JPH07196690A

JPH07196690A - コクシジウム症家禽ワクチン

Info

Publication number: JPH07196690A
Application number: JP6279543A
Authority: JP
Inventors: Janene M Bumstead; ジヤニン・マリリン・バムステツド; Paul Patrick James Dunn; ポール・パトリツク・ジエイムズ・ダン; Fiona Margaret Tomley; フイオナ・マーガレツト・トムリー; Arnoldus N Vermeulen; アーノルダス・ニコラス・フエルムーレン
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1993-11-12
Filing date: 1994-11-14
Publication date: 1995-08-01
Also published as: ZA948983B; AU7881194A; AU684317B2; US5614195A; ATE232903T1; US5843722A; DE69432137T2; NZ264914A; ES2192559T3; HU217022B; DE69432137D1; EP0653489A1; EP0653489B1; HUT69924A; CA2135547A1; US5795741A; PT653489E; DK0653489T3

Abstract

(57)【要約】【構成】免疫原性を有する新規Ｅｉｍｅｒｉａタンパ
ク質、及びこれらのタンパク質をコードするＤＮＡ配
列。【効果】これらのタンパク質を家禽に投与して、トリ
のコクシジウム症を予防することができる。更には、コ
クシジウム症用ベクターワクチン調製のためにこれらの
タンパク質をコードするＤＮＡを使用することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＥｉｍｅｒｉａ種、特に
Ｅｉｍｅｒｉａｍａｘｉｍａに由来し、免疫リンパ球
を刺激することが可能なタンパク質に係る。本発明は更
に、前記タンパク質の全部又は抗原的に重要な部分、こ
のような核酸配列を含む組換えベクター、このような組
換えベクターで形質転換された宿主細胞又は生物、及び
コクシジウム症に対する家禽の感染防御用ワクチンに係
る。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】コクシ
ジウム症はＡｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ亜門Ｅｉｍｅｒｉａ
属の細胞内原生動物寄生虫である多数のコクシジウム種
のうちの１種以上による感染に起因する疾患である。本
明細書中において家禽は、卵又は食肉源として使用さ
れ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホ
ロホロチョウ、キジ、ハト及びクジャク等の商業的に重
要な類を含む飼育鳥類として定義される。

【０００３】ニワトリのコクシジウム症は数種の異なる
Ｅｉｍｅｒｉａ種、即ちＥｉｍｅｒｉａａｃｅｒｖｕ
ｌｉｎａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、
Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｍ
ｉｔｉｓ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ及び
Ｅ．ｈａｇａｎｉに起因することが知られている。もっ
とも、後者２種については実在を疑う者もある。これら
のＥｉｍｅｒｉａ種のいずれかの低レベル感染の結果、
再感染に対する感染防御免疫が生じる。

【０００４】ニワトリに及ぼす病原作用は種によって異
なり、ニワトリの種類によっても異なる。例えばＥ．ａ
ｃｅｒｖｕｌｉｎａ又はＥ．ｍａｘｉｍａのような寄生
虫は、食物消化を主要機能とする小腸の大部分に寄生す
るため、これらの寄生虫がブロイラーのニワトリに与え
る被害は甚大である。

【０００５】Ｅ．ｍａｘｉｍａは、上記に列挙した種の
うちで免疫原性が最も高く、感染後に良好な天然感染防
御をもたらす。しかしながら、株間の変異があり、株間
の交差感染防御はほとんど又は全く認められない。

【０００６】Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫は生活環の間に多数
の段階を経る。生活環は、ニワトリが構内飼養中又は粉
塵吸入により胞子形成性オーシスト（接合子嚢）として
知られる感染段階を取り込むと、開始する。Ｅ．ｍａｘ
ｉｍａの場合、オーシストは非常に大型である。胞子形
成したオーシストの壁は砂嚢及び腸管内で機械的粉砕作
用と化学的作用との組み合わせにより破壊され、４個の
スポロシストが放出される。スポロシストは十二指腸に
移動し、胆汁と消化酵素に暴露され、スポロシスト当た
り平均１０個のスポロゾイトが放出される。

【０００７】スポロゾイトは侵入及び生殖するのに適切
な宿主上皮細胞を求めて移動する。上皮細胞の感染後、
寄生虫は生活環のシゾント期に入り、シゾント当たり８
〜１６から＞２００までのメロゾイトを生成する。メロ
ゾイトは一旦シゾントから放出されると別の上皮細胞に
自由に感染する。これらの無性生殖サイクルを２〜５回
繰り返した後、細胞内メロゾイトは雌性配偶子母細胞及
び雄性配偶子母細胞として知られる有性形態に成長す
る。雌性配偶子母細胞が雄性配偶子母細胞から放出され
たミクロガメートにより受精すると、接合子が形成さ
れ、それ自体の周囲にシスト壁を形成する。新たに形成
されたオーシストは感染したニワトリから糞便とともに
排泄される。

【０００８】温度及び湿度と十分な空気中酸素の適正な
環境条件下で、オーシストは感染段階で胞子形成し、新
しい宿主に感染して疾患を伝染できるようになる。従っ
て、トリ間で寄生虫を移動させるために中間宿主は不要
である。

【０００９】Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫がニワトリの消化管
に感染する結果、体重利得が減少し、飼料利用率が低下
し、産卵が停止し、多くの場合は死に至る。家禽の集約
生産の拡大に伴い、この寄生虫による損害も深刻になっ
ており、実際にコクシジウム症は経済的に最も重大な寄
生虫病となっている。オランダでは、家禽飼育業者の損
害額は毎年１００万ギルダーを越え、１９８６年の損害
額は約１３００万ギルダーであった。同年の合衆国の損
害額は３億ドルであった。

【００１０】従来、コクシジウム症を防除するためにい
くつかの方法が試みられている。化学療法剤の出現以前
には、寝わらの機械的除去と共に消毒剤を使用する衛生
設備の改善が主たる方法であった。しかしながら、通常
は疾患を伝達するに十分な数のオーシストが残存してい
た。

【００１１】十分な管理に加えて飼料又は飲料水に抗コ
クシジウム症剤を導入した結果、疾患防除にある程度成
功した。しかしながら、抗コクシジウム症剤は、一因に
は薬剤耐性コクシジウム株が発生するため、長年使用す
る間に効力が低下することが知見された。更に、数種の
化学療法剤は食肉中に残渣を残し、食肉の消費に不適切
であることが知見された。

【００１２】全７種のＥｉｍｅｒｉａ種の早発系からの
オーシストを含む生ワクチンをニワトリに投与すること
により疾患を免疫学的に防除する試みも行われた。この
ような早発系はニワトリにＥｉｍｅｒｉａ種の野生集団
を接種し、感染の結果として分泌される最初の寄生虫を
採取することにより得られる。採取した寄生虫をニワト
リに戻し、サイクルを数回繰り返す。最終的に、腸内の
無性生殖サイクル数の少ない早発系の寄生虫が生産され
る。従って、このような系は免疫原性を維持しながら、
腸内で生産する寄生虫数が少なく、その結果、宿主ニワ
トリに与える損害も少ない。このタイプのワクチンの欠
点は、ニワトリの生体内で生産する必要があり、再現性
が低いため、高価であるという点にある。

【００１３】遺伝子工学の出現により、有効なワクチン
の新規製造方法が提供された。これらの方法を使用し
て、数種の病原微生物の抗原性タンパク質をコードする
ＤＮＡが大腸菌のような宿主微生物にクローニングさ
れ、その結果、ワクチンに配合することが可能な十分高
いレベルでタンパク質が発現された。このように産生さ
れたタンパク質の利点は、非感染性であり、比較的廉価
に製造できるという点にある。こうして、肝炎、単純疱
疹及び口蹄疫のような多数のウイルスに対するワクチン
が製造された。

【００１４】コクシジウム症ワクチンを遺伝子工学によ
り製造することが試みられた。ヨーロッパ特許出願第３
３７５８９号は、グループＢＥｉｍｅｒｉａｔｅｎ
ｅｌｌａタンパク質を単離し、新規発現ベクターに挿入
し、このようなベクターを使用して適当な宿主を形質転
換させたと報告している。ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／０
４４６１号は、「ｍＲＮＡ経路」又は「核酸ＤＮＡ経
路」のいずれかを使用して抗原性タンパク質を産生する
微生物を構築したと記載している。このように、Ｅ．ｔ
ｅｎｅｌｌａ及びＥ．ｍａｘｉｍａから数種の抗原が製
造及び配列決定された。この型の経路を使用してワクチ
ンに配合する抗原を製造するには、異種において抗体を
誘導し得る抗原を選択する手段のみに頼っている。この
アプローチでは必ずしも最大の感染防御性を有する抗原
を選択することはできない。

【００１５】Ｈ．Ｓ．Ｌｉｌｌｅｈｏｊ（Ｖｅｔ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．，１３，３２１−
３３０，１９８６）によると、コクシジウムに感染した
ニワトリにおける感染防御免疫の発生は種特異的Ｔ細胞
応答の発生に起因し得ると考えられる。

【００１６】

【課題を解決するための手段】Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫を
細分し、免疫Ｔリンパ球を刺激するタンパク質を選択し
た後、このようなタンパク質をコードする核酸を含むベ
クターを製造し、その後、このようなタンパク質を含む
ワクチンを製造することにより、より有効な感染防御性
のコクシジウム症ワクチンを製造できることがここに知
見された。

【００１７】本発明の１特徴によると、精製Ｅｉｍｅｒ
ｉａｍａｘｉｍａＴリンパ球刺激タンパク質又はそ
の免疫学的に活性な部分が提供される。このようなタン
パク質は、これと通常会合する寄生虫全体又は他のタン
パク質を実質的に含まない。

【００１８】本発明の第２の特徴によると、精製Ｅｉｍ
ｅｒｉａｍａｘｉｍａＴリンパ球刺激タンパク質の
全部又は実質的部分、特に免疫学的に活性な部分をコー
ドする核酸配列が提供される。このような核酸配列は、
組換え核酸分子をもたらす発現制御配列に作動的に結合
していてもよく、このような分子を適切なベクターに挿
入すると、核酸配列を発現することが可能な組換えベク
ターが得られる。

【００１９】このような組換えベクター又は上記核酸配
列を使用して適切な宿主細胞又は生物を形質転換させる
ことができる。次いで、このような形質転換宿主細胞又
は生物を使用して、コクシジウム症に対する家禽の感染
防御用ワクチンに配合するための刺激タンパク質を製造
することができる。あるいは、形質転換宿主細胞又は生
物自体をワクチンに配合することもできる。

【００２０】一般に、「タンパク質」なる用語は、生物
学的活性を有するアミノ酸の分子鎖を意味する。タンパ
ク質は特定長でなく、必要に応じて例えばグリコシル
化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化により、ｉ
ｎｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏで改変することがで
き、従って、特にペプチド、オリゴペプチド及びポリペ
プチドが定義に含まれる。

【００２１】より特定的には、本発明は、配列番号２及
び４に示すアミノ酸配列を有するＴリンパ球タンパク質
又はその免疫学的に活性な部分、並びに生物学的に機能
的なその等価物又は変異体を提供する。

【００２２】本明細書中に特に開示する生物学的に機能
的な等価物又は変異体は、例えば１種以上のアミノ酸の
欠失、挿入及び／又は置換により上記アミノ酸配列から
誘導されるタンパク質でありながら、Ｅｉｍｅｒｉａ抗
原の１種以上の免疫原決定基を維持するものであり、即
ち前記変異体は宿主動物に免疫応答を誘発することが可
能な１種以上のエピトープを有する。

