JPH07194380A - ｍＣ２６遺伝子発現制御領域を用いてトランスジェニック動物乳腺において物質を生産する新規製造法 - Google Patents
ｍＣ２６遺伝子発現制御領域を用いてトランスジェニック動物乳腺において物質を生産する新規製造法Info
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- JPH07194380A JPH07194380A JP5355132A JP35513293A JPH07194380A JP H07194380 A JPH07194380 A JP H07194380A JP 5355132 A JP5355132 A JP 5355132A JP 35513293 A JP35513293 A JP 35513293A JP H07194380 A JPH07194380 A JP H07194380A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、ｍＣ２６蛋白質の発現制御領域を
用いた異種遺伝子生産のためのトランスジェニック動物
の作製方法を提供することを目的とする。 【構成】 ｍＣ２６蛋白質をコードする構造遺伝子の一
部および該遺伝子の発現制御領域を含むＤＮＡ断片を発
現カセットとして用いて異種遺伝子を該発現カセットに
挿入した組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを
大腸菌等の発現ベクターに挿入し、該ベクターを用いて
トランスジェニック動物を作製する技術に関する。
用いた異種遺伝子生産のためのトランスジェニック動物
の作製方法を提供することを目的とする。 【構成】 ｍＣ２６蛋白質をコードする構造遺伝子の一
部および該遺伝子の発現制御領域を含むＤＮＡ断片を発
現カセットとして用いて異種遺伝子を該発現カセットに
挿入した組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを
大腸菌等の発現ベクターに挿入し、該ベクターを用いて
トランスジェニック動物を作製する技術に関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生物体内において所望
の異種遺伝子を発現させることを可能ならしめる染色体
ＤＮＡ由来の遺伝子の発現制御領域を導入するトランス
ジェニック生物の生産方法に関する。特定すれば、本発
明はｍＣ２６蛋白質をコードする構造遺伝子の一部およ
び該構造遺伝子の上流および下流に位置する該遺伝子の
発現を制御する制御領域配列からなるＤＮＡ断片を用い
て大腸菌その他の宿主中で増幅するための組換え発現ベ
クターを作製し、そして該ベクターを用いてｍＣ２６遺
伝子の遺伝子制御領域を生物体内に導入して遺伝子発現
制御実験モデル動物を創造し、所望の物質を哺乳動物の
乳腺その他の組織において生産させることを可能ならし
めるトランスジェニック技術に関する。
の異種遺伝子を発現させることを可能ならしめる染色体
ＤＮＡ由来の遺伝子の発現制御領域を導入するトランス
ジェニック生物の生産方法に関する。特定すれば、本発
明はｍＣ２６蛋白質をコードする構造遺伝子の一部およ
び該構造遺伝子の上流および下流に位置する該遺伝子の
発現を制御する制御領域配列からなるＤＮＡ断片を用い
て大腸菌その他の宿主中で増幅するための組換え発現ベ
クターを作製し、そして該ベクターを用いてｍＣ２６遺
伝子の遺伝子制御領域を生物体内に導入して遺伝子発現
制御実験モデル動物を創造し、所望の物質を哺乳動物の
乳腺その他の組織において生産させることを可能ならし
めるトランスジェニック技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学により作製した組換え体遺伝
子から物質を生産するための宿主系として、大腸菌、枯
草菌、酵母をはじめとする微生物および各種の培養動植
物細胞が利用されている。さらに、ＤＮＡを生物体内に
導入し、トランスジェニック生物を作製し、組換え体遺
伝子を発現させて組換え体蛋白質を生産させることが可
能である［パルミッター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ）ら、Ｃｅ
ｌｌ，Ｖｏｌ ２９，７０１−７１０（１９８２）］。
子から物質を生産するための宿主系として、大腸菌、枯
草菌、酵母をはじめとする微生物および各種の培養動植
物細胞が利用されている。さらに、ＤＮＡを生物体内に
導入し、トランスジェニック生物を作製し、組換え体遺
伝子を発現させて組換え体蛋白質を生産させることが可
能である［パルミッター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ）ら、Ｃｅ
ｌｌ，Ｖｏｌ ２９，７０１−７１０（１９８２）］。
【０００３】例えば、マイクロインジェクション法によ
り、組換え体ＤＮＡを含む溶液を胚（受精卵）に注入
し、創造したトランスジェニック動物体内において導入
遺伝子を発現させて蛋白質を合成させることが一般的で
ある［ディチュリオ（ＤｉＴｕｌｌｉｏ）ら、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １０，７４−７７（１
９９２）］。レトロウィルスを中間ベクターとして利用
する方法も開発されている［ヤニッシュ（Ｊａｅｎｉｓ
ｃｈ）ら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ ２４，５１９（１９８
１）］が、このようなウイルスの使用は、オンコジーン
の活性化または不所望な転写等の危険性を少なからず有
する。また、組換え体ＤＮＡを直接、動物体内に注射し
て遺伝子を発現させる方法も開発されているが、発現効
率および導入遺伝子の安定性の点で工業的規模の使用に
おける信頼性に欠ける。
り、組換え体ＤＮＡを含む溶液を胚（受精卵）に注入
し、創造したトランスジェニック動物体内において導入
遺伝子を発現させて蛋白質を合成させることが一般的で
ある［ディチュリオ（ＤｉＴｕｌｌｉｏ）ら、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １０，７４−７７（１
９９２）］。レトロウィルスを中間ベクターとして利用
する方法も開発されている［ヤニッシュ（Ｊａｅｎｉｓ
ｃｈ）ら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ ２４，５１９（１９８
１）］が、このようなウイルスの使用は、オンコジーン
の活性化または不所望な転写等の危険性を少なからず有
する。また、組換え体ＤＮＡを直接、動物体内に注射し
て遺伝子を発現させる方法も開発されているが、発現効
率および導入遺伝子の安定性の点で工業的規模の使用に
おける信頼性に欠ける。
【０００４】トランスジェニック動物の作製において導
入する組換え遺伝子は、ゲノミックＤＮＡでもｍＲＮＡ
に相補的なｃＤＮＡでもよい。さらに、該ＤＮＡの前後
に任意のプロモーター、エンハンサーおよび転写終結シ
グナルなどの遺伝子の発現制御領域を付加した組換え体
ＤＮＡも用いられる。
入する組換え遺伝子は、ゲノミックＤＮＡでもｍＲＮＡ
に相補的なｃＤＮＡでもよい。さらに、該ＤＮＡの前後
に任意のプロモーター、エンハンサーおよび転写終結シ
グナルなどの遺伝子の発現制御領域を付加した組換え体
ＤＮＡも用いられる。
【０００５】プロモーター、エンハンサーには、特定の
臓器・組織でのみ発現する性質を備えたもの（組織特異
的発現）、生物の成長過程の一定の時期にのみ発現する
性質を備えたもの（時期特異的発現）、細胞内外の環境
による刺激に反応する性質を備えたもの（刺激反応性）
等があるので、所望の遺伝子本来のプロモーターおよび
エンハンサーとは異なる性質をもつ、他の生物あるいは
他の遺伝子由来の発現制御領域配列を用いて組換え体を
作製し、そして生物体内に導入することにより、トラン
スジェニック生物体内で所望の時期および位置に所望の
異種遺伝子を発現させることが可能である［特開平３−
２１０１８７号］。
臓器・組織でのみ発現する性質を備えたもの（組織特異
的発現）、生物の成長過程の一定の時期にのみ発現する
性質を備えたもの（時期特異的発現）、細胞内外の環境
による刺激に反応する性質を備えたもの（刺激反応性）
等があるので、所望の遺伝子本来のプロモーターおよび
エンハンサーとは異なる性質をもつ、他の生物あるいは
他の遺伝子由来の発現制御領域配列を用いて組換え体を
作製し、そして生物体内に導入することにより、トラン
スジェニック生物体内で所望の時期および位置に所望の
異種遺伝子を発現させることが可能である［特開平３−
２１０１８７号］。
【０００６】天然のミルク蛋白質遺伝子、例えばアルフ
ァ・カゼイン遺伝子は、プロラクチン、インシュリン、
グルココルチコイド、プロジェステロン、エストロジェ
ンなどの各種ホルモンの刺激に反応する遺伝子領域すな
わちホルモン反応性エレメントを持ち、泌乳期の乳腺に
おいて、時期特異的かつ組織特異的に発現するように調
節される。ミルク蛋白質遺伝子の発現制御領域を付加し
た組換え遺伝子は、これを導入したトランスジェニック
動物の乳腺において、天然のミルク蛋白質遺伝子と同様
に転写および翻訳され、そして組換え遺伝子がコードす
る蛋白質を分泌させることができる［特開昭６３−２９
１号］。また、乳清蛋白質（ＷＡＰ、βラクトグロブリ
ン）遺伝子を含む発現ベクターを利用した、外来遺伝子
産物のミルク中への分泌技術も開示されている［特開昭
６３−２９１号、特表昭６４−５００１６２号］。
ァ・カゼイン遺伝子は、プロラクチン、インシュリン、
グルココルチコイド、プロジェステロン、エストロジェ
ンなどの各種ホルモンの刺激に反応する遺伝子領域すな
わちホルモン反応性エレメントを持ち、泌乳期の乳腺に
おいて、時期特異的かつ組織特異的に発現するように調
節される。ミルク蛋白質遺伝子の発現制御領域を付加し
た組換え遺伝子は、これを導入したトランスジェニック
動物の乳腺において、天然のミルク蛋白質遺伝子と同様
に転写および翻訳され、そして組換え遺伝子がコードす
る蛋白質を分泌させることができる［特開昭６３−２９
１号］。また、乳清蛋白質（ＷＡＰ、βラクトグロブリ
ン）遺伝子を含む発現ベクターを利用した、外来遺伝子
産物のミルク中への分泌技術も開示されている［特開昭
６３−２９１号、特表昭６４−５００１６２号］。
【０００７】ｍＣ２６遺伝子産物は、乳腺で泌乳期特異
的かつ組織特異的に多量に発現する遺伝子として同定さ
れ［サトウ（Ｓａｔｏｗ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９
９，１６３９−１６４３（１９８６）］、また、その後
ドーベンコ（Ｄｏｗｂｅｎｋｏ）ら［Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖ
ｏｌ ２６８，Ｎｏ．６：４５２５−４５２９（１９９
３）］により白血球接着分子として同定され、ＧＬＹＣ
ＡＭ−１と呼ばれている分子である。該遺伝子座はマウ
スにおいてマップされており、該遺伝子の構造遺伝子部
分および周辺の一部のヌクレオチド配列は既に決定され
ている［ドーベンコ（Ｄｏｗｂｅｎｋｏ）ら、上記］。
的かつ組織特異的に多量に発現する遺伝子として同定さ
れ［サトウ（Ｓａｔｏｗ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９
９，１６３９−１６４３（１９８６）］、また、その後
ドーベンコ（Ｄｏｗｂｅｎｋｏ）ら［Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖ
ｏｌ ２６８，Ｎｏ．６：４５２５−４５２９（１９９
３）］により白血球接着分子として同定され、ＧＬＹＣ
ＡＭ−１と呼ばれている分子である。該遺伝子座はマウ
スにおいてマップされており、該遺伝子の構造遺伝子部
分および周辺の一部のヌクレオチド配列は既に決定され
ている［ドーベンコ（Ｄｏｗｂｅｎｋｏ）ら、上記］。
【０００８】ｍＣ２６遺伝子をクローン化してグルココ
ルチコイドレセプターを持つマウス線維芽細胞由来のＬ
細胞に導入し、遷移性発現および形質転換細胞中での発
現が検討されたが、該遺伝子に対するホルモンの作用が
従来の知見とは異なることが明らかとなり、さらに、該
遺伝子の転写産物が従来公知のｍＲＮＡとは異なる異常
なＲＮＡであることが判明した。即ち、ｍＣ２６遺伝子
が従来公知の他のカゼイン遺伝子とは異なった発現制御
機構を有することが明らかになった［カワムラ（ｋａｗ
ａｍｕｒａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１，１０３
−１１０（１９８７）］。
ルチコイドレセプターを持つマウス線維芽細胞由来のＬ
細胞に導入し、遷移性発現および形質転換細胞中での発
現が検討されたが、該遺伝子に対するホルモンの作用が
従来の知見とは異なることが明らかとなり、さらに、該
遺伝子の転写産物が従来公知のｍＲＮＡとは異なる異常
なＲＮＡであることが判明した。即ち、ｍＣ２６遺伝子
が従来公知の他のカゼイン遺伝子とは異なった発現制御
機構を有することが明らかになった［カワムラ（ｋａｗ
ａｍｕｒａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１，１０３
−１１０（１９８７）］。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】この事実に基づき、ｍ
Ｃ２６の発現系、特に転写エンハンサー／プロモーター
領域の機能を解明し、異種遺伝子の効果的発現を達成し
てｍＣ２６遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝
子発現制御実験モデル動物を創造し、さらに、所望の物
質を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とす
るトランスジェニック技術を確立すべく研究を行った。
即ち、本発明の目的は、ｍＣ２６の構造遺伝子およびそ
の発現に関与する周辺の制御領域を含むゲノミックＤＮ
Ａを用いて、大腸菌その他の宿主中で増幅するための組
換え発現ベクターを作製し、そして該ベクターを利用し
てｍＣ２６遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝
子発現制御実験モデル動物を創造し、そして所望の物質
を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とする
トランスジェニック技術を提供することである。
Ｃ２６の発現系、特に転写エンハンサー／プロモーター
領域の機能を解明し、異種遺伝子の効果的発現を達成し
てｍＣ２６遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝
子発現制御実験モデル動物を創造し、さらに、所望の物
質を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とす
るトランスジェニック技術を確立すべく研究を行った。
即ち、本発明の目的は、ｍＣ２６の構造遺伝子およびそ
の発現に関与する周辺の制御領域を含むゲノミックＤＮ
Ａを用いて、大腸菌その他の宿主中で増幅するための組
換え発現ベクターを作製し、そして該ベクターを利用し
てｍＣ２６遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝
子発現制御実験モデル動物を創造し、そして所望の物質
を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とする
トランスジェニック技術を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、ｍＣ２６の構造遺伝子およびその周
辺の発現制御領域、特に５’上流領域に位置するエンハ
ンサー／プロモーター領域を含む、ゲノミックＤＮＡの
塩基配列を決定し、該ＤＮＡを含む組換え発現ベクター
を作製した。そして該ベクターを利用してｍＣ２６遺伝
子の発現制御領域が動物細胞中で発現制御されることを
確認しさらに、該ベクターを導入した動物の乳腺におい
て所望の外来異種遺伝子が導入され、かつ、該遺伝子産
物が発現されることを確認して本発明を完成するに至っ
た。
を解決するために、ｍＣ２６の構造遺伝子およびその周
辺の発現制御領域、特に５’上流領域に位置するエンハ
ンサー／プロモーター領域を含む、ゲノミックＤＮＡの
塩基配列を決定し、該ＤＮＡを含む組換え発現ベクター
を作製した。そして該ベクターを利用してｍＣ２６遺伝
子の発現制御領域が動物細胞中で発現制御されることを
確認しさらに、該ベクターを導入した動物の乳腺におい
て所望の外来異種遺伝子が導入され、かつ、該遺伝子産
物が発現されることを確認して本発明を完成するに至っ
た。
【００１１】本発明によれば、以下に示すＤＮＡ： （ｉ）図４に示す２３０４ｂｐのｍＣ２６遺伝子の５’
上流発現制御領域； （ｉｉ）図５に示す２３２０ｂｐのｍＣ２６構造遺伝子
部分；および （ｉｉｉ）図６に示す７７０ｂｐのｍＣ２６遺伝子の
３’下流発現制御領域；を転写方向に順番に含む発現カ
セットとしてのＤＮＡが提供される。
上流発現制御領域； （ｉｉ）図５に示す２３２０ｂｐのｍＣ２６構造遺伝子
部分；および （ｉｉｉ）図６に示す７７０ｂｐのｍＣ２６遺伝子の
３’下流発現制御領域；を転写方向に順番に含む発現カ
セットとしてのＤＮＡが提供される。
【００１２】本発明の一つの態様として、上記（ｉｉ）
の全部または一部を外来異種遺伝子に置換するか、また
は（ｉｉ）のいずれか１カ所に外来異種遺伝子を挿入し
た発現カセットが提供される。そのような異種遺伝子
は、特に限定されない。上記発現カセットの作製におい
ては、
の全部または一部を外来異種遺伝子に置換するか、また
は（ｉｉ）のいずれか１カ所に外来異種遺伝子を挿入し
た発現カセットが提供される。そのような異種遺伝子
は、特に限定されない。上記発現カセットの作製におい
ては、
【００１３】（１）図５中の第１エクソン（配列番号１
中、第２３０５ヌクレオチド〜第２４１８ヌクレオチ
ド）を含ませることにより、下流に連結された異種遺伝
子蛋白質を細胞外に分泌させるためのシグナル配列を付
加すること、および（２）図５中の第２エクソン（配列
番号１中、第３１４５ヌクレオチド〜第３１８８ヌクレ
オチド）、第３エクソン（配列番号１中、第３９２８ヌ
クレオチド〜第４１４３ヌクレオチド）、および第４エ
クソン（配列番号１中、第４３７２ヌクレオチド〜第４
６２４ヌクレオチド）を分断または削除して、スプライ
シングに関与すると考えられる第１イントロン（配列番
号１中、第２４１９ヌクレオチド〜第３１４４ヌクレオ
チド）、第２イントロン（配列番号１中、第３１８９ヌ
クレオチド〜第３９２７ヌクレオチド）、および第３イ
ントロン（配列番号１中、第４１４４ヌクレオチド〜第
４３７１ヌクレオチド）を全てまたは一部連結した形で
含ませることにより、発現の効率をさらに増加させるこ
と；等が好ましいが、異種遺伝子産物の分泌効率、異種
遺伝子の種類、および組換えＤＮＡの連結の容易性等を
考慮して、各々の場合において、これらのファクターを
適宜選択することが好ましい。
中、第２３０５ヌクレオチド〜第２４１８ヌクレオチ
ド）を含ませることにより、下流に連結された異種遺伝
子蛋白質を細胞外に分泌させるためのシグナル配列を付
加すること、および（２）図５中の第２エクソン（配列
番号１中、第３１４５ヌクレオチド〜第３１８８ヌクレ
オチド）、第３エクソン（配列番号１中、第３９２８ヌ
クレオチド〜第４１４３ヌクレオチド）、および第４エ
クソン（配列番号１中、第４３７２ヌクレオチド〜第４
６２４ヌクレオチド）を分断または削除して、スプライ
シングに関与すると考えられる第１イントロン（配列番
号１中、第２４１９ヌクレオチド〜第３１４４ヌクレオ
チド）、第２イントロン（配列番号１中、第３１８９ヌ
クレオチド〜第３９２７ヌクレオチド）、および第３イ
ントロン（配列番号１中、第４１４４ヌクレオチド〜第
４３７１ヌクレオチド）を全てまたは一部連結した形で
含ませることにより、発現の効率をさらに増加させるこ
と；等が好ましいが、異種遺伝子産物の分泌効率、異種
遺伝子の種類、および組換えＤＮＡの連結の容易性等を
考慮して、各々の場合において、これらのファクターを
適宜選択することが好ましい。
【００１４】本発明は、さらに、上記発現カセットを含
む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを哺乳動物の
胚細胞に導入することからなる、トランスジェニック動
物の生産方法に関する。該生産方法において、上記
（ｉ）および（ｉｉｉ）の領域に代えて、（ｉ）のさら
に５’上流領域、および（ｉｉｉ）のさらに３’下流領
域を含むＤＮＡ断片も使用することができる。例えば、
図１中の約１２．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、または図２
中の約６．７ｋｂのＥＣｏＲＩ断片を用いることができ
る。
む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを哺乳動物の
胚細胞に導入することからなる、トランスジェニック動
物の生産方法に関する。該生産方法において、上記
（ｉ）および（ｉｉｉ）の領域に代えて、（ｉ）のさら
に５’上流領域、および（ｉｉｉ）のさらに３’下流領
域を含むＤＮＡ断片も使用することができる。例えば、
図１中の約１２．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、または図２
中の約６．７ｋｂのＥＣｏＲＩ断片を用いることができ
る。
【００１５】本発明の別の側面においては、図４または
図６に示す配列を有するＤＮＡ断片の全てまたは一部
を、それぞれ、従来公知のあらゆる遺伝子を発現するた
めの発現制御領域として用いうることは、当業者であれ
ば認識されるであろう。
図６に示す配列を有するＤＮＡ断片の全てまたは一部
を、それぞれ、従来公知のあらゆる遺伝子を発現するた
めの発現制御領域として用いうることは、当業者であれ
ば認識されるであろう。
【００１６】本発明書において使用されるベクターなる
用語は、プラスミド由来のもの、バクテリオファージ由
来のものを含むように意図するものとして使用され、本
発明においては大腸菌由来のものが好ましく、特にλフ
ァージが好ましいが、これらに限定されない。
用語は、プラスミド由来のもの、バクテリオファージ由
来のものを含むように意図するものとして使用され、本
発明においては大腸菌由来のものが好ましく、特にλフ
ァージが好ましいが、これらに限定されない。
【００１７】本発明において、「ＥｃｏＲＩ断片」なる
記載は、両末端がＥｃｏＲＩ認識配列であるＤＮＡ断片
を意味し、また、「ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片」
なる記載は、一方の末端がＥｃｏＲＩ認識配列であり他
方の末端がＨｉｎｄＩＩＩ認識配列であるＤＮＡ断片を
意味する。他の制限酵素による同様の表記も、同等の意
味をなすものとして用いられる。
記載は、両末端がＥｃｏＲＩ認識配列であるＤＮＡ断片
を意味し、また、「ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片」
なる記載は、一方の末端がＥｃｏＲＩ認識配列であり他
方の末端がＨｉｎｄＩＩＩ認識配列であるＤＮＡ断片を
意味する。他の制限酵素による同様の表記も、同等の意
味をなすものとして用いられる。
【００１８】本明細書において使用されるＤＮＡ断片の
大きさの表示に関して、下一桁までを明記してある配列
を除き、０．１ｋｂ単位にて表示されている配列は、電
気泳動によるおおよそのサイズを示す。従って、実際の
ヌクレオチド数と表示塩基対（ｂｐ）数には多少の誤差
があることは、当業者には認識されるであろう。ｍＣ２
６遺伝子の５’上流発現制御領域（図４）および３’下
流発現制御領域（図６）のヌクレオチド配列は一部公表
されているが［ドーベンコ（Ｄｏｗｂｅｎｋｏ）ら、上
記文献］、本発明において初めて明らかにされた配列を
含む上記領域が異種遺伝子の大量発現に必須であること
が明らかとなった。
大きさの表示に関して、下一桁までを明記してある配列
を除き、０．１ｋｂ単位にて表示されている配列は、電
気泳動によるおおよそのサイズを示す。従って、実際の
ヌクレオチド数と表示塩基対（ｂｐ）数には多少の誤差
があることは、当業者には認識されるであろう。ｍＣ２
６遺伝子の５’上流発現制御領域（図４）および３’下
流発現制御領域（図６）のヌクレオチド配列は一部公表
されているが［ドーベンコ（Ｄｏｗｂｅｎｋｏ）ら、上
記文献］、本発明において初めて明らかにされた配列を
含む上記領域が異種遺伝子の大量発現に必須であること
が明らかとなった。
【００１９】以下のの記載において、当業界において常
法として用いられる組換えＤＮＡ技術は、特筆しない限
り以下の文献：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッシュ（Ｆｒ
ｉｓｔｃｈ）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）著、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）；Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、デービス（Ｄａｖ
ｉｓ）、ディブナー（Ｄｉｂｎｅｒ）、バッテイ（Ｂａ
ｔｔｅｙ）著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＮｅＷ Ｙｏｒｋ
（１９８６）；等に記載されている技術を使用して実施
することが可能である。 （１）ＤＮＡ断片の調製
法として用いられる組換えＤＮＡ技術は、特筆しない限
り以下の文献：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッシュ（Ｆｒ
ｉｓｔｃｈ）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）著、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）；Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、デービス（Ｄａｖ
ｉｓ）、ディブナー（Ｄｉｂｎｅｒ）、バッテイ（Ｂａ
ｔｔｅｙ）著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＮｅＷ Ｙｏｒｋ
（１９８６）；等に記載されている技術を使用して実施
することが可能である。 （１）ＤＮＡ断片の調製
【００２０】本発明のｍＣ２６構造遺伝子（図５）、該
構造遺伝子の５’上流発現制御領域（図４）、および該
構造遺伝子の３’下流発現制御領域（図６）各々のＤＮ
Ａ断片は一緒にあるいは別々に、公知の方法を利用して
マウスゲノミックＤＮＡライブラリーから取得すること
ができる。本発明では、従来のオリゴマープローブを用
いる方法、またはメッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡプ
ローブを作製して用いる２種類の方法［オリゴ（ｄＴ）
プライマー法およびランダムプライマー法］に加えて、
ｍＲＮＡを直接プローブとする方法を好ましい方法とし
て記載するが、これらの方法に限定されない。 （ｉ）オリゴマーＤＮＡプローブによる方法 オリゴマーＤＮＡプローブ法に用いるプローブは２０塩
基前後またはそれ以上の長さであり、かつ、染色体ＤＮ
Ａ中に高頻度に反復する配列を含まないことが好まし
い。例えば、ｍＣ２６遺伝子の第１エクソン中の配列： の内の少なくとも一つを用いることが好ましいが、これ
らに限定されない。合成ＤＮＡの標識法は特に限定され
ないが放射性標識による方法が一般的である。標識プロ
ーブを用いてマウスゲノミックＤＮＡライブラリーから
ハイブリダイゼーションによりｍＣ２６遺伝子ＤＮＡを
取得する方法は、公知の方法を用いることができる［Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、サムブルックら、
前記］。ヒトあるいはマウスなどのゲノミックＤＮＡラ
イブラリーは市販品を利用できる。
構造遺伝子の５’上流発現制御領域（図４）、および該
構造遺伝子の３’下流発現制御領域（図６）各々のＤＮ
Ａ断片は一緒にあるいは別々に、公知の方法を利用して
マウスゲノミックＤＮＡライブラリーから取得すること
ができる。本発明では、従来のオリゴマープローブを用
いる方法、またはメッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡプ
ローブを作製して用いる２種類の方法［オリゴ（ｄＴ）
プライマー法およびランダムプライマー法］に加えて、
ｍＲＮＡを直接プローブとする方法を好ましい方法とし
て記載するが、これらの方法に限定されない。 （ｉ）オリゴマーＤＮＡプローブによる方法 オリゴマーＤＮＡプローブ法に用いるプローブは２０塩
基前後またはそれ以上の長さであり、かつ、染色体ＤＮ
Ａ中に高頻度に反復する配列を含まないことが好まし
い。例えば、ｍＣ２６遺伝子の第１エクソン中の配列： の内の少なくとも一つを用いることが好ましいが、これ
らに限定されない。合成ＤＮＡの標識法は特に限定され
ないが放射性標識による方法が一般的である。標識プロ
ーブを用いてマウスゲノミックＤＮＡライブラリーから
ハイブリダイゼーションによりｍＣ２６遺伝子ＤＮＡを
取得する方法は、公知の方法を用いることができる［Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、サムブルックら、
前記］。ヒトあるいはマウスなどのゲノミックＤＮＡラ
イブラリーは市販品を利用できる。
【００２１】マウス以外の動物種のｍＣ２６に相当する
遺伝子を得る場合は、種間の塩基配列の変異を考慮する
必要がある。即ち、ハイブリダイゼーションにおける温
度または反応溶液の組成を変更することにより選択度を
