JPH07203996A

JPH07203996A - ヒト単純疱疹ウイルス検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途

Info

Publication number: JPH07203996A
Application number: JP6003132A
Authority: JP
Inventors: Koichi Yamanishi; 弘一山西; Toshiya Aono; 利哉青野; Motohiro Kondo; 元宏近藤; Yutaka Takarada; 裕宝田
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1994-01-17
Filing date: 1994-01-17
Publication date: 1995-08-08

Abstract

(57)【要約】【目的】簡便、迅速、特異的且つ高感度にヒト単純疱疹
ウイルスを検出可能なオリゴヌクレオチドを提供する。【構成】配列表・配列番号１〜８に示す核酸配列と７０
％以上の相同性を有するか、またはそれらの相補的配列
と７０％以上の相同性を有することを特徴とするヒト単
純疱疹ウイルス検出用オリゴヌクレオチドと該オリゴヌ
レオチドを標識プローブまたはプライマーとするヒト単
純疱疹ウイルス検出法およびその試薬キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト単純疱疹ウイルス
（ＨｅｒｐｅｓＳｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ：ＨＳＶ
と略すことがある）を簡便かつ迅速に検出するオリゴヌ
クレオチドおよびその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＨＳＶは初感染では不顕性であることが
多いが、顕性である場合には重篤であることが多い。Ｈ
ＳＶは初感染後、神経節に潜伏し、発熱・過労・免疫抑
制剤投与等が引き金となって、再活性化されることが知
られている。ＨＳＶには主として上半身に感染する１型
（ＨＳＶ−１）と、下半身に感染する２型（ＨＳＶ−
２）に分類される。ＨＳＶは口内炎・咽頭炎・角膜炎・
性器ヘルペスといった日常診療で頻繁に取り扱われる疾
病から、ヘルペス脳炎や、脳脊髄膜炎といった、命に関
わる重篤な疾病に至るまで、非常に多様な臨床像を示す
ことからその診断意義は高い。また、最近、アシクロビ
ル等の効果的な治療薬が開発されたことにより、簡便、
迅速な早期診断方法の確立が望まれている。

【０００３】ＨＳＶを検出する方法としては、培養法
や、免疫法が知られている。しかしながら、培養法では
分離培養から、同定まで５〜７日を要し、迅速な診断を
行うことができない。一方、免疫法の場合、抗原を検査
する方法では、株間変異の激しいＨＳＶでは抗原性の多
様性が問題となる。また、抗体を検査する方法では、一
般に過去にそのウイルスに羅患したことを示す意味でし
かなく、検査時の状態を反映するものではない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、簡便、迅速、特異的且つ高感度にヒト単純疱疹ウイ
ルスを検出可能なオリゴヌクレオチドを提供することで
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らはＨＳＶの遺
伝子に関する種々の検討を重ねた結果、簡便、迅速、特
異的かつ高感度にＨＳＶを検出できる配列を有するオリ
ゴヌクレオチドを得、それを用いた検出方法を確立し、
本発明を完成させるに至った。

【０００６】本発明は、ＨＳＶに特異的なオリゴヌクレ
オチド、すなわち、配列表・配列番号１〜８（但し、Ａ
はアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン
を表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換
されてもよい）に示す核酸配列と７０％以上の相同性を
有するか、またはそれらに相補的な配列と７０％以上の
相同性を有するヒト単純疱疹ウイルス検出用オリゴヌク
レオチドである。

【０００７】また本発明は、上記ヒト単純疱疹ウイルス
検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プロー
ブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した
結合体の標識を測定することを特徴とする試料中のヒト
単純疱疹ウイルスの検出法である。

【０００８】さらに本発明は上記ヒト単純疱疹ウイルス
検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライマー、また
は該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマ
ーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマ
ーを伸長させ、得られたプライマー伸長物を測定するこ
とを特徴とする試料中のヒト単純疱疹ウイルスの検出法
である。

【０００９】また本発明は上記ヒト単純疱疹ウイルス検
出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プローブ
を含むことを特徴とする試料中のヒト単純疱疹ウイルス
検出用試薬キットである。

