JPH0720875B2 - 細胞毒性薬剤としてのクロトキシン錯体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、治療剤として、薬理学的に許容可能な賦形剤
中にクロタルス ドウリッスス テリフィクス（Crotal
us durissus terrificus）の粗製毒液から精製されたク
ロトキシン錯体のサブユニットＡ及びＢを含む、癌腫の
治療に有用である医薬組成物に関するものである。本発
明は、また、前記組成物の薬理学的に有効な量を投与す
ることによる癌腫の治療方法に関する。

〔先行技術〕

蛇の毒液が鎮痛効果を有することは古くから知られてお
り、多くの著者が、三叉神経症、脊髄癆症、及び、腫瘍
の治療にコブラやガラガラ蛇の粗製毒液を投与すること
の有効性について指摘してきている。腫瘍の場合、患者
の70％はモルヒネ投与を行なわくても痛みから解放され
る。

しかしながら、これらの患者について追跡調査を行なっ
た著者はほとんどいない。新しい鎮痛薬の登場によっ
て、この分野での研究が取りやめになったうえ、化学療
法の進歩によって、毒液の抗新生物（抗腫瘍）薬の有す
る作用の可能性についての研究が放棄されることになっ
た。その当時、粗製の毒液を適切な分類もせずに使用し
たことは明白である。時折、インド又は南アフリカから
来たコブラの毒液を無差別に使用したため予測不可能な
結果が生じることもあった。

これとは別に、蛇の毒液から単離され、且つ、均質に精
製される最初の細胞毒性成分はブラガンサら（Braganca
et al）が1967年に、ナジヤ ナジヤ（Naja naja）毒
液かれ得たシトトキシン（cytotoxins）（細胞毒素）で
あった。後日、タケチら（Takechi et al.）が1971年
に、同一の毒液から、腫瘍細胞に対して高度の細胞毒性
活性をもった２種類の細胞毒素を単離した。ジルロ（Gi
llo）が1966年に、ウイルトハイナー及びジルロ（Wirth
einer ＆ Gillo）が同じく1966年に、また、ブリスボワ
ら（Brisbois et al）が1968年に、ナジヤ ナジヤ毒液
が腫瘍細胞を破壊しないでその増殖を不能にし、動物体
（ハツカネズミ）にできた腫瘍の成長を抑制する効果の
あることを証明した。

しかしながら、毒液の組成が複雑で、適切な制御方法も
見当らなかったことから、研究者達は、細胞毒素が通常
細胞に遭遇した場合の腫瘍細胞に対するその細胞毒性作
用は選択的なものではないと考えるようになった。

コブラ科の蛇の毒液（例えばコブラの毒液）から得た59
〜62の強塩基性アミノ酸のペプチドである細胞毒素に対
して、ガラガラ蛇類の毒液は細胞毒素を含んでおらず、
その細胞毒性作用は他の成分と同類である。

Crotalus durissus terrificusの毒液から得たクロトキ
シンと同定される留分は、1938年にスロッタ及びフレン
ケル−コンラート（Slotta ＆ Fraenkel−Conrat）が該
毒液を熱処理し、次いで、アルコール沈殿させることに
よって最初に単離したものである。この留分はピリジン
とpH4.7の酢酸の混合溶液を用いて晶出でき、自由電気
泳動（リー及びフレンケル−コンラート（Li ＆ Fraenk
el−Conrat）ならびに超遠心分離（グラレン及びスベド
ベルク（Gralen ＆ Svedberg,1938）による検討の結
果、顕著な不均質性は示されず、従って、この留分は均
質な化学物質と見なすことができた。

1971年、２つの研究グループが、「クロトキシン」は、
事実、２種の主要成分によって形成された錯体であるこ
とを証明した（ルプザーメンら（Rubsamen et al.）197
1;ヘンドン及びフレンケル−コンラート（Hendon ＆ Fr
aenkel−Conrat）1971）。上記主要成分の一方は、分子
量が14,500、等電点が9.7のホスホリパーゼA₂で、また
の名をクロトキシンＢ（塩基性）という。他方の成分
は、分子量が9,500、等電点が3.5のペプチドで、酵素活
性を欠いている。またの名をクロトキシンＡ（酸性）と
いう。

以下の手順で、Crotalus durissus terrificus毒液から
塩基性ホスホリパーゼA₂,即ちクロトキシンB,と酸性サ
ブユニット，即ちクロトキシンA,を分離した。

（１） 「セファデックス（Sephadex）Ｇ−75」カラム
を使用し、pH4.5でクロマトグラフ処理を行なう。

（２） 「CM−Sephadex C−50」でイオン交換クロマト
グラフ処理を行ない、0.1乃至1.0M（pH3.5）の凹状の容
積モル濃度勾配を有する蟻酸アンモニウムで溶出を行な
ったのち、同一緩衝液の直線状勾配（1.0乃至3.0M）で
溶出を行なった。この工程により、下記の成分を分離し
た。

