルーラ・ミヌタ・ｖ・テキセンシスＩＦＯ１１０
２を一白金耳量接種し、２５℃にて２４時間振とう培養
した。培養終了液を遠心分離（１０，０００rpm 、１０
分、４℃）して菌体を集め、該集菌体を蒸留水５０mlに
懸濁後、再び遠心分離（１０，０００rpm 、１０分、４
℃）して得た菌体をＤ−リンゴ酸生成酵素源とした。

【００２３】反応液（マレイン酸二ナトリウム０．３
％、トルエン０．１ml）３mlに上記で調製したＤ−リ
ンゴ酸生成酵素源１ml（１０mg乾燥菌体／ml）を加え、
３０℃にて４８時間反応させた。反応液中に生成したリ
ンゴ酸は、酵素法（Ｆ−キットＤ−，Ｌ−リンゴ酸、
ベーリンガー・マンハイム・山之内製）によりＤ−，Ｌ
−体をそれぞれ別々に測定した。この時の生成Ｄ−リン
ゴ酸は１０．５３mg/ml であり、光学純度は９３．８％
ｅ．ｅ．であった。

【００２４】実施例３上記培地組成Ａの培地３０mlを３００ml容三角フラスコ
に分注して、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに、
サッカロミコプシス・リポリチカＩＦＯ１５４２を一白
金耳量接種し、２５℃にて２４時間振とう培養した。培
養終了液を遠心分離（１０，０００rpm 、１０分、４
℃）して菌体を集め、該集菌体を蒸留水５０mlに懸濁
後、再び遠心分離（１０，０００rpm 、１０分、４℃）
して得た菌体をＤ−リンゴ酸生成酵素源とした。

【００２５】反応液（マレイン酸二ナトリウム０．３
％、トルエン０．１ml）３mlに上記で調製したＤ−リ
ンゴ酸生成酵素源１ml（１０mg乾燥菌体／ml）を加え、
３０℃にて４８時間反応させた。反応液中に生成したリ
ンゴ酸は、酵素法（Ｆ−キットＤ−，Ｌ−リンゴ酸、
ベーリンガー・マンハイム・山之内製）によりＤ−，Ｌ
−体をそれぞれ別々に測定した。この時の生成Ｄ−リン
ゴ酸は４．３６mg/mlであり、光学純度は９７．７％
ｅ．ｅ．であった。

【００２６】

【発明の効果】本発明によれば、安価なマレイン酸から
効率よく、光学純度の高いＤ−（＋）−リンゴ酸を容易
に製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｄ−リンゴ酸生成能を有するウスチラゴ
属、ロドトルーラ属又はサッカロミコプシス属に属する
微生物あるいはこれらの処理物を、マレイン酸の水性溶
液中に作用させて反応液中にＤ−リンゴ酸を生成させ、
該反応液からＤ−リンゴ酸を採取することを特徴とする
Ｄ−リンゴ酸の製造法。
【請求項２】マレイン酸からのＤ−リンゴ酸生成能を
有するウスチラゴ・スファエロジーナ。