【００２３】本発明の特定タンパク質には個々のＥｉｍ
ｅｒｉａ寄生虫又は株間に天然の変異が存在し得ること
が理解されよう。これらの変異は、完全配列における１
個以上のアミノ酸の相違又は、完全配列中の１個以上の
アミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加により
立証され得る。生物学的及び免疫学的活性を実質的に変
化させないアミノ酸置換は例えばＮｅｕｒａｔｈら著
“ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ” ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ（１９７９）に記載され
ている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換又は進化中に頻
発した置換は特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、
Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌであ
る（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓｏｆｐ
ｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎ
ｄ．，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．，１９７
８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３参照）。他のアミノ酸
置換としては、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌ
ａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ
／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／
Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ及びＡｌａ／
Ｇｌｕを挙げることができる。この情報に基づき、Ｌｉ
ｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは迅速且つ高感度でタンパ
ク質を比較し（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１
４４１，１９８５）、同種タンパク質間の機能的類似を
決定する方法を開発した。産物タンパク質が免疫反応性
を維持する限り、本発明の実施態様のこのようなアミノ
酸置換は発明の範囲に含まれる。

【００２４】本発明は更に、上記Ｅｉｍｅｒｉａのタン
パク質をコードする単離精製核酸配列を提供する。この
ような核酸配列を配列番号１、３及び５に示す。遺伝子
コードの縮重により、同一アミノ酸をコードする別のコ
ドンをもたらすコドンの塩基置換が可能であり、例えば
ＧＡＴ及びＧＡＡのいずれもアミノ酸グルタミン酸のコ
ドンであることは当業者に周知である。従って、配列番
号２及び４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を発
現させるためには、核酸配列は夫々配列番号１及び３に
示す核酸配列と異なるコドン構成であってもよいことは
自明である。

【００２５】Ｌｏｎｇら（ＦｏｌｉｏＶｅｔ．Ｌａ
ｔ．，１９７６，６，２０１−２０７）により記載さ
れているようにニワトリを介してＥｉｍｅｒｉａｍａ
ｘｉｍａ寄生虫を生産した。感染したニワトリの糞から
からオーシストを単離し、胞子形成後、飽和塩化ナトリ
ウム中の浮選により精製した。次に、胞子形成したオー
シストを使用して無病原体４週齢ニワトリに感染させ
た。胞子形成した別量のオーシストをトリに投与し、免
疫応答を追加刺激した。

【００２６】上述のように浮選により精製した胞子形成
オーシストの調製物を崩壊剤中で振動させ、スポロゾイ
トを放出させた。スポロゾイトをタンパク質分解酵素で
処理し、スポロゾイトを放出させた後、Ｓｃｈｍａｔｚ
ら（Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．，１９８４，３１，１８
１−１８３）の方法に従ってイオン交換クロマトグラフ
ィーにより洗浄及び精製した。スポロゾイトを緩衝液に
懸濁し、水浴中で沸騰させ、遠心後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動）用ポリアクリルアミドゲルにアプライした。分
子量マーカーを同一ゲル上で泳動させ、Ｅｉｍｅｒｉａ
抗原の分子量を外挿した。ゲルをＴｏｗｂｉｎ及びＧｏ
ｒｄｏｎ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，１
９８４，７２，３１３−３４０）の方法によりニトロセ
ルロース紙上で電気泳動させた。次にニトロセルロース
紙を洗浄し、製造業者の指示に従ってＡｕｒｏｄｙｅ染
色により可視化した。

【００２７】タンパク質バンドをニトロセルロース紙か
ら切り出し、小片に分割し、ガラスバイアルに移した。
その後、ニトロセルロース片をジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）に溶解し、可溶化するまで放置した後、激
しく撹拌しながら炭酸塩／重炭酸塩を滴下することによ
りニトロセルロース粒子を沈降させた。次にサンプルを
遠心分離し、ニトロセルロース粒子のペレットを数回洗
浄した後、再懸濁し、小アリコートに分けた。

【００２８】電気泳動ゲルからのタンパク質バンドが感
染したトリからのリンパ球を刺激したか否かを決定する
ために、上述のように感染したニワトリから静脈穿刺に
より採血し、リンパ球増殖アッセイで使用した。血液を
６００ｇで遠心分離し、１０分後に沈殿した赤血球の上
部の細胞懸濁液を除去して、更に１０分間４００ｇで遠
心分離した。第２の遠心分離後に沈殿した細胞を数回洗
浄し、最終的に再懸濁した。再懸濁した細胞を、希釈し
た再懸濁ニトロセルロース粒子と共に丸底プレートで培
養した。対照ウェルにはタンパク質を含まないニトロセ
ルロース粒子を収容した。

【００２９】リンパ球培養物を９６時間インキュベート
し、最後の１６時間は培養物に³Ｈ−チミジンをパルス
し、その後、細胞をガラスマイクロファイバーフィルタ
ーに回収した。乾燥後、フィルターをシンチレーション
バイアルに入れ、液体シンチレーションカクテルを加え
（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｏｒ２９９［登録商標］Ｐａ
ｃｋａｒｄ，Ｃａｖｅｒｓｈａｍ、英国）、シンチレー
ションスペクトルフォトメーターで放射能を測定した。
下式：ＳＩ＝ｃｐｍ１／ｃｐｍ２（式中、ｃｐｍ１＝タンパク質を含むＮＣ粒子と共にイ
ンキュベートした３重培養物の平均ｃｐｍ、ｃｐｍ２＝
タンパク質を含まないＮＣ粒子と共にインキュベートし
た３重培養物の平均ｃｐｍ）を使用して得られた刺激指
数（ＳＩ）として結果を表した。

【００３０】この方法によると、多くはＴリンパ球が増
殖している。

【００３１】この結果、刺激指数はトリ及びゲルにより
異なるが、約７０，０００Ｄの相対分子量（Ｍｒ）を有
するタンパク質バンドは免疫感作したトリからのリンパ
球を常に刺激し、他方、対照トリからのリンパ球は刺激
しないことが判明した。

【００３２】この検出後、Ｅ．ｍａｘｉｍａスポロゾイ
トの新鮮な調製物を上述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分離し、ニトロセルロースに移した。Ｍｒ＝７０，０
００Ｄ（ｐ７０）のタンパク質バンドを切り出し、上述
のように可溶化させ、リン酸緩衝塩液（ＰＢＳ）で洗っ
た後、ＰＢＳに再懸濁した。この懸濁液をウサギに２週
間おきに注射を繰り返すことにより皮下接種した。各注
射から２週間後にウサギの側耳静脈から静脈穿刺により
採血した。ウェスタンブロッティングによると、５回の
追加刺激後にウサギ抗ｐ７０血清が得られたことが判明
した。

【００３３】トリフルオロ酢酸セシウム勾配による遠心
分離によりＥ．ｍａｘｉｍａスポロゾイトから全リボ核
酸（ＲＮＡ）を抽出精製した。メッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）を非ｍＲＮＡから分離するために、オリゴ
ｄＴＣＥＬＬＵＬＯＳＥ（ポリ［Ａ］Ｑｕｉｋ，Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）のカラムを製造業者に指示に従って
使用した。次に、無水エタノール中の酢酸ナトリウムを
使用してポリ（Ａ）＋ＲＮＡ又はｍＲＮＡをカラムから
一晩溶出させた。

【００３４】ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）合成キット
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してｍＲＮＡからコピ
ーデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を合成した。（Ｘｈｏ
Ｉ制限部位を含む）オリゴｄＴ鋳型及びモロニー−マウ
ス白血病ウイルス逆転写酵素を使用して第１のｃＤＮＡ
鎖を合成した。後でクローニングプロトコルで使用でき
るように制限酵素による消化からｃＤＮＡを保護するた
めに、第１のｃＤＮＡ鎖中のシトシン残基をメチル化し
た。ＲＮＡｓｅＨ及びＤＮＡポリメラーゼＩを使用し
て第２のｃＤＮＡ鎖を合成した後、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼを使用して末端を修復した。ＥｃｏＲＩアダプタ
ーをＴ４ＤＮＡリガーゼにより平滑末端化ｃＤＮＡに
連結した。ＸｈｏＩで消化し、ＸｈｏＩ適合性３’末端
とＥｃｏＲＩ適合性５’末端を有するｃＤＮＡを生成し
た。

【００３５】ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化して脱リン酸
化したＵｎｉ−ＺＡＰＸＲベクターに、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを使用してｃＤＮＡを連結した。得られた一次
ライブラリー（Ｅｍｘ８及びＥｍｘ９）を大腸菌Ｓ
ＵＲＥ細胞で平板培養及び増幅した。Ｅｍｘ８ライブラ
リーは６５％の組換え体を与え、Ｅｍｘ９ライブラリー
は５５％の組換え体を与えることが判明した。

【００３６】上述のように調製したウサギ抗ｐ７０抗血
清を使用して２つのライブラリー、Ｅｍｘ８及びＥｍｘ
９をスクリーニングした。陽性プラークを釣菌し、陽性
がプラーク純粋となるまで再スクリーニングした。

【００３７】２つのライブラリーＥｍｘ８及びＥｍｘ９
におけるクローンからのｃＤＮＡをプラスミドｐＵＣ１
９にサブクローニングし、制限エンドヌクレアーゼ消化
により分析した。あるいは、ｉｎｖｉｖｏ切り出しを
使用してλＺａｐからのプラスミドレスキューをｃＤＮ
Ａに適用した後、制限エンドヌクレアーゼ消化により分
析した。

【００３８】こうして数種の異なるクローンを同定し
た。２つのクローンの選択された抗血清は２ｄＰＡＧ
Ｅにより分離されたＥ．ｍａｘｉｍａスポロゾイトのブ
ロット上で抗ｐ７０抗血清により認識される種々のスポ
ットと交差反応し、これらのクローンをＤＮＡ配列分析
に選択した。これは、Ｂａｎｋｉｅｒら（Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓｉｎｔｈｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）８５：ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓｉｎＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１−３４，１９８３）に記載のＭ
１３／ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を使用してラン
ダムサブクローニング及び配列決定により実施した。

【００３９】本発明の核酸配列はＥｉｍｅｒｉａｍａ
ｘｉｍａ株から単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）技術を含む組換えＤＮＡ技術により増幅することが
でき、あるいは当業者に公知の方法によりｉｎｖｉｔ
ｒｏで化学的に合成することができる。

【００４０】本発明の核酸配列は、該配列が天然では会
合又は結合しない種々の複製実施ＤＮＡ配列に連結し、
適切な宿主の形質転換に使用可能な所謂組換えベクター
とすることができる。有用な組換えベクターは好ましく
はプラスミド、バクテリオファージ、コスミド又はウイ
ルスから得られる。

【００４１】本発明の核酸配列をクローニングするため
に使用可能な特定ベクター又はクローニングベクターは
当業者に公知であり、特にプラスミドベクター（例えば
ｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔプラスミド）、バクテリオファージ（例えば
λｇｔ−Ｗｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ２８及びＭ１３由来ファ
ージ）、又はウイルスベクター（例えばＳＶ４０、アデ
ノウイルス又はポリオーマウイルス）を挙げることがで
きる（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ編，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａｓｕｒｖｅｙ
ｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃ
ｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅ
ｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８；Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．
Ａ．ら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１１０，１−２４，
１９９０も参照のこと）。本発明の組換えベクターの構
築に使用される方法は当業者に公知であり、特にＭａｎ
ｉａｔｉｓ，Ｔら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２
版；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，１９８９）に記載されている。

【００４２】例えば本発明の核酸配列をクローニングに
ベクターに挿入するには、遺伝子及び所望のクローニン
グベクターの両方を相補的ＤＮＡ末端を生成するのに用
いたと同一の制限酵素で切断すると、容易に実施でき
る。