【００１０】さらに本発明は上記ヒト単純疱疹ウイルス
検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライマー、また
は該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマ
ーを含むことを特徴とする試料中のヒト単純疱疹ウイル
スの検出用試薬キットである。

【００１１】本発明のヒト単純疱疹ウイルス検出用オリ
ゴヌクレオチドは、配列表・配列番号１〜８（但し、Ａ
はアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン
を表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換
されてもよい）に示す核酸配列と７０％以上の相同性を
有するか、またはそれらの相補的配列と７０％以上の相
同性を有するものであり、ヒト単純疱疹ウイルスに特異
的に反応する。一般にオリゴヌクレオチドは化学合成に
より調製できるので、クローン化したオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドに比べ容易、大量且つ安価に
一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能であ
る。

【００１２】本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リ
ボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基
（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に
際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリ
ジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意のＵ
をＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよ
い。またオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるいは置
換といった点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあっても
よい。

【００１３】本発明の標識核酸プローブは、上記ヒト単
純疱疹ウイルス検出用オリゴヌクレオチドに標識を結合
したものであり、標識物としては放射性物質や酵素、蛍
光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性
担体などの公知の標識を用いることができる。標識の仕
方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよい。ま
た、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。

【００１４】本発明の核酸プライマーは、上記ヒト単純
疱疹ウイルス検出用オリゴヌクレオチドをそのまま使用
するか、あるいは該オリゴヌクレオチドを標識化したも
のを使用する。

【００１５】本発明のヒト単純疱疹ウイルス検出用オリ
ゴヌクレオチドを用いてＨＳＶを検出する場合、（１）
本発明オリゴヌクレオチドをプローブとして検出する方
法、（２）本発明オリゴヌクレオチドをプライマーとし
てＤＮＡポリメラーゼ等により伸長反応させて検出する
方法がある。上記（２）の場合、上記オリゴヌクレオチ
ドに標識を導入することにより検出が容易に可能とな
る。上記（１）の場合、本発明のオリゴヌクレオチドを
標識化した標識核酸プローブを試料中のＤＮＡまたはＲ
ＮＡと交雑させ、交雑した結合体の標識を適当な検出法
で検出することで達成される。一方、上記（２）の場
合、本発明のオリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライ
マーとするか、または該オリゴヌクレオチドを標識化し
た標識核酸プライマーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと
交雑させ、ＤＮＡポリメラーゼ等によりプライマーを伸
長させ、得られたプライマー伸長物を直接測定するか、
標識プローブを用いて測定する。

【００１６】本発明のオリゴヌクレオチドをプライマー
として用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼ等を使用する遺
伝子増幅（ＰＣＲ等）を行なうことにより、ＨＳＶの遺
伝子のみを特異的に増幅することができる。増幅反応に
際しては反応時に放射性物質などの標識の結合したヌク
レオチドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動に
より分画して特異なバンドを検出することにより、容易
にＨＳＶを検出することができる。さらに本発明の型特
異的オリゴヌクレオチドを用いることにより、電気泳動
後、増幅産物のサイズにより容易に型の判別も行うこと
ができる。また前述の標識オリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いれば増幅産物を直接検出することも可能
である。

【００１７】本発明のヒト単純疱疹検出用試薬キット
は、本発明のヒト単純疱疹ウイルス検出用オリゴヌクレ
オチド、もしくはこのオリゴヌクレオチドを適当な標識
剤で標識化した標識オリゴヌクレオチドを含むものであ
る。核酸プライマーを含む試薬キットには標識プローブ
を含んでいてもよい。また、その他の成分としては、標
識検出物質や緩衝液などを含む。さらに核酸プライマ
ー、または標識核酸プライマーを含む本発明の試薬キッ
トには、他の成分として、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素
に応じた基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰなど）、標識検出物
質や緩衝液などを含む。

