JPH07198721A - 免疫測定用緩衝液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 免疫測定法において問題となる抗原、抗体も
しくはその修飾物の非特異的吸着を減少する緩衝液を提
供する 【構成】 トリス（ヒドロキシ）アミノメタン、塩基性
アミノ酸およびε−アミノカプロイン酸からなる群から
選択されるアミノ基含有化合物を０.１Ｍ以上含有する
免疫測定用緩衝液。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は生体内微量物質等の測定
に用いられる免疫測定法に使用する免疫測定用緩衝液に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定
法、レーザーネフェロメトリー法等の免疫応答反応を利
用した測定法は、目的物を試料から単離する前処理が不
要であり、しかもごく微量の物質を測定することがで
き、血清、尿等の生体試料中および細胞培養上清に含有
される微量物質、例えばペプチドホルモン類、ステロイ
ドホルモン類、タンパク質類等の測定に盛んに用いられ
ている。

【０００３】しかしながら、上記のような免疫測定法を
実施する場合、使用する抗体等の非特異的吸着および／
または反応試料中の干渉物質による免疫反応の非特異的
阻害によるバックグラウンドの高さが問題となる。バッ
クグラウンド値が高いと、測定感度が低下し、臨床検査
等においても多量の試料が必要となる。

【０００４】器壁等への非特異的吸着を除くため、従来
からタンパク質で器壁をコートしたり、界面活性剤を添
加した緩衝液で洗浄を行うなどの方法が用いられてい
る。また、例えば塩類と疎水性タンパク質やゼラチン、
ケラチン、コラーゲン等の分解物等のペプチド等とを共
存させたものを用いて干渉物質による非特異的な阻害を
抑制する方法が提案されている（特公昭５９−２５１８
４、特公昭６３−４１４７）。

【０００５】

【従来技術の問題点】従来の方法によって干渉物質等の
除去を行っても、免疫反応以外の非特異的結合を有効に
除外することは困難である。このためバックグラウンド
が高くなり、測定の感度や測定値の信頼性が低下する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、免疫測定法
において問題となる抗原、抗体もしくはその修飾物の非
特異的吸着を減少する緩衝液を提供することを目的とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明はトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、塩基性
アミノ酸およびε−アミノカプロイン酸からなる群から
選択されるアミノ基含有化合物を０.１Ｍ以上含有する
免疫測定用緩衝液に関する。

【０００８】免疫測定を含む生化学的な測定に用いる緩
衝液中、ｐＨ調整のためにトリスを１０ｍＭ程度添加す
ることは知られているが、本発明は免疫反応に関与する
物質の非特異的吸着を防ぐために添加するものであり、
０.１Ｍ以上の濃度が必要である。トリスの濃度は０.１
Ｍ以上であればよいが、好ましくは０.１Ｍ〜１.０Ｍ添
加する。トリスを共存させることにより免疫測定系にお
ける非特異的吸着が抑制されるが、０.１Ｍ未満ではそ
の効果が得られない。

【０００９】塩基性アミノ酸としては、リジン、アルギ
ニン等が好適に用いられる。本発明の免疫測定用緩衝液
中、塩基性アミノ酸は少なくとも０.１Ｍ、好ましくは
０.１Ｍ〜１.０Ｍ添加する。塩基性アミノ酸を共存させ
ることにより免疫測定系における非特異的吸着が抑制さ
れるが、その添加量が０.１Ｍ未満ではその効果が得ら
れない。

【００１０】ε−アミノカプロイン酸の濃度は０.１Ｍ
以上であればよいが、好ましくは０.１Ｍ〜１.０Ｍ添加
する。ε−アミノカプロイン酸を共存させることにより
免疫測定系における非特異的吸着が抑制されるが、添加
量が０.１Ｍ未満であるとその効果を得ることができな
い。