【００４３】あるいは、１本鎖ＤＮＡを消化することに
より又は１本鎖末端に適当なＤＮＡポリメラーゼを充填
することにより平滑末端に生成される制限部位を改変す
ることが必要な場合もある。その後、平滑末端をＴ４
ＤＮＡリガーゼのような酵素で連結することができる。

【００４４】必要に応じてリンカーをＤＮＡ末端に連結
することにより制限部位を生成することができる。この
ようなリンカーは制限部位配列をコードする特定のオリ
ゴヌクレオチド配列を含み得る。制限酵素で切断したベ
クター及び核酸配列をホモポリマーテーリングにより更
に改変してもよい。

【００４５】本明細書中で使用する「形質転換」なる用
語は、使用する方法（例えば直接取り込みか又は形質導
入か）に関係なく、異種核酸配列を宿主細胞に導入する
ことを意味する。異種核酸配列は自律複製を介して維持
してもよいし、あるいは、宿主ゲノムに組み込んでもよ
い。必要に応じて指定宿主に適合可能な適当な制御配列
を有する組換えベクターを提供する。制御配列は挿入核
酸配列の発現を調節することができる。微生物以外に、
多細胞生物に由来する細胞培養物も宿主として使用する
ことができる。

【００４６】本発明の組換えベクターは好ましくは、所
望の形質転換細胞、例えばｐＢＲ３２２におけるアンピ
シリン及びテトラサイクリン耐性や、ｐＵＣ８における
アンピシリン耐性及びβ−ガラクトシダーゼのα−ペプ
チドを選択するために使用可能な１種以上のマーカー活
性を含む。

【００４７】適切な宿主細胞はポリペプチドをコードす
る核酸配列又はこのような核酸配列を含む組換えベクタ
ーにより形質転換することができ、必要に応じて前記核
酸配列によりコードされる前記ポリペプチドを発現させ
るために使用することが可能な微生物又は細胞である。
宿主細胞は原核生物起源（例えば大腸菌、枯草菌及びシ
ュウドモナス種の細菌）でもよいし、真核生物起源でも
よく、後者では酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）や、より高等な真核生物細
胞（例えば昆虫、植物又は、ＨｅＬａ細胞及びチャイニ
ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳動物細
胞）を使用できる。昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔ
ｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳｆ９細胞系（Ｌｕｃ
ｋｏｗら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６，４７−５
５，１９８８）を挙げることができる。真核生物クロー
ニング系における本発明の核酸配列のクローニング及び
発現に関する情報は、Ｅｓｓｅｒ，Ｋ．ら（Ｐｌａｓｍ
ｉｄｓｏｆＥｕｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８６）に記載されている。

【００４８】一般に、本発明で有用な組換えベクターを
構築するためには原核生物が好適である。特に大腸菌Ｋ
１２株、特にＤＨ５ａ又はＭＣ１０６１株が有用であ
る。

【００４９】発現に際しては、本発明の核酸配列を発現
ベクターに導入、即ち本発明の配列を発現制御配列に作
動的に結合する。このような制御配列はプロモーター、
エンハンサー、オペレーター、インデューサー、リボソ
ーム結合部位等である。従って、本発明は、発現制御配
列に作動的に結合した上記Ｅｉｍｅｒｉａタンパク質を
コードする核酸配列を含み、ベクターに含まれるＤＮＡ
配列を形質転換宿主細胞中で発現させることが可能な組
換えベクターを提供する。

【００５０】当然のことながら、形質転換宿主がＥｉｍ
ｅｒｉａタンパク質抗原の少なくとも１種以上の免疫原
決定基を有するポリペプチドを産生する限り、クローニ
ングベクターの選択部位に挿入されたヌクレオチド配列
は所望のポリペプチドの実際の構造遺伝子の部分ではな
いヌクレオチドを含んでもよいし、所望のタンパク質の
完全構造遺伝子のフラグメントのみを含んでもよい。

【００５１】宿主細胞が細菌であるとき、使用可能な有
用な発現制御配列はＴｒｐプロモーター及びオペレータ
ー（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．，８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター
及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７
５，６１５，１９７８）；外膜タンパク質プロモーター
（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．及びＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，Ｅ
ＭＢＯＪ．，１，７７１−７７５，１９８２）；バク
テリオファージλプロモーター及びオペレーター（Ｒｅ
ｍａｕｔ，Ｅ．ら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，
１１，４６７７−４６８８，１９８３）；α−アミラー
ゼ（枯草菌）プロモーター及びオペレーター、終結配
列、並びに選択した宿主細胞に適合可能な他の発現促進
及び制御配列を含む。宿主細胞が酵母であるとき、有用
な発現制御配列の例としては例えばα−接合因子を挙げ
ることができる。昆虫細胞の場合にはバキュロウイルス
のポリヘドリン又はｐ１０プロモーターを使用すること
ができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主
細胞が哺乳動物起源の場合には、有用な発現制御配列の
例としてＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．
Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１
９８３）又はメタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎ
ｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９６，３９−４
２，９８２）又は熱衝撃プロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８２，４９４９−５３，１９８４）を挙げることができ
る。あるいは、Ｅｉｍｅｒｉａに存在する発現制御配列
も使用することができる。遺伝子発現を最大にするため
には、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＬａｕｅｒ（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，４７３，１９７
９）も参照されたい。

【００５２】従って本発明は、上記核酸配列、組換え核
酸分子又は組換えベクターを含み、前記核酸配列の発現
によりＥｉｍｅｒｉａタンパク質を産生することが可能
な宿主細胞も包含する。

【００５３】Ｅｉｍｅｒｉａ感染に対する家禽の免疫感
作は、免疫学的関連での本発明のタンパク質を所謂サブ
ユニットワクチンとしてトリに投与することにより達せ
られる。本発明のサブユニットワクチンは、任意に医薬
的に許容可能なキャリヤーの存在下で純粋形態のタンパ
ク質を含み得る。タンパク質は、融合産物の精製に有利
であり得る非関連タンパク質に任意に共有結合していて
もよい。例えばβ−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、
プロキモシン、血液凝固因子Ｘａ等が挙げられる。

【００５４】これらのタンパク質をそのまま使用すると
感染防御免疫を誘発する能力が低い場合もある。免疫原
性を誘発するためには小フラグメントをキャリヤー分子
に結合することが好ましい。この目的に適切なキャリヤ
ーは高分子であり、例えば天然ポリマー（アオガイヘモ
シアニン（ＫＬＨ）、アルブミン、トキシン等のタンパ
ク質）や、合成ポリマー、例えばポリアミノ酸（ポリリ
シン、ポリアラニン）又は両親媒性化合物のミセル（例
えばサポニン）である。あるいは、これらのフラグメン
トをそのポリマー、好ましくは線状ポリマーとして提供
してもよい。

【００５５】必要に応じてワクチンで使用する本発明の
タンパク質は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル
化又はリン酸化によりｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉ
ｖｏで改変してもよい。

【００５６】サブユニットワクチンの代替物は生ワクチ
ンである。本発明の核酸配列は、組換え微生物が増幅能
力を維持し、挿入核酸配列によりコードされるポリペプ
チドを発現し、感染宿主トリに免疫応答を誘発するよう
に、組換えＤＮＡ技術により微生物（例えば細菌又はウ
イルス）に導入される。

【００５７】本発明の好適態様は、組換えベクターウイ
ルスに感染した宿主細胞又は宿主トリにおいてＤＮＡ配
列を発現することが可能な、上記異種核酸配列を含む組
換えベクターウイルスである。「異種」なる用語は、本
発明の核酸配列が一般に天然ではベクターウイルス中に
存在しないことを意味する。

【００５８】更に本発明は、核酸配列の発現によりＥｉ
ｍｅｒｉａタンパク質を産生することが可能な、組換え
ベクターウイルスに感染した宿主細胞又は宿主培養物も
包含する。

【００５９】例えば周知のｉｎｖｉｖｏ相同組換え技
術を使用して本発明の異種核酸配列をベクターウイルス
のゲノムに挿入することができる。

【００６０】第１段階としてベクターゲノムの挿入領域
に対応するＤＮＡフラグメント、即ち感染又は複製に必
要な機能等のベクターの必須機能を損なわずに異種配列
を組み込むために使用可能な領域を標準組換えＤＮＡ技
術に従ってクローニングベクターに挿入する。挿入領域
は多数の微生物について報告されている（例えばヨーロ
ッパ特許第８０，８０６号、１１０，３８５号、８３，
２８６号、３１４，５６９号、ＷＯ８８／０２０２２
号、ＷＯ８８／０７０８８号、米国特許第４，７６９，
３３０号及び４，７２２，８４８号）。

【００６１】第２段階として、必要に応じて第１段階か
ら得られた組換えベクター分子中に存在する挿入領域に
欠失を導入する。これは例えば、第１段階からの組換え
ベクター分子の適当なエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化又
は制限酵素処理により達せられる。

【００６２】第３段階として、第１段階の組換えベクタ
ー中に存在する挿入領域又は前記組換えベクターから欠
失したＤＮＡの代わりに異種核酸配列を挿入する。挿入
領域ＤＮＡ配列はベクターゲノムとの相同組換えが生起
可能なように十分な長さを有するべきである。その後、
適切な細胞を野生型ベクターウイルスで感染させるか、
又は適当なベクターＤＮＡ配列がフランキングした挿入
体を含む組換えベクターの存在下でベクターゲノムＤＮ
Ａで形質転換させ、組換えベクターとベクターゲノムの
対応領域間で組換えを行う。こうして細胞培養物中に組
換えベクター子孫を生産することができ、例えばハイブ
リダイゼーション、異種核酸配列と同時に組み込まれた
遺伝子によりコードされる酵素活性の検出、又は組換え
ベクターにより免疫的に発現される抗原異種ポリペプチ
ドの検出を介して、例えば遺伝子型又は表現型により前
記子孫を選択することができる。

【００６３】次に、この組換え微生物を家禽に投与して
免疫感作後、該微生物は所定時間維持されるか、又は接
種動物の体内で複製し、本発明の挿入核酸配列によりコ
ードされるポリペプチドをｉｎｖｉｖｏで発現し、接
種動物の免疫系を刺激する。本発明の核酸配列の組み込
みに適切なベクターは、ウイルス［例えばワクシニアウ
イルス（ヨーロッパ特許第１１０，３８５号、８３，２
８６号、米国特許第４，７６９，３３０号及び４，７２
２，８４８号）又は鳥類ポックスウイルス（ＷＯ８８／
０２０２２）のようなポックスウイルス；例えばＨＶＴ
（ＷＯ８８／０７０８８）又はマレック病ウイルスのよ
うなヘルペスウイルス；アデノウイルス、インフルエン
ザウイルス等］；又は細菌（例えば大腸菌又は特定のサ
ルモネラ種）に由来し得る。この型の組換え微生物を使
用すると、宿主動物で合成されたポリペプチドを表面抗
原として暴露することができる。この関連では、ポリペ
プチドとＯＭＰタンパク質もしくは例えば大腸菌の繊毛
タンパク質との融合、又は生物により認識されるシグナ
ル及びアンカー配列の合成などが予想できる。更に、免
疫感作すべき動物の体内にＥｉｍｅｒｉａポリペプチド
を必要に応じてより大きい全体の一部としての放出する
ことも可能である。これらの場合のいずれにおいても、
種々の病原体及び／又は所与の病原体の種々の抗原に対
する感染防御を生じるように、１種以上の免疫原産物を
発現させることも可能である。