【００１８】また、本発明のオリゴヌクレオチドを固相
担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもでき
る。この場合、捕捉プローブと、標識（核酸）プローブ
の組み合わせでサンドイッチアッセイを行ってもよい
し、標的核酸を標識して捕捉する方法もある。また、オ
リゴヌクレオチドをビオチンで標識し、ハイブリダイゼ
ーション後、アビジン結合担体で捕捉する方法もある。
サンドイッチアッセイにおいてはどちらか一方に本発明
のオリゴヌクレオチドを用いれば、該オリゴヌクレオチ
ドの特異性により特異的な測定が可能となり、他方のオ
リゴヌクレオチドの特異性は若干低くてもなんら問題は
ない。

【００１９】

【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。

【００２０】実施例１（各種オリゴヌクレオチドの合
成）ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号１〜８示される配
列を有するオリゴヌクレオチドを各種合成した。以下、
配列表・配列番号１〜８に示される各種オリゴヌクレオ
チドを、それぞれオリゴヌクレオチド(1) 〜(8) と呼
ぶ。手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２μＭスケ
ールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はア
ンモニア水で５５℃一夜実施した。精製はファルマシア
社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。なお合成した
オリゴヌクレオチドは必要により以下の方法で５’末端
に³²Ｐ−リン酸基を結合させた。

【００２１】反応液組成オリゴヌクレオチド５〜２０pmoles １０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液１０μｌ１mM [γ-³²PＡＴＰ(10mCi/ml) １μｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡製）１０単位水全量が１００μｌとなる量上記のように調製した反応混合液を３７℃で１時間反応
させた。ここで１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩
衝液とは、0.5M Tris-HCl(pH8.0)、0.1M MgCl₂、0.1M 2
-メルカプトエタノールを示す。

【００２２】実施例２（ヒト単純疱疹ウイルスの共通
増幅）（１）キットＡ：ヒト単純疱疹ウイルス由来核酸を増幅
するためのキット（ａ）実施例１のオリゴヌクレオチド(1) （ｂ）実施例１のオリゴヌクレオチド(2) （ｃ）ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）, ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ

【００２３】（２）ウイルス核酸の調製ヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）の標準株とし
てＳｅｉｂｅｒｔ株、同２型（ＨＳＶ−２）の標準株と
してＵＷ２６８株を用いた。また、特異性を調べるため
に水痘ー帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）河口株、ＥＢウイ
ルス（ＥＢＶ；Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒｕ
ｓ）Ｂ９５−８株、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ；ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）ＡＤ１６９株、
ヒトヘルペスウイルス６型Ａ型（ＨＨＶ−６Ａ）Ｕ１１
０２株、同Ｂ型（ＨＨＶ−６Ｂ）橋本株、ヒトヘルペス
ウイルス７型（ＨＨＶ−７）ＲＫ株、および、ヒト胎盤
ＤＮＡ（シグマ社製）を用いた。ウイルス核酸は常法に
より調製した。

【００２４】ＰＣＲ反応液９３μｌに前記核酸溶液５μｌ、実施例１のオリ
ゴヌクレオチド(1) と(2) １μｌずつをプライマーとし
て加え、ヒト単純疱疹ウイルス由来核酸の増幅を行っ
た。反応液組成は以下の通りである。反応液組成ＫＣｌ 50 mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） 10 mM ＭｇＣｌ₂ 1.5 mM ゼラチン 0.01 % dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各0.2 mM Tth DNA ポリメラーゼ 40 単位/ml

【００２５】反応条件は次の通りである。熱変性：９４℃、１分、アニーリング：５５℃、２分重合反応：７５℃、１．５分を３０回行った。これらの操作はパーキン−エルマー／
シータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイ
クラーを用いて行った。

【００２６】検出１０μｌの反応液を２％アガロースゲル電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出
した（図１）。図１中、レーン２〜１０は、それぞれＨ
ＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨ
Ｖ−６（Ａ）、ＨＨＶ−６（Ｂ）、ＨＨＶ−７およびヒ
ト胎盤ＤＮＡを示す。また、レーン１、１１は分子量マ
ーカーを示す。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、
時間は３０分行った。操作方法並びに他の条件はManiat
isらのMolecular Cloning(1982) に記載の方法に従っ
た。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、相対
泳動度の比較により、検出されたヌクレオチド断片の長
さを算出した。