下げることが望ましい。別法としては、コドンの縮重を
考慮することが好ましい。上記は全て市販の試薬および
機械・装置を利用して、常法に従って実施することがで
きる。 （ｉｉ）メッセンジャーＲＮＡ法
遺伝子を得る場合は、種間の塩基配列の変異を考慮する
必要がある。即ち、ハイブリダイゼーションにおける温
度または反応溶液の組成を変更することにより選択度を
下げることが望ましい。別法としては、コドンの縮重を
考慮することが好ましい。上記は全て市販の試薬および
機械・装置を利用して、常法に従って実施することがで
きる。 （ｉｉ）メッセンジャーＲＮＡ法
【００２２】メッセンジャーＲＮＡ法に用いるｍＲＮＡ
は常法に従って単離する。使用する動物は限定されない
が、ヒト、ヤギおよびマウスが好ましく、そして組織は
特に限定されないが泌乳最盛期の乳腺が好ましい。通
常、ｍＲＮＡからｃＤＮＡプローブを作製する際のプラ
イマーは、オリゴｄＴプライマーおよびランダム（ヘキ
サマー）プライマーが用いられ、共に市販品を利用する
ことができる。そして、これらプライマーを常法に従っ
て標識する。これら２種類のプライマーを用いて調製さ
れたｃＤＮＡプローブに加えて、さらにｍＲＮＡのキャ
ップ構造部分を標識したプローブ、即ち、キャップラベ
ル・プローブを作製してスクリーニングに使用すること
ができる。該プローブの標識は市販の放射標識キャップ
類縁体、およびグアニリル・トランスフェラーゼ（例え
ば、ベセスダリサーチ社）などを利用して使用説明書に
従って実施することができる。
は常法に従って単離する。使用する動物は限定されない
が、ヒト、ヤギおよびマウスが好ましく、そして組織は
特に限定されないが泌乳最盛期の乳腺が好ましい。通
常、ｍＲＮＡからｃＤＮＡプローブを作製する際のプラ
イマーは、オリゴｄＴプライマーおよびランダム（ヘキ
サマー）プライマーが用いられ、共に市販品を利用する
ことができる。そして、これらプライマーを常法に従っ
て標識する。これら２種類のプライマーを用いて調製さ
れたｃＤＮＡプローブに加えて、さらにｍＲＮＡのキャ
ップ構造部分を標識したプローブ、即ち、キャップラベ
ル・プローブを作製してスクリーニングに使用すること
ができる。該プローブの標識は市販の放射標識キャップ
類縁体、およびグアニリル・トランスフェラーゼ（例え
ば、ベセスダリサーチ社）などを利用して使用説明書に
従って実施することができる。
【００２３】上記ｃＤＮＡプローブによるスクリーニン
グは常法を用いることが可能であるが、エクソンが数十
ｂｐ程度の長さしかない遺伝子が多数報告されているこ
とを考慮して、プローブの全長は長い方が良いとは限ら
ず、比較的長いプローブ（約５００ｂｐ）と比較的短い
プローブ（約３０ｂｐ）に分けて結果を比較することが
好ましい。
グは常法を用いることが可能であるが、エクソンが数十
ｂｐ程度の長さしかない遺伝子が多数報告されているこ
とを考慮して、プローブの全長は長い方が良いとは限ら
ず、比較的長いプローブ（約５００ｂｐ）と比較的短い
プローブ（約３０ｂｐ）に分けて結果を比較することが
好ましい。
【００２４】ゲノミックＤＮＡライブラリーの作製に用
いる動物は哺乳類が好ましく、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサ
ギ、ラットおよびマウスが特に好ましい。ヒトおよびマ
ウス等では市販品ゲノミックＤＮＡライブラリーも利用
することができる。使用する組織は特に限定されないが
肝臓が好ましい。次に、このＤＮＡを制限酵素で完全ま
たは部分消化することにより１５〜２０ｋｂｐのＤＮＡ
断片を分画する。制限酵素は特に限定されないがＥｃｏ
ＲＩが好ましい。染色体ＤＮＡの抽出、制限酵素分解お
よび超遠心分画は、常法により行うことができ、ライブ
ラリー作製に用いるベクターは、プラスミド、バクテリ
オファージ、コスミッドの何れを用いてもよいが、λフ
ァージが特に好ましく、市販品を利用できる。
いる動物は哺乳類が好ましく、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサ
ギ、ラットおよびマウスが特に好ましい。ヒトおよびマ
ウス等では市販品ゲノミックＤＮＡライブラリーも利用
することができる。使用する組織は特に限定されないが
肝臓が好ましい。次に、このＤＮＡを制限酵素で完全ま
たは部分消化することにより１５〜２０ｋｂｐのＤＮＡ
断片を分画する。制限酵素は特に限定されないがＥｃｏ
ＲＩが好ましい。染色体ＤＮＡの抽出、制限酵素分解お
よび超遠心分画は、常法により行うことができ、ライブ
ラリー作製に用いるベクターは、プラスミド、バクテリ
オファージ、コスミッドの何れを用いてもよいが、λフ
ァージが特に好ましく、市販品を利用できる。
【００２５】比活性の低いプローブを用いる場合、およ
び／またはシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が低い場合
は、コロニーの形成またはファージプラークの形成にあ
たり、高濃度にカザミノ酸を含有するスーパーブロス
等、高栄養価の培地を用いる。宿主として大腸菌を用い
る場合はＬＥ３９２またはＪＭ系の菌株が好ましい。ハ
イブリダイゼーションに用いるフィルターは特に限定さ
れないが、ニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ社製Ｂ
Ａ８５など）が好ましい。
び／またはシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が低い場合
は、コロニーの形成またはファージプラークの形成にあ
たり、高濃度にカザミノ酸を含有するスーパーブロス
等、高栄養価の培地を用いる。宿主として大腸菌を用い
る場合はＬＥ３９２またはＪＭ系の菌株が好ましい。ハ
イブリダイゼーションに用いるフィルターは特に限定さ
れないが、ニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ社製Ｂ
Ａ８５など）が好ましい。
【００２６】挿入されるべきＤＮＡのサイズによっては
ベクターが不安定になるために、期待される信号強度が
得られない場合がある。このような場合は、１枚のプレ
ートから３枚のフィルターにブロットし、プラークを選
別する際、各スポットの信号強度を強度、中度、弱度の
３段階にクラス分けすることが好ましい。
ベクターが不安定になるために、期待される信号強度が
得られない場合がある。このような場合は、１枚のプレ
ートから３枚のフィルターにブロットし、プラークを選
別する際、各スポットの信号強度を強度、中度、弱度の
３段階にクラス分けすることが好ましい。
【００２７】得られたクローン遺伝子が乳腺で組織特異
的に発現することを確認するためには、乳腺以外の組
織、例えば肝臓から上記操作により作製されたプローブ
を対照とする。
的に発現することを確認するためには、乳腺以外の組
織、例えば肝臓から上記操作により作製されたプローブ
を対照とする。
【００２８】また、得られたクローン遺伝子が、乳腺中
で、しかも時期特異的に発現することを確認するために
は、泌乳期以外の乳腺、例えば、未経産成熟動物の乳腺
から上記操作により作製されたプローブを対照とする。
以上の操作によって得られる乳腺特異的に発現する遺伝
子クローン群中には、動物種により差異があるが、一般
に、α、β、γ、δ、εなどのカゼイン蛋白質遺伝子群
［特開昭６３−３０９１９２］、ＷＡＰ、αラクトアル
ブミン、βラクトグロブリン［特開平３−５０５６７
４］などのホェー蛋白質遺伝子群［特開昭６３−２９
１］などの複数の既知のミルク蛋白遺伝子が存在する。
これらは、ノーザン・ハイブリダイゼーションによるほ
か、それぞれの遺伝子のヌクレオチド配列を参考にして
作製したオリゴマーＤＮＡプローブを用い、常法を用い
てハイブリダイゼーションを行うことにより判別するこ
とができる。あるいは、それぞれのクローンＤＮＡの一
部の塩基配列を決定することによっても判別できる。特
に、βカゼインのｍＲＮＡの大きさはｍＣ２６蛋白質遺
伝子のｍＲＮＡの大きさに近いので、塩基配列決定によ
り確認することが好ましい。 （２）構造遺伝子の決定
で、しかも時期特異的に発現することを確認するために
は、泌乳期以外の乳腺、例えば、未経産成熟動物の乳腺
から上記操作により作製されたプローブを対照とする。
以上の操作によって得られる乳腺特異的に発現する遺伝
子クローン群中には、動物種により差異があるが、一般
に、α、β、γ、δ、εなどのカゼイン蛋白質遺伝子群
［特開昭６３−３０９１９２］、ＷＡＰ、αラクトアル
ブミン、βラクトグロブリン［特開平３−５０５６７
４］などのホェー蛋白質遺伝子群［特開昭６３−２９
１］などの複数の既知のミルク蛋白遺伝子が存在する。
これらは、ノーザン・ハイブリダイゼーションによるほ
か、それぞれの遺伝子のヌクレオチド配列を参考にして
作製したオリゴマーＤＮＡプローブを用い、常法を用い
てハイブリダイゼーションを行うことにより判別するこ
とができる。あるいは、それぞれのクローンＤＮＡの一
部の塩基配列を決定することによっても判別できる。特
に、βカゼインのｍＲＮＡの大きさはｍＣ２６蛋白質遺
伝子のｍＲＮＡの大きさに近いので、塩基配列決定によ
り確認することが好ましい。 （２）構造遺伝子の決定
【００２９】得られたｍＣ２６蛋白質遺伝子の発現制御
領域と構造遺伝子部分を決定するためには、以下の方法
により実施することができる。得られたクローンＤＮＡ
を各種の制限酵素により、それぞれ完全消化あるいは部
分消化することにより、制限酵素マップを作製する。こ
のとき、それぞれの分解産物を各々３等分し、３枚のゲ
ルに同時に電気泳動した後、それぞれのゲル中の断片を
計３枚のフィルターにサザーン・トランスファーする。
クローンのスクリーニングに用いた３種のプローブの各
々を上記の３枚のフィルターのうちの一枚にそれぞれ反
応させ、サザーン・ハイブリダイゼーションを行う。こ
れにより、構造遺伝子部分のうち、５’末端、中間のエ
クソン、３’末端を含む断片がそれぞれ決定できる。以
上は常法および本発明に記載された方法を用いて行うこ
とができる。
領域と構造遺伝子部分を決定するためには、以下の方法
により実施することができる。得られたクローンＤＮＡ
を各種の制限酵素により、それぞれ完全消化あるいは部
分消化することにより、制限酵素マップを作製する。こ
のとき、それぞれの分解産物を各々３等分し、３枚のゲ
ルに同時に電気泳動した後、それぞれのゲル中の断片を
計３枚のフィルターにサザーン・トランスファーする。
クローンのスクリーニングに用いた３種のプローブの各
々を上記の３枚のフィルターのうちの一枚にそれぞれ反
応させ、サザーン・ハイブリダイゼーションを行う。こ
れにより、構造遺伝子部分のうち、５’末端、中間のエ
クソン、３’末端を含む断片がそれぞれ決定できる。以
上は常法および本発明に記載された方法を用いて行うこ
とができる。
【００３０】次に、それぞれの制限酵素による消化断片
ＤＮＡと乳腺から抽出して精製したｍＲＮＡあるいは市
販されている発現ベクター、例えばｐＢｌｕｅＳｃｒｉ
ｐｔＩＩ（プロメガ社）のプロモーターを利用して作製
したリボプローブとを用いて、Ｓ１マッピング法によ
り、５’末端、中間のエクソン、３’末端の正確な位置
をそれぞれ決定することが可能である。正確を期するた
めに、必要に応じてプライマーエクステンション法また
はＰＣＲ法を併用する。
ＤＮＡと乳腺から抽出して精製したｍＲＮＡあるいは市
販されている発現ベクター、例えばｐＢｌｕｅＳｃｒｉ
ｐｔＩＩ（プロメガ社）のプロモーターを利用して作製
したリボプローブとを用いて、Ｓ１マッピング法によ
り、５’末端、中間のエクソン、３’末端の正確な位置
をそれぞれ決定することが可能である。正確を期するた
めに、必要に応じてプライマーエクステンション法また
はＰＣＲ法を併用する。
【００３１】以上により決定した構造遺伝子の位置に基
づき、常法により染色体ＤＮＡの塩基配列を決定する。
この結果得られた情報に基づき、該塩基配列の一部を含
むオリゴマーＤＮＡを合成し、これをプライマーとして
プライマーエクステンション法またはＰＣＲ法を行うこ
とにより、遺伝子の構造を再度確認する。配列番号１
は、マウスｍＣ２６蛋白質遺伝子の全構造遺伝子とその
５’上流域および３’下流域に位置する制御領域ＤＮＡ
を含むＥｃｏＲＩ認識部位からＨｉｎｄＩＩＩ認識部位
までの５３９４ｂｐの塩基配列を示す（図４、図５およ
び図６をこの順序で連結したものが配列番号１に相当す
る）。
づき、常法により染色体ＤＮＡの塩基配列を決定する。
この結果得られた情報に基づき、該塩基配列の一部を含
むオリゴマーＤＮＡを合成し、これをプライマーとして
プライマーエクステンション法またはＰＣＲ法を行うこ
とにより、遺伝子の構造を再度確認する。配列番号１
は、マウスｍＣ２６蛋白質遺伝子の全構造遺伝子とその
５’上流域および３’下流域に位置する制御領域ＤＮＡ
を含むＥｃｏＲＩ認識部位からＨｉｎｄＩＩＩ認識部位
までの５３９４ｂｐの塩基配列を示す（図４、図５およ
び図６をこの順序で連結したものが配列番号１に相当す
る）。
【００３２】（３）発現ベクターの構築 最初に、上記方法に従って調製されたｍＣ２６構造遺伝
子を含むＥＣｏＲＩ断片を、適当なベクターのＥＣｏＲ
Ｉ切断部位に挿入し、該ベクターの宿主内でＤＮＡを増
幅した後回収する。用いるベクターは特に限定されな
い。図５に示すとおり、ｍＣ２６構造遺伝子は第１ない
し第４エクソンおよび第１ないし第３イントロンからな
る。第１エクソンは蛋白質の分泌に関与し、各イントロ
ンはスプライシングに関与することが予測されるので、
異種遺伝子の種類あるいは組換えＤＮＡの作製容易性等
を考慮して、適宜、これらの領域を分断、除去あるいは
残して異種遺伝子をｍＣ２６構造遺伝子部分のいずれか
に挿入することが好ましい。
子を含むＥＣｏＲＩ断片を、適当なベクターのＥＣｏＲ
Ｉ切断部位に挿入し、該ベクターの宿主内でＤＮＡを増
幅した後回収する。用いるベクターは特に限定されな
い。図５に示すとおり、ｍＣ２６構造遺伝子は第１ない
し第４エクソンおよび第１ないし第３イントロンからな
る。第１エクソンは蛋白質の分泌に関与し、各イントロ
ンはスプライシングに関与することが予測されるので、
異種遺伝子の種類あるいは組換えＤＮＡの作製容易性等
を考慮して、適宜、これらの領域を分断、除去あるいは
残して異種遺伝子をｍＣ２６構造遺伝子部分のいずれか
に挿入することが好ましい。
【００３３】以下において、ｍＣ２６構造遺伝子部分を
全てまたは一部除去するための方法：簡易な発現ベクタ
ー構築法（構築法Ａ）；およびｍＣ２６構造遺伝子の転
写開始点または第１エクソンから転写終結点までを正確
に除去するための方法（構築法Ｂ）；を例示するが、こ
れらの方法に限定されない。
全てまたは一部除去するための方法：簡易な発現ベクタ
ー構築法（構築法Ａ）；およびｍＣ２６構造遺伝子の転
写開始点または第１エクソンから転写終結点までを正確
に除去するための方法（構築法Ｂ）；を例示するが、こ
れらの方法に限定されない。
【００３４】構築法Ａ （ｉ）制限酵素断片の作製 ｍＣ２６遺伝子の転写開始点あるいは第１エクソンの終
端を切断する制限酵素（酵素Ａ１とする。以下同様）な
らびに転写終結点の近傍を切断する制限酵素（酵素Ａ
２）により、上記の増幅したＤＮＡを切断する。一方、
乳腺中で生産することを希望する遺伝子を含むインサー
トＤＮＡ断片を同様の方法で調製する（酵素Ａ３および
酵素Ａ４）。
端を切断する制限酵素（酵素Ａ１とする。以下同様）な
らびに転写終結点の近傍を切断する制限酵素（酵素Ａ
２）により、上記の増幅したＤＮＡを切断する。一方、
乳腺中で生産することを希望する遺伝子を含むインサー
トＤＮＡ断片を同様の方法で調製する（酵素Ａ３および
酵素Ａ４）。
【００３５】酵素Ａ１およびＡ３、および酵素Ａ２およ
びＡ４がそれぞれ同一で、かつ、生じた断片の末端が平
滑末端でない場合は、常法によりベクターおよびインサ
ートの２つのＤＮＡ断片をそのまま連結でき、ＤＮＡリ
ガーゼにより１つの環状ＤＮＡとして回収できる。
びＡ４がそれぞれ同一で、かつ、生じた断片の末端が平
滑末端でない場合は、常法によりベクターおよびインサ
ートの２つのＤＮＡ断片をそのまま連結でき、ＤＮＡリ
ガーゼにより１つの環状ＤＮＡとして回収できる。
【００３６】酵素Ａ１−Ａ２、Ａ３およびＡ４のそれぞ
れが相異なる場合および生じた断片の末端が平滑末端で
ある場合は、ベクターおよびインサートの２つの断片を
適切に結合するために、後述する合成リンカー法または
ブラントエンド法の２つの方法のいずれかを利用する。
れが相異なる場合および生じた断片の末端が平滑末端で
ある場合は、ベクターおよびインサートの２つの断片を
適切に結合するために、後述する合成リンカー法または
ブラントエンド法の２つの方法のいずれかを利用する。
【００３７】（ｉｉ）使用に適する制限酵素 上記（ｉ）で使用するのに適する制限酵素の例を下記に
示すが、これらに限定されない。 酵素Ａ１（ｍＣ２６遺伝子の転写開始点の５’末端ある
いは第１エクソンの終端の近傍を切断する酵素） 第１群 ＧｓｕＩ，ＢｓｍＩ，ＡｐｙＩ，ＥｃｏＲＩ
Ｉ，ＢｓｔＮＩ，ＭｖａＩ，ＳｃｒＦＩ，ＢｓａＪＩ； 第２群 ＡｌｕＩ； 第３群 ＢｓｒＩ，ＸｍｎＩ，ＭｂｏＩＩ； 第４群 ＡｐｙＩ，ＥｓｏＲＩＩ，ＢｓｔＮＩ，Ｍｖａ
Ｉ，ＳｃｒＦＩ； 第５群 ＡＩｗ４４Ｉ，ＡｐａＬＩ，Ｂｓｐ１２８６
Ｉ，ＳｄｕＩ，ＨｇｉＡＩ，ＤｄｅＩ，ＢｓｍＡＩ； 酵素Ａ２（ｍＣ２６遺伝子の転写終結点の３’末端の近
傍を切断する酵素） 第１群 ＤｄｅＩ，ＢＳＩＩ； 第２群 ＢｃｎＩ，ＣａｕＩＩ，ＮｃｉＩ，ＳｃｒＦ
Ｉ； 第３群 ＢｓａＪＩ，ＢｃｎＩ，ＣａｕＩＩ，Ｎｓｉ
Ｉ，ＳｓｒＦＩ； 第４群 ＸｂａＩ；
示すが、これらに限定されない。 酵素Ａ１（ｍＣ２６遺伝子の転写開始点の５’末端ある
いは第１エクソンの終端の近傍を切断する酵素） 第１群 ＧｓｕＩ，ＢｓｍＩ，ＡｐｙＩ，ＥｃｏＲＩ
Ｉ，ＢｓｔＮＩ，ＭｖａＩ，ＳｃｒＦＩ，ＢｓａＪＩ； 第２群 ＡｌｕＩ； 第３群 ＢｓｒＩ，ＸｍｎＩ，ＭｂｏＩＩ； 第４群 ＡｐｙＩ，ＥｓｏＲＩＩ，ＢｓｔＮＩ，Ｍｖａ
Ｉ，ＳｃｒＦＩ； 第５群 ＡＩｗ４４Ｉ，ＡｐａＬＩ，Ｂｓｐ１２８６
Ｉ，ＳｄｕＩ，ＨｇｉＡＩ，ＤｄｅＩ，ＢｓｍＡＩ； 酵素Ａ２（ｍＣ２６遺伝子の転写終結点の３’末端の近
傍を切断する酵素） 第１群 ＤｄｅＩ，ＢＳＩＩ； 第２群 ＢｃｎＩ，ＣａｕＩＩ，ＮｃｉＩ，ＳｃｒＦ
Ｉ； 第３群 ＢｓａＪＩ，ＢｃｎＩ，ＣａｕＩＩ，Ｎｓｉ
Ｉ，ＳｓｒＦＩ； 第４群 ＸｂａＩ；
【００３８】（ｉｉｉ）合成リンカー法 ベクターＤＮＡおよびインサートＤＮＡの両断片中に存
在する制限酵素認識部位等を考慮の上、双方のＤＮＡの
末端が互いに粘着性末端となるべく設計した合成ＤＮＡ
すなわちリンカーＤＮＡを両ＤＮＡ断片にそれぞれ共有
結合により連結する。
在する制限酵素認識部位等を考慮の上、双方のＤＮＡの
末端が互いに粘着性末端となるべく設計した合成ＤＮＡ
すなわちリンカーＤＮＡを両ＤＮＡ断片にそれぞれ共有
結合により連結する。
【００３９】実際に使用されるリンカーＤＮＡの配列お
よび共有結合反応の方法の詳細は、挿入しようとする遺
伝子の塩基配列によりそれぞれ異なるが、多くの場合は
市販品を利用でき、また、希望する配列のリンカーＤＮ
Ａを設計し、常法により合成することができる。
よび共有結合反応の方法の詳細は、挿入しようとする遺
伝子の塩基配列によりそれぞれ異なるが、多くの場合は
市販品を利用でき、また、希望する配列のリンカーＤＮ
Ａを設計し、常法により合成することができる。
【００４０】この結果得られたＤＮＡ断片をＤＮＡリガ
ーゼにより連結する。この粘着性末端の結合によって生
じる二本鎖ＤＮＡ部分が、制限酵素の認識部位となるよ
うに塩基配列を選ぶことにより、同部位をふたたび制限
酵素で正確に切断されるように設計することも可能であ
る。以上は全て常法により行うことができる。
ーゼにより連結する。この粘着性末端の結合によって生
じる二本鎖ＤＮＡ部分が、制限酵素の認識部位となるよ
うに塩基配列を選ぶことにより、同部位をふたたび制限
酵素で正確に切断されるように設計することも可能であ
る。以上は全て常法により行うことができる。
【００４１】（ｉｖ）ブラントエンド法 インサートＤＮＡの制限酵素切断部位が平滑末端である
か、または５’末端あるいは３’末端突出型の切断端で
ありかつその形状がそのままベクターＤＮＡ側の切断端
に直接結合できない場合は、突出した一本鎖部分を酵素
処理により除去する。用いる酵素は一本鎖ＤＮＡを特異
的に切断する酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼよびＰ１ヌ
クレアーゼなどを利用することができ、別法としては、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて突出一本鎖部分の
相補鎖を合成することも可能である。この後、ＤＮＡリ
ガーゼを用いて平滑端同士を結合することができる。Ｄ
ＮＡリガーゼはＴ４バクテリオファージ由来のリガーゼ
が広く用いられている。以上は常法により行うことがで
き、上記酵素等は市販されているものを使用することが
できる。
か、または５’末端あるいは３’末端突出型の切断端で
ありかつその形状がそのままベクターＤＮＡ側の切断端
に直接結合できない場合は、突出した一本鎖部分を酵素
処理により除去する。用いる酵素は一本鎖ＤＮＡを特異
的に切断する酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼよびＰ１ヌ
クレアーゼなどを利用することができ、別法としては、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて突出一本鎖部分の
相補鎖を合成することも可能である。この後、ＤＮＡリ
ガーゼを用いて平滑端同士を結合することができる。Ｄ
ＮＡリガーゼはＴ４バクテリオファージ由来のリガーゼ
が広く用いられている。以上は常法により行うことがで
き、上記酵素等は市販されているものを使用することが
できる。
【００４２】構築法Ｂ ｍＣ２６遺伝子の構造遺伝子部分を転写開始点から転写
終結点まで、あるいは、第１エクソンの終端から転写終
結点までを正確に切断、除去し、所望の遺伝子のＤＮＡ
をインサート断片として挿入する方法を記載する。上記
Ａ法で記載した方法により調製したｍＣ２６遺伝子ベク
ターＤＮＡに対し、緩徐な条件下でエキソヌクレアーゼ
を作用させて一定時間ごとに反応を停止して一連のＤＮ
Ａ調製物を得る。これら各々の調製物に対して、図３に
記載された各制限酵素の消化の有無を観察することによ
り、求める長さのＤＮＡが得られたことを確認する。
終結点まで、あるいは、第１エクソンの終端から転写終
結点までを正確に切断、除去し、所望の遺伝子のＤＮＡ
をインサート断片として挿入する方法を記載する。上記
Ａ法で記載した方法により調製したｍＣ２６遺伝子ベク
ターＤＮＡに対し、緩徐な条件下でエキソヌクレアーゼ
を作用させて一定時間ごとに反応を停止して一連のＤＮ
Ａ調製物を得る。これら各々の調製物に対して、図３に
記載された各制限酵素の消化の有無を観察することによ
り、求める長さのＤＮＡが得られたことを確認する。
【００４３】一度このように工作してベクターＤＮＡを
得た後は、前出の合成リンカー法の項で述べたように、
制限酵素の認識部位となるべく計画した小ＤＮＡ断片を
上記ＤＮＡ断片に付加する。以後利用する際には、希望
する制限酵素で切断され、さらに付加した小ＤＮＡ断片
をも同時に取り除かれるよう設計することも可能であ
る。このような目的には、平滑末端を生じる制限酵素が
望ましく、具体的にはＥｃｏＲＶ，ＰｖｕＩＩなどを挙
げることができる。上記の方法で作製したｍＣ２６遺伝
子ベクターに、希望する遺伝子のＤＮＡ断片をインサー
トとして結合する。この目的には、上記構築法Ａに記載
した、合成リンカー法またはブラントエンド法のいずれ
かを用いることができる。発現すべき蛋白質をより正確
に設計するためにはブラントエンド法が好ましい。
得た後は、前出の合成リンカー法の項で述べたように、
制限酵素の認識部位となるべく計画した小ＤＮＡ断片を
上記ＤＮＡ断片に付加する。以後利用する際には、希望
する制限酵素で切断され、さらに付加した小ＤＮＡ断片
をも同時に取り除かれるよう設計することも可能であ
る。このような目的には、平滑末端を生じる制限酵素が
望ましく、具体的にはＥｃｏＲＶ，ＰｖｕＩＩなどを挙
げることができる。上記の方法で作製したｍＣ２６遺伝
子ベクターに、希望する遺伝子のＤＮＡ断片をインサー
トとして結合する。この目的には、上記構築法Ａに記載
した、合成リンカー法またはブラントエンド法のいずれ
かを用いることができる。発現すべき蛋白質をより正確
に設計するためにはブラントエンド法が好ましい。
【００４４】（４）骨形成誘導蛋白質をコードするＤＮ
Ａ断片の単離 骨形成誘導蛋白質のｃＤＮＡクローンは、その両端が制
限酵素ＥｃｏＲＶの切断点となるように設計し、同酵素
により一段階操作で切り出せることが好ましい。該クロ
ーンを前記したブラントエンド法により、上記ｍＣ２６
遺伝子ＤＮＡベクターに挿入する。この際、挿入位置の
両端となる部分の塩基配列は、構築法Ａの内、酵素Ａ１
ならびに酵素Ａ２として記載した制限酵素の認識部位と
なるべく設計することにより、ベクター作製の工程を簡
略化することができる。上記工程により作製したＤＮＡ
をそのまま遺伝子導入生物の作製に用いることができ
る。また、上記ベクター中に、微生物、例えば、大腸菌
内でプラスミドあるいは溶原性ファージとして増殖する
ことができる塩基配列を含むことにより、必要に応じ
て、常法を用いて大腸菌等により容易にベクターを増幅
および回収することができる。
Ａ断片の単離 骨形成誘導蛋白質のｃＤＮＡクローンは、その両端が制
限酵素ＥｃｏＲＶの切断点となるように設計し、同酵素
により一段階操作で切り出せることが好ましい。該クロ
ーンを前記したブラントエンド法により、上記ｍＣ２６
遺伝子ＤＮＡベクターに挿入する。この際、挿入位置の
両端となる部分の塩基配列は、構築法Ａの内、酵素Ａ１
ならびに酵素Ａ２として記載した制限酵素の認識部位と
なるべく設計することにより、ベクター作製の工程を簡
略化することができる。上記工程により作製したＤＮＡ
をそのまま遺伝子導入生物の作製に用いることができ
る。また、上記ベクター中に、微生物、例えば、大腸菌
内でプラスミドあるいは溶原性ファージとして増殖する
ことができる塩基配列を含むことにより、必要に応じ
て、常法を用いて大腸菌等により容易にベクターを増幅
および回収することができる。
【００４５】（５）遺伝子導入生物の生産法 上記発現ベクターに挿入した組換え体ＤＮＡを制限酵素
により切断し、原核細胞内で増殖させるのに用いた大腸
菌等の発現ベクター由来のＤＮＡと、ｍＣ２６遺伝子の
ＤＮＡおよび発現を希望する遺伝子のＤＮＡとからなる
真核生物由来ＤＮＡとを分離する。用いる制限酵素は特
に限定されないが、プラスミド部分とｍＣ２６遺伝子の
構造遺伝子部分の５’上流末端および３’下流末端とが
接続する部分は何れも制限酵素ＥｃｏＲＩの認識・切断
部位になるよう設計して、本酵素を用いることにより上
記の工程を簡略化することができる。制限酵素により切
断したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法によりそ
れぞれ単一のバンドとして分離した後、発現を希望する
遺伝子ＤＮＡのバンドを含む部分のアガロ「スゲルを切
り出してＤＮＡを抽出回収する。
により切断し、原核細胞内で増殖させるのに用いた大腸
菌等の発現ベクター由来のＤＮＡと、ｍＣ２６遺伝子の
ＤＮＡおよび発現を希望する遺伝子のＤＮＡとからなる
真核生物由来ＤＮＡとを分離する。用いる制限酵素は特
に限定されないが、プラスミド部分とｍＣ２６遺伝子の
構造遺伝子部分の５’上流末端および３’下流末端とが
接続する部分は何れも制限酵素ＥｃｏＲＩの認識・切断
部位になるよう設計して、本酵素を用いることにより上
記の工程を簡略化することができる。制限酵素により切
断したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法によりそ
れぞれ単一のバンドとして分離した後、発現を希望する
遺伝子ＤＮＡのバンドを含む部分のアガロ「スゲルを切
り出してＤＮＡを抽出回収する。
【００４６】上記の方法により単離精製した真核生物由
来ＤＮＡをマイクロインジェクション法により、ガラス
ピペットを用いて受精卵の雄性前核に注入する。この受
精卵を、一定時間培養後、あるいは直ちに、予め用意し
た偽妊娠動物すなわち代理母の子宮に移植する。これら
は常法により行うことができる［新生化学実験講座１
９、動物実験法（東京化学同人社刊、１９９１）；ゴー
ドン（Ｇｏｒｄｏｎ）とラドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，４
１１−４４２（１９８３）；ジオメック（Ｚｉｏｍｅ
ｋ）とジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｃｅｌ１ ２
１，９３５−９４２（１９８０）；ゴードン（Ｇｏｒｄ
ｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４（１９８０）；ゴー
ドン（Ｇｏｒｄｏｎ）とラドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２１４，１２４４−１２４６（１９８
１）；ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら（翻訳：山内ら）、マ
ウス胚の操作マニュアル、近代出版］。用いる生物種
は、特に限定されないが、例としてマウスを挙げること
ができ、特にＣＤ−１マウスが好ましい。
来ＤＮＡをマイクロインジェクション法により、ガラス
ピペットを用いて受精卵の雄性前核に注入する。この受
精卵を、一定時間培養後、あるいは直ちに、予め用意し
た偽妊娠動物すなわち代理母の子宮に移植する。これら
は常法により行うことができる［新生化学実験講座１
９、動物実験法（東京化学同人社刊、１９９１）；ゴー
ドン（Ｇｏｒｄｏｎ）とラドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，４