【００６４】本発明のベクターワクチンは、組換え細菌
又は本発明の核酸配列を含む組換えベクターに感染した
宿主細胞を培養した後、組換え細菌又はベクターを含む
細胞及び／又は該細胞中で成長した組換えベクターウイ
ルスを任意に純粋形態で採取し、任意に凍結乾燥形態の
ワクチンに形成することにより製造することができる。

【００６５】本発明の組換えベクターで形質転換した宿
主細胞も同様に、前記核酸配列によりコードされるポリ
ペプチドの発現に好ましい条件下で培養することができ
る。ワクチンは粗培養物、宿主細胞溶解物又は宿主細胞
抽出物のサンプルを使用して製造することができるが、
別の態様によると、所期用途に応じて本発明のより高度
に精製したポリペプチドをワクチンに形成する。産生さ
れたポリペプチドを精製するためには、本発明の組換え
ベクターで形質転換した宿主細胞を十分な容量中で培養
し、産生されたポリペプチドをこのような細胞から単離
し、又はタンパク質が分泌される場合には培地から単離
する。培地中に分泌されたポリペプチドは常法（例えば
塩分画、遠心分離、超遠心分離、クロマトグラィー、ゲ
ル濾過又は免疫アフィニティクロマトグラィー）により
単離精製することができ、細胞内ポリペプチドはまず最
初に前記細胞を収集することにより単離し、例えば音波
処理又は他の機械的破壊手段（例えばフレンチプレス）
により細胞を破壊した後、ポリペプチドを他の細胞内成
分から分離し、ポリペプチドをワクチンに形成する。細
胞破壊は化学的手段（例えばＥＤＴＡ又は、例えばＴｒ
ｉｔｏｎＸ１１４のような界面活性剤）や、酵素手段
（例えばリゾチーム消化）により実施してもよい。

【００６６】本発明のポリペプチドに対する抗体又は抗
血清は受動的免疫療法、診断イムノアッセイ及び抗イデ
ィオタイプ抗体の生成にも使用できると予想される。

【００６７】上記特徴を有するＥｉｍｅｒｉａタンパク
質を使用して、ポリクローナル、単一特異的及びモノク
ローナルのいずれの抗体をも製造することができる。ポ
リクローナル抗体が所望される場合には、ポリクローナ
ル血清の製造及び処理方法は当業者に公知である（例え
ばＭａｙｅｒ及びＷａｌｔｅｒ編，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌａｎｄ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。免疫原に対
する単一特異的抗体は、Ｈａｌｌら（Ｎａｔｕｒｅ，３
１１，３７９−３８７，１９８４）の方法の変法により
多重特異的抗血清からアフィニティ精製することができ
る。本明細書中で使用する単一特異的抗体なる用語は、
関連抗原の同種結合特徴を有する単一抗体種又は複数抗
体種として定義される。本明細書中で使用する同種結合
なる用語は、抗体種が特異抗原又はエピトープに結合で
きることを意味する。

【００６８】本発明のＥｉｍｅｒｉａタンパク質に対し
て反応性のモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法
（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，
２５６，４９５−４９７，１９７５）により近交系マウ
スを免疫感作することにより製造することができる。ダ
ルベッコの変性イーグル培地のような適当な細胞培地で
ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリン中で成長
させることによりハイブリドーマ細胞を選択する。好ま
しくはＭａｃＰｈｅｒｓｏｎの軟質寒天法（Ｓｏｆｔ
ＡｇａｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＴｉｓｓｕｅＣｕ
ｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ編，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ，２７６，１９７３）を使用し
て抗体生産ハイブリドーマをクローニングする。別々の
コロニーを培養プレートの個々のウェルに移し、適当な
培地で培養する。適当な免疫原でスクリーニングするこ
とにより抗体生産細胞を同定する。免疫原陽性ハイブリ
ドーマ細胞を当業者に公知の方法により維持する。ハイ
ブリドーマをｉｎｖｉｔｒｏ培養することにより、又
は当業者に公知の手順を用いてハイブリドーマ注入後に
マウスで腹水を調製することにより特異的抗モノクロー
ナル抗体を製造する。

【００６９】抗イディオタイプ抗体は、感染防御を必要
とし且つワクチンで免疫原として使用可能な病原体の抗
原の「内部像」を有する免疫グロブリンである（Ｄｒｅ
ｅｓｍａｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ，１
５１，７６１，１９８５）。抗イディオタイプ抗体を誘
導する方法は当業者に公知である（ＭａｃＮａｍａｒａ
ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６，１３２５，１９８４）。

【００７０】本発明のワクチンは従来の能動免疫感作法
で投与することができ、予防的に有効な量、即ちビルレ
ントＥｉｍｅｒｉａ寄生虫によるチャレンジに対する免
疫を家禽に誘導する量の免疫感作抗原又は該抗原を発現
することが可能な組換え微生物を、剤形にあわせて１回
又は繰り返し投与する。免疫とは、非ワクチン接種群に
比較してワクチン接種後のニワトリ集団に顕著な感染防
御レベルを誘導することとして定義される。

【００７１】感染防御の増加に次いで、本発明のポリペ
プチドを含むワクチンは、感染動物により放出されるオ
ーシストの数も減少させる。一般に、放出されるオーシ
ストは集団内の他の動物に感染する。放出されるオーシ
ストの数が減少すると、その後に感染する動物の数も減
少し、更に感染負荷量も低下する。

【００７２】更に、ワクチンは寄生虫自体に作用しない
としても、発病率を低下させることができる。特に、疾
患の症状が寄生虫により放出される産物に起因する場合
には顕著である。このような産物に対するワクチンは寄
生虫を攻撃することなく症状を緩和する。

【００７３】生ウイルスベクターワクチンの場合、ニワ
トリ１匹当たりの用量は１０５〜１０８ｐｆｕの範囲で
あり得る。本発明の典型的なサブユニットワクチンは本
発明のタンパク質１μｇ〜１ｍｇを含有する。このよう
なワクチンは、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、
経口又は鼻腔内の各経路で投与することができる。

【００７４】更に、ワクチンは水性媒体又は水含有懸濁
液をも含有し、多くの場合は活性及び／又は貯蔵寿命を
増加させるために他の成分と混合する。これらの成分は
塩類、ｐＨ緩衝液、安定剤（例えば脱脂乳又はカゼイン
水解物）、乳化剤、免疫応答増進用アジュバント（例え
ば油類、ムラミルジペプチド、水酸化アルミニウム、サ
ポニン、ポリアニオン及び両親媒性物質）及び保存剤で
あり得る。

【００７５】本発明のポリペプチドを含有するワクチン
は更に、Ｅ．ｍａｘｉｍａの他の免疫原性タンパク質又
は他のＥｉｍｅｒｉａ種の免疫原性タンパク質を含有し
得る。このような組換えワクチンは家禽集団における寄
生虫負荷量を減少させ、コクシジウム症に対する感染防
御レベルを増加する。

【００７６】自明のことながら、本発明のワクチンは更
に、家禽の他の病原体に関連する免疫原を含んでもよい
し、あるいはこれらの免疫原［例えばマレック病ウイル
ス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、
感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血因子
（ＣＡＡ）、レオウイルス、鳥類レトロウイルス、鳥類
アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス又は
多価ワクチンを製造するための大腸菌の抗原等］をコー
ドする核酸配列を含んでもよい。

【００７７】本発明は更に、本発明のタンパク質を含む
「免疫化学試薬」に関する。「免疫化学試薬」なる用語
は、本発明のタンパク質が適切な支持体に結合している
か又は標識物質を有することを意味する。

【００７８】使用可能な支持体は例えば微量試験ウェ
ル、キュベット、管、毛管、膜、フィルター、試験スト
リップ等の内壁や、粒子（例えばラテックス粒子、赤血
球、染料ゾル、金属ゾル又は、ゾル粒子としての金属化
合物）の表面である。

【００７９】使用可能な標識物質は特に、放射性同位
体、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾル又は、ゾル
粒子としての金属化合物である。

【００８０】本発明の核酸配列は更に、任意組織種にお
けるＥｉｍｅｒｉａ関連核酸の検出のための特定のハイ
ブリダイゼーション実験用プローブを設計するためにも
使用することができる。

【００８１】本発明は更に、Ｅｉｍｅｒｉａ感染の診断
に有用な前記核酸配列を含むテストキットも包含する。

【００８２】本発明は更に、イムノアッセイで使用する
ためのテストキットにも係り、該テストキットは本発明
の少なくとも１種の免疫化学試薬を含む。このテストキ
ットを使用して行われる免疫化学反応は好ましくはサン
ドイッチ反応、凝集反応、競合反応又は阻害反応であ
る。

【００８３】サンドイッチ反応を実施するためには、テ
ストキットは例えば固体支持体（例えば微量試験ウェル
の内壁）に結合した本発明のポリペプチドと、本発明の
標識ポリペプチド又は標識抗抗体から構成され得る。

【００８４】以下、実施例により本発明を説明する。

【００８５】実施例１Ｅ．ｍａｘｉｍａスポロゾイトの抗原の調製１．ａ．ｉ．寄生虫の調製Ｌｏｎｇら（ＦｏｌｉｏＶｅｔ．Ｌａｔ．，１９７
６，６：２０１−２０７）に記載のごとく、Ｅｉｍｅｒ
ｉａｍａｘｉｍａＨｏｕｇｈｔｏｎ株（Ｅ．ｍａｘ
ｉｍａＨ）寄生虫をＬｉｇｈｔＳｕｓｓｅｘニワト
リにおいて継代した。糞便からオーシストを単離し、２
％二クロム酸カリウム中２９℃で７２時間胞子形成さ
せ、１０％次亜塩素酸ナトリウムで洗浄することにより
表面殺菌し、飽和塩化ナトリウム中に浮上させることに
より精製した。胞子形成したオーシストをリン酸緩衝塩
類溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．６中に浮遊させ、振盪破壊し
た。０．５％ｗ／ｖブタ胆汁（Ｄｉｆｃｏ）及び０．２
５％ｗ／ｖトリプシン（Ｄｉｆｃｏ１：２５０）を含
むＰＢＳｐＨ７．６中にスポロシストを浮遊させ、４
１℃で３０分間インキュベートした。放出されたスポロ
ゾイトをＰＢＳｐＨ８．０中で洗浄し、Ｓｃｈｍａｔ
ｚら（Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．，１９８４，３１：１
８１−１８３）によって記載されているようにＤＥ−５
２（Ｗｈａｔｍａｎ）カラム上で精製し、ペレットとし
てエッペンドルフ試験管中に−７０℃で保管した。

【００８６】１．ａ．ii．抗原の調製スポロゾイトペレット（５×１０⁷）を、１００ｍｌの
試料緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ６．８，２
％ＳＤＳ，１０％グリセロール，１００ｍＭＤＴＴ
及び１０ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）中で１０
分間沸騰することにより可溶化し、次いで不連続ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル上に添加した。ゲルを電気泳
動し、Ｔｏｗｂｉｎ及びＧｏｒｄｏｎの方法（Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８４，７２：３１３
−３４０）によりポリペプチドをニトロセルロース（Ｎ
Ｃ）ペーパーに移した。移した後、０．３％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０を含むＰＢＳｐＨ７．６中でＮＣペーパーを
濯ぎ、製造業者指示に従ってコロイド金（Ａｕｒｏｄｙ
ｅ，Ｃａｍｂｉｏ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で染色することに
よりポリペプチドを可視化した。