【００２７】結果ＰＣＲ産物はヒト単純疱疹ウイルスを用いたときのみバ
ンドが観察された（図１：レーン２、３）。分子量マー
カーより、そのサイズは約３２０塩基対と同定された。
これは核酸配列から計算されるヌクレオチドの長さとよ
く一致した。

【００２８】実施例３（ヒト単純疱疹ウイルスの特異
増幅）（１）キットＢ：ヒト単純疱疹ウイルス由来核酸を増幅
するためのキット（ａ）実施例１のオリゴヌクレオチド(1) （ｂ）実施例１のオリゴヌクレオチド(3) （ｃ）実施例１のオリゴヌクレオチド(4) （ｄ）ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製），ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ

【００２９】ＰＣＲ反応液９３μｌに前記核酸溶液５μｌ、実施例１のオリ
ゴヌクレオチド(1) 、(3) および(4) １μｌずつをプラ
イマーとして加え、ヒト単純疱疹ウイルス由来核酸の型
特異的増幅を行った。反応液組成、及び検出の方法は実
施例２と同様に行った。図２中、レーン２〜１０は、そ
れぞれＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭ
Ｖ、ＨＨＶ−６（Ａ）、ＨＨＶ−６（Ｂ）、ＨＨＶ−７
およびヒト胎盤ＤＮＡを示す。また、レーン１、１１は
分子量マーカーを示す。

【００３０】結果ＰＣＲ産物はヒト単純疱疹ウイルスを用いたときのみバ
ンドが観察された（図２：レーン２、３）。分子量マー
カーより、そのサイズはＨＳＶ−１では約２１０塩基
対、ＨＳＶ−２では約２８０塩基対と同定された。これ
は核酸配列から計算されるヌクレオチドの長さとよく一
致した。

【００３１】実施例４（ヒト単純疱疹ウイルスの特異
検出）実施例２の増幅産物がどのヒト単純疱疹ウイルスに由来
するものか特定するためにドット・ブロット・ハイブリ
ダイゼーションを行った。（１）キットＣ：ヒト単純疱疹ウイルス由来核酸を検出
するためのキット実施例１のオリゴヌクレオチド(5) および(6) 、及び
(7) または(8) を含み、５’末端に、³²Ｐ−リン酸基を
有している。（２）ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション実施例２のＰＣＲ産物１μｌに０．３規定のＮａＯＨを
１００μｌ加え、室温で１５分間変性し、ドットブロッ
ター（ＢＲＬ社製）を用いて５×ＳＳＣで湿潤したナイ
ロン膜（ハイボンドＮプラス，アマシャム社製）にブロ
ットした。なおＳＳＣとは１５ｍＭクエン酸三ナトリウ
ム、１５ｍＭ塩化ナトリウム溶液を示し、５×ＳＳＣと
はＳＳＣの５倍濃厚液を示す。この膜を８０℃、３０分
間加熱処理して核酸を固定化した後、ハイブリダイゼー
ションを行った。まず、乾燥した膜（８×１２ｃｍ）を
５×ＳＳＣに５分間浸した。次にハイブリダイゼーショ
ンバック（ＢＲＬ社製）に膜を移し、ハイブリダイゼー
ションバッファー（５×ＳＳＣ、０．５％ウシ血清アル
ブミン、０．５％ポリビニールピロリドン、１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム）５ｍｌを加えてポリシーラーでシー
ルし、５０℃、１５分間プレハイブリダイゼーションを
行った。次にキットＢのオリゴヌクレオチドプローブ
(5) から(8) の中のいずれか５μl を含むハイブリダイ
ゼーションバッファー５ｍｌで５５℃、１５分間ハイブ
リダイゼーションを行った。膜をポリバックから取り出
し、洗浄液−１（１×ＳＳＣ、１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム）で５５℃、５分間で２回、振とう洗浄した。洗浄
液−２（１×ＳＳＣ）で室温、５分間で２回、振とう洗
浄した後、膜を充分乾燥させた。