【００１１】本発明の免疫測定用緩衝液にはさらにタン
パク質および塩類を添加するのが好ましい。タンパク質
としては血清アルブミン、ゼラチン、ケラチン、コラー
ゲン等が好適に用いられる。タンパク質は２種類以上を
混合して用いても良い。反応系中のタンパク質の濃度は
０.５％以上であればよいが、好ましくは０.５％〜２.
０％、より好ましくは０.５％〜１.０％である。

【００１２】塩類としては、測定系を阻害しない塩類で
あれば特に限定されない。塩類としては、塩化ナトリウ
ム、リン酸塩、塩化マグネシウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩類が好適に用
いられる。塩類は２種類以上を混合して用いても良い。
塩類の濃度は０.５Ｍ以上であればよいが、好ましくは
０.５Ｍ〜２.０Ｍ、より好ましくは０.５Ｍ〜１.０Ｍで
ある。

【００１３】緩衝液中にタンパク質と塩を共存させるこ
とにより、測定系の非特異的吸着のみならず、干渉物質
の影響を除外することが可能となり、より感度の高い測
定を行うことができる。特に血清、尿等の生体由来の試
料や細胞培養上清等の干渉物質が多く含まれる試料の測
定に特に有用である。

【００１４】本発明の免疫測定用緩衝液のベースとなる
緩衝液は、通常免疫測定に用いられる緩衝液がいずれも
好適に用いられる。測定系によって適宜選択すればよい
が、具体的には例えばリン酸ナトリウム緩衝液、クエン
酸−リン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝
液、酢酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウ
ム緩衝液、フタル酸ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナト
リウム緩衝液、およびこれらのカリウム塩緩衝液、イミ
ダゾール塩酸緩衝液等が挙げられる。

【００１５】緩衝液のｐＨは５.５から７に調整するの
が好ましい。ｐＨが７を越えるとバックグラウンド値が
上昇し、測定感度が低下する。またｐＨが５.５未満の
場合には測定系の酵素反応による発色が低下する等の問
題が生じる。

【００１６】本発明の免疫測定用緩衝液を用いることに
より、免疫測定時の非特異的吸着が抑制され、バックグ
ラウンド値が低下し測定感度および信頼性の高い測定を
行うことができる。本発明の免疫測定用緩衝液は、酵素
免疫測定法、ラジオイムノアッセ、レーザーネフェロメ
トリー等の免疫反応を用いる各種の微量物質の測定に好
適に用いられる。測定対象は血清、尿、生体試料中に含
まれる微量物質、あるいは細胞上清中に含まれる微量物
質等のみならず、標準物質等の精製品を測定する場合に
用いてもよい。

【００１７】以下実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれによって何ら限定されるもので
はない。

【実施例】サンドイッチ法によるＴＧＦ−β１（ヒト由来形質転換
成長因子β１）の酵素免疫測定 実施例１ 以下の緩衝液ＡおよびＢをそれぞれ用いてＴＧＦ−β１
の測定を行った。 緩衝液Ａ：０.５％牛血清アルブミン、０.５％ゼラチ
ン、０.５Ｍ塩化ナトリウム、０.０１％チメロサールを
含む０.０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６) 緩衝液Ｂ：０.２Ｍトリス、０.５％牛血清アルブミン、
０.５％ゼラチン、０.５Ｍ塩化ナトリウム、０.０１％
チメロサールを含む０.０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
(ｐＨ６)

【００１８】０.１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ^-に
希釈した各濃度のヒトＴＧＦ−β１含有液２５０μｌを
試験管に加え、さらにポリスチレンビーズ−抗ヒトＴＧ
Ｆ−β１抗体(ニワトリ由来の抗ヒトＴＧＦ−β１を固
定化した、直径６.３５ｍｍのポリスチレンビーズ)を１
個加え、４℃で一晩反応させた。