【００８７】ＮＣペーパーを、各々が限定範囲の分子量
のＥｉｍｅｒｉａポリペプチドを担うストリップに切断
した。各ストリップを小片に細断し、それらを、ラベル
を付けたガラスバイアルに移した。可溶化及び無菌化を
保証すべく、各バイアルに４００ｍｌのＤＭＳＯを添加
し、混合物を６０分間放置した。激しく撹拌しながら同
量の炭酸／重炭酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．６）を滴
下して加えることにより、ＮＣ粒子を沈殿させた。試料
を１．５ｍｌマイクロ遠心管に移し、１０，０００ｇで
５分間遠心した。ＮＣ粒子をＲＰＭＩ１６４０培地
（ＧｉｂｃｏＢｉｏｃｕｌｔ、Ｐａｉｓｌｅｙ，スコ
ットランド）中で３回洗浄し、最終的に１ｍｌの同培地
中に懸濁させ、２００ｍｌのアリコートに分割し、−７
０℃で凍結保存した。

【００８８】実施例２リンパ球刺激抗原の同定２．ａ．方法２．ａ．ｉ．被検動物の免疫一次感染のため、数グループのＲｅａｓｅｈｅａｔｈ−
Ｃニワトリ（４週齢，１０羽で１グループ）にＥ．ｍａ
ｘｉｍａＨの胞子形成オーシスト４０００個を経口投
与した。二次感染のためには、同じトリにＥ．ｍａｘｉ
ｍａＨの胞子形成オーシスト５０，０００個を経口投
与した。各実験で、同じ週齢の対照グループのＲｅａｓ
ｅｈｅａｔｈ−Ｃニワトリを別個に収容した。

【００８９】２．ａ．ii．末梢血リンパ球の調製表在する翼の静脈から、ヘパリン（１０単位／ｍｌ）を
含むプラスチックシリンジ中に血液試料（５ｍｌ）を採
取した。血液を試験管（Ｆａｌｃｏｎ２０２７，Ｂｅ
ｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移し、Ｓｏｒｖａｌ
ｌＲＣ３Ｂ遠心機において４００ｒｐｍで１５分間遠
心した。沈殿した赤血球の上方の細胞層をピペットで慎
重に取り出して新たな試験管（Ｆａｌｃｏｎ２０５
９，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に入れ、２０
００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈積した細胞を、１０
％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，ウイルス及びマイコプラズマ
は除去済みのもの，ＧｉｂｃｏＢｉｏｃｕｌｔ）、２
００単位／ｍｌのペニシリン及び２００ｍｇ／ｍｌのス
トレプトマイシン（Ｇ．Ｒ．Ｓｑｕｉｂｂ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｍｏｒｅｔｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を含むＲＰＭＩ
１６４０中で３回洗浄し、同じ培地中に４×１０⁶細
胞／ｍｌで再浮遊させた。１００ｍｌの細胞アリコート
（４×１０⁵）を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−Ｇｉ
ｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）の丸底ウ
ェル中にピペット添加した。各ウェルに１００ｍｌの調
製試料を添加した。試験試料は、調製済のＮＣ粒子懸濁
液（実施例１．ａ．ｉ．参照）を、１０％ＦＣＳ、２０
０単位／ｍｌペニシリン、２００ｍｇ／ｍｌストレプト
マイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地で希釈したもの
からなった。希釈物を調製するため、懸濁物を−７０℃
から融解し、培地で１０倍に希釈し、更に連続２倍希釈
系列を作製した。対照試料は、タンパク質を含まないＮ
Ｃ粒子懸濁液を同様に希釈したものからなった。また、
別の一連の対照試料は、スポロゾイトを凍結−融解及び
超音波処理することにより調製した全スポロゾイトの溶
解物（０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質）を含んでいた。
複製体を含む各細胞調製物に対して各試料を３つずつ調
製し、これらをプレートにランダムに置いた。プレート
を５％ＣＯ₂下に４１℃で９６時間インキュベートした
が、最後の１６時間は、４８Ｃｉ／ｍＭｏｌで１ｍＣｉ
３Ｈ−チミジン（ＡｍｅｒｓｈａｍＵ．Ｋ．）と一
緒に震動処理し、ガラスマイクロファイバーフィルター
（ＭＡ７８１、ＤｙｎａｔｒｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓＬｔｄ．）上に回収した（Ｄｙｎａｔｒｏｎ
ＭａｃｒｏｍａｓｈＨａｒｖｅｓｔｅｒ，Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬｔｄ．，Ｓｕｓ
ｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。５０℃で１時間乾燥した
後、円板フィルターをシンチレーションバイアルに入
れ、３．５ｍｌの液体シンチレーション用混合物（Ｓｃ
ｉｎｔｉｌｌａｔｏｒ２９９ＴｍＰａｃｋａｒｄ，
Ｃａｖｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）を添加し、シンチレー
ション分光光度計（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓＩｎｃ．ＬＳ９０００）において放射能取込みを
測定した。

【００９０】２．ｂ．結果結果は、各被検トリ由来の細胞を含む試料ごとに以下の
ように計算した刺激指数（ＳＩ）で表わす：ＳＩ＝ｃｐｍ１／ｃｐｍ２〔ここで、ｃｐｍ１は、タンパク質を担うＮＣ粒子と一
緒にインキュベートした３つの培養物の１分当たりの平
均カウントであり、ｃｐｍ２は、タンパク質を持たない
ＮＣ粒子と一緒にインキュベートした３つの培養物の１
分当たりの平均カウントである〕。

【００９１】相対分子量が約７３，０００／７１，００
０／６９，０００Ｄ（総じて７０，０００Ｄと称する）
のポリペプチドを含む可溶化ＮＣストリップは、感染ト
リ由来のリンパ球の増殖を刺激することが判った（表１
参照）。対照トリ由来のリンパ球は増殖が刺激されなか
った。ＳＩは４〜９の範囲で変化したが、経時調査で
は、二次感染の４日後の被検トリから調製したリンパ球
が最も増殖したことが判った。

【００９２】実施例３リンパ球刺激抗原に対する抗体の産生及びスクリーニン
グ３．ａ．方法３．ａ．ｉ．動物の免疫病原体を保有しないウサギ（Ｈａｒｌａｎ−Ｏｌａｃ，
Ｂｉｃｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ）をコクシジウム不
在下に維持した。実施例１に記載のごとく、Ｅ．ｍａｘ
ｉｍａＨスポロゾイトペレットのポリペプチドを可溶
化し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て分離し、ＮＣに移した。分子量７０，０００Ｄを有す
るポリペプチドを担うＮＣストリップを切り取り、実施
例１に記載のごとくＤＭＳＯ中で可溶化し、ＰＢＳｐ
Ｈ７．０中で洗浄し、最終的に１ｍｌのＰＢＳｐＨ
７．０中に懸濁させた。懸濁液を４カ所に皮下注射した
（１カ所０．２５ｍｌ）。注射は、その都度ウサギ１個
体に付き１つのＮＣストリップを使用して２週間ごとに
実施した。各注射の２週間後にウサギから採血した。

【００９３】３．ａ．ii．１または２次元ブロッティン
グによる抗血清のスクリーニング実施例１に記載のごとく、Ｅ．ｍａｘｉｍａＨスポロ
ゾイトペレットのポリペプチドを可溶化し、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。或い
は、スポロゾイト（７×１０⁷）を５００ｍｌの溶解用
緩衝液（０．２％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０，２０ｍＭ
ＣＨＡＰＳ，９Ｍ尿素，０．２％Ｂｉｏｌｙｔｅｓ
３−１０（Ｂｉｏｒａｄ），１ｍＭＤＴＴ）中に浮
遊させ、超音波処理し（１０ミクロンで１０秒間ずつ３
回処理し破裂させる，ＭＳＥｓｏｎｉｐｒｅｐ５
０）、凍結−融解を３サイクル実施した。試料を遠心機
中で１２，０００ｇで１分間遠心し、次いで、実質的に
Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９
７５，２５０：４００７−４０２１）に記載されている
ような２次元ゲル電気泳動によってポリペプチドを分離
した。

【００９４】分離したポリペプチドを実施例１に記載の
ごとくＮＣペーパーに移した。ＮＣペーパーを、３％ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴＴＮ緩衝液（１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４，５００ｍＭＮａ
Ｃｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に浸漬し、静
かに揺動しながら室温で２時間インキュベートした。ペ
ーパーを水で濯ぎ、ストリップに切断し、各ストリップ
を、１％ＢＳＡを含むＴＴＮで１：２５０に希釈したウ
サギ血清試料中で３時間インキュベートした。ストリッ
プを０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＴＮ中で３回
洗浄してから、アルカリ性ホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ中で１時間インキ
ュベートし、１％ＢＳＡを含むＴＴＮで１：７５００に
希釈した。ストリップを０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を
含むＴＴＮ中で更に３回、ＡＰ緩衝液（１００ｍＭＴ
ｒｉｓｐＨ９．５，１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂）中で１回洗浄した。ストリップを５０ｍｇ
／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム及び５０ｍｇ／ｍｌ
ブロモクロロインドリルホスフェートを含むＡＰ緩衝液
中でインキュベートすることにより、ホスファターゼ結
合体の結合を検出した。

【００９５】３．ｂ．結果Ｅ．ｍａｘｉｍａのポリペプチドの１次元ウェスターン
ブロット上にプローブしたウサギ抗ｐ７０血清の特異性
を図１に示す。２次元ウェスターンブロット上のスポッ
トの認識は表２にまとめて示す。

【００９６】実施例４Ｅ．ｍａｘｉｍａスポロゾイトｃＤＮＡライブラリーの
構築４．ａ．方法４．ａ．ｉ．ｍＲＮＡの単離Ｅ．ｍａｘｉｍａスポロゾイト（５×１０⁸）を実施例
１に記載のごとく精製した。製造業者指示に従ってＲＮ
Ａ抽出キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用し、全細胞
ＲＮＡを調製した。簡単に述べると、緩衝したグアニジ
ウムチオシアネート、Ｎ−ラウリルサルコシン及びＥＤ
ＴＡ中でインキュベートすることによりスポロゾイトを
溶解し、緩衝トリフルオロ酢酸セシウムで超遠心するこ
とによりＲＮＡを他の細胞成分から分離した。ＲＮＡペ
レットをＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ
７．５，１ｍＭＥＤＴＡ）中に慎重に溶解し、エタノ
ール沈殿物として−７０℃で保管した。この全ＲＮＡ調
製物から、製造業者指示に従ってオリゴ（ｄＴ）セルロ
ースカラム（ｐｏｌｙ（Ａ）Ｑｕｉｋ，Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）を使用してメッセンジャーＲＮＡを精製し
た。

【００９７】４．ａ．ii．ｃＤＮＡの合成及びクローニ
ング製造業者指示に従ってＺＡＰ−ｃＤＮＡＴＭ合成キット
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、メッセンジャーＲ
ＮＡからｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ集団の大きさ
は、合成されたｃＤＮＡの一部のアガロースゲル電気泳
動及びオートラジオグラフィーによって判断したとこ
ろ、２００ｂｐ以下から約６ｋｂｐであった。Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを４種全てのｄＮＴＰの存在下に使用
し、残りのｃＤＮＡの末端を３７℃で３０分間修復し
た。ＥｃｏＲＩアダプターをｃＤＮＡのブラント末端に
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して８℃で２４時間かけて
連結した。ＸｈｏＩで消化し、全ての３’末端にＸｈｏ
Ｉ制限部位を、全ての５’末端にＥｃｏＲＩ制限部位を
有するｃＤＮＡを生産した。試料を１ｍｌのＳｅｐｈａ
ｃｒｙｌＳ−４００カラムを通した後、遠心すること
により、オリゴヌクレオチド（過剰なアダプター及び制
限酵素消化されたプライマー−鋳型）を除去した。