【００３２】（３）検出ナイロン膜にＸ線フィルム（New AIF RX 富士写真工業
製）を密着させ、−８０℃で一昼夜感光させた。フィル
ムの感光度からヒト単純疱疹ウイルスの検出を行った。

【００３３】結果それぞれのウイルスに特異的なオリゴヌクレオチド・プ
ローブはそれぞれのウイルス由来の増幅産物のみと特異
的に反応し、他のウイルス由来やヒトＤＮＡ由来の増幅
産物との反応は観察されなかった（表１）。

【００３４】

【表１】

【００３５】実施例５（ヒト単純疱疹ウイルスの高感
度特異検出）ヒト単純疱疹ウイルスに由来する増幅産物をより高感度
に検出するためにサザンブロット・ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。（１）キットＤ：ヒト単純疱疹ウイルス由来核酸を検出
するためのキット実施例１のオリゴヌクレオチド(5) 、
(7) または(6) 、(8) で、５’末端に、 ³²Ｐ−リン酸基
を有している。（２）サザンブロット・ハイブリダイゼーション実施例３のＨＳＶ−１由来ＰＣＲ産物およびＨＳＶ−２
由来ＰＣＲ産物を、それぞれ５段階の５倍希釈を行い原
液を含めて６種の濃度のＰＣＲ産物溶液を各々５μl を
２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。エチジ
ウムブロマイド液で染色し写真撮影を行った後、Maniat
isらのMolecular Cloning (1982)に記載の方法により、
ナイロン膜（ハイボンドＮプラス，アマシャム社製）に
ブロットした。ハイブリダイゼーションはプローブとし
て実施例１のオリゴヌクレオチド(6)（ＨＳＶ−１用：
図３）及び (8)（ＨＳＶ−２用：図４）を用いて実施例
４と同様に行った。

【００３６】（３）検出実施例４と同様に行った（図３：ＨＳＶ−１，図４：Ｈ
ＳＶ−２）。図３中、レーン２〜７は、それぞれＰＣＲ
産物の原液、同５倍希釈液、２５倍希釈液、１２５倍希
釈液、６２５倍希釈液、３１２５倍希釈液を示す。ま
た、レーン１、１１は分子量マーカーを示す。図４中、
レーン２〜７は、それぞれＰＣＲ産物の原液、同５倍希
釈液、２５倍希釈液、１２５倍希釈液、６２５倍希釈
液、３１２５倍希釈液を示す。また、レーン１、１１は
分子量マーカーを示す。結果ＨＳＶ−１，ＨＳＶ−２共に、電気泳動法では１２５倍
希釈液までしか検出することはできなかったが（図３−
Ａ、図４−Ａ）、サザンブロット・ハイブリダイゼーシ
ョンを行うことにより、３１２５倍希釈液まで検出する
ことができた（図３−Ｂ、図４−Ｂ）。

【００３７】

【発明の効果】本発明により従来培養に時間のかかって
いたヒト単純疱疹ウイルスを迅速、簡便に特異的且つ高
感度で型別に測定することが可能となった。本発明のオ
リゴヌクレオチドは増幅反応のプライマーとしても、直
接検出用のプローブとしても用いることが可能である。
また。プライマーにより増幅した増幅産物をプローブで
検出することにより、感度、特異性をさらに高く検出す
ることも可能で、その臨床的意義は大きい。

【００３８】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列の特徴存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト単純疱疹ウイルスに共通の配列。配列 GTTTGTGTGT TGTTCGGTCA TAAGC 25

【００３９】配列番号：２配列の長さ：22 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列の特徴存在位置：1..22 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト単純疱疹ウイルスに共通の配列。配列 GCGTAGTACA CCGTGATCGG GA 22

【００４０】配列番号：３配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列の特徴存在位置：1..24 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）に
特異的な配列。配列 TCGGCCATCT TGAGAGAGGC ATCC 24