【００１９】緩衝液にてビーズをよく洗浄した後、試験
管内に緩衝液で希釈した抗ＴＧＦ−β１モノクローナル
抗体（マウスＩｇＧ：1.25μg/ml)２５０μｌを加えて
３７℃で１時間反応させた。緩衝液にてビーズをよく洗
浄した後、緩衝液で希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ
抗体(０.５μg/ml)２５０μlを添加し、３７℃で１時間
反応させた。緩衝液にてビーズをよく洗浄した後、緩衝
液で希釈したストレプトアビジン化ペルオキシダーゼ
（ギブコ社製、５０００倍希釈で使用）２５０μlを添
加してさらに１時間反応させた。反応後緩衝液でビーズ
を洗浄した。別に用意した、過酸化水素(０.００１％)
を含むオルトフェニレンジアミン溶液(０.４mg/ml、０.
１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液(ｐＨ５))２５０μｌの入
った試験官に洗浄したビーズを加え、室温暗下で３０分
間反応させた後２Ｎの硫酸７５０μｌを添加して反応を
停止させ、Ａ４９２ｎｍの吸光度を測定した。結果を表
１に示す。

【００２０】

【表１】

【００２１】ＴＧＦ−β１を添加しない場合の吸光度、
すなわちバックグラウンド値は、トリスを添加した緩衝
液Ｂでは、添加していない緩衝液Ａを用いた場合と比べ
て約半分となっている。一方、ＴＧＦ-β１を添加した
場合の吸光度は、トリスを添加する、しないにかかわら
ずほぼ同じ値を得た。緩衝液へのトリスの添加により免
疫反応を阻害することなく、非特異的吸着を抑制するこ
とが可能である。

【００２２】実施例２ 緩衝液Ａに１０ｍＭおよび１００ｍＭのトリスを加えた
組成の緩衝液ＣおよびＤを用い実施例１と同様にしてＴ
ＧＦ−β１を０および５ng/ml含有する試料に対する吸
光度を求めた。結果を表２に示す。

【００２３】

【表２】

【００２４】表２に示した通り、ＴＧＦ−β１を添加し
ない場合の吸光度、すなわちバックグラウンド値はトリ
スを１０ｍＭ添加してもほとんど変化が無かったが、１
００ｍＭのトリス添加により約２５％低下した。緩衝液
に０.１Ｍ以上のトリスを添加することによって免疫反
応を阻害することなくバックグラウンド値を低下するこ
とが可能である。

【００２５】実施例３ 実施例１においてＴＧＦ−β１の濃度を０〜５０ng/ml
まで変化させて吸光度を測定し、標準曲線を作成した。
緩衝液としては、実施例１に用いたトリスを含まない緩
衝液Ａと０.２Ｍのトリスを含有する緩衝液Ｂを用い
た。結果を図１に示す。

【００２６】図１に示したグラフより、緩衝液Ａを用い
た場合にはバックグラウンド値が高いため、測定可能な
下限が５ng/mlであるのに対し、トリスを含有する緩衝
液Ｂを用いると０.５ng/mlから測定することが可能とな
った。

【００２７】実施例４ 緩衝液ｐＨの測定値におよぼす影響を調べた。実施例１
で用いた０.２Ｍトリスを含有する緩衝液ＢのｐＨを５
から８に塩酸あるいは水酸化ナトリウム溶液で調整した
ものを用い、実施例１と同様にしてＴＧＦ−β１を０お
よび５ng/ml含有する試料における吸光度を求めた。結
果を表３に示す。

【００２８】

【表３】

【００２９】表３に示した通り、ｐＨが５.５〜７の範
囲ではバックグラウンドが効果的に抑制された。しかし
ｐＨが５.５以下となると、酵素による発色が悪くなり
有効な測定が困難となり、また、ｐＨが８以上となると
バックグラウンドが上昇するため測定には適さない。

【００３０】実施例５ 緩衝液Ａに塩基性アミノ酸であるアルギニンを０.２Ｍ
加えた組成の緩衝液Ｅおよび緩衝液Ａを用い、実施例１
と同様にしてＴＧＦ−β１を０および５ng/ml含有する
試料に対する吸光度を求めた。結果を表４に示す。