【００９８】１００ｎｇずつのｃＤＮＡを１ｍｇのＵｎ
ｉ−ＺＡＰＸＲベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｅ
ｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、脱リン酸化したもの）
に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して１２℃で一晩かけて
連結した。連結したＤＮＡを、製造業者指示に従ってＧ
ｉｇａｐａｃｋＩＩＧｏｌｄパッケージング抽出物
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してファージヘッド中
にパッケージングした。得られた一次ライブラリーを
Ｅ．ｃｏｌｉＳＵＲＥ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
において平板培養して増幅し、得られた増幅ライブラリ
ー（Ｅｍｘ８及びＥｍｘ９）の力価をＥ．ｃｏｌｉＸ
Ｌ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において
測定した。全ては製造業者指示に従った。簡単に述べる
と、全ての平板培養において、宿主細胞を０．２％（ｗ
／ｖ）マルトース及び１０ｍＭＭｇＳＯ₄を補充した
Ｌブロス中で３０℃で振盪しながら一晩増殖させた。細
胞は、使用前に１０ｍＭＭｇＳＯ₄を用いてＯＤ６０
０＝０．５に希釈した。各ライブラリーの組換え体の
数は、０．４％（ｗ／ｖ）５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘｇａｌ）及び
２．５ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド
（ＩＰＴＧ）（ＮｏｒｔｈｕｍｂｒｉａＢｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｓＬｔｄ．）の存在下にファージを平板培養
することにより測定した。

【００９９】４．ｂ．結果Ｅｍｘ８は３×１０⁸ｐｆｕ／ｍｌ（６５％組換え体）
を含み、Ｅｍｘ９は６×１０⁸ｐｆｕ／ｍｌ（５５％組
換え体）を含んでいた。

【０１００】実施例５Ｅ．ｍａｘｉｍａｐ７０抗原をコードするｃＤＮＡク
ローンの同定５．ａ．方法ｃＤＮＡライブラリーのイムノスクリーニングをＳｔｒ
ａｔａｇｅｎｅによって与えられている標準指示に従っ
て行なった。１％ＢＳＡを含むＴＴＮで１：１００に希
釈したウサギ抗ｐ７０血清中にペーパーを浸漬した。こ
の後の全ての作業工程は実施例３ａにおいてウェスター
ンブロットの展開に記載したものと同一とした。陽性プ
ラークを同定し、バクテリオファージ粒子を溶出すべく
＋４℃で一晩保管した後、プラークを再スクリーニング
した。再スクリーニングは、全ての陽性プラークが純粋
な抗体反応性集団を含むまで継続した。

【０１０１】５．ｂ．結果ライブラリーＥｍｘ８及びＥｍｘ９から、ウサギ抗ｐ７
０血清に反応した２０の独立のプラーク（ｐＥｍ７０／
１〜ｐＥｍ７０／２０）を単離し、プラーク精製した。

【０１０２】実施例６Ｅ．ｍａｘｉｍａｐ７０抗原をコードするｃＤＮＡク
ローンの分析６．ａ．方法６．ａ．ｉ．クローン特異的抗体の選択０．２ｍｌのＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞アリコートを、プラ
ーク精製ファージ集団由来の１〜３×１０³ｐｆｕに感
染させた。これらを９０ｍｍの皿に塗り広げ、実施例
５．ａ．に記載の方法に従って処理したが、但し３％Ｂ
ＳＡを含むＴＴＮ中でＮＣペーパーを一晩インキュベー
トすることを含んだ。次いでペーパーをＴＴＮ中で濯
ぎ、１％ＢＳＡを含むＴＴＮで１：１００に希釈したウ
サギ抗ｐ７０血清５ｍｌ中にそれぞれ浸漬し、静かに揺
動しながら室温で６時間インキュベートした。ペーパー
を３％ＢＳＡを含むＴＴＮ中で３回洗浄し、次いで、各
ペーパーを５ｍｌの０．２ＭグリシンｐＨ２．８中に浸
漬し、１０分間揺動することにより結合抗体を溶出し
た。クローン−特異的抗体を含む溶出液を、０．３Ｍ
Ｔｒｉｓ，１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加することによ
り中性ｐＨにした。クローン特異的抗体を未希釈のまま
で使用し、１または２次元ゲル電気泳動によって分離し
たＥ．ｍａｘｉｍａスポロゾイトタンパク質のウェスタ
ーンブロットをプローブした。ウェスターンブロットの
調製及びイムノスクリーニング方法は全て実施例３．
ａ．ii．に記載のものと同じとした。

【０１０３】６．ａ．ii．ｃＤＮＡ挿入物の分析Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１９８７，１５：６７３７）の方法を使用
して組換えファージのストックからＤＮＡを調製し、制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化することによりｃ
ＤＮＡ挿入物を解離した。各ｃＤＮＡを、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し且つウシ腸ホスファターゼ
で脱リン酸化しておいたｐＵＣ１９（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）に連結した。連結したＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ株ＴＧ
１中に形質転換によって導入した。Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ
（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９１，
１９：２７９２）の方法を使用してプラスミドを単離
し、制限エンドヌクレアーゼで消化することにより分析
した。

【０１０４】プラスミドｐＵＣ１９中にサブクローニン
グする代わりに、製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の
指示に従って組換えλＺＡＰＩＩからｉｎｖｉｖｏ切
断することにより、ｃＤＮＡクローンをプラスミドｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に救済した。ｃＤＮＡを含むｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドをアルカリ性溶解（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍａｎｄＤｏｌｙ，１９７９，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓｒｅｓ．，７：１５１３）によって
単離し、制限エンドヌクレアーゼで消化することにより
ｃＤＮＡを分析した。

【０１０５】６．ａ．iii．ＤＮＡ配列決定ＣｓＣｌ／エチジウムブロミド濃度勾配において平衡遠
心することによりｐＥｍ７０／１を精製し、Ｂａｎｋｉ
ｅｒ及びＢａｒｒｅｌｌ（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎ
ｔｈｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）８５：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＮ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１−３４，１９８３）によって記載されているように
Ｍ１３ファージ中にランダムにサブクローニングするこ
とによりｃＤＮＡ挿入物の配列を決定した。他のクロー
ンに対しては、ｃＤＮＡ挿入物の５’及び３’末端の配
列を二本鎖プラスミドＤＮＡから直接決定した。

【０１０６】６．ｂ．結果６．ｂ．ｉ．クローン特異的抗体の反応性ライブラリーＥｍｘ８及びＥｍｘ９（実施例５参照）か
ら単離した２０個のプラーク精製λ集団を使用し、クロ
ーン特異的抗体を生産した。これらのうち１４の抗体
は、Ｅ．ｍａｘｉｍａスポロゾイトタンパク質の１次元
ブロットにおける約７０ｋＤａのポリペプチドと特異的
に交差反応した。クローン選択した抗体を使用し、Ｅ．
ｍａｘｉｍａスポロゾイトタンパク質の２次元ブロット
をプローブした。任意に番号付けすることによりポリペ
プチドスポットを識別すると、５つのクローン選択抗体
が、無傷の抗ｐ７０血清によって認識されるスポットの
サブセットであるスポット群と反応した。この情報を表
２にまとめて示す。

【０１０７】６．ｂ．ii．制限マップ作成７０ｋＤａのポリペプチドに特異的な抗体を選択した１
４のクローンの分析制限酵素消化は、６種類の大きさの
ｃＤＮＡ挿入物が存在することを示した。これらのうち
２つをｐＥｍ７０／１及びｐＥｍ７０／４と称した。２
つのｃＤＮＡ挿入物の制限酵素マップを図２に示す。

【０１０８】６．ｂ．iii．ＤＮＡ配列分析見い出されたヌクレオチド配列はｐＥｍ７０／１のもの
であり、その推定アミノ酸配列は配列番号１の核酸１２
６から示されたものである。クローンｐＥｍ７０／１に
認められる配列は、５’ＥｃｏＲＩアダプター及び３’
ポリＡ配列とこれらに続いてＸｈｏＩ部位を含む１２９
４ｂｐｃＤＮＡである。ｃＤＮＡは、最初のヌクレオ
チドトリプレットから、ポリ（Ａ）配列に先立つ１２５
８ｂｐにあるオーカー終結コドン（ＴＡＡ）まで“オー
プン”であると見られる。推定アミノ酸配列は４１９ア
ミノ酸即ち約４６ｋＤａのタンパク質をコードする。ｃ
ＤＮＡは６７ｂｐ及び１０００ｂｐに内部ＥｃｏＲＩ部
位を有すると共に、固有のＳｃａＩ（６９９ｂｐ）、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ（７３６ｂｐ）、ＳｓｐＩ（９９５ｂ
ｐ）、ＨｉｎｃＩＩ（１２００ｂｐ）及びＰｓｔＩ（１
２５１ｂｐ）制限部位を有する（ｂｐは、クローンｐＥ
ｍ７０／１に認められる配列の開始点、即ち配列番号１
の核酸１２６からの距離で測定した）。配列番号１に示
した配列の最初の１２５のヌクレオチドの分析は実施例
９に記述する。

【０１０９】ｐＥｍ７０／４の５’及び３’末端の配列
は配列番号３及び５に示す。

【０１１０】実施例７ｐＥｍ７０／１によってコードされる組換えタンパク質
の発現７．ａ．方法７．ａ．ｉ．プラスミドｐＲＳＥＴＡＥｍ７０／１の構
築１μｇのプラスミドｐＥｍ７０／１を１０単位のＢａｍ
ＨＩと１０単位のＸｈｏＩを用いて３７℃で２時間消化
し、ｃＤＮＡ挿入物を、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化及び
脱リン酸化したプラスミドｐＲＳＥＴＡ（ＩｎＶｉｔｒ
ｏｇｅｎ）中に連結した。連結したＤＮＡをＥ．ｃｏｌ
ｉ株ＨＭＳ１７４中にトランスフェクトし、組換えプラ
スミドｐＲＳＥＴＡＥｍ７０／１を含むコロニーをピッ
クアップし、プラスミドＤＮＡをアルカリ性溶解（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍａｎｄＤｏｌｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄ．Ｒｅｓ．，７，１５１３，１９７９）によって単離
した。

【０１１１】７．ａ．ii．プラスミドｐＲＳＥＴＡＥｍ
７０／１由来の（Ｈｉｓ）６−Ｅｍ７０／１融合タンパ
ク質の発現プラスミドを保有する細菌を、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬブロス中で一晩増殖させた。一晩培養
物１０ｍｌを予め暖めた（３７℃）のＬブロスで１：１
００に希釈し、通気しながら３７℃で５時間増殖させ
た。ウェスターンブロット分析のために試料を取り出し
た。

【０１１２】７．ａ．iii．金属親和性クロマトグラフ
ィーによる（Ｈｉｓ）６−Ｅｍ７０／１融合タンパク質
の精製５時間培養したｐＲＳＥＴＡＥｍ７０／１を遠心し、細
菌ペレットを、５ｍｌ６Ｍグアニジン−ＨＣｌ，２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．８中に再懸濁させ、最高出
力で３０秒間ずつ４回超音波処理し破裂させた（ＭＳＥ
Ｓｏｎｉｐｒｅｐ）。超音波処理したものを１０，０
００×ｇで遠心して不溶性物質を除去し、上清を、８Ｍ
尿素，２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．８で平衡化し
ておいた１０ｍｌの固定化ニッケル樹脂（“ＰｒｏＢｏ
ｎｄＴＭ”，ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。樹脂
及び溶解物の混合物をガラスカラムに注ぎ込み、樹脂を
３０分間硬化させた。カラム底部の栓を開き、“素通り
液（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）”を回収し、再度樹脂
に添加し、回収した。樹脂を平衡化緩衝液で、２８０ｎ
ｍ（Ａ２８０）における溶出液の吸収が＜０．０５とな
るまで洗浄した。次いで樹脂をｐＨ６．０の平衡化緩衝
液で洗浄して非特異的に結合した細菌タンパク質を除去
し、最終的に組換えタンパク質をｐＨ４．０の平衡化緩
衝液で溶出した。更に組換えタンパク質を、大量のＰＢ
ＳｐＨ７．６で＋４℃で１６時間透析した。染料結合
試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してタンパク質濃度を推
定すると、１リットルの培養物からの収量は約５ｍｇで
あった。