１１−４４２（１９８３）；ジオメック（Ｚｉｏｍｅ
ｋ）とジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｃｅｌ１ ２
１，９３５−９４２（１９８０）；ゴードン（Ｇｏｒｄ
ｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４（１９８０）；ゴー
ドン（Ｇｏｒｄｏｎ）とラドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２１４，１２４４−１２４６（１９８
１）；ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら（翻訳：山内ら）、マ
ウス胚の操作マニュアル、近代出版］。用いる生物種
は、特に限定されないが、例としてマウスを挙げること
ができ、特にＣＤ−１マウスが好ましい。
【００４７】偽妊娠動物の作製方法は動物種により異な
るが、各々既に獣医畜産技術として確立している。マウ
ス、ラット、ウサギをはじめとする囓歯類動物は、膣刺
激により容易に偽妊娠状態を誘起できる。また、ウシ、
ヤギ、ヒツジなど反芻類家畜およびウマ、イヌ、ネコに
ついては、ホルモン剤の投与により、偽妊娠を誘起す
る。また常法により、必要に応じて、動物にホルモン剤
を投与し過排卵を誘起して、採卵数を増加させることが
できる［実験生物学講座１、生物材料調製法（１９８
２）、江上信雄ら編、哺乳動物の初期発生、丸善出版株
式会社］。
るが、各々既に獣医畜産技術として確立している。マウ
ス、ラット、ウサギをはじめとする囓歯類動物は、膣刺
激により容易に偽妊娠状態を誘起できる。また、ウシ、
ヤギ、ヒツジなど反芻類家畜およびウマ、イヌ、ネコに
ついては、ホルモン剤の投与により、偽妊娠を誘起す
る。また常法により、必要に応じて、動物にホルモン剤
を投与し過排卵を誘起して、採卵数を増加させることが
できる［実験生物学講座１、生物材料調製法（１９８
２）、江上信雄ら編、哺乳動物の初期発生、丸善出版株
式会社］。
【００４８】代理母により出産された産仔のうち、組換
え遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を判別す
るため、産仔の体組織の一部から抽出したゲノムＤＮＡ
を分析する。
え遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を判別す
るため、産仔の体組織の一部から抽出したゲノムＤＮＡ
を分析する。
【００４９】一般には、導入した組換えＤＮＡをプロー
ブとしてゲノムＤＮＡのサザン・ハイブリダイゼーショ
ンにより証明する。また、組換えＤＮＡの塩基配列から
設計した合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ法により
微量のＤＮＡからも証明することができる。以上は全て
常法に従って行うことができる［ディチュリオら、前記
文献］。産仔の体組織としては、マウス、ラットでは尾
の先端が、また、ウシ、ヤギなどの中・大動物では耳朶
などが、広く用いられるが、口内の粘膜も試料として利
用できる。
ブとしてゲノムＤＮＡのサザン・ハイブリダイゼーショ
ンにより証明する。また、組換えＤＮＡの塩基配列から
設計した合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ法により
微量のＤＮＡからも証明することができる。以上は全て
常法に従って行うことができる［ディチュリオら、前記
文献］。産仔の体組織としては、マウス、ラットでは尾
の先端が、また、ウシ、ヤギなどの中・大動物では耳朶
などが、広く用いられるが、口内の粘膜も試料として利
用できる。
【００５０】また、所望の異種遺伝子産物の生産を確認
するためには、ウエスタンブロット等により実施するこ
とが可能であるが、これに限定されない。
するためには、ウエスタンブロット等により実施するこ
とが可能であるが、これに限定されない。
【００５１】トランスジェニック動物もまた、通常の生
物同様に自己増殖能力をもつことが期待できる。このこ
とにより、一度希望するトランスジェニック動物が得ら
れた後は、もはや、以上に述べた操作によらず、トラン
スジェニックである動物を育成し、他のトランスジェニ
ック動物または非トランスジェニック動物と交配し、新
たな子孫を出生せしむることにより、親となるトランス
ジェニック動物と同等の、あるいは雑種のトランスジェ
ニック動物を得ることができる。本発明の上記技術は、
以下に述べる利点を有する。
物同様に自己増殖能力をもつことが期待できる。このこ
とにより、一度希望するトランスジェニック動物が得ら
れた後は、もはや、以上に述べた操作によらず、トラン
スジェニックである動物を育成し、他のトランスジェニ
ック動物または非トランスジェニック動物と交配し、新
たな子孫を出生せしむることにより、親となるトランス
ジェニック動物と同等の、あるいは雑種のトランスジェ
ニック動物を得ることができる。本発明の上記技術は、
以下に述べる利点を有する。
【００５２】（１）乳腺は、組換え遺伝子に由来する物
質を大量に生産させる組織として優れている。乳腺は、
本来の性質上、蛋白質等の各種物質を大量生産すること
のできる器官であり、さらにミルク成分物質の大量生産
を指標として育種改良されてきたウシ、ヤギなどの家畜
を利用することができる点で有利である。
質を大量に生産させる組織として優れている。乳腺は、
本来の性質上、蛋白質等の各種物質を大量生産すること
のできる器官であり、さらにミルク成分物質の大量生産
を指標として育種改良されてきたウシ、ヤギなどの家畜
を利用することができる点で有利である。
【００５３】また、乳腺は外分泌腺であるため、搾乳に
より極めて短時間のうちに体外に取り出すことができ
る。したがって、生産物質の細胞内での過剰蓄積による
凝集塊の形成およびそれに伴う炎症反応等の悪影響を最
小限に抑えることができる。さらに、ミルクは乳腺にお
いてのみ大量生産されるため組織特異性を考慮する必要
がない。動物体内で天然に生産される物質であっても、
生産量が過大であったり、生産組織が本来と異なる場合
には、動物に疾病を引き起こすことは頻繁に観察されて
いる。よって、生体に及ぼす影響を最小限に抑えること
ができる。なお、組織特異性から、ミルク蛋白質遺伝子
の発現制御領域を付加した組換え遺伝子を単に受精卵に
注入するだけで、所望の生成物が乳腺からミルク中にの
み分泌される点も有利である。
より極めて短時間のうちに体外に取り出すことができ
る。したがって、生産物質の細胞内での過剰蓄積による
凝集塊の形成およびそれに伴う炎症反応等の悪影響を最
小限に抑えることができる。さらに、ミルクは乳腺にお
いてのみ大量生産されるため組織特異性を考慮する必要
がない。動物体内で天然に生産される物質であっても、
生産量が過大であったり、生産組織が本来と異なる場合
には、動物に疾病を引き起こすことは頻繁に観察されて
いる。よって、生体に及ぼす影響を最小限に抑えること
ができる。なお、組織特異性から、ミルク蛋白質遺伝子
の発現制御領域を付加した組換え遺伝子を単に受精卵に
注入するだけで、所望の生成物が乳腺からミルク中にの
み分泌される点も有利である。
【００５４】そして、乳腺におけるミルクの大量生産は
時期特異的、即ち、動物が妊娠して分娩した時にのみお
こり、成長期にはおこらないため、トランスジェニック
動物の正常な成長に害をもたらさない。一方、幼若また
は成体トランスジェニック動物のミルクの合成は、ホル
モンを外部から投与して人為的にミルク蛋白質の合成を
開始させて維持させる誘起泌乳も可能なため、人為的に
制御することもできる。このことを利用して、メタロチ
オネイン遺伝子のように、所望の時期に組換え遺伝子の
スイッチ・オン／オフを行えるトランスジェニック生物
を創製し、生物学研究の実験モデル生物として利用する
ことが可能である。
時期特異的、即ち、動物が妊娠して分娩した時にのみお
こり、成長期にはおこらないため、トランスジェニック
動物の正常な成長に害をもたらさない。一方、幼若また
は成体トランスジェニック動物のミルクの合成は、ホル
モンを外部から投与して人為的にミルク蛋白質の合成を
開始させて維持させる誘起泌乳も可能なため、人為的に
制御することもできる。このことを利用して、メタロチ
オネイン遺伝子のように、所望の時期に組換え遺伝子の
スイッチ・オン／オフを行えるトランスジェニック生物
を創製し、生物学研究の実験モデル生物として利用する
ことが可能である。
【００５５】（２）哺乳動物細胞の蛋白質生産機構を利
用するため、哺乳動物由来の外来遺伝子の発現において
利点を有する。蛋白質への糖鎖の付加、リン酸基あるい
はイオウ等が結合する複雑な修飾、およびジスルフィド
結合の形成の仕方等は哺乳動物に特有な様式による場合
が多く、例えば大腸菌等の細菌を用いた場合に本来の生
理活性が認められる蛋白質が生産されることは稀であ
る。このような欠点の解決策として培養動物細胞の利用
が挙げられるが、費用および労力がかかるにもかかわら
ず成功例は少なく、信頼性に欠ける。
用するため、哺乳動物由来の外来遺伝子の発現において
利点を有する。蛋白質への糖鎖の付加、リン酸基あるい
はイオウ等が結合する複雑な修飾、およびジスルフィド
結合の形成の仕方等は哺乳動物に特有な様式による場合
が多く、例えば大腸菌等の細菌を用いた場合に本来の生
理活性が認められる蛋白質が生産されることは稀であ
る。このような欠点の解決策として培養動物細胞の利用
が挙げられるが、費用および労力がかかるにもかかわら
ず成功例は少なく、信頼性に欠ける。
【００５６】（３）トランスジェニック動物は自己複製
能力をもち、生産システムの更新、規模拡大が極めて容
易かつ安価である。交配により新たな子孫を出生せし
め、親となるトランスジェニック動物と同等あるいは雑
種のトランスジェニック動物を得ることができる。この
際、当初のトランスジェニック動物を創製するにあたっ
て行った遺伝子工学を初めとする人為的操作は何ら必要
ない。生産設備の拡大をきわめて安価かつ容易に行うこ
とが可能である。このことは、培養細胞プラントまたは
化学工場には望み得ない点である。
能力をもち、生産システムの更新、規模拡大が極めて容
易かつ安価である。交配により新たな子孫を出生せし
め、親となるトランスジェニック動物と同等あるいは雑
種のトランスジェニック動物を得ることができる。この
際、当初のトランスジェニック動物を創製するにあたっ
て行った遺伝子工学を初めとする人為的操作は何ら必要
ない。生産設備の拡大をきわめて安価かつ容易に行うこ
とが可能である。このことは、培養細胞プラントまたは
化学工場には望み得ない点である。
【００５７】また、トランスジェニック動物は、安全か
つ低廉に維持できる。大腸菌をはじめとする微生物のＤ
ＮＡ複製機構は高等動物に比して原始的で精度が低いた
め、菌株を一定の性状に維持することが困難であり、醸
造業などで製品の品質を維持するために高度の技術を必
要とする。培養細胞についても、組換えＤＮＡを導入し
た場合、長期間その遺伝子発現の性状を維持することが
困難である。これに対し、高等動物個体は、きわめて安
定といえる。物質生産能力についても、ウシでは１０年
程度まで経済性良く一定の品質のミルク生産を維持、あ
るいは産次に従ってむしろ増大することは公知である。
トランスジェニック動物についても、同様の結果が期待
できる。
つ低廉に維持できる。大腸菌をはじめとする微生物のＤ
ＮＡ複製機構は高等動物に比して原始的で精度が低いた
め、菌株を一定の性状に維持することが困難であり、醸
造業などで製品の品質を維持するために高度の技術を必
要とする。培養細胞についても、組換えＤＮＡを導入し
た場合、長期間その遺伝子発現の性状を維持することが
困難である。これに対し、高等動物個体は、きわめて安
定といえる。物質生産能力についても、ウシでは１０年
程度まで経済性良く一定の品質のミルク生産を維持、あ
るいは産次に従ってむしろ増大することは公知である。
トランスジェニック動物についても、同様の結果が期待
できる。
【００５８】さらに、動物個体は、免疫系をはじめとす
る生体防御機構を備えており、微生物や動物細胞の培養
に必須である無菌的環境設備は必要としない。反対に、
感染、すなわち人体内部への侵襲による危害は発生し得
ず、バイオハザードの点で極めて有利である。
る生体防御機構を備えており、微生物や動物細胞の培養
に必須である無菌的環境設備は必要としない。反対に、
感染、すなわち人体内部への侵襲による危害は発生し得
ず、バイオハザードの点で極めて有利である。
【００５９】
【実施例】以下の実施例は、本発明を例示するためのも
のであり、本発明を限定するように意図するものではな
い。以下において、異種遺伝子として骨形成誘導蛋白質
遺伝子（ハムスター−ヒトの融合遺伝子：ｈａＢＩＰ）
を用いて本発明を例示するが、これらに限定されるもの
ではなく、他の異種遺伝子も使用可能なことは当業者で
あれば認識されるであろう。
のであり、本発明を限定するように意図するものではな
い。以下において、異種遺伝子として骨形成誘導蛋白質
遺伝子（ハムスター−ヒトの融合遺伝子：ｈａＢＩＰ）
を用いて本発明を例示するが、これらに限定されるもの
ではなく、他の異種遺伝子も使用可能なことは当業者で
あれば認識されるであろう。
【００６０】なお、以下に記載する発現ベクターは何れ
も微生物中において増幅可能なベクターであり、例とし
て大腸菌ベクターを示すが、これらに限定されるもので
はない。また、これら発現ベクターの増幅は常法にした
がって実施することが可能である［前記文献：Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇおよびＢａｓｉｃ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
等を参照せよ］。 実施例１ ｍＣ２６構造遺伝子および該遺伝子の発現制御領域の単
離
も微生物中において増幅可能なベクターであり、例とし
て大腸菌ベクターを示すが、これらに限定されるもので
はない。また、これら発現ベクターの増幅は常法にした
がって実施することが可能である［前記文献：Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇおよびＢａｓｉｃ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
等を参照せよ］。 実施例１ ｍＣ２６構造遺伝子および該遺伝子の発現制御領域の単
離
【００６１】（ｉ）プローブの作製 マウスの必乳最盛期の乳腺を用いて、常法に従い［サト
ウ（Ｓａｔｏｗ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９，１６
３９−１６４３（１９８６）］、全ｍＲＮＡをポリ
（Ａ）ＲＮＡ画分として単離した。１０μｇの全ｍＲＮ
Ａに関して、オリゴ（ｄＴ）プライマー（バイオテック
インターナショナル（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ）社／コスモバイオ社）およびランダムヘ
キサマー（バイオテックインターナショナル）をプライ
マーとして、アマシャム社またはＮＥＮ社の標識キット
を用いて３２Ｐ標識した。ｍＲＮＡのキャップ部分を標
識するに際しては、常法［ミズモト（Ｍｉｚｕｍｏｔ
ｏ）とリップマン（Ｌｉｐｍａｎｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７６，４９６１
（１９７９）］に従い、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラ
ム（ベセスダリサーチ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ）社、米国／コスモバイオ社）を用いてｍＲＮＡ
をポリ（Ａ）ＲＮＡ画分として精製し、ワクシニアウイ
ルスのグアリニルトランスフェラーゼ（ベセスダリサー
チ社）により標識した。標識後、そのまま、またはＲＮ
ａｓｅＡ（シグマ社、米国）を用いて部分消化し（１０
〜１００ｎｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを加え、１分間、３
７℃処理後、等容のホルムアミドを加えて反応停止）、
６Ｍ〜８Ｍの尿素を含む６％アクリルアミドゲル電気泳
動に供し、大きさを確認した。 （ｉｉ）ライブラリーの作製
ウ（Ｓａｔｏｗ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９，１６
３９−１６４３（１９８６）］、全ｍＲＮＡをポリ
（Ａ）ＲＮＡ画分として単離した。１０μｇの全ｍＲＮ
Ａに関して、オリゴ（ｄＴ）プライマー（バイオテック
インターナショナル（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ）社／コスモバイオ社）およびランダムヘ
キサマー（バイオテックインターナショナル）をプライ
マーとして、アマシャム社またはＮＥＮ社の標識キット
を用いて３２Ｐ標識した。ｍＲＮＡのキャップ部分を標
識するに際しては、常法［ミズモト（Ｍｉｚｕｍｏｔ
ｏ）とリップマン（Ｌｉｐｍａｎｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７６，４９６１
（１９７９）］に従い、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラ
ム（ベセスダリサーチ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ）社、米国／コスモバイオ社）を用いてｍＲＮＡ
をポリ（Ａ）ＲＮＡ画分として精製し、ワクシニアウイ
ルスのグアリニルトランスフェラーゼ（ベセスダリサー
チ社）により標識した。標識後、そのまま、またはＲＮ
ａｓｅＡ（シグマ社、米国）を用いて部分消化し（１０
〜１００ｎｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを加え、１分間、３
７℃処理後、等容のホルムアミドを加えて反応停止）、
６Ｍ〜８Ｍの尿素を含む６％アクリルアミドゲル電気泳
動に供し、大きさを確認した。 （ｉｉ）ライブラリーの作製
【００６２】Ｂａｌｂ／ｃマウスのゲノミックＤＮＡラ
イブラリー（クローンテック社）を制限酵素ＥｃｏＲＩ
で部分消化または完全消化したのち、部分消化物に関し
ては消化物をλＣｈａｒｏｎ４Ａに、また完全消化物に
関してはｐＳＰ６４（プロメガバイオテック（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社、米国）に連結してライブ
ラリーを作製した。
イブラリー（クローンテック社）を制限酵素ＥｃｏＲＩ
で部分消化または完全消化したのち、部分消化物に関し
ては消化物をλＣｈａｒｏｎ４Ａに、また完全消化物に
関してはｐＳＰ６４（プロメガバイオテック（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社、米国）に連結してライブ
ラリーを作製した。
【００６３】ウシ、ニワトリ、イヌ、ヤギ、モルモッ
ト、ハムスター、ヒト、カンガルー、サル、マウス、ハ
ト、ブタ、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物種について
は、λ由来のファージベクター、例えばλｇｔ１０、λ
ｇｔ１１、ＥＭＢＬ３またはλＣｈａｒｏｎ４Ａの各ベ
クターに挿入されたｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡの
ライブラリーが市販品として購入可能である（クロンテ
ック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社／ＴＯＹＯＢＯ社）。な
お、ｐＳＰ６４（プロメガ社）および市販ゲノミックＤ
ＮＡ（クローンテック社）の組み合わせによっても、こ
れらと同等のライブラリーを作製することは、当業者で
あれば容易に可能であろう。
ト、ハムスター、ヒト、カンガルー、サル、マウス、ハ
ト、ブタ、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物種について
は、λ由来のファージベクター、例えばλｇｔ１０、λ
ｇｔ１１、ＥＭＢＬ３またはλＣｈａｒｏｎ４Ａの各ベ
クターに挿入されたｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡの
ライブラリーが市販品として購入可能である（クロンテ
ック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社／ＴＯＹＯＢＯ社）。な
お、ｐＳＰ６４（プロメガ社）および市販ゲノミックＤ
ＮＡ（クローンテック社）の組み合わせによっても、こ
れらと同等のライブラリーを作製することは、当業者で
あれば容易に可能であろう。
【００６４】（ｉｉｉ）陽性クローンのスクリーニング このライブラリーの中から、上記（ｉ）において作製し
たプローブを用いてスクリーニングを行った。その結
果、λＣｈａｒｏｎ４ＡのライブラリーからはλＭＣ２
６が、そして、ｐＳＰ６４のライブラリーからはｐＳｍ
Ｃ２６が乳腺特異的に発現する陽性クローンとして同定
された。これら構築物のマップを、それぞれ図１および
図２に示す。
たプローブを用いてスクリーニングを行った。その結
果、λＣｈａｒｏｎ４ＡのライブラリーからはλＭＣ２
６が、そして、ｐＳＰ６４のライブラリーからはｐＳｍ
Ｃ２６が乳腺特異的に発現する陽性クローンとして同定
された。これら構築物のマップを、それぞれ図１および
図２に示す。
【００６５】実施例２ ｍＣ２６構造遺伝子および該遣伝子の発現制御領域の特
徴 （ｉ）陽性クローンの特徴 λＭＣ２６クローンおよびｐＳｍＣ２６クローンの制限
酵素地図を作製して比較したところ、λＭＣ２６は約１
２．７ｋｂの挿入断片（ＥｃｏＲＩ断片）を、そしてｐ
ＳｍＣ２６は約６．７ｋｂの挿入断片（ＥｃｏＲＩ断
片）を含むことがわかった。そして、約６．７ｋｂの断
片は約１２．７ｋｂの断片内に含まれるものであること
が、制限酵素マッピングにより明らかとなった。これら
の結果は図１および図２の制限酵素認識部位の比較から
明らかである。
徴 （ｉ）陽性クローンの特徴 λＭＣ２６クローンおよびｐＳｍＣ２６クローンの制限
酵素地図を作製して比較したところ、λＭＣ２６は約１
２．７ｋｂの挿入断片（ＥｃｏＲＩ断片）を、そしてｐ
ＳｍＣ２６は約６．７ｋｂの挿入断片（ＥｃｏＲＩ断
片）を含むことがわかった。そして、約６．７ｋｂの断
片は約１２．７ｋｂの断片内に含まれるものであること
が、制限酵素マッピングにより明らかとなった。これら
の結果は図１および図２の制限酵素認識部位の比較から
明らかである。
【００６６】（ｉｉ）塩基配列決定 ｐＳｍＣ２６の約６．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を切り出
し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより約５．
４ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＢｌｕ
ｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（プロメガ社）に挿入してサ
ブクローン化した。このサブクローンに関して、デリー
ションキット（ＴａＫａＲａ社）を用いて欠失変異体の
シリーズを作製した。約５．４ｋｂの断片の制限酵素マ
ップを図３に示す。これらのシリーズの配列は、ジデオ
キシ法［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｍａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５
４６３（１９７７）］により、ＤＮＡ塩基配列決定機
（ＡＢＩ社、モデル３７３Ａ、およびファルマシア社、
Ａ．Ｌ．Ｆ．モデル）を使用して決定された。決定され
た塩基配列を配列番号１とする。
し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより約５．
４ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＢｌｕ
ｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（プロメガ社）に挿入してサ
ブクローン化した。このサブクローンに関して、デリー
ションキット（ＴａＫａＲａ社）を用いて欠失変異体の
シリーズを作製した。約５．４ｋｂの断片の制限酵素マ
ップを図３に示す。これらのシリーズの配列は、ジデオ
キシ法［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｍａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５
４６３（１９７７）］により、ＤＮＡ塩基配列決定機
（ＡＢＩ社、モデル３７３Ａ、およびファルマシア社、
Ａ．Ｌ．Ｆ．モデル）を使用して決定された。決定され
た塩基配列を配列番号１とする。
【００６７】配列番号１中、ヌクレオチド番号２３０５
〜２３０７のＡＧＣから始まり、ヌクレオチド番号４６
２２〜４６２４のＣＣＴで終わる構造遺伝子部分が存在
する（図５）。
〜２３０７のＡＧＣから始まり、ヌクレオチド番号４６
２２〜４６２４のＣＣＴで終わる構造遺伝子部分が存在
する（図５）。
【００６８】図５に示すとおり、ｍＣ２６構造遺伝子内
には第１ないし第３イントロンが存在しており、スプラ
イシングに関与していることが予測されるので、異種遺
伝子発現のためのカセットとして用いる場合は、これら
の配列を含ませることが好ましい。しかし、下記実施例
から明らかなとおり、異種遺伝子の種類によってはこれ
らは必要でない場合もある。よって、発現カセットを作
製するための連結の複雑さも考慮して、これらの配列を
含ませるか否かを検討する必要がある。
には第１ないし第３イントロンが存在しており、スプラ
イシングに関与していることが予測されるので、異種遺
伝子発現のためのカセットとして用いる場合は、これら
の配列を含ませることが好ましい。しかし、下記実施例
から明らかなとおり、異種遺伝子の種類によってはこれ
らは必要でない場合もある。よって、発現カセットを作
製するための連結の複雑さも考慮して、これらの配列を
含ませるか否かを検討する必要がある。
【００６９】該構造遺伝子部分の上流および下流領域の
ヌクレオチド配列には、公知のカゼイン遺伝子との間で
相同性は認められない。また、上記文献［ドーベンコ
ら、前記］において開示されていない部分、即ち、配列
番号１中の第１４３９ヌクレオチド〜第１５２２に存在
するＧＡＡトリプレットの連続重複配列部分（以下、Ｍ
ｂｏＩＩリピートと称する）は、いわゆるトリプルリピ
ートと称される発現制御配列と同等のものと考えられ、
この部分が発現制御に関与している可能性は高い（図
４、下線部分）。マウスＩｇＨ遺伝子においてもＭｂｏ
ＩＩリピートが発見されており、発現制御エンハンサー
として機能していると考えられている。配列番号１のヌ
クレオチド配列は、一方の末端がＥｃｏＲＩ認識部位で
あり、そして他方の末端がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位で
あるＤＮＡ断片として、λＭＣ２６クローンおよびｐＳ
ｍＣ２６クローンから容易に分離され、発現カセットと
して以後の実験に使用された。
ヌクレオチド配列には、公知のカゼイン遺伝子との間で
相同性は認められない。また、上記文献［ドーベンコ
ら、前記］において開示されていない部分、即ち、配列
番号１中の第１４３９ヌクレオチド〜第１５２２に存在
するＧＡＡトリプレットの連続重複配列部分（以下、Ｍ
ｂｏＩＩリピートと称する）は、いわゆるトリプルリピ
ートと称される発現制御配列と同等のものと考えられ、
この部分が発現制御に関与している可能性は高い（図
４、下線部分）。マウスＩｇＨ遺伝子においてもＭｂｏ
ＩＩリピートが発見されており、発現制御エンハンサー
として機能していると考えられている。配列番号１のヌ
クレオチド配列は、一方の末端がＥｃｏＲＩ認識部位で
あり、そして他方の末端がＨｉｎｄＩＩＩの認識部位で
あるＤＮＡ断片として、λＭＣ２６クローンおよびｐＳ
ｍＣ２６クローンから容易に分離され、発現カセットと
して以後の実験に使用された。
【００７０】実施例３ マウス骨形成誘導蛋白質を発現するトランスジェニック
動物の作製 実施例１において単離したｐＳｍＣ２６の約６．７ｋｂ
断片のうち配列を決定した５３９４ｂｐのＤＮＡ断片を
発現カセットとして用いて、ｍＣ２６構造遺伝子部分
に、外来異種遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作製し
た。以下にその概要を記載する。
動物の作製 実施例１において単離したｐＳｍＣ２６の約６．７ｋｂ
断片のうち配列を決定した５３９４ｂｐのＤＮＡ断片を
発現カセットとして用いて、ｍＣ２６構造遺伝子部分
に、外来異種遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作製し
た。以下にその概要を記載する。
【００７１】（ｉ）組換えＤＮＡの作製 最初に、ｐＳｍＣ２６から約６．７ｋｂ断片のＥｃｏＲ
Ｉ断片を切り出し、さらにＨｉｎｄＩＩＩにより部分消
化し、ゲル電気泳動法により５３９４ｂｐのＤＮＡ断片
を回収した。該断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ＋の
ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ二重消化物に連結してｐＢ
ｍＣ２６ＥＨを作製した。ｐＢｍＣ２６ＥＨのマップを
図７に示す。
Ｉ断片を切り出し、さらにＨｉｎｄＩＩＩにより部分消
化し、ゲル電気泳動法により５３９４ｂｐのＤＮＡ断片
を回収した。該断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ＋の
ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ二重消化物に連結してｐＢ
ｍＣ２６ＥＨを作製した。ｐＢｍＣ２６ＥＨのマップを
図７に示す。
【００７２】一方、外来異種遺伝子としては、ハムスタ
ー−ヒトの融合遺伝子である骨形成誘導蛋白質遺伝子を
用いた。このヌクレオチド配列を配列番号２として示
す。該融合遺伝子は、以下の工程により取得した： ヒト骨形成誘導蛋白質（ＢＩＰ）遺伝子の一部の配列：
ＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＡＧＡ（配列番号
７） を有するＤＮＡを５’側プライマーとし、そして、ＧＣ
ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡ（配列番号８） を有するＤＮＡを３’側（逆のストランド）プライマー
とし、ハムスター由来のＢａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ ｋ
ｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞株から常法（チオシアン酸グ
アニジン法：前記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、サムブルックらを参照）により抽出したＲＮＡ（１
０μｇ）から逆転写酵素ＲＡＶ−２（ＴａＫａＲａ社）
およびｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー
社／ＴａＫａＲａ社）を用い、添付の緩衝液によりパー
キンエルマー社の装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｅｔｕｓ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ４８
０）を用いて添付の使用説明書に従ってＲＴ−ＰＣＲ反
応を実施し、ハムスターＢＩＰに相補的な二本鎖を得
た。該二本鎖ＤＮＡを電気泳動により確認後（図８、レ
ーン３〜５）、ゲルから回収し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐ
ｔＩＩベクターのＥｃｏＲＶ切断部位に挿入してＤＮＡ
を増幅し、ファルマシア社ＡＬＦ自動シークエンサーに
より塩基配列を決定した。上記操作により、該ＤＮＡ
は、ヒトＢＩＰ ＤＮＡ（配列番号７および８）および
新規遺伝子であるハムスターＢＩＰのヒト遺伝子に相似
する部分のＤＮＡが結合したヒトーハムスター融合遺伝
子ＤＮＡとして得られた。
ー−ヒトの融合遺伝子である骨形成誘導蛋白質遺伝子を
用いた。このヌクレオチド配列を配列番号２として示
す。該融合遺伝子は、以下の工程により取得した： ヒト骨形成誘導蛋白質（ＢＩＰ）遺伝子の一部の配列：
ＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＡＧＡ（配列番号
７） を有するＤＮＡを５’側プライマーとし、そして、ＧＣ
ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡ（配列番号８） を有するＤＮＡを３’側（逆のストランド）プライマー
とし、ハムスター由来のＢａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ ｋ
ｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞株から常法（チオシアン酸グ
アニジン法：前記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、サムブルックらを参照）により抽出したＲＮＡ（１
０μｇ）から逆転写酵素ＲＡＶ−２（ＴａＫａＲａ社）
およびｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー
社／ＴａＫａＲａ社）を用い、添付の緩衝液によりパー
キンエルマー社の装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｅｔｕｓ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ４８
０）を用いて添付の使用説明書に従ってＲＴ−ＰＣＲ反
応を実施し、ハムスターＢＩＰに相補的な二本鎖を得
た。該二本鎖ＤＮＡを電気泳動により確認後（図８、レ
ーン３〜５）、ゲルから回収し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐ
ｔＩＩベクターのＥｃｏＲＶ切断部位に挿入してＤＮＡ
を増幅し、ファルマシア社ＡＬＦ自動シークエンサーに
より塩基配列を決定した。上記操作により、該ＤＮＡ
は、ヒトＢＩＰ ＤＮＡ（配列番号７および８）および
新規遺伝子であるハムスターＢＩＰのヒト遺伝子に相似
する部分のＤＮＡが結合したヒトーハムスター融合遺伝
子ＤＮＡとして得られた。
【００７３】ｐＢｍＣ２６ＥＨ中の配列番号１の第２３
０５ヌクレオチドから第４６２４ヌクレオチドまでを除
去したＤＮＡに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ
社）を用いて上記ＤＮＡを連結して得た組換えＤＮＡ
を、大腸菌ＪＭ１０９株にトランスフェクションして増
幅した。増幅された該組換えＤＮＡの塩基配列を決定し
て確認し、制限酵素ＢｓｓＨＩＩ（ＴａＫａＲａ社）で
切断して直鎖状ＤＮＡとしてアガロースゲル電気泳動に
よりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ由来のＤＮＡ部分と、
ｈａＢＩＰを挿入されたｍＣ２６発現カセット部分を分
離してゲルから回収した。このＤＮＡの１〜５μｇ／ｍ
ｌ溶液を以下の実施例に用いた。
０５ヌクレオチドから第４６２４ヌクレオチドまでを除
去したＤＮＡに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ
社）を用いて上記ＤＮＡを連結して得た組換えＤＮＡ
を、大腸菌ＪＭ１０９株にトランスフェクションして増
幅した。増幅された該組換えＤＮＡの塩基配列を決定し
て確認し、制限酵素ＢｓｓＨＩＩ（ＴａＫａＲａ社）で
切断して直鎖状ＤＮＡとしてアガロースゲル電気泳動に
よりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ由来のＤＮＡ部分と、
ｈａＢＩＰを挿入されたｍＣ２６発現カセット部分を分
離してゲルから回収した。このＤＮＡの１〜５μｇ／ｍ
ｌ溶液を以下の実施例に用いた。
【００７４】（ｉｉ）受精卵の採取 マウスの性周期（４日間）を考慮して、毎日、メスのマ
ウス膣内をガラスピペットにより水で洗浄し、細胞診に
より性周期を調べた（スメアチェック）。マウスを同調
群に分けて、群飼し、オスのマウスと交配後、翌朝の膣
栓（プラグ）形成を確認して妊娠マウスを得た。母群頭
数が少ない場合は、ゴナドトロピン腹腔内注射により過
排卵処置を行った。塩酸ケタミンまたはペントバルビタ
ールの５０倍希釈液を腹腔内注射して導入麻酔し、エー
テル麻酔下に手術を行い、輸卵管ないし子宮角を移動中
の卵を回収した。用いたマウスはチャールズリバー（Ｃ
ｈｉｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）社のＣＤ−１マウスを用い
た。
ウス膣内をガラスピペットにより水で洗浄し、細胞診に
より性周期を調べた（スメアチェック）。マウスを同調
群に分けて、群飼し、オスのマウスと交配後、翌朝の膣
栓（プラグ）形成を確認して妊娠マウスを得た。母群頭
数が少ない場合は、ゴナドトロピン腹腔内注射により過
排卵処置を行った。塩酸ケタミンまたはペントバルビタ
ールの５０倍希釈液を腹腔内注射して導入麻酔し、エー
テル麻酔下に手術を行い、輸卵管ないし子宮角を移動中
の卵を回収した。用いたマウスはチャールズリバー（Ｃ
ｈｉｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）社のＣＤ−１マウスを用い
た。
【００７５】（ｉｉｉ）受精卵へのＤＮＡの注入 上記（ｉ）において作製したｐＢｍＣ２６ＥＨを大腸菌
ＪＭ１０９株内で増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫ
ｐｎＩの認識部位において切断して直鎖状にし、該直鎖
状ＤＮＡをマウスの受精卵前核に注入した。上記ＤＮＡ
を１〜５μｇ／ｍｌの濃度に溶解した溶液をマイクロイ
ンジェクションした。この方法により操作された胚を子
宮頸管刺激により偽妊娠させたメスまたは性周期同調群
より選択した代理母（受容メス）の卵管腹腔口に適切な
大きさのシリコンチューブカテーテルを挿入して移し、
妊娠へと進展させた。
ＪＭ１０９株内で増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫ
ｐｎＩの認識部位において切断して直鎖状にし、該直鎖
状ＤＮＡをマウスの受精卵前核に注入した。上記ＤＮＡ
を１〜５μｇ／ｍｌの濃度に溶解した溶液をマイクロイ
ンジェクションした。この方法により操作された胚を子
宮頸管刺激により偽妊娠させたメスまたは性周期同調群
より選択した代理母（受容メス）の卵管腹腔口に適切な
大きさのシリコンチューブカテーテルを挿入して移し、
妊娠へと進展させた。
【００７６】マイクロインジェクション後の卵の１時間
生存率は５２％であった。上記遺伝子導入卵を１頭につ
き２０個ずつ４０頭の代理母に移入したところ、５４頭
の産子を得た。上記５４頭の産仔のうち、ＤＮＡ診断に
よりトランスジェニックと判明したものは７頭（１３
％）であった。
生存率は５２％であった。上記遺伝子導入卵を１頭につ
き２０個ずつ４０頭の代理母に移入したところ、５４頭
の産子を得た。上記５４頭の産仔のうち、ＤＮＡ診断に
よりトランスジェニックと判明したものは７頭（１３
％）であった。
【００７７】（ｉｖ）ＤＮＡ診断 トランスジェニックマウスの口内粘膜細胞または培養白
血球細胞から常法により得たＤＮＡに関して、ＰＣＲ法
のキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社の使用説明書に
従った）を用いて実施した。結果を図８に示す。
血球細胞から常法により得たＤＮＡに関して、ＰＣＲ法
のキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社の使用説明書に
従った）を用いて実施した。結果を図８に示す。
【００７８】図８は、培養細胞株および組換え動物細胞
により抽出した各ＲＮＡ１０μｇについて、ヒト−ハム
スター融合遺伝子であるｈａＢＩＰのｍＲＮＡの発現の
有無をＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。レーン４、５お
よび６は、ハムスター由来のＢＨＫ細胞から抽出したＲ
ＮＡ；レーン２は、ヒト由来細胞株であるＮａｍａｌｗ
ａ細胞ＲＮＡ；レーン１は、組換え動物細胞から抽出し
たＲＮＡ；に対するＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。５’お
よび３’のプライマーはヒトＢＩＰ遺伝子ＤＮＡの構造
遺伝子部分の配列からオリゴマー一本鎖ＤＮＡを合成し
て使用したものであり、各ＰＣＲ反応産物のＤＮＡ配列
は同一となると予想される。図８は、ＰＣＲ反応後、２
％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロミド染色
した結果を示すが、各バンドのアガロース部分を切り出
してＮａＩにより溶解後、ＤＮＡをガラスパウダーに吸
着させて回収し、全塩基配列を決定したところ、同一の
配列を有することが確認された。
により抽出した各ＲＮＡ１０μｇについて、ヒト−ハム
スター融合遺伝子であるｈａＢＩＰのｍＲＮＡの発現の
有無をＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。レーン４、５お
よび６は、ハムスター由来のＢＨＫ細胞から抽出したＲ
ＮＡ；レーン２は、ヒト由来細胞株であるＮａｍａｌｗ
ａ細胞ＲＮＡ；レーン１は、組換え動物細胞から抽出し
たＲＮＡ；に対するＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。５’お
よび３’のプライマーはヒトＢＩＰ遺伝子ＤＮＡの構造
遺伝子部分の配列からオリゴマー一本鎖ＤＮＡを合成し
て使用したものであり、各ＰＣＲ反応産物のＤＮＡ配列
は同一となると予想される。図８は、ＰＣＲ反応後、２
％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロミド染色
した結果を示すが、各バンドのアガロース部分を切り出
してＮａＩにより溶解後、ＤＮＡをガラスパウダーに吸
着させて回収し、全塩基配列を決定したところ、同一の
配列を有することが確認された。
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【図１】図１は、λＭＣ２６の制限酵素マップを示す。
実線部分はλＣｈａｒｏｎ４Ａに由来する。実線以外の
部分、即ち、ＥｃｏＲＩ（＃１−３．４ｋｂｐ）からＥ
ｃｏＲＩ（＃１＋１０．６ｋｂｐ）までの太枠で示され
た部分が約１２．７ｋｂＥｃｏＲＩ断片に相当する。＃
１は配列番号１のヌクレオチド番号１に相当する。５’
および３’の表示は、ｍＣ２６構造遺伝子に対するもの
である。
実線部分はλＣｈａｒｏｎ４Ａに由来する。実線以外の
部分、即ち、ＥｃｏＲＩ（＃１−３．４ｋｂｐ）からＥ
ｃｏＲＩ（＃１＋１０．６ｋｂｐ）までの太枠で示され
た部分が約１２．７ｋｂＥｃｏＲＩ断片に相当する。＃
１は配列番号１のヌクレオチド番号１に相当する。５’
および３’の表示は、ｍＣ２６構造遺伝子に対するもの
である。
【図２】図２は、ｐＳｍＣ２６の制限酵素マップを示
す。ｐＳＰ６４由来のＥＣｏＲＩ−ＥＣｏＲＩ部分以外
の太枠部分が約６．７ｋｂＥＣｏＲＩ断片に相当し、図
１のＥｃｏＲＩ（＃＜）からＥｃｏＲＩ（＃１＋６．７
ｋｂｐ）の太枠部分に対応する。５’および３’の表示
は、ｍＣ２６構造遺伝子に対するものである。
す。ｐＳＰ６４由来のＥＣｏＲＩ−ＥＣｏＲＩ部分以外
の太枠部分が約６．７ｋｂＥＣｏＲＩ断片に相当し、図
１のＥｃｏＲＩ（＃＜）からＥｃｏＲＩ（＃１＋６．７
ｋｂｐ）の太枠部分に対応する。５’および３’の表示
は、ｍＣ２６構造遺伝子に対するものである。
【図３】図３は、配列番号１の制限酵素マップを示す。
Ｅは制限酵素ＥｃｏＲＩを、Ｘは制限酵素ＸｂａＩを、
Ｐは制限酵素ＰｓｔＩを、そしてＨは制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩを示す。太枠はエクソンを示す。
Ｅは制限酵素ＥｃｏＲＩを、Ｘは制限酵素ＸｂａＩを、
Ｐは制限酵素ＰｓｔＩを、そしてＨは制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩを示す。太枠はエクソンを示す。
【図４】図４は、ｍＣ２６遺伝子の５’上流発現制御領
域である。下線部はＭｏｂＩＩリピートを示す。
域である。下線部はＭｏｂＩＩリピートを示す。
【図５】図５は、ｍＣ２６遺伝子の構造遺伝子部分を示
す。ヌクレオチド番号は、図４からの通し番号を示し、
配列番号１のヌクレオチド番号に対応する。
す。ヌクレオチド番号は、図４からの通し番号を示し、
配列番号１のヌクレオチド番号に対応する。
【図６】図６は、ｍＣ２６遺伝子の３’下流発現制御領
域である。ヌクレオチド番号は、図４および図５からの
通し番号を示し、配列番号１のヌクレオチド番号に対応
する。
域である。ヌクレオチド番号は、図４および図５からの
通し番号を示し、配列番号１のヌクレオチド番号に対応
する。
【図７】図７は、ｐＢｍＣ２６ＥＨの制限酵素マップを
示す。実線部分がｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋
に由来する。実線部分以外のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片が配列番号１の５３９４ｂｐのＤＮＡである。
示す。実線部分がｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋
に由来する。実線部分以外のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片が配列番号１の５３９４ｂｐのＤＮＡである。
【図８】図８は、ＰＣＲ法によるＤＮＡ診断の結果であ
り、ＰＣＲ反応後、２％アガロースゲル電気泳動し、エ
チジウムブロミド染色した結果を示す。Ｍは分子量マー
カーを示す。レーン１は組換え動物細胞（ヒト−ハムス
ター組換え体ＢＩＰ）を示し、レーン２はヒトＮａｍａ
ｌｗａ細胞（ネガティブコントロール）を示し、レーン
３はＢＨＫ細胞株１を示し、レーン４はＢＨＫ細胞株２
を示し、そしてレーン５はＢＨＫ細胞株３を示す。
り、ＰＣＲ反応後、２％アガロースゲル電気泳動し、エ
チジウムブロミド染色した結果を示す。Ｍは分子量マー
カーを示す。レーン１は組換え動物細胞（ヒト−ハムス
ター組換え体ＢＩＰ）を示し、レーン２はヒトＮａｍａ
ｌｗａ細胞（ネガティブコントロール）を示し、レーン
３はＢＨＫ細胞株１を示し、レーン４はＢＨＫ細胞株２
を示し、そしてレーン５はＢＨＫ細胞株３を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年２月７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 ｍＣ２６遺伝子発現制御領域を用いて
トランスジェニック動物乳腺において物質を生産する新
規製造法
トランスジェニック動物乳腺において物質を生産する新
規製造法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生物体内において所望
の異種遺伝子を発現させることを可能ならしめる染色体
ＤＮＡ由来の遺伝子の発現制御領域を導入するトランス
ジェニック生物の生産方法に関する。特定すれば、本発
明はｍＣ２６蛋白質をコードする構造遺伝子の一部およ
び該構造遺伝子の上流および下流に位置する該遺伝子の
発現を制御する制御領域配列からなるＤＮＡ断片を用い
て大腸菌その他の宿主中で増幅するための組換え発現ベ
クターを作製し、そして該ベクターを用いてｍＣ２６遺
伝子の遺伝子制御領域を生物体内に導入して遺伝子発現
制御実験モデル動物を創造し、所望の物質を哺乳動物の
乳腺その他の組織において生産させることを可能ならし
めるトランスジェニック技術に関する。
の異種遺伝子を発現させることを可能ならしめる染色体
ＤＮＡ由来の遺伝子の発現制御領域を導入するトランス
ジェニック生物の生産方法に関する。特定すれば、本発
明はｍＣ２６蛋白質をコードする構造遺伝子の一部およ
び該構造遺伝子の上流および下流に位置する該遺伝子の
発現を制御する制御領域配列からなるＤＮＡ断片を用い
て大腸菌その他の宿主中で増幅するための組換え発現ベ
クターを作製し、そして該ベクターを用いてｍＣ２６遺
伝子の遺伝子制御領域を生物体内に導入して遺伝子発現
制御実験モデル動物を創造し、所望の物質を哺乳動物の
乳腺その他の組織において生産させることを可能ならし
めるトランスジェニック技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学により作製した組換え体遺伝
子から物質を生産するための宿主系として、大腸菌、枯
草菌、酵母をはじめとする微生物および各種の培養動植
物細胞が利用されている。さらに、ＤＮＡを生物体内に
導入し、トランスジェニック生物を作製し、組換え体遺
伝子を発現させて組換え体蛋白質を生産させることが可
能である［パルミッター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ）ら、Ｃｅ
ｌｌ，Ｖｏｌ ２９，７０１−７１０（１９８２）］。
子から物質を生産するための宿主系として、大腸菌、枯
草菌、酵母をはじめとする微生物および各種の培養動植
物細胞が利用されている。さらに、ＤＮＡを生物体内に
導入し、トランスジェニック生物を作製し、組換え体遺
伝子を発現させて組換え体蛋白質を生産させることが可
能である［パルミッター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ）ら、Ｃｅ
ｌｌ，Ｖｏｌ ２９，７０１−７１０（１９８２）］。
【０００３】例えば、マイクロインジェクション法によ
り、組換え体ＤＮＡを含む溶液を胚（受精卵）に注入
し、創造したトランスジェニック動物体内において導入
遺伝子を発現させて蛋白質を合成させることが一般的で
ある［ディチュリオ（ＤｉＴｕｌｌｉｏ）ら、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １０，７４−７７（１
９９２）］。レトロウィルスを中間ベクターとして利用
する方法も開発されている［ヤニッシュ（Ｊａｅｎｉｓ
ｃｈ）ら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ ２４，５１９（１９８
１）］が、このようなウイルスの使用は、オンコジーン
の活性化または不所望な転写等の危険性を少なからず有
する。また、組換え体ＤＮＡを直接、動物体内に注射し
て遺伝子を発現させる方法も開発されているが、発現効
率および導入遺伝子の安定性の点で工業的規模の使用に
おける信頼性に欠ける。
り、組換え体ＤＮＡを含む溶液を胚（受精卵）に注入
し、創造したトランスジェニック動物体内において導入
遺伝子を発現させて蛋白質を合成させることが一般的で
ある［ディチュリオ（ＤｉＴｕｌｌｉｏ）ら、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １０，７４−７７（１
９９２）］。レトロウィルスを中間ベクターとして利用
する方法も開発されている［ヤニッシュ（Ｊａｅｎｉｓ
ｃｈ）ら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ ２４，５１９（１９８
１）］が、このようなウイルスの使用は、オンコジーン
の活性化または不所望な転写等の危険性を少なからず有
する。また、組換え体ＤＮＡを直接、動物体内に注射し
て遺伝子を発現させる方法も開発されているが、発現効
率および導入遺伝子の安定性の点で工業的規模の使用に
おける信頼性に欠ける。
【０００４】トランスジェニック動物の作製において導
入する組換え遺伝子は、ゲノミックＤＮＡでもｍＲＮＡ
に相補的なｃＤＮＡでもよい。さらに、該ＤＮＡの前後
に任意のプロモーター、エンハンサーおよび転写終結シ
グナルなどの遺伝子の発現制御領域を付加した組換え体
ＤＮＡも用いられる。
入する組換え遺伝子は、ゲノミックＤＮＡでもｍＲＮＡ
に相補的なｃＤＮＡでもよい。さらに、該ＤＮＡの前後
に任意のプロモーター、エンハンサーおよび転写終結シ
グナルなどの遺伝子の発現制御領域を付加した組換え体
ＤＮＡも用いられる。
【０００５】プロモーター、エンハンサーには、特定の
臓器・組織でのみ発現する性質を備えたもの（組織特異
的発現）、生物の成長過程の一定の時期にのみ発現する
性質を備えたもの（時期特異的発現）、細胞内外の環境
による刺激に反応する性質を備えたもの（刺激反応性）
等があるので、所望の遺伝子本来のプロモーターおよび
エンハンサーとは異なる性質をもつ、他の生物あるいは
他の遺伝子由来の発現制御領域配列を用いて組換え体を
作製し、そして生物体内に導入することにより、トラン
スジェニック生物体内で所望の時期および位置に所望の
異種遺伝子を発現させることが可能である［特開平３−
２１０１８７号］。
臓器・組織でのみ発現する性質を備えたもの（組織特異
的発現）、生物の成長過程の一定の時期にのみ発現する
性質を備えたもの（時期特異的発現）、細胞内外の環境
による刺激に反応する性質を備えたもの（刺激反応性）
等があるので、所望の遺伝子本来のプロモーターおよび
エンハンサーとは異なる性質をもつ、他の生物あるいは
他の遺伝子由来の発現制御領域配列を用いて組換え体を
作製し、そして生物体内に導入することにより、トラン
スジェニック生物体内で所望の時期および位置に所望の
異種遺伝子を発現させることが可能である［特開平３−
２１０１８７号］。
【０００６】天然のミルク蛋白質遺伝子、例えばアルフ
ァ・カゼイン遺伝子は、プロラクチン、インシュリン、
グルココルチコイド、プロジェステロン、エストロジェ
ンなどの各種ホルモンの刺激に反応する遺伝子領域すな
わちホルモン反応性エレメントを持ち、泌乳期の乳腺に
おいて、時期特異的かつ組織特異的に発現するように調
節される。ミルク蛋白質遺伝子の発現制御領域を付加し
た組換え遺伝子は、これを導入したトランスジェニック
動物の乳腺において、天然のミルク蛋白質遺伝子と同様
に転写および翻訳され、そして組換え遺伝子がコードす
る蛋白質を分泌させることができる［特開昭６３−２９
１号］。また、乳清蛋白質（ＷＡＰ、βラクトグロブリ
ン）遺伝子を含む発現ベクターを利用した、外来遺伝子
産物のミルク中への分泌技術も開示されている［特開昭
６３−２９１号、特表昭６４−５００１６２号］。
ァ・カゼイン遺伝子は、プロラクチン、インシュリン、
グルココルチコイド、プロジェステロン、エストロジェ
ンなどの各種ホルモンの刺激に反応する遺伝子領域すな
わちホルモン反応性エレメントを持ち、泌乳期の乳腺に
おいて、時期特異的かつ組織特異的に発現するように調
節される。ミルク蛋白質遺伝子の発現制御領域を付加し
た組換え遺伝子は、これを導入したトランスジェニック
動物の乳腺において、天然のミルク蛋白質遺伝子と同様
に転写および翻訳され、そして組換え遺伝子がコードす
る蛋白質を分泌させることができる［特開昭６３−２９
１号］。また、乳清蛋白質（ＷＡＰ、βラクトグロブリ
ン）遺伝子を含む発現ベクターを利用した、外来遺伝子
産物のミルク中への分泌技術も開示されている［特開昭
６３−２９１号、特表昭６４−５００１６２号］。
【０００７】ｍＣ２６遺伝子産物は、乳腺で泌乳期特異
的かつ組織特異的に多量に発現する遺伝子として同定さ
れ［サトウ（Ｓａｔｏｗ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９
９，１６３９−１６４３（１９８６）］、また、その後
ドーベンコ（Ｄｏｗｂｅｎｋｏ）ら［Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖ
ｏｌ ２６８，Ｎｏ．６：４５２５−４５２９（１９９
３）］により白血球接着分子として同定され、ＧＬＹＣ
ＡＭ−１と呼ばれている分子である。該遺伝子座はマウ
スにおいてマップされており、該遺伝子の構造遺伝子部
分および周辺の一部のヌクレオチド配列は既に決定され
ている［ドーベンコ（Ｄｏｗｂｅｎｋｏ）ら、上記］。
的かつ組織特異的に多量に発現する遺伝子として同定さ
れ［サトウ（Ｓａｔｏｗ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９
９，１６３９−１６４３（１９８６）］、また、その後
ドーベンコ（Ｄｏｗｂｅｎｋｏ）ら［Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖ
ｏｌ ２６８，Ｎｏ．６：４５２５−４５２９（１９９
３）］により白血球接着分子として同定され、ＧＬＹＣ
ＡＭ−１と呼ばれている分子である。該遺伝子座はマウ
スにおいてマップされており、該遺伝子の構造遺伝子部
分および周辺の一部のヌクレオチド配列は既に決定され
ている［ドーベンコ（Ｄｏｗｂｅｎｋｏ）ら、上記］。
【０００８】ｍＣ２６遺伝子をクローン化してグルココ
ルチコイドレセプターを持つマウス線維芽細胞由来のＬ
細胞に導入し、遷移性発現および形質転換細胞中での発
現が検討されたが、該遺伝子に対するホルモンの作用が
従来の知見とは異なることが明らかとなり、さらに、該
遺伝子の転写産物が従来公知のｍＲＮＡとは異なる異常
なＲＮＡであることが判明した。即ち、ｍＣ２６遺伝子
が従来公知の他のカゼイン遺伝子とは異なった発現制御
機構を有することが明らかになった［カワムラ（ｋａｗ
ａｍｕｒａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１，１０３
−１１０（１９８７）］。
ルチコイドレセプターを持つマウス線維芽細胞由来のＬ
細胞に導入し、遷移性発現および形質転換細胞中での発
現が検討されたが、該遺伝子に対するホルモンの作用が
従来の知見とは異なることが明らかとなり、さらに、該
遺伝子の転写産物が従来公知のｍＲＮＡとは異なる異常
なＲＮＡであることが判明した。即ち、ｍＣ２６遺伝子
が従来公知の他のカゼイン遺伝子とは異なった発現制御
機構を有することが明らかになった［カワムラ（ｋａｗ
ａｍｕｒａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１，１０３
−１１０（１９８７）］。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】この事実に基づき、ｍ
Ｃ２６の発現系、特に転写エンハンサー／プロモーター
領域の機能を解明し、異種遺伝子の効果的発現を達成し
てｍＣ２６遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝
子発現制御実験モデル動物を創造し、さらに、所望の物
質を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とす
るトランスジェニック技術を確立すべく研究を行った。
即ち、本発明の目的は、ｍＣ２６の構造遺伝子およびそ
の発現に関与する周辺の制御領域を含むゲノミックＤＮ
Ａを用いて、大腸菌その他の宿主中で増幅するための組
換え発現ベクターを作製し、そして該ベクターを利用し
てｍＣ２６遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝
子発現制御実験モデル動物を創造し、そして所望の物質
を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とする
トランスジェニック技術を提供することである。
Ｃ２６の発現系、特に転写エンハンサー／プロモーター
領域の機能を解明し、異種遺伝子の効果的発現を達成し
てｍＣ２６遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝
子発現制御実験モデル動物を創造し、さらに、所望の物
質を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とす
るトランスジェニック技術を確立すべく研究を行った。
即ち、本発明の目的は、ｍＣ２６の構造遺伝子およびそ
の発現に関与する周辺の制御領域を含むゲノミックＤＮ
Ａを用いて、大腸菌その他の宿主中で増幅するための組
換え発現ベクターを作製し、そして該ベクターを利用し
てｍＣ２６遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝
子発現制御実験モデル動物を創造し、そして所望の物質
を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とする
トランスジェニック技術を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、ｍＣ２６の構造遺伝子およびその周
辺の発現制御領域、特に５’上流領域に位置するエンハ
ンサー／プロモーター領域を含む、ゲノミックＤＮＡの
塩基配列を決定し、該ＤＮＡを含む組換え発現ベクター
を作製した。そして該ベクターを利用してｍＣ２６遺伝
子の発現制御領域が動物細胞中で発現制御されることを
確認し、さらに、該ベクターを導入した動物の乳腺にお
いて所望の外来異種遺伝子が導入され、かつ、該遺伝子
産物が発現されることを確認して本発明を完成するに至
った。
を解決するために、ｍＣ２６の構造遺伝子およびその周
辺の発現制御領域、特に５’上流領域に位置するエンハ
ンサー／プロモーター領域を含む、ゲノミックＤＮＡの
塩基配列を決定し、該ＤＮＡを含む組換え発現ベクター
を作製した。そして該ベクターを利用してｍＣ２６遺伝
子の発現制御領域が動物細胞中で発現制御されることを
確認し、さらに、該ベクターを導入した動物の乳腺にお
いて所望の外来異種遺伝子が導入され、かつ、該遺伝子
産物が発現されることを確認して本発明を完成するに至
った。
【００１１】本発明によれば、以下に示すＤＮＡ： （ｉ）図４に示す２３０４ｂｐのｍＣ２６遺伝子の５’
上流発現制御領域； （ii）図５に示す２３２０ｂｐのｍＣ２６構造遺伝子部
分；および （iii）図６に示す７７０ｂｐのｍＣ２６遺伝子の３’
下流発現制御領域；を転写方向に順番に含む発現カセッ
トとしてのＤＮＡが提供される。
上流発現制御領域； （ii）図５に示す２３２０ｂｐのｍＣ２６構造遺伝子部
分；および （iii）図６に示す７７０ｂｐのｍＣ２６遺伝子の３’
下流発現制御領域；を転写方向に順番に含む発現カセッ
トとしてのＤＮＡが提供される。
【００１２】本発明の一つの態様として、上記（ii）の
全部または一部を外来異種遺伝子に置換するか、または
（ii）のいずれか１カ所に外来異種遺伝子を挿入した発
現カセットが提供される。そのような異種遺伝子は、特
に限定されない。
全部または一部を外来異種遺伝子に置換するか、または
（ii）のいずれか１カ所に外来異種遺伝子を挿入した発
現カセットが提供される。そのような異種遺伝子は、特
に限定されない。
【００１３】上記発現カセットの作製においては、
（１）図５中の第１エクソン（配列番号１中、第２３０
５ヌクレオチド〜第２４１８ヌクレオチド）を含ませる
ことにより、下流に連結された異種遺伝子蛋白質を細胞
外に分泌させるためのシグナル配列を付加すること、お
よび（２）図５中の第２エクソン（配列番号１中、第３
１４５ヌクレオチド〜第３１８８ヌクレオチド）、第３
エクソン（配列番号１中、第３９２８ヌクレオチド〜第
４１４３ヌクレオチド）、および第４エクソン（配列番
号１中、第４３７２ヌクレオチド〜第４６２４ヌクレオ
チド）を分断または削除して、スプライシングに関与す
ると考えられる第１イントロン（配列番号１中、第２４
１９ヌクレオチド〜第３１４４ヌクレオチド）、第２イ
ントロン（配列番号１中、第３１８９ヌクレオチド〜第
３９２７ヌクレオチド）、および第３イントロン（配列
番号１中、第４１４４ヌクレオチド〜第４３７１ヌクレ
オチド）を全てまたは一部連結した形で含ませることに
より、発現の効率をさらに増加させること；等が好まし
いが、異種遺伝子産物の分泌効率、異種遺伝子の種類、
および組換えＤＮＡの連結の容易性等を考慮して、各々
の場合において、これらのファクターを適宜選択するこ
とが好ましい。
（１）図５中の第１エクソン（配列番号１中、第２３０
５ヌクレオチド〜第２４１８ヌクレオチド）を含ませる
ことにより、下流に連結された異種遺伝子蛋白質を細胞
外に分泌させるためのシグナル配列を付加すること、お
よび（２）図５中の第２エクソン（配列番号１中、第３
１４５ヌクレオチド〜第３１８８ヌクレオチド）、第３
エクソン（配列番号１中、第３９２８ヌクレオチド〜第
４１４３ヌクレオチド）、および第４エクソン（配列番
号１中、第４３７２ヌクレオチド〜第４６２４ヌクレオ
チド）を分断または削除して、スプライシングに関与す
ると考えられる第１イントロン（配列番号１中、第２４
１９ヌクレオチド〜第３１４４ヌクレオチド）、第２イ
ントロン（配列番号１中、第３１８９ヌクレオチド〜第
３９２７ヌクレオチド）、および第３イントロン（配列
番号１中、第４１４４ヌクレオチド〜第４３７１ヌクレ
オチド）を全てまたは一部連結した形で含ませることに
より、発現の効率をさらに増加させること；等が好まし
いが、異種遺伝子産物の分泌効率、異種遺伝子の種類、
および組換えＤＮＡの連結の容易性等を考慮して、各々
の場合において、これらのファクターを適宜選択するこ
とが好ましい。
【００１４】本発明は、さらに、上記発現カセットを含
む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを哺乳動物の
胚細胞に導入することからなる、トランスジェニック動
物の生産方法に関する。該生産方法において、上記
（ｉ）および（iii）の領域に代えて、（ｉ）のさらに
５’上流領域、および（iii）のさらに３’下流領域を
含むＤＮＡ断片も使用することができる。例えば、図１
中の約１２．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、または図２中の
約６．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を用いることができる。
む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを哺乳動物の
胚細胞に導入することからなる、トランスジェニック動
物の生産方法に関する。該生産方法において、上記
（ｉ）および（iii）の領域に代えて、（ｉ）のさらに
５’上流領域、および（iii）のさらに３’下流領域を
含むＤＮＡ断片も使用することができる。例えば、図１
中の約１２．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、または図２中の
約６．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を用いることができる。
【００１５】本発明の別の側面においては、図４または
図６に示す配列を有するＤＮＡ断片の全てまたは一部
を、それぞれ、従来公知のあらゆる遺伝子を発現するた
めの発現制御領域として用いうることは、当業者であれ
ば認識されるであろう。
図６に示す配列を有するＤＮＡ断片の全てまたは一部
を、それぞれ、従来公知のあらゆる遺伝子を発現するた
めの発現制御領域として用いうることは、当業者であれ
ば認識されるであろう。
【００１６】本明細書において使用されるベクターなる
用語は、プラスミド由来のもの、バクテリオファージ由
来のものを含むように意図するものとして使用され、本
発明においては大腸菌由来のものが好ましく、特にλフ
ァージが好ましいが、これらに限定されない。
用語は、プラスミド由来のもの、バクテリオファージ由
来のものを含むように意図するものとして使用され、本
発明においては大腸菌由来のものが好ましく、特にλフ
ァージが好ましいが、これらに限定されない。
【００１７】本明細書において、「ＥｃｏＲＩ断片」な
る記載は、両末端がＥｃｏＲＩ認識配列であるＤＮＡ断
片を意味し、また、「ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片」なる記載は、一方の末端がＥｃｏＲＩ認識配列であ
り他方の末端がＨｉｎｄＩＩＩ認識配列であるＤＮＡ断
片を意味する。他の制限酵素による同様の表記も、同等
の意味をなすものとして用いられる。
る記載は、両末端がＥｃｏＲＩ認識配列であるＤＮＡ断
片を意味し、また、「ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片」なる記載は、一方の末端がＥｃｏＲＩ認識配列であ
り他方の末端がＨｉｎｄＩＩＩ認識配列であるＤＮＡ断
片を意味する。他の制限酵素による同様の表記も、同等
の意味をなすものとして用いられる。
【００１８】本明細書において使用されるＤＮＡ断片の
大きさの表示に関して、下一桁までを明記してある配列
を除き、０．１ｋｂ単位にて表示されている配列は、電
気泳動によるおおよそのサイズを示す。従って、実際の
ヌクレオチド数と表示塩基対（ｂｐ）数には多少の誤差
があることは、当業者には認識されるであろう。
大きさの表示に関して、下一桁までを明記してある配列
を除き、０．１ｋｂ単位にて表示されている配列は、電
気泳動によるおおよそのサイズを示す。従って、実際の
ヌクレオチド数と表示塩基対（ｂｐ）数には多少の誤差
があることは、当業者には認識されるであろう。
【００１９】ｍＣ２６遺伝子の５’上流発現制御領域
（図４）および３’下流発現制御領域（図６）のヌクレ
オチド配列は一部公表されているが［ドーベンコ（Ｄｏ
ｗｂｅｎｋｏ）ら、上記文献］、本発明において初めて
明らかにされた配列を含む上記領域が異種遺伝子の大量
発現に必須であることが明らかとなった。
（図４）および３’下流発現制御領域（図６）のヌクレ
オチド配列は一部公表されているが［ドーベンコ（Ｄｏ
ｗｂｅｎｋｏ）ら、上記文献］、本発明において初めて
明らかにされた配列を含む上記領域が異種遺伝子の大量
発現に必須であることが明らかとなった。
【００２０】以下の記載において、当業界において常法
として用いられる組換えＤＮＡ技術は、特筆しない限り
以下の文献：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、サ
ムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッシュ（Ｆｒｉ
ｓｔｃｈ）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）著、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）；Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、デービス（Ｄａｖ
ｉｓ）、ディブナー（Ｄｉｂｎｅｒ）、バッテイ（Ｂａ
ｔｔｅｙ）著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８６）；等に記載されている技術を使用して実施
することが可能である。
として用いられる組換えＤＮＡ技術は、特筆しない限り
以下の文献：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、サ
ムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッシュ（Ｆｒｉ
ｓｔｃｈ）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）著、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）；Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、デービス（Ｄａｖ
ｉｓ）、ディブナー（Ｄｉｂｎｅｒ）、バッテイ（Ｂａ
ｔｔｅｙ）著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８６）；等に記載されている技術を使用して実施
することが可能である。
【００２１】（１）ＤＮＡ断片の調製 本発明のｍＣ２６構造遺伝子（図５）、該構造遺伝子の
５’上流発現制御領域（図４）、および該構造遺伝子の
３’下流発現制御領域（図６）各々のＤＮＡ断片は一緒
にあるいは別々に、公知の方法を利用してマウスゲノミ
ックＤＮＡライブラリーから取得することができる。
５’上流発現制御領域（図４）、および該構造遺伝子の
３’下流発現制御領域（図６）各々のＤＮＡ断片は一緒
にあるいは別々に、公知の方法を利用してマウスゲノミ
ックＤＮＡライブラリーから取得することができる。
【００２２】本発明では、従来のオリゴマープローブを
用いる方法、またはメッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡ
プローブを作製して用いる２種類の方法［オリゴ（ｄ
Ｔ）プライマー法およびランダムプライマー法］に加え
て、ｍＲＮＡを直接プローブとする方法を好ましい方法
として記載するが、これらの方法に限定されない。
用いる方法、またはメッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡ
プローブを作製して用いる２種類の方法［オリゴ（ｄ
Ｔ）プライマー法およびランダムプライマー法］に加え
て、ｍＲＮＡを直接プローブとする方法を好ましい方法
として記載するが、これらの方法に限定されない。
【００２３】（ｉ）オリゴマーＤＮＡプローブによる方
法 オリゴマーＤＮＡプローブ法に用いるプローブは２０塩
基前後またはそれ以上の長さであり、かつ、染色体ＤＮ
Ａ中に高頻度に反復する配列を含まないことが好まし
い。
法 オリゴマーＤＮＡプローブ法に用いるプローブは２０塩
基前後またはそれ以上の長さであり、かつ、染色体ＤＮ
Ａ中に高頻度に反復する配列を含まないことが好まし
い。
【００２４】例えば、ｍＣ２６遺伝子の第１エクソン中
の配列： ５’ＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＣ ３’（配列番号３）； ５’ＴＧＧＣＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＡＡ ３’（配列番号４）； ５’ＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＡＡＴＣＴＣ ３’（配列番号５）；およ び ５’ＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣ ３’（配列番号６） の内の少なくとも一つを用いることが好ましいが、これ
らに限定されない。
の配列： ５’ＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＣ ３’（配列番号３）； ５’ＴＧＧＣＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＡＡ ３’（配列番号４）； ５’ＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＡＡＴＣＴＣ ３’（配列番号５）；およ び ５’ＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣ ３’（配列番号６） の内の少なくとも一つを用いることが好ましいが、これ
らに限定されない。
【００２５】合成ＤＮＡの標識法は特に限定されないが
放射性標識による方法が一般的である。標識プローブを
用いてマウスゲノミックＤＮＡライブラリーからハイブ
リダイゼーションによりｍＣ２６遺伝子ＤＮＡを取得す
る方法は、公知の方法を用いることができる［Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、サムブルックら、前
記］。ヒトあるいはマウスなどのゲノミックＤＮＡライ
ブラリーは市販品を利用できる。
放射性標識による方法が一般的である。標識プローブを
用いてマウスゲノミックＤＮＡライブラリーからハイブ
リダイゼーションによりｍＣ２６遺伝子ＤＮＡを取得す
る方法は、公知の方法を用いることができる［Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、サムブルックら、前
記］。ヒトあるいはマウスなどのゲノミックＤＮＡライ
ブラリーは市販品を利用できる。
【００２６】マウス以外の動物種のｍＣ２６に相当する
遺伝子を得る場合は、種間の塩基配列の変異を考慮する
必要がある。即ち、ハイブリダイゼーションにおける温
度または反応溶液の組成を変更することにより選択度を
下げることが望ましい。別法としては、コドンの縮重を
考慮することが好ましい。上記は全て市販の試薬および
機械・装置を利用して、常法に従って実施することがで
きる。
遺伝子を得る場合は、種間の塩基配列の変異を考慮する
必要がある。即ち、ハイブリダイゼーションにおける温
度または反応溶液の組成を変更することにより選択度を
下げることが望ましい。別法としては、コドンの縮重を
考慮することが好ましい。上記は全て市販の試薬および
機械・装置を利用して、常法に従って実施することがで
きる。
【００２７】（ii）メッセンジャーＲＮＡ法 メッセンジャーＲＮＡ法に用いるｍＲＮＡは常法に従っ
て単離する。使用する動物は限定されないが、ヒト、ヤ
ギおよびマウスが好ましく、そして組織は特に限定され
ないが泌乳最盛期の乳腺が好ましい。通常、ｍＲＮＡか
らｃＤＮＡプローブを作製する際のプライマーは、オリ
ゴｄＴプライマーおよびランダム（ヘキサマー）プライ
マーが用いられ、共に市販品を利用することができる。
そして、これらプライマーを常法に従って標識する。こ
れら２種類のプライマーを用いて調製されたｃＤＮＡプ
ローブに加えて、さらにｍＲＮＡのキャップ構造部分を
標識したプローブ、即ち、キャップラベル・プローブを
作製してスクリーニングに使用することができる。該プ
ローブの標識は市販の放射標識キャップ類縁体、および
グアニリル・トランスフェラーゼ（例えば、ベセスダリ
サーチ社）などを利用して使用説明書に従って実施する
ことができる。
て単離する。使用する動物は限定されないが、ヒト、ヤ
ギおよびマウスが好ましく、そして組織は特に限定され
ないが泌乳最盛期の乳腺が好ましい。通常、ｍＲＮＡか
らｃＤＮＡプローブを作製する際のプライマーは、オリ
ゴｄＴプライマーおよびランダム（ヘキサマー）プライ
マーが用いられ、共に市販品を利用することができる。
そして、これらプライマーを常法に従って標識する。こ
れら２種類のプライマーを用いて調製されたｃＤＮＡプ
ローブに加えて、さらにｍＲＮＡのキャップ構造部分を
標識したプローブ、即ち、キャップラベル・プローブを
作製してスクリーニングに使用することができる。該プ
ローブの標識は市販の放射標識キャップ類縁体、および
グアニリル・トランスフェラーゼ（例えば、ベセスダリ
サーチ社）などを利用して使用説明書に従って実施する
ことができる。
【００２８】上記ｃＤＮＡプローブによるスクリーニン
グは常法を用いることが可能であるが、エクソンが数十
ｂｐ程度の長さしかない遺伝子が多数報告されているこ
とを考慮して、プローブの全長は長い方が良いとは限ら
ず、比較的長いプローブ（約５００ｂｐ）と比較的短い
プローブ（約３０ｂｐ）に分けて結果を比較することが
好ましい。
グは常法を用いることが可能であるが、エクソンが数十
ｂｐ程度の長さしかない遺伝子が多数報告されているこ
とを考慮して、プローブの全長は長い方が良いとは限ら
ず、比較的長いプローブ（約５００ｂｐ）と比較的短い
プローブ（約３０ｂｐ）に分けて結果を比較することが
好ましい。
【００２９】ゲノミックＤＮＡライブラリーの作製に用
いる動物は哺乳類が好ましく、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサ
ギ、ラットおよびマウスが特に好ましい。ヒトおよびマ
ウス等では市販品ゲノミックＤＮＡライブラリーも利用
することができる。使用する組織は特に限定されないが
肝臓が好ましい。次に、このＤＮＡを制限酵素で完全ま
たは部分消化することにより１５〜２０ｋｂｐのＤＮＡ
断片を分画する。制限酵素は特に限定されないがＥｃｏ
ＲＩが好ましい。染色体ＤＮＡの抽出、制限酵素分解お
よび超遠心分画は、常法により行うことができ、ライブ
ラリー作製に用いるベクターは、プラスミド、バクテリ
オファージ、コスミッドの何れを用いてもよいが、λフ
ァージが特に好ましく、市販品を利用できる。
いる動物は哺乳類が好ましく、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサ
ギ、ラットおよびマウスが特に好ましい。ヒトおよびマ
ウス等では市販品ゲノミックＤＮＡライブラリーも利用
することができる。使用する組織は特に限定されないが
肝臓が好ましい。次に、このＤＮＡを制限酵素で完全ま
たは部分消化することにより１５〜２０ｋｂｐのＤＮＡ
断片を分画する。制限酵素は特に限定されないがＥｃｏ
ＲＩが好ましい。染色体ＤＮＡの抽出、制限酵素分解お
よび超遠心分画は、常法により行うことができ、ライブ
ラリー作製に用いるベクターは、プラスミド、バクテリ
オファージ、コスミッドの何れを用いてもよいが、λフ
ァージが特に好ましく、市販品を利用できる。
【００３０】比活性の低いプローブを用いる場合、およ
び／またはシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が低い場合
は、コロニーの形成またはファージプラークの形成にあ
たり、高濃度にカザミノ酸を含有するスーパーブロス
等、高栄養価の培地を用いる。宿主として大腸菌を用い
る場合はＬＥ３９２またはＪＭ系の菌株が好ましい。ハ
イブリダイゼーションに用いるフィルターは特に限定さ
れないが、ニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ社製Ｂ
Ａ８５など）が好ましい。
び／またはシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が低い場合
は、コロニーの形成またはファージプラークの形成にあ
たり、高濃度にカザミノ酸を含有するスーパーブロス
等、高栄養価の培地を用いる。宿主として大腸菌を用い
る場合はＬＥ３９２またはＪＭ系の菌株が好ましい。ハ
イブリダイゼーションに用いるフィルターは特に限定さ
れないが、ニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ社製Ｂ
Ａ８５など）が好ましい。
【００３１】挿入されるべきＤＮＡのサイズによっては
ベクターが不安定になるために、期待される信号強度が
得られない場合がある。このような場合は、１枚のプレ
ートから３枚のフィルターにブロットし、プラークを選
別する際、各スポットの信号強度を強度、中度、弱度の
３段階にクラス分けすることが好ましい。
ベクターが不安定になるために、期待される信号強度が
得られない場合がある。このような場合は、１枚のプレ
ートから３枚のフィルターにブロットし、プラークを選
別する際、各スポットの信号強度を強度、中度、弱度の
３段階にクラス分けすることが好ましい。
【００３２】得られたクローン遺伝子が乳腺で組織特異
的に発現することを確認するためには、乳腺以外の組
織、例えば肝臓から上記操作により作製されたプローブ
を対照とする。
的に発現することを確認するためには、乳腺以外の組
織、例えば肝臓から上記操作により作製されたプローブ
を対照とする。
【００３３】また、得られたクローン遺伝子が、乳腺中
で、しかも時期特異的に発現することを確認するために
は、泌乳期以外の乳腺、例えば、未経産成熟動物の乳腺
から上記操作により作製されたプローブを対照とする。
で、しかも時期特異的に発現することを確認するために
は、泌乳期以外の乳腺、例えば、未経産成熟動物の乳腺
から上記操作により作製されたプローブを対照とする。
【００３４】以上の操作によって得られる乳腺特異的に
発現する遺伝子クローン群中には、動物種により差異が
あるが、一般に、α、β、γ、δ、εなどのカゼイン蛋
白質遺伝子群［特開昭６３−３０９１９２］、ＷＡＰ、
αラクトアルブミン、βラクトグロブリン［特開平３−
５０５６７４］などのホェー蛋白質遺伝子群［特開昭６
３−２９１］などの複数の既知のミルク蛋白遺伝子が存
在する。これらは、ノーザン・ハイブリダイゼーション
によるほか、それぞれの遺伝子のヌクレオチド配列を参
考にして作製したオリゴマーＤＮＡプローブを用い、常
法を用いてハイブリダイゼーションを行うことにより判
別することができる。あるいは、それぞれのクローンＤ
ＮＡの一部の塩基配列を決定することによっても判別で
きる。特に、βカゼインのｍＲＮＡの大きさはｍＣ２６
蛋白質遺伝子のｍＲＮＡの大きさに近いので、塩基配列
決定により確認することが好ましい。
発現する遺伝子クローン群中には、動物種により差異が
あるが、一般に、α、β、γ、δ、εなどのカゼイン蛋
白質遺伝子群［特開昭６３−３０９１９２］、ＷＡＰ、
αラクトアルブミン、βラクトグロブリン［特開平３−
５０５６７４］などのホェー蛋白質遺伝子群［特開昭６
３−２９１］などの複数の既知のミルク蛋白遺伝子が存
在する。これらは、ノーザン・ハイブリダイゼーション
によるほか、それぞれの遺伝子のヌクレオチド配列を参
考にして作製したオリゴマーＤＮＡプローブを用い、常
法を用いてハイブリダイゼーションを行うことにより判
別することができる。あるいは、それぞれのクローンＤ
ＮＡの一部の塩基配列を決定することによっても判別で
きる。特に、βカゼインのｍＲＮＡの大きさはｍＣ２６
蛋白質遺伝子のｍＲＮＡの大きさに近いので、塩基配列
決定により確認することが好ましい。
【００３５】（２）構造遺伝子の決定 得られたｍＣ２６蛋白質遺伝子の発現制御領域と構造遺
伝子部分を決定するためには、以下の方法により実施す
ることができる。
伝子部分を決定するためには、以下の方法により実施す
ることができる。
【００３６】得られたクローンＤＮＡを各種の制限酵素
により、それぞれ完全消化あるいは部分消化することに
より、制限酵素マップを作製する。このとき、それぞれ
の分解産物を各々３等分し、３枚のゲルに同時に電気泳
動した後、それぞれのゲル中の断片を計３枚のフィルタ
ーにサザーン・トランスファーする。クローンのスクリ
ーニングに用いた３種のプローブの各々を上記の３枚の
フィルターのうちの一枚にそれぞれ反応させ、サザーン
・ハイブリダイゼーションを行う。これにより、構造遺
伝子部分のうち、５’末端、中間のエクソン、３’末端
を含む断片がそれぞれ決定できる。以上は常法および本
発明に記載された方法を用いて行うことができる。
により、それぞれ完全消化あるいは部分消化することに
より、制限酵素マップを作製する。このとき、それぞれ
の分解産物を各々３等分し、３枚のゲルに同時に電気泳
動した後、それぞれのゲル中の断片を計３枚のフィルタ
ーにサザーン・トランスファーする。クローンのスクリ
ーニングに用いた３種のプローブの各々を上記の３枚の
フィルターのうちの一枚にそれぞれ反応させ、サザーン
・ハイブリダイゼーションを行う。これにより、構造遺
伝子部分のうち、５’末端、中間のエクソン、３’末端
を含む断片がそれぞれ決定できる。以上は常法および本
発明に記載された方法を用いて行うことができる。
【００３７】次に、それぞれの制限酵素による消化断片
ＤＮＡと乳腺から抽出して精製したｍＲＮＡあるいは市
販されている発現ベクター、例えばｐＢｌｕｅＳｃｒｉ
ｐｔＩＩ（プロメガ社）のプロモーターを利用して作製
したリボプローブとを用いて、Ｓ１マッピング法によ
り、５’末端、中間のエクソン、３’末端の正確な位置
をそれぞれ決定することが可能である。正確を期するた
めに、必要に応じてプライマーエクステンション法また
はＰＣＲ法を併用する。
ＤＮＡと乳腺から抽出して精製したｍＲＮＡあるいは市
販されている発現ベクター、例えばｐＢｌｕｅＳｃｒｉ
ｐｔＩＩ（プロメガ社）のプロモーターを利用して作製
したリボプローブとを用いて、Ｓ１マッピング法によ
り、５’末端、中間のエクソン、３’末端の正確な位置
をそれぞれ決定することが可能である。正確を期するた
めに、必要に応じてプライマーエクステンション法また
はＰＣＲ法を併用する。
【００３８】以上により決定した構造遺伝子の位置に基
づき、常法により染色体ＤＮＡの塩基配列を決定する。
この結果得られた情報に基づき、該塩基配列の一部を含
むオリゴマーＤＮＡを合成し、これをプライマーとして
プライマーエクステンション法またはＰＣＲ法を行うこ
とにより、遺伝子の構造を再度確認する。
づき、常法により染色体ＤＮＡの塩基配列を決定する。
この結果得られた情報に基づき、該塩基配列の一部を含
むオリゴマーＤＮＡを合成し、これをプライマーとして
プライマーエクステンション法またはＰＣＲ法を行うこ
とにより、遺伝子の構造を再度確認する。
【００３９】配列番号１は、マウスｍＣ２６蛋白質遺伝
子の全構造遺伝子とその５’上流域および３’下流域に
位置する制御領域ＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ認識部位から
ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位までの５３９４ｂｐの塩基配列
を示す（図４、図５および図６をこの順序で連結したも
のが配列番号１に相当する）。