（１） クロトキシンA; （２） 等電点4.1のホスホリパーゼA₂; （３） クロタミン（汚染物質）と同定しうる第三成
分、及び、 （４） 最後に溶出する塩基性ホスホリパーゼA₂（クロ
トキシンＢ）。

クロトキシンＡは、更に、リン酸カリウム（pH6.5）を
溶出剤として使用し、DEAE−Sephadex A−50カラム中で
クロマトグラフ処理して精製する。クロトキシンＢは、
また、更に、「CM−Sephadex C−50」カラム（pH3.5）
中でクロマトグラフ処理して精製する。

精製留分は薄膜（アメリカ合衆国、マサチューセッツ
州、ダンバース所在のアミコン カンパニー（AMICON C
O.）製、ダイアフロー（Dia−flo）UM−10メンブランを
使用し、限外濾過によって濃縮したのち、広範囲の透析
により0.15M NaClで平衡にさせる。精製した成分は、ド
デシル硫酸ナトリウム並びに、アミノ酸組成物の存在下
で、ポリアクリルアミド・ゲルでの電気泳動において、
均質な物質として行動する。説明の明確のために、「サ
ブユニットＡ及びＢ」を指す場合、それらはそれぞれ分
離した、或は、複合形体の「クロトキシンＡ」及び「ク
ロトキシンＢ」（ホスホリパーゼA₂）に対応する。

〔発明の解決すべき課題〕

本発明の目的は、薬理学的に受容可能な賦形剤中に治療
剤としてCrotalus durissus terrificusの粗製毒液から
精製したクロトキシン錯体のサブユニットＡ及びＢを含
む、癌腫の治療に有用な医薬組成物を提供することにあ
る。

本発明の他の目的は、薬理学的に受容可能な賦形剤中に
入れたクロトキシン錯体のサブユニットＡ及びＢを含む
医薬組成物の治療的に有効な量を患者に投与することか
らなる、癌腫の治療方法を提供することにある。

本発明の以上の目的及びその他の目的、並びに、長所及
び新規な面は、本発明に関する以下の詳細な記載から明
らかとなろう。

〔問題を解決するための手段〕

本発明は、発明者らによって発見されたクロトキシンＡ
及びＢの抗腫瘍特性に基づいている。

1. 酵素特性 Ａ） クロトキシンＢの酵素特性 クロトキシンＢはホスホリパーゼA₂であって、下記の反
応式に従って脂肪酸と、1,2−ジアシル（１−アルケニ
ル−２−アシル、又は、１−アルキル−２−アシル）−
sn−グリセロ−３−ホスホグリセリド（ホスホリピッ
ド）のグリセロール部位の２位の水酸基との間にあるエ
ステル結合を加水分解する際に触媒として働く。

〔但し、R₁及びR₂は脂肪酸残基;R₃はＨ（ホスファチン
酸）、ポリアルコール（ホスファチジルグリセロール中
のグリセロール、ホスファチジルイノシトール中のイノ
シトール）、或は、窒素添加アルコール（ホスファチジ
ルコリン中のコリン、ホスファチジルエタノールアミン
中のエタノールアミン、ホスファチジルセリン中のセリ
ン）である。〕 反応生成物は遊離脂肪酸（III）及び一般にリソ誘導体
（リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタ
ノールアミン）と定義される１−アシル誘導体（II）で
ある。加水分解反応は立体特異性をもち、グリセロール
のＣ−２のエステル結合による位置特異性を示し、共同
因子としてCa²⁺イオンを特定的に必要とする。

クロトキシンＢは、化学合成によって得られ非常に良く
水に溶け、ミセルとして凝集される短鎖レシチンのよう
なホスホリピッド、並びに、小胞として又はリポソーム
として凝集される長鎖脂肪酸（C₁₆,C₂₂を有するか或は
リポ蛋白質や生物学的薄膜のような生物学的に重要な構
造のリン脂質を、異なる凝集状態において加水分解す
る。該クロトキシンＢが卵黄リポ蛋白質（40℃において
pH8.0）に対してもつ比活性（Specific activity）は、
700μmolの加水分解基質／分/mg蛋白質である。

他の脂質分解酵素と共通の重要な機能的性質は、水溶性
リン脂質の存在下で、該基質の活性部位に結合し、且
つ、Ca²⁺の存在下で生産的な第三級錯体を生成すること
である。そして触媒反応が起きて、加水分解生成物が遊
離する。リン脂質が凝集（ミセル又は小胞）すると、酵
素はその活性部位を基質分子の順序立てられた配列に向
かって配向させ、リン脂質と水の界面に吸着してモノマ
ー分子を係合させ、且つ、Ca²⁺イオンの存在下で、界面
第三級錯体が形成される。加水分解は同一の反応機構で
進行するが、加水分解速度は極度に増大する（10,000倍
乃至100,000倍）。