【０１１３】７．ｂ．結果組換えｐＥｍ７０／１を、そのＮ末端に６つのヒスチジ
ン残基を有する融合体としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ
た。ウサギ抗ｐ７０またはニワトリ抗組換えｐＥｍ７０
／１血清と特異的に反応した融合タンパク質は４６〜４
８ｋＤａのダブレットであった（図３，トラック１）。
発現ベクター由来のタンパク質成分は６つのヒスチジン
と、全部で約１ｋＤａのエンテロキナーゼ認識配列（ａ
ｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ｌｙｓ）とであった。５時間の
培養で生産された組換えタンパク質（図３，トラック
１）は超音波処理後の可溶性フラクション中に存在し
（図３，トラック２）、ニッケルアフィニティーカラム
から精製された（図３，トラック４及び５）。図４は、
ｐＲＳＥＴＡＥｍ７０／１によって発現された組換えタ
ンパク質の精製のクーマシー染色ポリアクリルアミドゲ
ルを示す。

【０１１４】実施例８組換えタンパク質（Ｈｉｓ）６−Ｅｍ７０／１によるニ
ワトリの免疫８．ａ．方法８．ａ．ｉ．動物の免疫３６羽のＬｉｇｈｔＳｕｓｓｅｘトリを３週齢になる
までコクシジウム不在下で飼育した。被検トリをランダ
ムに２つのグループに割り当て、それぞれ１つの鳥かご
内に収容した。血液試料を採取し、１８羽のトリは、Ｐ
ＢＳ中の２５μｇの（実施例７に記載のごとく調製し
た）抗原及び１００μｇサポニンを皮下注射（０．１ｍ
ｌ）することにより免疫した。残りの１８羽のトリは、
ＰＢＳ中の２５μｇの（ニッケル樹脂に結合しなかっ
た）細菌抗原及び５μｇサポニンを用いて免疫した。免
疫は２週間の間隔で更に２回繰り返し、各免疫のあと血
液試料を採取した。

【０１１５】８．ａ．ii．動物の抗原投与最終免疫の２週間後、全てのトリにＥ．ｍａｘｉｍａの
胞子形成オーシスト１００個を経口投与によって与え
た。各トリの糞便を、紙を敷いたトレー上に日毎に収集
することで回収し、チャレンジ後５〜１０日に各トリに
よって排泄されたオーシストの総数を、糞便を混合及び
希釈した試料をＭａｃｍａｓｔｅｒカウントチャンバー
においてカウントすることにより算出した。

【０１１６】８．ｂ．結果表３は、抗原によって免疫されたかまたは偽性免疫され
た２グループのトリの個々のオーシストの排出量及びグ
ループ平均を示す。抗原を受容したトリは偽性免疫され
たグループよりオーシスト排出量が低く、これは、実施
例７に記載のごとき抗原を使用してニワトリをＥｉｍｅ
ｒｉａｍａｘｉｍａによる感染から保護し得ることを
示している。

【０１１７】実施例９Ｅｍ７０／１遺伝子の追加５’ヌクレオチド配列９．ａ．方法５’ＲＡＣＥ法（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ，ｃＤＮＡ末端の迅速増
幅法）（Ｆｒｏｈｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５、８９９８，１９８
８；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓＲｅｓ．，１７，２９１９，１９８８；ＣＬ
ＯＮＴＥＣＨＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、
ｃＤＮＡＥｍ７０／１をコードする遺伝子の５’ＤＮ
Ａ末端配列を更に得た。Ｆａｓｔｔｒａｃｋキット（Ｉ
ｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、２００×１０⁶ Ｅ．
ｍａｘｉｍａスポロゾイトからメッセンジャーＲＮＡを
単離した。製造業者指示（ＣＬＯＮＴＥＣＨＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ）に従ってＡＭＶ逆転写酵素
を使用し、２μｇｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
但しここで、遺伝子特異的プライマーに代えてランダム
プライマーを１μｇ使用して第１鎖ｃＤＮＡ合成をプラ
イムした。ＲＮＡをＮａＯＨで加水分解し、ＲＮＡリガ
ーゼを使用してアンカープライマー（配列番号６）をｃ
ＤＮＡの５’末端に連結した。連結したｃＤＮＡを水で
１：１０に希釈し、アンカー特異的プライマー（配列番
号７）及びアンチセンス遺伝子特異的プライマー（配列
番号８）を使用してＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に
よって分析した。アガロースゲル電気泳動により判断し
たところ、ＰＣＲにより約８００ｂｐの単一産物が得ら
れた。このフラグメントをＧｅｎｅＣｌｅａｎキット
（ＳｔｒａｔａｔｅｃｈＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使
用してアガロースゲルから切り取り、１０単位のＥｃｏ
ＲＩを用いて消化し、ＥｃｏＲＩ消化及び脱リン酸化し
たＭ１３ｍｐ１８に連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１中
にトランスフェクトした後、組換えプラークをピックア
ップし、一本鎖ＤＮＡを単離し、ＰＲＩＳＭＴＭＤｙ
ｅＤｅｏｘｙＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ
ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して挿入物のヌクレオチド
配列を決定した。

【０１１８】９．ｂ．結果５’ＲＡＣＥ及びその後にＥｃｏＲＩサブクローニング
を使用し、既に（実施例６）決定した配列に連結したＥ
ｍ７０／１の上流の追加の１２５ヌクレオチドを得た。

【０１１９】実施例１０バキュロウイルスをベクターとして用いるＥ．ｍａｘ
ｉｍａＥｍ７０／１抗原の昆虫細胞中での発現１０．ａ．ｐＡｃＥＭの構築Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等が記載する方法（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ８）を用い
て、ｐＥｍ７０／１のＸｈｏＩ部位を合成リンカーでＢ
ｇｌＩＩに変換した。その後、抗原７０／１をコードす
る遺伝子を含むｐＥｍ７０／１の１．３ｋｂインサート
をＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片として単離し、Ｄｒ．
Ｄ．Ｂｉｓｈｏｐ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉ
ｒｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）から入手し
たバキュロトランスファーベクターｐＡｃＬａｃＺ＋Ｍ
ＣＳのＢａｍＨＩ部位に連結した。

【０１２０】ポリヘドリンプロモーターに関する正確な
取り込みを制限消化物によって検証した。

【０１２１】先に行った配列分析から、ｐＥｍ７０／１
のインサートのコード化領域がＮ末端で不完全であり、
ＡＴＧイニシエーターが欠如していることが判明した。

【０１２２】発現を可能にするため、ｐＥｍ７０／１由
来の１．３ｋｂ断片のｐＡｃＬａｃＺ＋ＭＣＳへの挿入
後に復元された単一ＢａｍＨＩ部位に、ＢａｍＨＩ適合
性突出末端（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅｐｒｏｔｒｕｄｉ
ｎｇｅｎｄｓ）を含む相補的なオリゴＬ１（配列番号
９）及びＬ２（配列番号１０）からなる４２ｂｐ合成Ｄ
ＮＡ断片を連結した。これによってプラスミドｐＡｃＥ
Ｍが得られた。ｐＡｃＥＭ内に４２ｂｐリンカーが正確
に挿入されたことで、抗原７０／１の主要部分をコード
するＥ．ｍａｘｉｍａ遺伝子に融合したポリヘドリン
タンパク質の最初の１１アミノ酸の読取り枠が得られ
た。ヌクレオチドの配列分析により、プラスミドｐＡｃ
ＥＭ内のポリヘドリンプロモーター下流の最終構造を検
証した。

【０１２３】１０．ｂ．昆虫細胞のトランスフェクショ
ン及びバキュロウイルス組換え体の単離標準的な技術（Ｄ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｋ．Ｍｉ
ｌｌｅｒ，ａｎｄＶ．Ｌｕｃｋｏｗ：Ｂａｃｕｌ
ｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ
ｓ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，Ｏ
ｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｐｒｅｓｓ，１
９９４）に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ／
ＢＲＬ）及び野生型バキュロウイルスＤＮＡを用いてｐ
ＡｃＥＭＤＮＡをＳｆ９細胞内にトランスフェクトし
た。Ｘ−ｇａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）の寒天重層を含
む組織培養皿で組換えプラークを同定した。青色プラー
クを採取して、野生型ウイルスが検出できなくなるまで
３度平板培養した。Ｔ７５及びＴ１７５フラスコ、最後
にＳｆ９細胞を含む１００ｍｌのスピナー瓶でウイルス
プラークを増殖させた。免疫蛍光法でウイルス力価を測
定した：Ｓｆ９細胞を含むマイクロタイタープレートを
希釈したウイルスに感染させた。６日間インキュベート
した後にプレートをアルコールで固定し、産生したＥｍ
７０／１スポロゾイトタンパク質に対するニワトリポリ
クローナル抗体を１：５００に希釈したもので染色し
た。１：６００ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ニワトリＩｇＧ（Ｋ
ＰＬ）を用いて次のインキュベーションを実施した。ｖ
ＡｃＥＭウイルスストックの力価は７．２Ｌｏｇ₁₀
ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌであった。

【０１２４】１０．ｃ．昆虫細胞内でのＥ．ｍａｘｉ
ｍａ７０／１タンパク質の産生それぞれが指数増殖す
るＳｆ９細胞を３×１０⁷個含んでいる４つのＴ１７５
フラスコをｖＡｃＥＭウイルスストックに感染させた。
このときのｍ．ｏ．ｉは１０ＴＣＩＤ₅₀／細胞であっ
た。３日後、感染した細胞を氷上で採取した。細胞を１
×１０⁷個／ｍｌの濃度でＰＢＳに再度懸濁させて、超
音波処理した。超音波処理した細胞に０．０７５％ホル
マリンを加えて、４℃で１週間インキュベートして不活
化した。ホルムアルデヒドを等モル量のＮａ₂Ｓ₂０₅で
中和した。

【０１２５】１０．ｄ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタ
ンブロッティングを用いたバキュロ発現産物の分析超音波処理後に再度懸濁させた細胞の試料を、（１８８
ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ６．８、６％ＳＤＳ±０．２Ｍ
β−メルカプト−エタノールからなる）還元（Ｒ）又
は非還元（ＮＲ）試料緩衝液と２：３の割合で混合し、
９５℃で１０分間沸騰させ、１３０００ｒｐｍで１０分
間遠心分離にかけ、ＳＤＳ−ゲル上に充填した。非感染
細胞及びインサートを含まないＳＨＡＭ組換え感染細胞
を対照として使用した。

【０１２６】１２％ＰＡＡゲル（厚さ１．５ｍｍ）上
で試料を分析した。各レーンで８０μｌの試料を充填し
た。ゲルの一部をＣＢＢ（クーマシーブリリアントブル
ーＲ２５０）で染色し、残りはニトロセルロース上で電
気ブロッティングした。