子の全構造遺伝子とその５’上流域および３’下流域に
位置する制御領域ＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ認識部位から
ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位までの５３９４ｂｐの塩基配列
を示す（図４、図５および図６をこの順序で連結したも
のが配列番号１に相当する）。
【００４０】（３）発現ベクターの構築 最初に、上記方法に従って調製されたｍＣ２６構造遺伝
子を含むＥｃｏＲＩ断片を、適当なベクターのＥｃｏＲ
Ｉ切断部位に挿入し、該ベクターの宿主内でＤＮＡを増
幅した後回収する。用いるベクターは特に限定されな
い。
子を含むＥｃｏＲＩ断片を、適当なベクターのＥｃｏＲ
Ｉ切断部位に挿入し、該ベクターの宿主内でＤＮＡを増
幅した後回収する。用いるベクターは特に限定されな
い。
【００４１】図５に示すとおり、ｍＣ２６構造遺伝子は
第１ないし第４エクソンおよび第１ないし第３イントロ
ンからなる。第１エクソンは蛋白質の分泌に関与し、各
イントロンはスプライシングに関与することが予測され
るので、異種遺伝子の種類あるいは組換えＤＮＡの作製
容易性等を考慮して、適宜、これらの領域を分断、除去
あるいは残して異種遺伝子をｍＣ２６構造遺伝子部分の
いずれかに挿入することが好ましい。
第１ないし第４エクソンおよび第１ないし第３イントロ
ンからなる。第１エクソンは蛋白質の分泌に関与し、各
イントロンはスプライシングに関与することが予測され
るので、異種遺伝子の種類あるいは組換えＤＮＡの作製
容易性等を考慮して、適宜、これらの領域を分断、除去
あるいは残して異種遺伝子をｍＣ２６構造遺伝子部分の
いずれかに挿入することが好ましい。
【００４２】以下において、ｍＣ２６構造遺伝子部分を
全てまたは一部除去するための方法：簡易な発現ベクタ
ー構築法（構築法Ａ）；およびｍＣ２６構造遺伝子の転
写開始点または第１エクソンから転写終結点までを正確
に除去するための方法（構築法Ｂ）；を例示するが、こ
れらの方法に限定されない。
全てまたは一部除去するための方法：簡易な発現ベクタ
ー構築法（構築法Ａ）；およびｍＣ２６構造遺伝子の転
写開始点または第１エクソンから転写終結点までを正確
に除去するための方法（構築法Ｂ）；を例示するが、こ
れらの方法に限定されない。
【００４３】構築法Ａ （ｉ）制限酵素断片の作製 ｍＣ２６遺伝子の転写開始点あるいは第１エクソンの終
端を切断する制限酵素（酵素Ａ１とする。以下同様）な
らびに転写終結点の近傍を切断する制限酵素（酵素Ａ
２）により、上記の増幅したＤＮＡを切断する。一方、
乳腺中で生産することを希望する遺伝子を含むインサー
トＤＮＡ断片を同様の方法で調製する（酵素Ａ３および
酵素Ａ４）。
端を切断する制限酵素（酵素Ａ１とする。以下同様）な
らびに転写終結点の近傍を切断する制限酵素（酵素Ａ
２）により、上記の増幅したＤＮＡを切断する。一方、
乳腺中で生産することを希望する遺伝子を含むインサー
トＤＮＡ断片を同様の方法で調製する（酵素Ａ３および
酵素Ａ４）。
【００４４】酵素Ａ１およびＡ３、および酵素Ａ２およ
びＡ４がそれぞれ同一で、かつ、生じた断片の末端が平
滑末端でない場合は、常法によりベクターおよびインサ
ートの２つのＤＮＡ断片をそのまま連結でき、ＤＮＡリ
ガーゼにより１つの環状ＤＮＡとして回収できる。
びＡ４がそれぞれ同一で、かつ、生じた断片の末端が平
滑末端でない場合は、常法によりベクターおよびインサ
ートの２つのＤＮＡ断片をそのまま連結でき、ＤＮＡリ
ガーゼにより１つの環状ＤＮＡとして回収できる。
【００４５】酵素Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４のそれぞ
れが相異なる場合および生じた断片の末端が平滑末端で
ある場合は、ベクターおよびインサートの２つの断片を
適切に結合するために、後述する合成リンカー法または
ブラントエンド法の２つの方法のいずれかを利用する。
れが相異なる場合および生じた断片の末端が平滑末端で
ある場合は、ベクターおよびインサートの２つの断片を
適切に結合するために、後述する合成リンカー法または
ブラントエンド法の２つの方法のいずれかを利用する。
【００４６】（ii）使用に適する制限酵素 上記（ｉ）で使用するのに適する制限酵素の例を下記に
示すが、これらに限定されない。
示すが、これらに限定されない。
【００４７】酵素Ａ１（ｍＣ２６遺伝子の転写開始点の
５’末端あるいは第１エクソンの終端の近傍を切断する
酵素） 第１群 ＧｓｕＩ，ＢｓｍＩ，ＡｐｙＩ，ＥｃｏＲＩ
Ｉ，ＢｓｔＮＩ，ＭｖａＩ，ＳｃｒＦＩ，ＢｓａＪＩ； 第２群 ＡｌｕＩ； 第３群 ＢｓｒＩ，ＸｍｎＩ，ＭｂｏＩＩ； 第４群 ＡｐｙＩ，ＥｃｏＲＩＩ，ＢｓｔＮＩ，Ｍｖａ
Ｉ，ＳｃｒＦＩ； 第５群 Ａｌｗ４４Ｉ，ＡｐａＬＩ，Ｂｓｐ１２８６
Ｉ，ＳｄｕＩ，ＨｇｉＡＩ，ＤｄｅＩ，ＢｓｍＡＩ； 酵素Ａ２（ｍＣ２６遺伝子の転写終結点の３’末端の近
傍を切断する酵素） 第１群 ＤｄｅＩ，ＢｓｌＩ； 第２群 ＢｃｎＩ，ＣａｕＩＩ，ＮｃｉＩ，ＳｃｒＦ
Ｉ； 第３群 ＢｓａＪＩ，ＢｃｎＩ，ＣａｕＩＩ，Ｎｃｉ
Ｉ，ＳｃｒＦＩ； 第４群 ＸｂａＩ； （iii）合成リンカー法 ベクターＤＮＡおよびインサートＤＮＡの両断片中に存
在する制限酵素認識部位等を考慮の上、双方のＤＮＡの
末端が互いに粘着性末端となるべく設計した合成ＤＮＡ
すなわちリンカーＤＮＡを両ＤＮＡ断片にそれぞれ共有
結合により連結する。
５’末端あるいは第１エクソンの終端の近傍を切断する
酵素） 第１群 ＧｓｕＩ，ＢｓｍＩ，ＡｐｙＩ，ＥｃｏＲＩ
Ｉ，ＢｓｔＮＩ，ＭｖａＩ，ＳｃｒＦＩ，ＢｓａＪＩ； 第２群 ＡｌｕＩ； 第３群 ＢｓｒＩ，ＸｍｎＩ，ＭｂｏＩＩ； 第４群 ＡｐｙＩ，ＥｃｏＲＩＩ，ＢｓｔＮＩ，Ｍｖａ
Ｉ，ＳｃｒＦＩ； 第５群 Ａｌｗ４４Ｉ，ＡｐａＬＩ，Ｂｓｐ１２８６
Ｉ，ＳｄｕＩ，ＨｇｉＡＩ，ＤｄｅＩ，ＢｓｍＡＩ； 酵素Ａ２（ｍＣ２６遺伝子の転写終結点の３’末端の近
傍を切断する酵素） 第１群 ＤｄｅＩ，ＢｓｌＩ； 第２群 ＢｃｎＩ，ＣａｕＩＩ，ＮｃｉＩ，ＳｃｒＦ
Ｉ； 第３群 ＢｓａＪＩ，ＢｃｎＩ，ＣａｕＩＩ，Ｎｃｉ
Ｉ，ＳｃｒＦＩ； 第４群 ＸｂａＩ； （iii）合成リンカー法 ベクターＤＮＡおよびインサートＤＮＡの両断片中に存
在する制限酵素認識部位等を考慮の上、双方のＤＮＡの
末端が互いに粘着性末端となるべく設計した合成ＤＮＡ
すなわちリンカーＤＮＡを両ＤＮＡ断片にそれぞれ共有
結合により連結する。
【００４８】実際に使用されるリンカーＤＮＡの配列お
よび共有結合反応の方法の詳細は、挿入しようとする遺
伝子の塩基配列によりそれぞれ異なるが、多くの場合は
市販品を利用でき、また、希望する配列のリンカーＤＮ
Ａを設計し、常法により合成することができる。
よび共有結合反応の方法の詳細は、挿入しようとする遺
伝子の塩基配列によりそれぞれ異なるが、多くの場合は
市販品を利用でき、また、希望する配列のリンカーＤＮ
Ａを設計し、常法により合成することができる。
【００４９】この結果得られたＤＮＡ断片をＤＮＡリガ
ーゼにより連結する。この粘着性末端の結合によって生
じる二本鎖ＤＮＡ部分が、制限酵素の認識部位となるよ
うに塩基配列を選ぶことにより、同部位をふたたび制限
酵素で正確に切断されるように設計することも可能であ
る。以上は全て常法により行うことができる。
ーゼにより連結する。この粘着性末端の結合によって生
じる二本鎖ＤＮＡ部分が、制限酵素の認識部位となるよ
うに塩基配列を選ぶことにより、同部位をふたたび制限
酵素で正確に切断されるように設計することも可能であ
る。以上は全て常法により行うことができる。
【００５０】（iv）ブラントエンド法 インサートＤＮＡの制限酵素切断部位が平滑末端である
か、または５’末端あるいは３’末端突出型の切断端で
ありかつその形状がそのままベクターＤＮＡ側の切断端
に直接結合できない場合は、突出した一本鎖部分を酵素
処理により除去する。用いる酵素は一本鎖ＤＮＡを特異
的に切断する酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼよびＰ１ヌ
クレアーゼなどを利用することができ、別法としては、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて突出一本鎖部分の
相補鎖を合成することも可能である。この後、ＤＮＡリ
ガーゼを用いて平滑端同士を結合することができる。Ｄ
ＮＡリガーゼはＴ４バクテリオファージ由来のリガーゼ
が広く用いられている。以上は常法により行うことがで
き、上記酵素等は市販されているものを使用することが
できる。
か、または５’末端あるいは３’末端突出型の切断端で
ありかつその形状がそのままベクターＤＮＡ側の切断端
に直接結合できない場合は、突出した一本鎖部分を酵素
処理により除去する。用いる酵素は一本鎖ＤＮＡを特異
的に切断する酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼよびＰ１ヌ
クレアーゼなどを利用することができ、別法としては、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて突出一本鎖部分の
相補鎖を合成することも可能である。この後、ＤＮＡリ
ガーゼを用いて平滑端同士を結合することができる。Ｄ
ＮＡリガーゼはＴ４バクテリオファージ由来のリガーゼ
が広く用いられている。以上は常法により行うことがで
き、上記酵素等は市販されているものを使用することが
できる。
【００５１】構築法Ｂ ｍＣ２６遺伝子の構造遺伝子部分を転写開始点から転写
終結点まで、あるいは、第１エクソンの終端から転写終
結点までを正確に切断、除去し、所望の遺伝子のＤＮＡ
をインサート断片として挿入する方法を記載する。
終結点まで、あるいは、第１エクソンの終端から転写終
結点までを正確に切断、除去し、所望の遺伝子のＤＮＡ
をインサート断片として挿入する方法を記載する。
【００５２】上記Ａ法で記載した方法により調製したｍ
Ｃ２６遺伝子ベクターＤＮＡに対し、緩徐な条件下でエ
キソヌクレアーゼを作用させて一定時間ごとに反応を停
止して一連のＤＮＡ調製物を得る。これら各々の調製物
に対して、図３に記載された各制限酵素の消化の有無を
観察することにより、求める長さのＤＮＡが得られたこ
とを確認する。
Ｃ２６遺伝子ベクターＤＮＡに対し、緩徐な条件下でエ
キソヌクレアーゼを作用させて一定時間ごとに反応を停
止して一連のＤＮＡ調製物を得る。これら各々の調製物
に対して、図３に記載された各制限酵素の消化の有無を
観察することにより、求める長さのＤＮＡが得られたこ
とを確認する。
【００５３】一度このように工作してベクターＤＮＡを
得た後は、前出の合成リンカー法の項で述べたように、
制限酵素の認識部位となるべく計画した小ＤＮＡ断片を
上記ＤＮＡ断片に付加する。以後利用する際には、希望
する制限酵素で切断され、さらに付加した小ＤＮＡ断片
をも同時に取り除かれるよう設計することも可能であ
る。このような目的には、平滑末端を生じる制限酵素が
望ましく、具体的にはＥｃｏＲＶ，ＰｖｕＩＩなどを挙
げることができる。
得た後は、前出の合成リンカー法の項で述べたように、
制限酵素の認識部位となるべく計画した小ＤＮＡ断片を
上記ＤＮＡ断片に付加する。以後利用する際には、希望
する制限酵素で切断され、さらに付加した小ＤＮＡ断片
をも同時に取り除かれるよう設計することも可能であ
る。このような目的には、平滑末端を生じる制限酵素が
望ましく、具体的にはＥｃｏＲＶ，ＰｖｕＩＩなどを挙
げることができる。
【００５４】上記の方法で作製したｍＣ２６遺伝子ベク
ターに、希望する遺伝子のＤＮＡ断片をインサートとし
て結合する。この目的には、上記構築法Ａに記載した、
合成リンカー法またはブラントエンド法のいずれかを用
いることができる。発現すべき蛋白質をより正確に設計
するためにはブラントエンド法が好ましい。
ターに、希望する遺伝子のＤＮＡ断片をインサートとし
て結合する。この目的には、上記構築法Ａに記載した、
合成リンカー法またはブラントエンド法のいずれかを用
いることができる。発現すべき蛋白質をより正確に設計
するためにはブラントエンド法が好ましい。
【００５５】（４）骨形成誘導蛋白質をコードするＤＮ
Ａ断片の単離 骨形成誘導蛋白質のｃＤＮＡクローンは、その両端が制
限酵素ＥｃｏＲＶの切断点となるように設計し、同酵素
により一段階操作で切り出せることが好ましい。該クロ
ーンを前記したブラントエンド法により、上記ｍＣ２６
遺伝子ＤＮＡベクターに挿入する。この際、挿入位置の
両端となる部分の塩基配列は、構築法Ａの内、酵素Ａ１
ならびに酵素Ａ２として記載した制限酵素の認識部位と
なるべく設計することにより、ベクター作製の工程を簡
略化することができる。
Ａ断片の単離 骨形成誘導蛋白質のｃＤＮＡクローンは、その両端が制
限酵素ＥｃｏＲＶの切断点となるように設計し、同酵素
により一段階操作で切り出せることが好ましい。該クロ
ーンを前記したブラントエンド法により、上記ｍＣ２６
遺伝子ＤＮＡベクターに挿入する。この際、挿入位置の
両端となる部分の塩基配列は、構築法Ａの内、酵素Ａ１
ならびに酵素Ａ２として記載した制限酵素の認識部位と
なるべく設計することにより、ベクター作製の工程を簡
略化することができる。
【００５６】上記工程により作製したＤＮＡをそのまま
遺伝子導入生物の作製に用いることができる。また、上
記ベクター中に、微生物、例えば、大腸菌内でプラスミ
ドあるいは溶原性ファージとして増殖することができる
塩基配列を含むことにより、必要に応じて、常法を用い
て大腸菌等により容易にベクターを増幅および回収する
ことができる。
遺伝子導入生物の作製に用いることができる。また、上
記ベクター中に、微生物、例えば、大腸菌内でプラスミ
ドあるいは溶原性ファージとして増殖することができる
塩基配列を含むことにより、必要に応じて、常法を用い
て大腸菌等により容易にベクターを増幅および回収する
ことができる。
【００５７】（５）遺伝子導入生物の生産法 上記発現ベクターに挿入した組換え体ＤＮＡを制限酵素
により切断し、原核細胞内で増殖させるのに用いた大腸
菌等の発現ベクター由来のＤＮＡと、ｍＣ２６遺伝子の
ＤＮＡおよび発現を希望する遺伝子のＤＮＡとからなる
真核生物由来ＤＮＡとを分離する。用いる制限酵素は特
に限定されないが、プラスミド部分とｍＣ２６遺伝子の
構造遺伝子部分の５’上流末端および３’下流末端とが
接続する部分は何れも制限酵素ＥｃｏＲＩの認識・切断
部位になるよう設計して、本酵素を用いることにより上
記の工程を簡略化することができる。
により切断し、原核細胞内で増殖させるのに用いた大腸
菌等の発現ベクター由来のＤＮＡと、ｍＣ２６遺伝子の
ＤＮＡおよび発現を希望する遺伝子のＤＮＡとからなる
真核生物由来ＤＮＡとを分離する。用いる制限酵素は特
に限定されないが、プラスミド部分とｍＣ２６遺伝子の
構造遺伝子部分の５’上流末端および３’下流末端とが
接続する部分は何れも制限酵素ＥｃｏＲＩの認識・切断
部位になるよう設計して、本酵素を用いることにより上
記の工程を簡略化することができる。
【００５８】制限酵素により切断したＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動法によりそれぞれ単一のバンドとし
て分離した後、発現を希望する遺伝子ＤＮＡのバンドを
含む部分のアガロースゲルを切り出してＤＮＡを抽出回
収する。
ロースゲル電気泳動法によりそれぞれ単一のバンドとし
て分離した後、発現を希望する遺伝子ＤＮＡのバンドを
含む部分のアガロースゲルを切り出してＤＮＡを抽出回
収する。
【００５９】上記の方法により単離精製した真核生物由
来ＤＮＡをマイクロインジェクション法により、ガラス
ピペットを用いて受精卵の雄性前核に注入する。この受
精卵を、一定時間培養後、あるいは直ちに、予め用意し
た偽妊娠動物すなわち代理母の子宮に移植する。これら
は常法により行うことができる［新生化学実験講座１
９、動物実験法（東京化学同人社刊、１９９１）；ゴー
ドン（Ｇｏｒｄｏｎ）とラドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，４
１１−４４２（１９８３）；ジオメック（Ｚｉｏｍｅ
ｋ）とジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｃｅｌｌ ２
１，９３５−９４２（１９８０）；ゴードン（Ｇｏｒｄ
ｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４（１９８０）；ゴー
ドン（Ｇｏｒｄｏｎ）とラドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２１４，１２４４−１２４６（１９８
１）；ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら（翻訳：山内ら）、マ
ウス胚の操作マニュアル、近代出版］。用いる生物種
は、特に限定されないが、例としてマウスを挙げること
ができ、特にＣＤ−１マウスが好ましい。
来ＤＮＡをマイクロインジェクション法により、ガラス
ピペットを用いて受精卵の雄性前核に注入する。この受
精卵を、一定時間培養後、あるいは直ちに、予め用意し
た偽妊娠動物すなわち代理母の子宮に移植する。これら
は常法により行うことができる［新生化学実験講座１
９、動物実験法（東京化学同人社刊、１９９１）；ゴー
ドン（Ｇｏｒｄｏｎ）とラドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，４
１１−４４２（１９８３）；ジオメック（Ｚｉｏｍｅ
ｋ）とジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｃｅｌｌ ２
１，９３５−９４２（１９８０）；ゴードン（Ｇｏｒｄ
ｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４（１９８０）；ゴー
ドン（Ｇｏｒｄｏｎ）とラドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２１４，１２４４−１２４６（１９８
１）；ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら（翻訳：山内ら）、マ
ウス胚の操作マニュアル、近代出版］。用いる生物種
は、特に限定されないが、例としてマウスを挙げること
ができ、特にＣＤ−１マウスが好ましい。
【００６０】偽妊娠動物の作製方法は動物種により異な
るが、各々既に獣医畜産技術として確立している。マウ
ス、ラット、ウサギをはじめとする囓歯類動物は、膣刺
激により容易に偽妊娠状態を誘起できる。また、ウシ、
ヤギ、ヒツジなど反芻類家畜およびウマ、イヌ、ネコに
ついては、ホルモン剤の投与により、偽妊娠を誘起す
る。また常法により、必要に応じて、動物にホルモン剤
を投与し過排卵を誘起して、採卵数を増加させることが
できる［実験生物学講座１、生物材料調製法（１９８
２）、江上信雄ら編、哺乳動物の初期発生、丸善出版株
式会社］。
るが、各々既に獣医畜産技術として確立している。マウ
ス、ラット、ウサギをはじめとする囓歯類動物は、膣刺
激により容易に偽妊娠状態を誘起できる。また、ウシ、
ヤギ、ヒツジなど反芻類家畜およびウマ、イヌ、ネコに
ついては、ホルモン剤の投与により、偽妊娠を誘起す
る。また常法により、必要に応じて、動物にホルモン剤
を投与し過排卵を誘起して、採卵数を増加させることが
できる［実験生物学講座１、生物材料調製法（１９８
２）、江上信雄ら編、哺乳動物の初期発生、丸善出版株
式会社］。
【００６１】代理母により出産された産仔のうち、組換
え遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を判別す
るため、産仔の体組織の一部から抽出したゲノムＤＮＡ
を分析する。
え遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を判別す
るため、産仔の体組織の一部から抽出したゲノムＤＮＡ
を分析する。
【００６２】一般には、導入した組換えＤＮＡをプロー
ブとしてゲノムＤＮＡのサザン・ハイブリダイゼーショ
ンにより証明する。また、組換えＤＮＡの塩基配列から
設計した合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ法により
微量のＤＮＡからも証明することができる。以上は全て
常法に従って行うことができる［ディチュリオら、前記
文献］。産仔の体組織としては、マウス、ラットでは尾
の先端が、また、ウシ、ヤギなどの中・大動物では耳朶
などが、広く用いられるが、口内の粘膜も試料として利
用できる。
ブとしてゲノムＤＮＡのサザン・ハイブリダイゼーショ
ンにより証明する。また、組換えＤＮＡの塩基配列から
設計した合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ法により
微量のＤＮＡからも証明することができる。以上は全て
常法に従って行うことができる［ディチュリオら、前記
文献］。産仔の体組織としては、マウス、ラットでは尾
の先端が、また、ウシ、ヤギなどの中・大動物では耳朶
などが、広く用いられるが、口内の粘膜も試料として利
用できる。
【００６３】また、所望の異種遺伝子産物の生産を確認
するためには、ウエスタンブロット等により実施するこ
とが可能であるが、これに限定されない。
するためには、ウエスタンブロット等により実施するこ
とが可能であるが、これに限定されない。
【００６４】トランスジェニック動物もまた、通常の生
物同様に自己増殖能力をもつことが期待できる。このこ
とにより、一度希望するトランスジェニック動物が得ら
れた後は、もはや、以上に述べた操作によらず、トラン
スジェニックである動物を育成し、他のトランスジェニ
ック動物または非トランスジェニック動物と交配し、新
たな子孫を出生せしむることにより、親となるトランス
ジェニック動物と同等の、あるいは雑種のトランスジェ
ニック動物を得ることができる。
物同様に自己増殖能力をもつことが期待できる。このこ
とにより、一度希望するトランスジェニック動物が得ら
れた後は、もはや、以上に述べた操作によらず、トラン
スジェニックである動物を育成し、他のトランスジェニ
ック動物または非トランスジェニック動物と交配し、新
たな子孫を出生せしむることにより、親となるトランス
ジェニック動物と同等の、あるいは雑種のトランスジェ
ニック動物を得ることができる。
【００６５】本発明の上記技術は、以下に述べる利点を
有する。
有する。
【００６６】（１）乳腺は、組換え遺伝子に由来する物
質を大量に生産させる組織として優れている。
質を大量に生産させる組織として優れている。
【００６７】乳腺は、本来の性質上、蛋白質等の各種物
質を大量生産することのできる器官であり、さらにミル
ク成分物質の大量生産を指標として育種改良されてきた
ウシ、ヤギなどの家畜を利用することができる点で有利
である。
質を大量生産することのできる器官であり、さらにミル
ク成分物質の大量生産を指標として育種改良されてきた
ウシ、ヤギなどの家畜を利用することができる点で有利
である。
【００６８】また、乳腺は外分泌腺であるため、搾乳に
より極めて短時間のうちに体外に取り出すことができ
る。したがって、生産物質の細胞内での過剰蓄積による
凝集塊の形成およびそれに伴う炎症反応等の悪影響を最
小限に抑えることができる。
より極めて短時間のうちに体外に取り出すことができ
る。したがって、生産物質の細胞内での過剰蓄積による
凝集塊の形成およびそれに伴う炎症反応等の悪影響を最
小限に抑えることができる。
【００６９】さらに、ミルクは乳腺においてのみ大量生
産されるため組織特異性を考慮する必要がない。動物体
内で天然に生産される物質であっても、生産量が過大で
あったり、生産組織が本来と異なる場合には、動物に疾
病を引き起こすことは頻繁に観察されている。よって、
生体に及ぼす影響を最小限に抑えることができる。な
お、組織特異性から、ミルク蛋白質遺伝子の発現制御領
域を付加した組換え遺伝子を単に受精卵に注入するだけ
で、所望の生成物が乳腺からミルク中にのみ分泌される
点も有利である。
産されるため組織特異性を考慮する必要がない。動物体
内で天然に生産される物質であっても、生産量が過大で
あったり、生産組織が本来と異なる場合には、動物に疾
病を引き起こすことは頻繁に観察されている。よって、
生体に及ぼす影響を最小限に抑えることができる。な
お、組織特異性から、ミルク蛋白質遺伝子の発現制御領
域を付加した組換え遺伝子を単に受精卵に注入するだけ
で、所望の生成物が乳腺からミルク中にのみ分泌される
点も有利である。
【００７０】そして、乳腺におけるミルクの大量生産は
時期特異的、即ち、動物が妊娠して分娩した時にのみお
こり、成長期にはおこらないため、トランスジェニック
動物の正常な成長に害をもたらさない。一方、幼若また
は成体トランスジェニック動物のミルクの合成は、ホル
モンを外部から投与して人為的にミルク蛋白質の合成を
開始させて維持させる誘起泌乳も可能なため、人為的に
制御することもできる。このことを利用して、メタロチ
オネイン遺伝子のように、所望の時期に組換え遺伝子の
スイッチ・オン／オフを行えるトランスジェニック生物
を創製し、生物学研究の実験モデル生物として利用する
ことが可能である。
時期特異的、即ち、動物が妊娠して分娩した時にのみお
こり、成長期にはおこらないため、トランスジェニック
動物の正常な成長に害をもたらさない。一方、幼若また
は成体トランスジェニック動物のミルクの合成は、ホル
モンを外部から投与して人為的にミルク蛋白質の合成を
開始させて維持させる誘起泌乳も可能なため、人為的に
制御することもできる。このことを利用して、メタロチ
オネイン遺伝子のように、所望の時期に組換え遺伝子の
スイッチ・オン／オフを行えるトランスジェニック生物
を創製し、生物学研究の実験モデル生物として利用する
ことが可能である。
【００７１】（２）哺乳動物細胞の蛋白質生産機構を利
用するため、哺乳動物由来の外来遺伝子の発現において
利点を有する。
用するため、哺乳動物由来の外来遺伝子の発現において
利点を有する。
【００７２】蛋白質への糖鎖の付加、リン酸基あるいは
イオウ等が結合する複雑な修飾、およびジスルフィド結
合の形成の仕方等は哺乳動物に特有な様式による場合が
多く、例えば大腸菌等の細菌を用いた場合に本来の生理
活性が認められる蛋白質が生産されることは稀である。
このような欠点の解決策として培養動物細胞の利用が挙
げられるが、費用および労力がかかるにもかかわらず成
功例は少なく、信頼性に欠ける。
イオウ等が結合する複雑な修飾、およびジスルフィド結
合の形成の仕方等は哺乳動物に特有な様式による場合が
多く、例えば大腸菌等の細菌を用いた場合に本来の生理
活性が認められる蛋白質が生産されることは稀である。
このような欠点の解決策として培養動物細胞の利用が挙
げられるが、費用および労力がかかるにもかかわらず成
功例は少なく、信頼性に欠ける。
【００７３】（３）トランスジェニック動物は自己複製
能力をもち、生産システムの更新、規模拡大が極めて容
易かつ安価である。
能力をもち、生産システムの更新、規模拡大が極めて容
易かつ安価である。
【００７４】交配により新たな子孫を出生せしめ、親と
なるトランスジェニック動物と同等あるいは雑種のトラ
ンスジェニック動物を得ることができる。この際、当初
のトランスジェニック動物を創製するにあたって行った
遺伝子工学を初めとする人為的操作は何ら必要ない。生
産設備の拡大をきわめて安価かつ容易に行うことが可能
である。このことは、培養細胞プラントまたは化学工場
には望み得ない点である。
なるトランスジェニック動物と同等あるいは雑種のトラ
ンスジェニック動物を得ることができる。この際、当初
のトランスジェニック動物を創製するにあたって行った
遺伝子工学を初めとする人為的操作は何ら必要ない。生
産設備の拡大をきわめて安価かつ容易に行うことが可能
である。このことは、培養細胞プラントまたは化学工場
には望み得ない点である。
【００７５】また、トランスジェニック動物は、安全か
つ低廉に維持できる。大腸菌をはじめとする微生物のＤ
ＮＡ複製機構は高等動物に比して原始的で精度が低いた
め、菌株を一定の性状に維持することが困難であり、醸
造業などで製品の品質を維持するために高度の技術を必
要とする。培養細胞についても、組換えＤＮＡを導入し
た場合、長期間その遺伝子発現の性状を維持することが
困難である。これに対し、高等動物個体は、きわめて安
定といえる。物質生産能力についても、ウシでは１０年
程度まで経済性良く一定の品質のミルク生産を維持、あ
るいは産次に従ってむしろ増大することは公知である。
トランスジェニック動物についても、同様の結果が期待
できる。
つ低廉に維持できる。大腸菌をはじめとする微生物のＤ
ＮＡ複製機構は高等動物に比して原始的で精度が低いた
め、菌株を一定の性状に維持することが困難であり、醸
造業などで製品の品質を維持するために高度の技術を必
要とする。培養細胞についても、組換えＤＮＡを導入し
た場合、長期間その遺伝子発現の性状を維持することが
困難である。これに対し、高等動物個体は、きわめて安
定といえる。物質生産能力についても、ウシでは１０年
程度まで経済性良く一定の品質のミルク生産を維持、あ
るいは産次に従ってむしろ増大することは公知である。
トランスジェニック動物についても、同様の結果が期待
できる。
【００７６】さらに、動物個体は、免疫系をはじめとす
る生体防御機構を備えており、微生物や動物細胞の培養
に必須である無菌的環境設備は必要としない。反対に、
感染、すなわち人体内部への侵襲による危害は発生し得
ず、バイオハザードの点で極めて有利である。
る生体防御機構を備えており、微生物や動物細胞の培養
に必須である無菌的環境設備は必要としない。反対に、
感染、すなわち人体内部への侵襲による危害は発生し得
ず、バイオハザードの点で極めて有利である。
【００７７】
【実施例】以下の実施例は、本発明を例示するためのも
のであり、本発明を限定するように意図するものではな
い。
のであり、本発明を限定するように意図するものではな
い。