【００４１】配列番号：４配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列の特徴存在位置：1..24 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト単純疱疹ウイルス２型（ＨＳＶ−２）に
特異的な配列。配列 GGCTGAATGT GGTAAACACG CTTC 24

【００４２】配列番号：５配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列の特徴存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）に
特異的な配列。配列 AGCGCGAACG ACCAACTACC CCGAT 25

【００４３】配列番号：６配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列の特徴存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）に
特異的な配列。配列 TCAGTTATCC TTAAGGTCTC TTTTG 25

【００４４】配列番号：７配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列の特徴存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト単純疱疹ウイルス２型（ＨＳＶ−２）に
特異的な配列。配列 TCCCAATCGA TTTCGCGGGA AGAAC 25

【００４５】配列番号：８配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列の特徴存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト単純疱疹ウイルス２型（ＨＳＶ−２）に
特異的な配列。配列 TTCCGGTTTT GGACCAGCTG ACCGA 25

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２の電気泳動結果を示す。

【図２】実施例３の電気泳動結果を示す。

【図３】実施例５のＨＳＶ−１由来ＰＣＲ産物を用いた
場合の電気泳動（Ａ）およびサザン・ハイブリダイゼー
ション（Ｂ）の結果を示す。

【図４】実施例５のＨＳＶ−２由来ＰＣＲ産物を用いた
場合の電気泳動（Ａ）およびサザン・ハイブリダイゼー
ション（Ｂ）の結果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表・配列番号１〜８（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示す核酸配列と７０％以上の相同性を有す
るか、またはそれらの相補的配列と７０％以上の相同性
を有することを特徴とするヒト単純疱疹ウイルス検出用
オリゴヌクレオチド。
【請求項２】配列表・配列番号１〜８（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示す核酸配列と７０％以上の相同性を有す
ることを特徴とするヒト単純疱疹ウイルス検出用オリゴ
ヌクレオチド。
【請求項３】配列表・配列番号１〜８（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示す核酸配列であることを特徴とするヒト
単純疱疹ウイルス検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項４】配列表・配列番号１〜８（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示す核酸配列の相補的配列と７０％以上の
相同性を有することを特徴とするヒト単純疱疹ウイルス
検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項５】配列表・配列番号１〜８（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい）に示す核酸配列の相補的配列であることを特
徴とするヒト単純疱疹ウイルス検出用オリゴヌクレオチ
ド。
【請求項６】請求項１に記載されるヒト単純疱疹ウイ
ルス検出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた標
識核酸プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑さ
せ、交雑した結合体の標識を測定することを特徴とする
試料中のヒト単純疱疹ウイルスの検出法。
【請求項７】請求項１に記載されるヒト単純疱疹ウイ
ルス検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライマーま
たは該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライ
マーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライ
マー伸長させ、得られたプライマー伸長物を測定するこ
とを特徴とする試料中のヒト単純疱疹ウイルスの検出
法。
【請求項８】請求項１に記載されるヒト単純疱疹ウイ
ルス検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プ
ローブを含むことを特徴とする試料中のヒト単純疱疹ウ
イルスの検出用試薬キット。
【請求項９】請求項１に記載されるヒト単純疱疹ウイ
ルス検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライマーま
たは該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライ
マーを含むことを特徴とする試料中のヒト単純疱疹ウイ
ルスの検出用試薬キット。
【請求項１０】請求項１に記載されるヒト単純疱疹ウ
イルス検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸
プローブおよび請求項１に記載されるヒト単純疱疹ウイ
ルス検出用オリゴヌクレオチドである核酸プライマーま
たは該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライ
マーを含むことを特徴とする試料中のヒト単純疱疹ウイ
ルスの検出用試薬キット。
【請求項１１】さらに核酸合成酵素およびｄＮＴＰお
よび／またはｒＮＴＰおよび緩衝液を含有することを特
徴とする請求項８〜１０に記載される試料中のヒト単純
疱疹ウイルスの検出用試薬キット。