【００３１】

【表４】

【００３２】表４に示す通り、アルギニンの添加によっ
てバックグラウンドは約２５％程度減少した一方、５ng
/mlのＴＧＦ−β１の吸光度は同程度の値を得た。緩衝
液へのアルギニンの添加により、免疫反応を阻害するこ
となく非特異的吸着を抑制することが可能である。

【００３３】実施例６ 緩衝液Ａにε−アミノカプロイン酸を０.２Ｍを加えた
組成の緩衝液Ｆおよび緩衝液Ａを用い、実施例１と同様
にしてε−アミノカプロイン酸の効果を調べた。結果を
表５に示す。

【００３４】

【表５】

【００３５】表５に示す通り、ε−アミノカプロイン酸
の添加によってバックグラウンドは約２５％程度減少し
た一方、５ng/mlのＴＧＦ−β１の吸光度は同程度の値
を得た。緩衝液へのε−アミノカプロイン酸の添加によ
り、免疫反応を阻害することなく非特異的吸着を抑制す
ることが可能である。

【００３６】サンドイッチ法によるエンドセリン−１の
酵素免疫測定 実施例７ 以下の緩衝液ＧおよびＨをそれぞれ用いてエンドセリン
−１の測定を行った。緩衝液Ｇ：０.１％牛血清アルブ
ミン、０.１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウ
ムおよび０.０１％チメロサールを含む０.０１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７） 緩衝液Ｈ：トリス０.２Ｍ、０.１％牛血清アルブミン、
０.１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウムおよ
び０.０１％チメロサールを含む０.０１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７）

【００３７】抗エンドセリン−１抗体（ウサギ由来のＩ
ｇＧ）を固相化した９６穴マイクロタイタープレート
に、上記緩衝液に希釈した各濃度のエンドセリン−１溶
液を１ウエルあたり５０μｌ添加した。ここへ抗エンド
セリン−１のモノクローナル抗体（マウス由来のＩｇ
Ｇ、１０μg/ml）を５０μｌ添加し、室温で３時間反応
させた。プレートを緩衝液でよく洗浄した後、各ウエル
に緩衝液で希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体
（０.５μg/ml)１００μｌを添加し、室温で１.５時間
反応させた。ふたたびプレートを緩衝液で洗浄した後、
各ウエルに緩衝液で希釈したストレプトアビジル化ペル
オキシダーゼ（ギブコ社製、５０００倍希釈）を１００
μｌ添加し、さらに１時間反応させた。プレートを緩衝
液で洗浄した後、各ウエルに過酸化水素（０.００１
％）を含む基質オルトフェニレンジアミン溶液(０.４mg
/ml、０.１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液(ｐＨ５))１００
μｌを添加し、室温暗下で３０分反応後に２Ｎ硫酸１０
０μｌを添加して反応を停止し、吸光度（Ａ４９２ｎ
ｍ）をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を表
６に示す。

【００３８】

【表６】

【００３９】表６から示されるごとく、バックグラウン
ド値はトリス添加により低く抑えられているがエンドセ
リン−１（ＥＴ−１）１０００ng/mlにおける測定値は
ほぼ同じであり、トリスの添加が免疫反応には何ら影響
を及ぼさず、非特異的吸着のみを阻害することが確認さ
れる。

【００４０】

【発明の効果】本発明の免疫測定用緩衝液は、免疫測定
における非特異的吸着を阻害し、測定のバックグラウン
ド値を下げるが、免疫反応自体には影響を及ぼさない。
このため、本発明の免疫測定用緩衝液により、測定の感
度および測定値の信頼性を増加させることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の実施例４の結果を示すグラフであ
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
   ン、塩基性アミノ酸およびε−アミノカプロイン酸から
   なる群から選択されるアミノ基含有化合物を０.１Ｍ以
   上含有する免疫測定用緩衝液。
2. 【請求項２】 さらにタンパク質を０.５％以上および
   塩類を０.５Ｍ以上含有する請求項１記載の免疫測定用
   緩衝液。
3. 【請求項３】 ｐＨが５.５から７の範囲である請求項
   １または２記載の免疫測定用緩衝液。