【００７８】以下において、異種遺伝子として骨形成誘
導蛋白質遺伝子（ハムスター−ヒトの融合遺伝子：ｈａ
ＢＩＰ）を用いて本発明を例示するが、これらに限定さ
れるものではなく、他の異種遺伝子も使用可能なことは
当業者であれば認識されるであろう。
導蛋白質遺伝子（ハムスター−ヒトの融合遺伝子：ｈａ
ＢＩＰ）を用いて本発明を例示するが、これらに限定さ
れるものではなく、他の異種遺伝子も使用可能なことは
当業者であれば認識されるであろう。
【００７９】なお、以下に記載する発現ベクターは何れ
も微生物中において増幅可能なベクターであり、例とし
て大腸菌ベクターを示すが、これらに限定されるもので
はない。また、これら発現ベクターの増幅は常法にした
がって実施することが可能である［前記文献：Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇおよびＢａｓｉｃ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
等を参照せよ］。
も微生物中において増幅可能なベクターであり、例とし
て大腸菌ベクターを示すが、これらに限定されるもので
はない。また、これら発現ベクターの増幅は常法にした
がって実施することが可能である［前記文献：Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇおよびＢａｓｉｃ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
等を参照せよ］。
【００８０】実施例１ ｍＣ２６構造遺伝子および該遺伝子の発現制御領域の単
離 （ｉ）プローブの作製 マウスの必乳最盛期の乳腺を用いて、常法に従い［サト
ウ（Ｓａｔｏｗ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９，１６
３９−１６４３（１９８６）］、全ｍＲＮＡをポリ
（Ａ）ＲＮＡ画分として単離した。１０μｇの全ｍＲＮ
Ａに関して、オリゴ（ｄＴ）プライマー（バイオテック
インターナショナル（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ）社／コスモバイオ社）およびランダムヘ
キサマー（バイオテックインターナショナル）をプライ
マーとして、アマシャム社またはＮＥＮ社の標識キット
を用いて32Ｐ標識した。
離 （ｉ）プローブの作製 マウスの必乳最盛期の乳腺を用いて、常法に従い［サト
ウ（Ｓａｔｏｗ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９，１６
３９−１６４３（１９８６）］、全ｍＲＮＡをポリ
（Ａ）ＲＮＡ画分として単離した。１０μｇの全ｍＲＮ
Ａに関して、オリゴ（ｄＴ）プライマー（バイオテック
インターナショナル（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ）社／コスモバイオ社）およびランダムヘ
キサマー（バイオテックインターナショナル）をプライ
マーとして、アマシャム社またはＮＥＮ社の標識キット
を用いて32Ｐ標識した。
【００８１】ｍＲＮＡのキャップ部分を標識するに際し
ては、常法［ミズモト（Ｍｉｚｕｍｏｔｏ）とリップマ
ン（Ｌｉｐｍａｎｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７６，４９６１（１９７９）］
に従い、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（ベセスダリ
サーチ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社、米
国／コスモバイオ社）を用いてｍＲＮＡをポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡ画分として精製し、ワクシニアウイルスのグアリニ
ルトランスフェラーゼ（ベセスダリサーチ社）により標
識した。標識後、そのまま、またはＲＮａｓｅＡ（シグ
マ社、米国）を用いて部分消化し（１０〜１００ｎｇ／
ｍｌのＲＮａｓｅＡを加え、１分間、３７℃処理後、等
容のホルムアミドを加えて反応停止）、６Ｍ〜８Ｍの尿
素を含む６％アクリルアミドゲル電気泳動に供し、大き
さを確認した。
ては、常法［ミズモト（Ｍｉｚｕｍｏｔｏ）とリップマ
ン（Ｌｉｐｍａｎｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７６，４９６１（１９７９）］
に従い、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（ベセスダリ
サーチ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社、米
国／コスモバイオ社）を用いてｍＲＮＡをポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡ画分として精製し、ワクシニアウイルスのグアリニ
ルトランスフェラーゼ（ベセスダリサーチ社）により標
識した。標識後、そのまま、またはＲＮａｓｅＡ（シグ
マ社、米国）を用いて部分消化し（１０〜１００ｎｇ／
ｍｌのＲＮａｓｅＡを加え、１分間、３７℃処理後、等
容のホルムアミドを加えて反応停止）、６Ｍ〜８Ｍの尿
素を含む６％アクリルアミドゲル電気泳動に供し、大き
さを確認した。
【００８２】（ii）ライブラリーの作製 Ｂａｌｂ／ｃマウスのゲノミックＤＮＡライブラリー
（クローンテック社）を制限酵素ＥｃｏＲＩで部分消化
または完全消化したのち、部分消化物に関しては消化物
をλＣｈａｒｏｎ４Ａに、また完全消化物に関してはｐ
ＳＰ６４（プロメガバイオテック（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ）社、米国）に連結してライブラリーを作
製した。
（クローンテック社）を制限酵素ＥｃｏＲＩで部分消化
または完全消化したのち、部分消化物に関しては消化物
をλＣｈａｒｏｎ４Ａに、また完全消化物に関してはｐ
ＳＰ６４（プロメガバイオテック（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ）社、米国）に連結してライブラリーを作
製した。
【００８３】ウシ、ニワトリ、イヌ、ヤギ、モルモッ
ト、ハムスター、ヒト、カンガルー、サル、マウス、ハ
ト、ブタ、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物種について
は、λ由来のファージベクター、例えばλｇｔ１０、λ
ｇｔ１１、ＥＭＢＬ３またはλＣｈａｒｏｎ４Ａの各ベ
クターに挿入されたｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡの
ライブラリーが市販品として購入可能である（クロンテ
ック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社／ＴＯＹＯＢＯ社）。な
お、ｐＳＰ６４（プロメガ社）および市販ゲノミックＤ
ＮＡ（クローンテック社）の組み合わせによっても、こ
れらと同等のライブラリーを作製することは、当業者で
あれば容易に可能であろう。
ト、ハムスター、ヒト、カンガルー、サル、マウス、ハ
ト、ブタ、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物種について
は、λ由来のファージベクター、例えばλｇｔ１０、λ
ｇｔ１１、ＥＭＢＬ３またはλＣｈａｒｏｎ４Ａの各ベ
クターに挿入されたｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡの
ライブラリーが市販品として購入可能である（クロンテ
ック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社／ＴＯＹＯＢＯ社）。な
お、ｐＳＰ６４（プロメガ社）および市販ゲノミックＤ
ＮＡ（クローンテック社）の組み合わせによっても、こ
れらと同等のライブラリーを作製することは、当業者で
あれば容易に可能であろう。
【００８４】（iii）陽性クローンのスクリーニング このライブラリーの中から、上記（ｉ）において作製し
たプローブを用いてスクリーニングを行った。
たプローブを用いてスクリーニングを行った。
【００８５】その結果、λＣｈａｒｏｎ４Ａのライブラ
リーからはλＭＣ２６が、そして、ｐＳＰ６４のライブ
ラリーからはｐＳｍＣ２６が乳腺特異的に発現する陽性
クローンとして同定された。これら構築物のマップを、
それぞれ図１および図２に示す。
リーからはλＭＣ２６が、そして、ｐＳＰ６４のライブ
ラリーからはｐＳｍＣ２６が乳腺特異的に発現する陽性
クローンとして同定された。これら構築物のマップを、
それぞれ図１および図２に示す。
【００８６】実施例２ ｍＣ２６構造遺伝子および該遺伝子の発現制御領域の特
徴 （ｉ）陽性クローンの特徴 λＭＣ２６クローンおよびｐＳｍＣ２６クローンの制限
酵素地図を作製して比較したところ、λＭＣ２６は約１
２．７ｋｂの挿入断片（ＥｃｏＲＩ断片）を、そしてｐ
ＳｍＣ２６は約６．７ｋｂの挿入断片（ＥｃｏＲＩ断
片）を含むことがわかった。そして、約６．７ｋｂの断
片は約１２．７ｋｂの断片内に含まれるものであること
が、制限酵素マッピングにより明らかとなった。これら
の結果は図１および図２の制限酵素認識部位の比較から
明らかである。
徴 （ｉ）陽性クローンの特徴 λＭＣ２６クローンおよびｐＳｍＣ２６クローンの制限
酵素地図を作製して比較したところ、λＭＣ２６は約１
２．７ｋｂの挿入断片（ＥｃｏＲＩ断片）を、そしてｐ
ＳｍＣ２６は約６．７ｋｂの挿入断片（ＥｃｏＲＩ断
片）を含むことがわかった。そして、約６．７ｋｂの断
片は約１２．７ｋｂの断片内に含まれるものであること
が、制限酵素マッピングにより明らかとなった。これら
の結果は図１および図２の制限酵素認識部位の比較から
明らかである。
【００８７】（ii）塩基配列決定 ｐＳｍＣ２６の約６．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を切り出
し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより約５．
４ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＢｌｕ
ｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（プロメガ社）に挿入してサ
ブクローン化した。このサブクローンに関して、デリー
ションキット（ＴａＫａＲａ社）を用いて欠失変異体の
シリーズを作製した。約５．４ｋｂの断片の制限酵素マ
ップを図３に示す。これらのシリーズの配列は、ジデオ
キシ法［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｍａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５
４６３（１９７７）］により、ＤＮＡ塩基配列決定機
（ＡＢＩ社、モデル３７３Ａ、およびファルマシア社、
Ａ．Ｌ．Ｆ．モデル）を使用して決定された。決定され
た塩基配列を配列番号１とする。
し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより約５．
４ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＢｌｕ
ｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（プロメガ社）に挿入してサ
ブクローン化した。このサブクローンに関して、デリー
ションキット（ＴａＫａＲａ社）を用いて欠失変異体の
シリーズを作製した。約５．４ｋｂの断片の制限酵素マ
ップを図３に示す。これらのシリーズの配列は、ジデオ
キシ法［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｍａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５
４６３（１９７７）］により、ＤＮＡ塩基配列決定機
（ＡＢＩ社、モデル３７３Ａ、およびファルマシア社、
Ａ．Ｌ．Ｆ．モデル）を使用して決定された。決定され
た塩基配列を配列番号１とする。
【００８８】配列番号１中、ヌクレオチド番号２３０５
〜２３０７のＡＧＣから始まり、ヌクレオチド番号４６
２２〜４６２４のＣＣＴで終わる構造遺伝子部分が存在
する（図５）。
〜２３０７のＡＧＣから始まり、ヌクレオチド番号４６
２２〜４６２４のＣＣＴで終わる構造遺伝子部分が存在
する（図５）。
【００８９】図５に示すとおり、ｍＣ２６構造遺伝子内
には第１ないし第３イントロンが存在しており、スプラ
イシングに関与していることが予測されるので、異種遺
伝子発現のためのカセットとして用いる場合は、これら
の配列を含ませることが好ましい。しかし、下記実施例
から明らかなとおり、異種遺伝子の種類によってはこれ
らは必要でない場合もある。よって、発現カセットを作
製するための連結の複雑さも考慮して、これらの配列を
含ませるか否かを検討する必要がある。
には第１ないし第３イントロンが存在しており、スプラ
イシングに関与していることが予測されるので、異種遺
伝子発現のためのカセットとして用いる場合は、これら
の配列を含ませることが好ましい。しかし、下記実施例
から明らかなとおり、異種遺伝子の種類によってはこれ
らは必要でない場合もある。よって、発現カセットを作
製するための連結の複雑さも考慮して、これらの配列を
含ませるか否かを検討する必要がある。
【００９０】該構造遺伝子部分の上流および下流領域の
ヌクレオチド配列には、公知のカゼイン遺伝子との間で
相同性は認められない。また、上記文献［ドーベンコ
ら、前記］において開示されていない部分、即ち、配列
番号１中の第１４３９ヌクレオチド〜第１５２２に存在
するＧＡＡトリプレットの連続重複配列部分（以下、Ｍ
ｂｏＩＩリピートと称する）は、いわゆるトリプルリピ
ートと称される発現制御配列と同等のものと考えられ、
この部分が発現制御に関与している可能性は高い（図
４、下線部分）。マウスＩｇＨ遺伝子においてもＭｂｏ
ＩＩリピートが発見されており、発現制御エンハンサー
として機能していると考えられている。
ヌクレオチド配列には、公知のカゼイン遺伝子との間で
相同性は認められない。また、上記文献［ドーベンコ
ら、前記］において開示されていない部分、即ち、配列
番号１中の第１４３９ヌクレオチド〜第１５２２に存在
するＧＡＡトリプレットの連続重複配列部分（以下、Ｍ
ｂｏＩＩリピートと称する）は、いわゆるトリプルリピ
ートと称される発現制御配列と同等のものと考えられ、
この部分が発現制御に関与している可能性は高い（図
４、下線部分）。マウスＩｇＨ遺伝子においてもＭｂｏ
ＩＩリピートが発見されており、発現制御エンハンサー
として機能していると考えられている。
【００９１】配列番号１のヌクレオチド配列は、一方の
末端がＥｃｏＲＩ認識部位であり、そして他方の末端が
ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位であるＤＮＡ断片として、λ
ＭＣ２６クローンおよびｐＳｍＣ２６クローンから容易
に分離され、発現カセットとして以後の実験に使用され
た。
末端がＥｃｏＲＩ認識部位であり、そして他方の末端が
ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位であるＤＮＡ断片として、λ
ＭＣ２６クローンおよびｐＳｍＣ２６クローンから容易
に分離され、発現カセットとして以後の実験に使用され
た。
【００９２】実施例３ マウス骨形成誘導蛋白質を発現するトランスジェニック
動物の作製 実施例１において単離したｐＳｍＣ２６の約６．７ｋｂ
断片のうち配列を決定した５３９４ｂｐのＤＮＡ断片を
発現カセットとして用いて、ｍＣ２６構造遺伝子部分
に、外来異種遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作製し
た。以下にその概要を記載する。
動物の作製 実施例１において単離したｐＳｍＣ２６の約６．７ｋｂ
断片のうち配列を決定した５３９４ｂｐのＤＮＡ断片を
発現カセットとして用いて、ｍＣ２６構造遺伝子部分
に、外来異種遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作製し
た。以下にその概要を記載する。
【００９３】（ｉ）組換えＤＮＡの作製 最初に、ｐＳｍＣ２６から約６．７ｋｂ断片のＥｃｏＲ
Ｉ断片を切り出し、さらにＨｉｎｄＩＩＩにより部分消
化し、ゲル電気泳動法により５３９４ｂｐのＤＮＡ断片
を回収した。該断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ＋の
ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ二重消化物に連結してｐＢ
ｍＣ２６ＥＨを作製した。ｐＢｍＣ２６ＥＨのマップを
図７に示す。
Ｉ断片を切り出し、さらにＨｉｎｄＩＩＩにより部分消
化し、ゲル電気泳動法により５３９４ｂｐのＤＮＡ断片
を回収した。該断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ＋の
ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ二重消化物に連結してｐＢ
ｍＣ２６ＥＨを作製した。ｐＢｍＣ２６ＥＨのマップを
図７に示す。
【００９４】一方、外来異種遺伝子としては、ハムスタ
ー−ヒトの融合遺伝子である骨形成誘導蛋白質遺伝子を
用いた。このヌクレオチド配列を配列番号２として示
す。
ー−ヒトの融合遺伝子である骨形成誘導蛋白質遺伝子を
用いた。このヌクレオチド配列を配列番号２として示
す。
【００９５】該融合遺伝子は、以下の工程により取得し
た： ヒト骨形成誘導蛋白質（ＢＩＰ）遺伝子の一部の配列：
ＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＡＧＡ（配列番号
７） を有するＤＮＡを５’側プライマーとし、そして、ＧＣ
ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡ（配列番号８） を有するＤＮＡを３’側（逆のストランド）プライマー
とし、ハムスター由来のＢａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ ｋ
ｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞株から常法（チオシアン酸グ
アニジン法：前記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、サムブルックらを参照）により抽出したＲＮＡ（１
０μｇ）から逆転写酵素ＲＡＶ−２（ＴａＫａＲａ社）
およびｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー
社／ＴａＫａＲａ社）を用い、添付の緩衝液によりパー
キンエルマー社の装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｅｔｕｓ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ４８
０）を用いて添付の使用説明書に従ってＲＴ−ＰＣＲ反
応を実施し、ハムスターＢＩＰに相補的な二本鎖を得
た。該二本鎖ＤＮＡを電気泳動により確認後（図８、レ
ーン３〜５）、ゲルから回収し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐ
ｔＩＩベクターのＥｃｏＲＶ切断部位に挿入してＤＮＡ
を増幅し、ファルマシア社ＡＬＦ自動シークエンサーに
より塩基配列を決定した。上記操作により、該ＤＮＡ
は、ヒトＢＩＰ ＤＮＡ（配列番号７および８）および
新規遺伝子であるハムスターＢＩＰのヒト遺伝子に相似
する部分のＤＮＡが結合したヒト−ハムスター融合遺伝
子ＤＮＡとして得られた。
た： ヒト骨形成誘導蛋白質（ＢＩＰ）遺伝子の一部の配列：
ＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＡＧＡ（配列番号
７） を有するＤＮＡを５’側プライマーとし、そして、ＧＣ
ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡ（配列番号８） を有するＤＮＡを３’側（逆のストランド）プライマー
とし、ハムスター由来のＢａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ ｋ
ｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞株から常法（チオシアン酸グ
アニジン法：前記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、サムブルックらを参照）により抽出したＲＮＡ（１
０μｇ）から逆転写酵素ＲＡＶ−２（ＴａＫａＲａ社）
およびｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー
社／ＴａＫａＲａ社）を用い、添付の緩衝液によりパー
キンエルマー社の装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｅｔｕｓ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ４８
０）を用いて添付の使用説明書に従ってＲＴ−ＰＣＲ反
応を実施し、ハムスターＢＩＰに相補的な二本鎖を得
た。該二本鎖ＤＮＡを電気泳動により確認後（図８、レ
ーン３〜５）、ゲルから回収し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐ
ｔＩＩベクターのＥｃｏＲＶ切断部位に挿入してＤＮＡ
を増幅し、ファルマシア社ＡＬＦ自動シークエンサーに
より塩基配列を決定した。上記操作により、該ＤＮＡ
は、ヒトＢＩＰ ＤＮＡ（配列番号７および８）および
新規遺伝子であるハムスターＢＩＰのヒト遺伝子に相似
する部分のＤＮＡが結合したヒト−ハムスター融合遺伝
子ＤＮＡとして得られた。
【００９６】ｐＢｍＣ２６ＥＨ中の配列番号１の第２３
０５ヌクレオチドから第４６２４ヌクレオチドまでを除
去したＤＮＡに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ
社）を用いて上記ＤＮＡを連結して得た組換えＤＮＡ
を、大腸菌ＪＭ１０９株にトランスフェクションして増
幅した。増幅された該組換えＤＮＡの塩基配列を決定し
て確認し、制限酵素ＢｓｓＨＩＩ（ＴａＫａＲａ社）で
切断して直鎖状ＤＮＡとしてアガロースゲル電気泳動に
よりｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ由来のＤＮＡ部分と、
ｈａＢＩＰを挿入されたｍＣ２６発現カセット部分を分
離してゲルから回収した。このＤＮＡの１〜５μｇ／ｍ
ｌ溶液を以下の実施例に用いた。
０５ヌクレオチドから第４６２４ヌクレオチドまでを除
去したＤＮＡに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ
社）を用いて上記ＤＮＡを連結して得た組換えＤＮＡ
を、大腸菌ＪＭ１０９株にトランスフェクションして増
幅した。増幅された該組換えＤＮＡの塩基配列を決定し
て確認し、制限酵素ＢｓｓＨＩＩ（ＴａＫａＲａ社）で
切断して直鎖状ＤＮＡとしてアガロースゲル電気泳動に
よりｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ由来のＤＮＡ部分と、
ｈａＢＩＰを挿入されたｍＣ２６発現カセット部分を分
離してゲルから回収した。このＤＮＡの１〜５μｇ／ｍ
ｌ溶液を以下の実施例に用いた。
【００９７】（ii）受精卵の採取 マウスの性周期（４日間）を考慮して、毎日、メスのマ
ウス膣内をガラスピペットにより水で洗浄し、細胞診に
より性周期を調べた（スメアチェック）。マウスを同調
群に分けて、群飼し、オスのマウスと交配後、翌朝の膣
栓（プラグ）形成を確認して妊娠マウスを得た。母群頭
数が少ない場合は、ゴナドトロピン腹腔内注射により過
排卵処置を行った。塩酸ケタミンまたはペントバルビタ
ールの５０倍希釈液を腹腔内注射して導入麻酔し、エー
テル麻酔下に手術を行い、輸卵管ないし子宮角を移動中
の卵を回収した。
ウス膣内をガラスピペットにより水で洗浄し、細胞診に
より性周期を調べた（スメアチェック）。マウスを同調
群に分けて、群飼し、オスのマウスと交配後、翌朝の膣
栓（プラグ）形成を確認して妊娠マウスを得た。母群頭
数が少ない場合は、ゴナドトロピン腹腔内注射により過
排卵処置を行った。塩酸ケタミンまたはペントバルビタ
ールの５０倍希釈液を腹腔内注射して導入麻酔し、エー
テル麻酔下に手術を行い、輸卵管ないし子宮角を移動中
の卵を回収した。
【００９８】用いたマウスはチャールズリバー（Ｃｈｉ
ｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）社のＣＤ−１マウスを用いた。
ｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）社のＣＤ−１マウスを用いた。
【００９９】（iii）受精卵へのＤＮＡの注入 上記（ｉ）において作製したｐＢｍＣ２６ＥＨを大腸菌
ＪＭ１０９株内で増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫ
ｐｎＩの認識部位において切断して直鎖状にし、該直鎖
状ＤＮＡをマウスの受精卵前核に注入した。上記ＤＮＡ
を１〜５μｇ／ｍｌの濃度に溶解した溶液をマイクロイ
ンジェクションした。この方法により操作された胚を子
宮頸管刺激により偽妊娠させたメスまたは性周期同調群
より選択した代理母（受容メス）の卵管腹腔口に適切な
大きさのシリコンチューブカテーテルを挿入して移し、
妊娠へと進展させた。
ＪＭ１０９株内で増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫ
ｐｎＩの認識部位において切断して直鎖状にし、該直鎖
状ＤＮＡをマウスの受精卵前核に注入した。上記ＤＮＡ
を１〜５μｇ／ｍｌの濃度に溶解した溶液をマイクロイ
ンジェクションした。この方法により操作された胚を子
宮頸管刺激により偽妊娠させたメスまたは性周期同調群
より選択した代理母（受容メス）の卵管腹腔口に適切な
大きさのシリコンチューブカテーテルを挿入して移し、
妊娠へと進展させた。
【０１００】マイクロインジェクション後の卵の１時間
生存率は５２％であった。
生存率は５２％であった。
【０１０１】上記遺伝子導入卵を１頭につき２０個ずつ
４０頭の代理母に移入したところ、５４頭の産子を得
た。
４０頭の代理母に移入したところ、５４頭の産子を得
た。
【０１０２】上記５４頭の産仔のうち、ＤＮＡ診断によ
りトランスジェニックと判明したものは７頭（１３％）
であった。
りトランスジェニックと判明したものは７頭（１３％）
であった。
【０１０３】（iv）ＤＮＡ診断 トランスジェニックマウスの口内粘膜細胞または培養白
血球細胞から常法により得たＤＮＡに関して、ＰＣＲ法
のキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社の使用説明書に
従った）を用いて実施した。結果を図８に示す。
血球細胞から常法により得たＤＮＡに関して、ＰＣＲ法
のキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社の使用説明書に
従った）を用いて実施した。結果を図８に示す。
【０１０４】図８は、培養細胞株および組換え動物細胞
により抽出した各ＲＮＡ１０μｇについて、ヒト−ハム
スター融合遺伝子であるｈａＢＩＰのｍＲＮＡの発現の
有無をＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。レーン４、５お
よび６は、ハムスター由来のＢＨＫ細胞から抽出したＲ
ＮＡ；レーン２は、ヒト由来細胞株であるＮａｍａｌｗ
ａ細胞ＲＮＡ；レーン１は、組換え動物細胞から抽出し
たＲＮＡ；に対するＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。５’お
よび３’のプライマーはヒトＢＩＰ遺伝子ＤＮＡの構造
遺伝子部分の配列からオリゴマー一本鎖ＤＮＡを合成し
て使用したものであり、各ＰＣＲ反応産物のＤＮＡ配列
は同一となると予想される。図８は、ＰＣＲ反応後、２
％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロミド染色
した結果を示すが、各バンドのアガロース部分を切り出
してＮａＩにより溶解後、ＤＮＡをガラスパウダーに吸
着させて回収し、全塩基配列を決定したところ、同一の
配列を有することが確認された。
により抽出した各ＲＮＡ１０μｇについて、ヒト−ハム
スター融合遺伝子であるｈａＢＩＰのｍＲＮＡの発現の
有無をＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。レーン４、５お
よび６は、ハムスター由来のＢＨＫ細胞から抽出したＲ
ＮＡ；レーン２は、ヒト由来細胞株であるＮａｍａｌｗ
ａ細胞ＲＮＡ；レーン１は、組換え動物細胞から抽出し
たＲＮＡ；に対するＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。５’お
よび３’のプライマーはヒトＢＩＰ遺伝子ＤＮＡの構造
遺伝子部分の配列からオリゴマー一本鎖ＤＮＡを合成し
て使用したものであり、各ＰＣＲ反応産物のＤＮＡ配列
は同一となると予想される。図８は、ＰＣＲ反応後、２
％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロミド染色
した結果を示すが、各バンドのアガロース部分を切り出