【０１２７】ブロットを、産生したＥ．ｍａｘ７０／
１スポロゾイトタンパク質に対するニワトリ血清（希釈
度１：５００）と共に（又は対照として陰性ニワトリ血
清と共に）インキュベートした。標準的な手順に従っ
て、両方のブロットをアルカリ性ホスファターゼ標識ヤ
ギ抗ニワトリＩｇＧ及びＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質で展開さ
せた。

【０１２８】ウイルスを含むＥｍ７０／１だけが、ニワ
トリ血清によって認識されるバンドを発現した。発現産
物のおおよそのＭｒは４５，０００であり、Ｍｒ３３，
０００で分解産物（ｂｒｅａｋ−ｄｏｗｎｐｒｏｄｕ
ｃｔ）が肉眼視できた。還元又は非還元条件下でのゲル
電気泳動後の発現及び認識に違いは検出されなかった。

【０１２９】実施例１１Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ−Ｅｍ７
０／１によるニワトリの免疫化１１．ａ．方法ＥｃｏＲＩ（２０単位）で消化した後、２μｇの精製プ
ラスミドｐＥｍ７０／１をｐＭＬＢ１１１３（Ｈｉｓ）
６３ベクターのＭＣＳ（多重クローン化部位）内にク
ローン化した（図５参照）。連結ＤＮＡを用いて、大腸
菌ＴＧ１を形質転換した。１００μｇのアンピシリンを
含むＬ寒天プレート上で組換えコロニーを選択し、アル
カリ性溶菌（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＆Ｄｏｌｙ）によっ
てプラスミドを調製した。制限酵素消化及びアガロース
ゲル電気泳動でプラスミドを分析し、右向きの９３２ｂ
ｐＥｃｏＲＩ断片を含む単一組換えプラスミドｐＭＬ
Ｂ（Ｈｉｓ）６３−Ｅｍ７０／１を選択した。

【０１３０】Ｈａｎａｈａｎの非常に有効な手順（Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７，１９８
３）を用いて、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｇａｌｌｉｎａ
ｒｕｍ９Ｒ株（Ｈ．ＷｉｌｌｉａｍｓＳｍｉｔ
ｈ，Ｊ．Ｈｙｇｉｅｎｅ，５４，４１９．１９
５６）をプラスミドｐＭＬＢ１１１３（Ｈｉｓ）６３−
Ｅｍ７０／１で形質転換した。５０ｍｌのＬ−ブロス＋
５０μｇのアンピシリン中にて、通気しながら３７℃で
１つのプラーク精製組換えコロニーを培養し、１０⁸個
／ｍｌの細菌密度まで増殖させた。

【０１３１】細菌を濃縮し、４０００ｇ，４℃で１０分
間遠心分離にかけて洗浄し、Ｌ−ブロスで１０⁹個／ｍ
ｌの免疫濃度まで希釈した。

【０１３２】３週齢のＷｈｉｔｅ −Ｌｅｇｈｏｒｎニ
ワトリ１２羽に、１０⁸個のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ９
Ｒ−Ｅｍ７０／１を０．１ｍｌのＬ−ブロスに加えたも
のを筋肉内注射した。２週間の間隔をあけてこのワクチ
ン接種を２度繰り返した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ９Ｒ
親株を同様に処理し、同一用量を対照ニワトリに与え
た。最後のワクチン接種から２週間後に全てのニワトリ
に抗原投与した。抗原投与及び保護評価は実施例８．
ａ．ｉｉに記載した方法で行った。

【０１３３】１１．ｂ．結果両グループの平均オーシスト排出量の減少を表４に示
す。

【０１３４】Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａベクターワクチンを
受容したトリは平均して、対照に比べオーシスト排出量
が少なかった。このことは、このベクターワクチンを使
用してワクチン接種した動物の寄生虫量を減少させて、
感染に関連する病原作用を低下させることができたこと
を示している。

【０１３５】表１Ｅ．ｍａｘｉｍａスポロゾイトのニトロセルロース付
着抗原に暴露した免疫トリ及び対照トリの刺激指数。各
刺激指数は１０羽のトリの平均値である。

【０１３６】

【表１】

【０１３７】表２Ｅ．ｍａｘｉｍａＨスポロゾイトの２−Ｄゲル分析
−ウサギ抗７０ｋＤａ血清によって認識される又はクロ
ーン特異抗体によって認識されるリンパ刺激性スポット
の同定。

【０１３８】

【表２】

【０１３９】表３Ｅ．ｍａｘｉｍａ抗原投与感染に対するｉｎｖｉｖ
ｏ保護：融合タンパク質ｐＲＳＥＴＡＥｍ７０／１で免
疫したトリ（グループ１）及び偽性免疫したトリ（グル
ープ２）のオーシスト排出量の比較

【０１４０】

【表３】

【０１４１】表４Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ−Ｅｍ７０／１ワクチンを
接種したニワトリの平均Ｅ．ｍａｘｉｍａオーシスト
排出量

【０１４２】

【表４】

【０１４３】

【配列表】

配列番号１：配列の長さ：1400塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：なしアンチセンス：なしフラグメント型：Ｃ末端起源: 生物名：Eimeria maxima 株名：Houghton 分化の程度：スポロゾイト直接の起源: ライブラリー名： Lambda ZAPII内でクローン化したス
ポロゾイトcDNA クローン名:Em70-1 配列の特徴：名／記号：CDS 存在位置：1..1368 配列：

【０１４４】

【表５】

【０１４５】

【表６】

【０１４６】

【表７】

【０１４７】配列番号２：配列の長さ：456アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列：

【０１４８】

【表８】

【０１４９】

【表９】

【０１５０】配列番号３：配列の長さ：242塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡハイポセティカル：なしアンチセンス：なしフラグメント型：Ｃ末端起源：生物名：Eimeria maxima 株名：Houghton 分化の程度：スポロゾイト直接の起源: ライブラリー名： Lambda ZAPII内でクローン化したス
ポロゾイトcDNA クローン名:Em70-4,クローンの5'末端配列の特徴：名／記号：CDS 存在位置：3..242 配列：

【０１５１】

【表１０】

【０１５２】配列番号４：配列の長さ：80アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列：

【０１５３】

【表１１】

【０１５４】配列番号５：配列の長さ：250塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：なしアンチセンス：なし起源: 生物名：Eimeria maxima 株名：Houghton 分化の程度：スポロゾイト直接の起源: ライブラリー名： Lambda ZAPII内でクローン化したス
ポロゾイトcDNA クローン名:Em70-4,クローンの3'末端配列：

【０１５５】

【表１２】

【０１５６】配列番号６：配列の長さ：35塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA ハイポセティカル：なしアンチセンス：なし配列：

【０１５７】

【表１３】

【０１５８】配列番号７：配列の長さ：38塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列：

【０１５９】

【表１４】

【０１６０】配列番号８：配列の長さ：２１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA ハイポセティカル：なしアンチセンス：なし配列：

【０１６１】

【表１５】

【０１６２】配列番号９：配列の長さ：46塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA ハイポセティカル：なしアンチセンス：なし配列：

【０１６３】

【表１６】

【０１６４】配列番号１０：配列の長さ：46塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA 配列：

【０１６５】

【表１７】

【図面の簡単な説明】

【図１】抗７０ｋＤ血清を用いてスクリーニングされた
Ｅ．ｍａｘｉｍａスポロゾイトを示す電気泳動（ウェス
ターンブロット）図である。

【図２】ｃＤＮＡ挿入物Ｅｍ７０／１及びＥｍ７０／４
の制限酵素マップ（５’−３’）を示す。

【図３】ニワトリ抗組換えｐＥｍ７０／１血清によりプ
ローブされた精製ｐＥｍ７０／１タンパク質の電気泳動
（ウェスターンブロット）図を示す。

【図４】ｐＲＳＥＴＡＥｍ７０／１によって発現された
組換えタンパク質ｐＥｍ７０／１の精製のＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動図である。

【図５】ｐＭＬＢ１１１３（Ｈｉｓ）６３の遺伝子マ
ップを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4ＢＧ０１Ｎ 33/569 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ポール・パトリツク・ジエイムズ・ダンイギリス国、オクスフオードシヤー・オー・エツクス・44・７・テイ・エル、セントメリーズ・クローズ・チヤルグローブ・２ (72)発明者フイオナ・マーガレツト・トムリーイギリス国、オクスフオード・オー・エツクス・４・１・エス・ピー、ストラツトフオード・ストリート・73 (72)発明者アーノルダス・ニコラス・フエルムーレンオランダ国、5431・ハー・ハー・キユイク、コールホーエンデルフエルド・34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＥｉｍｅｒｉａＴリンパ球刺激タンパ
ク質又はその免疫学的に活性な部分。
【請求項２】Ｅｉｍｅｒｉａ種がＥｉｍｅｒｉａｍ
ａｘｉｍａである請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】配列番号２に示すアミノ酸配列の少なく
とも一部を含むことを特徴とする請求項１に記載のタン
パク質又は生物学的に機能的なその等価物。
【請求項４】配列番号４に示すアミノ酸配列の少なく
とも一部を含むことを特徴とする請求項１に記載のタン
パク質又は生物学的に機能的なその等価物。
【請求項５】請求項１から４のいずれか一項に記載の
タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項６】核酸配列が配列番号１に示すＤＮＡ配列
の少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項５に記
載の核酸配列。
【請求項７】核酸配列が配列番号３に示すＤＮＡ配列
の少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項５に記
載の核酸配列。
【請求項８】核酸配列を発現させることが可能な発現
制御配列に作動的に結合した請求項５から７のいずれか
一項に記載の前記核酸配列を含む組換え核酸分子。
【請求項９】請求項５から７のいずれか一項に記載の
核酸配列を含む組換えベクター。
【請求項１０】核酸配列が発現制御配列に作動的に結
合していることを特徴とする請求項９に記載の組換えベ
クター。
【請求項１１】請求項５から７のいずれか一項に記載
の核酸配列、請求項８に記載の組換え核酸分子、又は請
求項９もしくは１０に記載の組換えベクター分子で形質
転換された宿主細胞又は生物。
【請求項１２】請求項１１に記載の宿主細胞を培養す
ることからなる、請求項１から４のいずれか一項に記載
のタンパク質の発現方法。
【請求項１３】請求項１から４のいずれか一項に記載
のタンパク質、請求項８に記載の組換え核酸分子、請求
項９もしくは１０に記載の組換えベクター、又は請求項
１１に記載の宿主細胞もしくは生物を獣医学的に許容可
能なキャリヤーと共に含むことを特徴とするコクシジウ
ム症に対する家禽の感染防御用ワクチン。
【請求項１４】請求項１１に記載の感染宿主細胞を培
養する段階と、組換えベクターを採取する段階と、前記
組換えベクターから免疫活性を有する獣医学的製剤を調
製する段階とを含む、コクシジウム症ワクチンの製造方
法。
【請求項１５】請求項１から４のいずれか一項に記載
のタンパク質又は請求項１２に記載の方法に従って製造
したタンパク質から免疫活性を有する獣医学的製剤を調
製することからなる、コクシジウム症ワクチンの製造方
法。
【請求項１６】請求項１から４のいずれか一項に記載
のタンパクに対して免疫反応性の抗体又は抗血清。
【請求項１７】支持体に結合しているか又は標識物質
を有する請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパ
ク質を含む免疫化学試薬。
【請求項１８】請求項５から７のいずれか一項に記載
の核酸配列、請求項１６に記載の抗体もしくは抗血清、
又は請求項１７に記載の免疫化学試薬を含むＥｉｍｅｒ
ｉａ感染診断用テストキット。
【請求項１９】請求項１３に記載のワクチンをトリに
投与することからなる、コクシジウム症に対する家禽の
感染防御方法。