してＮａＩにより溶解後、ＤＮＡをガラスパウダーに吸
着させて回収し、全塩基配列を決定したところ、同一の
配列を有することが確認された。
【０１０５】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：５３９４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ 株名：Ｂａｌｂ／ｃ 組織の種類：ｌｉｖｅｒ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＡＡＴ ｓｉｇｎａｌ 存在位置：２２３４−２２４３ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＴＡＴＡ ｓｉｇｎａｌ 存在位置：２２７５−２２８１ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２３０５−４６２４ 特徴を決定した方法：Ｐ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｏｌｙＡ ｓｉｇｎａｌ 存在位置：４６０７−４６１２ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GAATTCCCCA AGGGACAGCT TTAAATAAGA AAACAACTCA TTCAACAAAT GCAAGCTAGA 60 ATATCCAGCA AGAATTAAAT TCTGTACTAA ATACATTGAG ATGCAGGGAT AAACTAATAA 120 TGGTTCCAGT ACTGAAAACT GATCAACAAA ACCAGTAAGA TGCAAATCAT ATAATTACTG 180 TAAAACTGGA TATGTGTTAG ACAATAAAGG CTATAAGGCT AGGGCCCAAA TAAGTCTGTT 240 TGTCATTCTA TTCCCCCAAA GCTTGCAGAT GGCTAGTACT CAATAAATAG TAGTAGGCCA 300 TGGTAGTGAA CAAAGGTGGA TACCACCAAT AAGACACTGT GGGGTCAGAT GACTCACCAA 360 GGGAGACAAG ATGATGAGGG AAGTGGTTCA AAATCAGCAG AAAAGTCTAA TAGAGAGCAG 420 GATGTAGAAA CACCTCAGAC AGATAGACAG GAGAGCCTTC TTGACAGAGC AATAGCATGA 480 ACCTAGCATT CCAGGGAAGA AGGACCATCT TGCAGAAGTC AGGGATAAAG TAGAAACGGT 540 AGAGGGCCAA GATGTCTGAA CTTTATCACT AGAGGCTTTC ACACAAAGAA GTGACATGAC 600 CTCCAGGAGA TCTCTCCAGT ATTAACATGG AAGGTAGACT ATCATGTATG ACAGAAGAGA 660 AGAAACTACT ACCATAGCCT AGTCTGGTGA TGATGTATTT TAAACGTACT AGGGAATATG 720 TCTGTGGAAA CCTCCCCACC ATGGGCTTCC TGTGAATGTC TTCACCTGTC CCCTCCTGTT 780 TGTAACTTCC ATAGGCCATG GAAGGATCAA TGCTGGTGAG AAGAAATCAG ACAGGAAGGG 840 AGGTGAGAGG CAACCCAAAA CAAACTTCCT TTACTACCTC ATCTTGCCTA AGGAGATCCC 900 AGATGTAGCA AGAGGAAGAC AAGACAAGGC CTTGGAGCTT CCTCTCAAGA GAAGGAAGAC 960 TCACACTGGT TGGCACAGCC CAAGCTCTCC TTGCTCTGAA GGCTGGACTT TATCCTGTGT 1020 CCAGCAAGCA TGCACCTAAG AGATATCTTG GGATGCAGCA GACCTTTCTT GTCTGGAGAT 1080 GATCCAGAGG GAGGTTTCAT AGACATCATC AAAACCTCTG ATGAAGAAAG AAACTAGTTC 1140 AATTCCTAAG CCAGAATGAG ACATTAATCC TAGGTTTACC CCCCATCTCC TTTCCAGAGG 1200 CTTCCTCAGA CATCCTACTG CTCTATTTAA AGTCACTAGA TTCTGGAGGC AGAATTAGAG 1260 TGGTCTACTT TAAATAAACT TTTTCTAAAC TTACATACAT ACATACATAT ACATATATAC 1320 CAAGCCAAGG CTATTTGATA GACCATGTCT CAAAAAAAAA GAAAAATACA GATATATAAT 1380 AGATTAGCTA TATGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGGA 1440 AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA 1500 AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAAAGGGAAA TTAATTGGAA AAAGAAAAGG AACTCTCAGG 1560 ATGGAAAGGG ACCAGAGAAG GTAATATGGT GTGCCATAAT GAAGCCCTTT ATTTTCCATA 1620 GTAAATCTGC ACTAATGAAG GAAGACATGC ATACAAATAT GTGCTTGGTA GAAGCCACCT 1680 CATGACTTAA ATATGAGTTT CTTGATTAAT AAATAACTTC CCAAATATTA TTAATCCTAT 1740 ATGAGCAAAC CTAGCAGATG GAATTGAACC TGAACCTGCC TCACTCCTCC ATTCCTGAAC 1800 TGATGTGGAG GATTATCTGC ACCCTGGAGG ACCATCTGGT CTTTCCTTGA TTCAGTCATA 1860 TAAGCAATAT TTTCTGGACC CAAGTATGAG CCAGCTGCTA GAGAGGTACT GGAAAACCCA 1920 AGAAAAGCAA GAATAATCCC AGCATCACAG AAGTTTCACT CTTCTGAAGG AAACAGATAA 1980 TAATTAAATA ATCAGATGGG AAACTGTAAA AATAATACCA GTAATGGGTA ACATTAAGGA 2040 TGGGAGTCTA CTCAGGAAGT TATCCCAAAG GTACAAAGAG ATGGCACCTG GGGCTGGCAC 2100 ACCATGGCAG TAGCTAGGCC AAAGGGAAGG CTGGGGGCCT TACTTTCTTG CCAACTCATT 2160 TCCCAGAAAC ACCAATTCCC AAAACCCAAT GTAGTCTGAA TAGGAATTGG AGGGGAAGCC 2220 TGGCTTGCTT CCTGGTCTAA TCTCCAACTA TTGTCCAGCA TCCTTACCCC AAAATAAATA 2280 AAGCCCCAGC AAGACTGCTA CTCCAGCATT CTACTCTGCT TCCCAGGGAA AGCTGACCTT 2340 GTTCCAGTGC CACCATGAAA TTCTTCACTG TCCTGCTATT TGTCAGTCTT GCTGCCACCT 2400 CTCTTGCTCT CCTGCCTGGT AAGTGCACCT TTCTTTCTGC TCTCCTTAGT CTCCTACAGG 2460 CCATGGGCTG TCAGGTAAGC AAAATTGCCA CCCTTGTGGA AAGATGATAA GACATGGAAT 2520 GAAAAAGCCA CAGCTGGATG TGGGCATGAA GACATATAGC TCATGAGTCC AGAAACCCAG 2580 AAAACCAAGG CTGGGTTCAG AGGCTAGACT GAACCCATAA CAGGGCAGAC TATCAGTCAA 2640 CAGAGATTCT GTTAGATCCT ATCACCAGAG GCTTGATCAG CACAACCCAA GTAAAATCAC 2700 TGCTTTAGAC ATCCTTAGCT CCCTTGGTAC AATGAGAGCA AGATGCACAC ACCACATCAA 2760 GTGCTATCCA TAGCACTCAC TCTGTACCAT ATAGTTCCAG GAACTTAGAA TACACTAACA 2820 GCTTACATAA AGATCTGTCA TCATTGAAAT TTCATTAGAG AAAGAAGAAA AAATAAACAT 2880 ACTAAAAATA TTATATAGTA TTTTAGAAAT GCTAAGGGAA GTGTAGAGAA GAGAAACATA 2940 AGGGACTAGC TAGGCATGGT GGTGCACACC TGCATTTCCA ACACTCAGGA AGCAGAAGCA 3000 GAACTACTAA GCAAAACCCT ATCTAAAGCA AACAAACCAC AAAGAGTAAG GGAGGTTGAG 3060 GAAGCTGCAA TGAGGTAACT ACAAATGACC AGTTCACATG TTACTTGTCT TGAGATCTCT 3120 GGAGATTTTA TCTTCTCTCC TCAGGGTCCA AAGATGAACT TCAAATGAAG ACTCAGCCCA 3180 CAGATGCCAG TAAGTCTCAT GAGAGCATCT CTTAATTGTT GGTAGCAAAA GACTAGAGAG 3240 TAAATGATGT TAGGAGAAAG TGAACAAACA GTTCCTCATG CTGTTGGCCT TAATTCTGCC 3300 TGCTGCACTG ATGGGCCATA AATCTGGGGG GTAGGAACAT TTTGTATAGC ACTTATGCTA 3360 TATAGTCATT GGAAATTGGA ATGGGGACAG CATTTCATAC CCAAGAGCTG ACAGGTAATA 3420 TTTCAGCTCA CCCAAAGACA AGTGGGAGCA GGGGGGGAGG GGTCTCTTCA GTTATAGGCA 3480 CTGTACTACA CAGCCCAAAA AAAAAAAAAA ACTTAAGCAT TGATGGGCTC AGATTTGAAG 3540 ATGCATTGTA AAGATTGTTT AATCATGAGC TATTTTCCCA AATTAACCTG GGAAAACTCT 3600 GAGAAGCTAA AAGAGAAAAA CACTTGGTGT TCAGAAGGAA GAACCAAGGT TAAGAAGCTT 3660 CTCATGTAAG TCAAGCAAAG GGTGAGGTGT TTACAAATGT CTCTTAATCA AGAAGGTGGG 3720 TTTTCCTGGG GTTGAAGTAG CAGAAATTCT TAATCGTATC ATTAGAAATC TAATTCATGC 3780 CTTTGAGGAG CTCAGGAAGA TAAATGCTAG CATAGAACCC CAATGCTACT GTAGATCAGT 3840 TAGGCAATTA CTCAACACTA ATGCACCATG TGAAGAGACA CTTTTTCTCC CAGATTTCTC 3900 TGCCCCTCAC TCCCTACATG TCCTTAGTTC CAGCTGCCCA GTCCACTCCC ACCAGCTACA 3960 CCAGTGAGGA GAGTACTTCC AGTAAGGACC TTTCCAAGGA GCCTTCCATC TTCAGAGAAG 4020 AGCTGATTTC CAAAGATAAT GTGGTGATAG AATCTACCAA GCCAGAGAAT CAAGAGGCCC 4080 AGGATGGGCT CAGGAGCGGG TCATCTCAGC TGGAAGAGAC CACAAGACCC ACCACCTCAG 4140 CTGGTATGAG CCAGGGAAGA AGGAAGATGT CTTGGGAGGT GGTAAGCAGA GGAAGACAGG 4200 GCAGACAGTA GCTTGTATAA ATAGGAGGCT CTACAAAGGA AAAAGAAGTC CTAGAAGGAC 4260 AAATTTTAAG TGTAAACCAA CTGCCAGCAC TGCAGGAAGC TGTTGGGATG GGAGGATGGA 4320 GGTGTGAATG GGAACCCACT GTAACTGGAC ATTTCTATCT TCAAATTACA GCAACCACCT 4380 CAGAGGAAAA TCTGACCAAG TCAAGCCAGA CAGTGGAGGA AGAACTGGGT AAAATAATTG 4440 AAGGATTTGT AACTGGTGCA GAAGACATAA TCTCTGGTGC CAGTCGTATC ACGAAGTCAT 4500 GAAGACAAAA ACACCTAACC ACTAAGTCCC ATGCTAGGTG GTGCCTTCAT CAGCCACATT 4560 CTGCTCATCT GACCACCACC TCTCAGTCTG CCCTTTGATG TCTTACATTA AAGTATTGCA 4620 ACCTAAACCC GGCTCTCTGC TGGCTTTGTC AGACCGGGGA AAGTAAAGGT TAGGGTTAGG 4680 TTGGATTTCT CTTTAGCTAC TCTATCCTTT TAGAATAGAA TAAACCAAAC CTCTCACACA 4740 CACAACCCTC AGTTTACAAG CCCAGTCAAG TCTCCCCATC CAAAACAACC TCTGCAAAAA 4800 CTTGATCCTT GTCATCCATC TGTTCCTCCA ATATAGACAA CCTCCTTTCC TACTCACCAT 4860 AGCCTACCTG CTCCCACACA CCAGCCCATT ATAGTTGCTC TCCCAAAGGC CACATACAGC 4920 AACAGCCCTC ATGGCCTTCT TAGTTCTGGC TTTTCTACTC TAGCTCTGAA AGACTGGAAG 4980 CAACTATTTC CTCTAGAATC TTCTCCTCAC TAATTTTCTT TGCCACTTTT GATTATTCAA 5040 TCTCCCTGCT CCTTTTCTGA ACTGTTTGGT ATCTAATCCT AGATCCCATC CTGTACTCTC 5100 TTGCCTTCAT CTCTCTTCAG GATTCCCATA GCCTCATCTG TCAGGACTTC TTATTAACCC 5160 ACACAGCTAA CATCCACCAA GTGCCCATCA GACCTGCCTA CCTAATTTGC TCTGACTTTC 5220 CTGCAACCCT AAGCAGTTTT CACTATGAAT GCATACAAAA CATGGAGAAA TGAAAACACA 5280 GGAAAAGAAG ACTGCCTATG CAAGAGTAGG GATGAGAGGC ATCACTGCTC TCCAGCATCC 5340 TACCCCCAGC TTACATGAAA GGAAGCTCAA GAGATTAACA GAGCAACTAA GCTT 5394 配列番号：２ 配列の長さ：３５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．３５７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GACGAGAAGA CGATGCAGAA AGCCAGGCGG AGGCAGTGGG ATGAGCCACG GGTCTGCTCC 60 AGGCGGTACC TGAAAGTGGA CTTTGCGGAC ATCGGGTGGA ATGAATGGAT CATCTCCCCG 120 AAATCCTTCG ATGCCTACTA CTGCGCGGGG GCCTGCGAGT TCCCCATGCC CAAGATTGTC 180 CGCCCATCCA ATCATGCCAC CATCCAGGGC ATCGTCAGAG CGGTGGGCAT CGTCCCTGGC 240 ATCCCGGAGC CCTGTTGTGT TCCAGACAAG ATGAACTCCC TTGGAGTCCT TTTCCTGGAT 300 GAGAACCGGA ACGCGGTTCT GAAGGTGTAC CCCAACATGT CCGTGGACAC CTGTGCA 357 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GTGCCACCAT GAAATTCTTC 20 配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TGGCTTGCTT CCTGGTCTAA 20 配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TTGCTTCCTG GTCTAATCTC 20 配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CTCTGCTTCC CAGGGAAAGC 20 配列番号：７ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GACGAGAAGA CGATGCAGA 19 配列番号：８ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GCACAGGTGT CCACGGACA 19
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、λＭＣ２６の制限酵素マップを示す。
実線部分はλＣｈａｒｏｎ４Ａに由来する。実線以外の
部分、即ち、ＥｃｏＲＩ（＃１−３．４ｋｂｐ）からＥ
ｃｏＲＩ（＃１＋１０．６ｋｂｐ）までの太枠で示され
た部分が約１２．７ｋｂＥｃｏＲＩ断片に相当する。＃
１は配列番号１のヌクレオチド番号１に相当する。５’
および３’の表示は、ｍＣ２６構造遺伝子に対するもの
である。
実線部分はλＣｈａｒｏｎ４Ａに由来する。実線以外の
部分、即ち、ＥｃｏＲＩ（＃１−３．４ｋｂｐ）からＥ
ｃｏＲＩ（＃１＋１０．６ｋｂｐ）までの太枠で示され
た部分が約１２．７ｋｂＥｃｏＲＩ断片に相当する。＃
１は配列番号１のヌクレオチド番号１に相当する。５’
および３’の表示は、ｍＣ２６構造遺伝子に対するもの
である。
【図２】図２は、ｐＳｍＣ２６の制限酵素マップを示
す。ｐＳＰ６４由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ部分以外
の太枠部分が約６．７ｋｂＥｃｏＲＩ断片に相当し、図
１のＥｃｏＲＩ（＃＜）からＥｃｏＲＩ（＃１＋６．７
ｋｂｐ）の太枠部分に対応する。５’および３’の表示
は、ｍＣ２６構造遺伝子に対するものである。
す。ｐＳＰ６４由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ部分以外
の太枠部分が約６．７ｋｂＥｃｏＲＩ断片に相当し、図
１のＥｃｏＲＩ（＃＜）からＥｃｏＲＩ（＃１＋６．７
ｋｂｐ）の太枠部分に対応する。５’および３’の表示
は、ｍＣ２６構造遺伝子に対するものである。
【図３】図３は、配列番号１の制限酵素マップを示す。
Ｅは制限酵素ＥｃｏＲＩを、Ｘは制限酵素ＸｂａＩを、
Ｐは制限酵素ＰｓｔＩを、そしてＨは制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩを示す。太枠はエクソンを示す。
Ｅは制限酵素ＥｃｏＲＩを、Ｘは制限酵素ＸｂａＩを、
Ｐは制限酵素ＰｓｔＩを、そしてＨは制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩを示す。太枠はエクソンを示す。
【図４】図４は、ｍＣ２６遺伝子の５’上流発現制御領
域である。下線部はＭｏｂＩＩリピートを示す。
域である。下線部はＭｏｂＩＩリピートを示す。
【図５】図５は、ｍＣ２６遺伝子の構造遺伝子部分を示
す。ヌクレオチド番号は、図４からの通し番号を示し、
配列番号１のヌクレオチド番号に対応する。
す。ヌクレオチド番号は、図４からの通し番号を示し、
配列番号１のヌクレオチド番号に対応する。
【図６】図６は、ｍＣ２６遺伝子の３’下流発現制御領
域である。ヌクレオチド番号は、図４および図５からの
通し番号を示し、配列番号１のヌクレオチド番号に対応
する。
域である。ヌクレオチド番号は、図４および図５からの
通し番号を示し、配列番号１のヌクレオチド番号に対応
する。
【図７】図７は、ｐＢｍＣ２６ＥＨの制限酵素マップを
示す。実線部分がｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋
に由来する。実線部分以外のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片が配列番号１の５３９４ｂｐのＤＮＡである。
示す。実線部分がｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋
に由来する。実線部分以外のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片が配列番号１の５３９４ｂｐのＤＮＡである。
【図８】図８は、ＰＣＲ法によるＤＮＡ診断の結果であ
り、ＰＣＲ反応後、２％アガロースゲル電気泳動し、エ
チジウムブロミド染色した結果を示す。Ｍは分子量マー
カーを示す。レーン１は組換え動物細胞（ヒト−ハムス
ター組換え体ＢＩＰ）を示し、レーン２はヒトＮａｍａ
ｌｗａ細胞（ネガティブコントロール）を示し、レーン
３はＢＨＫ細胞株１を示し、レーン４はＢＨＫ細胞株２
を示し、そしてレーン５はＢＨＫ細胞株３を示す。
り、ＰＣＲ反応後、２％アガロースゲル電気泳動し、エ
チジウムブロミド染色した結果を示す。Ｍは分子量マー
カーを示す。レーン１は組換え動物細胞（ヒト−ハムス
ター組換え体ＢＩＰ）を示し、レーン２はヒトＮａｍａ
ｌｗａ細胞（ネガティブコントロール）を示し、レーン
３はＢＨＫ細胞株１を示し、レーン４はＢＨＫ細胞株２
を示し、そしてレーン５はＢＨＫ細胞株３を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (17)
- 【請求項１】 配列番号１のヌクレオチド配列を有する
ＤＮＡ。 - 【請求項２】 以下の工程：配列番号３ないし６のヌク
レオチド配列を有するＤＮＡからなる群から選択される
少なくとも１つのＤＮＡプローブとハイブリダイズする
約６．７ｋｂのＤＮＡ断片をマウスゲノミックＤＮＡラ
イブラリーのＥｃｏＲＩ消化物から得；そして該ＤＮＡ
断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化すること；により得られ
る、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号３のヌクレオチド配列を有する
ＤＮＡのみをプローブとして用いることにより得られ
る、請求項２記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 上記配列番号１の第２３０５ヌクレオチ
ドから第４６２４ヌクレオチドまでの範囲のいずれか１
カ所に異種遺伝子のコード領域が挿入されていることを
特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
ＤＮＡ。 - 【請求項５】 図５に示す第１ないし第４エクソンおよ
び第１ないし第３イントロンのうちの少なくともひとつ
が欠失していることを特徴とする、請求項４記載のＤＮ
Ａ。 - 【請求項６】 上記異種遺伝子が骨形成誘導蛋白質遺伝
子である、請求項４または５記載のＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項１ないし６のいずれか１項に記載
のＤＮＡを含む発現ベクター。 - 【請求項８】 大腸菌内で複製可能な請求項７記載の発
現ベクター。 - 【請求項９】 図４に示すヌクレオチド配列を遺伝子発
現制御領域として含むＤＮＡ。 - 【請求項１０】 図６に示すヌクレオチド配列を遺伝子
発現制御領域として含むＤＮＡ。 - 【請求項１１】 請求項７または８に記載の発現ベクタ
ーのＤＮＡを直鎖状にしてヒト以外の哺乳動物の胚の細
胞に導入することからなる、トランスジェニックな哺乳
動物の生産方法。 - 【請求項１２】 上記発現ベクター中に存在する、図４
に示すヌクレオチド配列を一方の末端とし、図６に示す
ヌクレオチド配列を他方の末端とし、かつ、ｍＣ２６構
造遺伝子部分および／または異種遺伝子コード領域を内
部に含むＤＮＡ断片に代えて、マウスゲノミックＤＮＡ
ライブラリーのＥｃｏＲＩ部分消化物であって、かつ、
配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片とハ
イブリダイズする約１２．７ｋｂのＤＮＡ断片を用いる
ことを特徴とする、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 上記約１２．７ｋｂのＤＮＡ断片が、
配列番号３ないし６のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
からなる群から選択される少なくとも１つのＤＮＡプロ
ーブとハイブリダイズするものとして選択されたもので
ある、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 上記約１２．７ｋｂのＤＮＡ断片が、
配列番号３のヌクレオチド配列を有するＤＮＡのみをＤ
ＮＡプローブとして用いて選択されたものである、請求
項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 上記約１２．７ｋｂのＤＮＡ断片中に
存在する配列番号１の第２３０５ヌクレオチドから第４
６２４ヌクレオチドまでの範囲のいずれか１カ所に異種
遺伝子のコード領域が挿入されていることを特徴とす
る、請求項１２ないし１４のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項１６】 上記約１２．７ｋｂのＤＮＡ断片中、
図５に示す第１ないし第４エクソンおよび第１ないし第
３イントロンのうちの少なくともひとつが欠失している
ことを特徴とする、請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 上記異種遺伝子が骨形成誘導蛋白質遺
伝子である、請求項１５または１６記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5355132A JPH07194380A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | ｍＣ２６遺伝子発現制御領域を用いてトランスジェニック動物乳腺において物質を生産する新規製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5355132A JPH07194380A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | ｍＣ２６遺伝子発現制御領域を用いてトランスジェニック動物乳腺において物質を生産する新規製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004218627A Division JP2004298196A (ja) | 2004-07-27 | 2004-07-27 | ｍＣ２６遺伝子発現制御領域を用いてトランスジェニック動物乳腺において物質を生産する新規製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07194380A true JPH07194380A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=18442129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5355132A Pending JPH07194380A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | ｍＣ２６遺伝子発現制御領域を用いてトランスジェニック動物乳腺において物質を生産する新規製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07194380A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6018039A (en) * | 1996-07-30 | 2000-01-25 | Satow; Hiroyasu | MC26 gene expression-regulatory region |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP5355132A patent/JPH07194380A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6018039A (en) * | 1996-07-30 | 2000-01-25 | Satow; Hiroyasu | MC26 gene expression-regulatory region |
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