集合した基質と酵素との相互作用から生ずる加水分解速
度のこのような増加は「界面の活性化（interfacial ac
tivation）」と称せられ、その機構は完全に解明されて
いない。

クロトキシンＢはクロトキシン錯体の非常に重要な薬理
活性成分である。

Ｂ） クロトキシンＡ（クロトキシン錯体に関する同物
質の特性） クロトキシンＡはいかなる検出可能な酵素活性或は毒性
をも示さないが、クロトキシン錯体の作用機構に関する
２つの重要な性質を示す。即ち： （ａ） クロトキシンＡを塩基性ホスホリパーゼA₂（ク
ロトキシンＢ）の溶液に加えると、もとの錯体と同程度
の減少した等電点（4.7）及び分子量を有する非常に安
定した錯体（Kb＝２×10^-9M）が自然に生成する。

（ｂ） クロトキシンＡ錯体においては、主として、基
質が凝集状態にある場合に、ホスホリパーゼA₂の酵素活
性は阻害される。

2. 薬効学−作用機構 集合体或は生物学的薄膜の形をしたリン脂質を加水分解
するには、塩基性ホスホリパーゼA₂をリン脂質と水との
界面に結合させることが必要で、この結合はクロトキシ
ン錯体が解離した後でしか生じない。本発明者らは二重
標識したクロトキシン錯体（I¹²⁵−クロトキシンＢ及び
H³−クロトキシンＡ）を用いて、クロトキシンＢだけが
膜に結合し、一方、クロトキシンＡは、上清中に残存す
ることを示した。本発明者らはジメチルスベリミデイト
と調製した錯体（complex）が、ホスホリパーゼ活性を
依然維持しているというものの、薄膜と結合する能力が
失なわれていることを見出した。

このことから、本発明者らは、クロトキシン錯体中での
クロトキシンＢの触媒部位がモノマー基質に到達でき、
且つ、その機能的な能力をそのまま維持することを証明
した。

しかしながら、単離したクロトキシンＢはリン脂質と水
の界面と確実に相互作用できるのに対して、クロトキシ
ンＡとの錯体はこの界面と相互作用ができないように思
える。

上記のことから、又、その他の結果から、次のような結
論に到達できる。

（ａ） クロトキシンＢとクロトキシンＡとによる錯体
の形成はクロトキシンＢの活性部位の構造と特性には影
響を与えないが、酵素がリン脂質と水との界面に結合す
るのを妨げ、その結果、凝集体又は生物学的薄膜の形を
とる基質の酵素加水分解を阻害する。

（ｂ） クロトキシンＢと凝集された基質の相互作用
は、機能的であり、又、活性部位とは位相的に異なる酵
素の表面における特定領域の露出によって異なる。その
ような露出面を有する遊離の酵素のみが界面に結合して
薄膜のリン脂質を加水分解するとともに「界面の活性
化」として知られる現象を呈することができる。

（ｃ） 酵素表面のこの特定領域は、クロトキシンＡに
よる錯体の形成によって生ずる領域である。このこと
は、界面を有するクロトキシンＢとクロトキシンＡとの
相互作用が互いに排他的、つまり、クロトキシンＡによ
る錯体の形成は酵素と薄膜との相互作用を阻害し、又、
クロトキシンＢと薄膜との相互作用はクロトキシンＡに
よる錯体の形成を阻害するということを意味する。

クロトキシン錯体の細胞病理学的効果、即ち、エールリ
ッヒ腹水腫瘍細胞に対する効果の観察は思いがけないも
のであったが、10^-9Mの範囲の濃度の錯体を用いると、
開始から60分で培養物の溶解が生じることが確認され
た。しかしながら、肝細胞、繊維芽細胞増殖、及び、腹
膜培養細胞に対するその細胞病理学的作用は僅かしかな
い。

作用機構に関する事項については、以下の観察が重要で
ある。

（ａ） クロトキシンは、腫瘍及び正常の細胞に対して
も細胞毒性作用を示すクロトキシン錯体の唯一の成分で
ある。両方の場合に、単離したクロトキシンＢの添加に
より、細胞損傷の証拠が得られた。

（ｂ） 細胞毒性作用は、クロトキシンＢの酵素活性と
関連がある。ｐ−ブロモフェナシルブロミド（カンチア
ーニ他（Canziani et al.）1982）を用いて治療を行な
うことによる活性部位の選択的ブロッキングが細胞毒性
活性を失わせる。観察された明確な変化は、酵素が細胞
膜に結合することに関連があるように思われる。しかし
ながら、この変化は、明らかに、細胞の溶解を引き起こ
すには不充分である。

（ｃ） しかしながら、クロトキシン錯体は腫瘍細胞に
対してより選択的な細胞毒性作用を呈する。

（ｄ） 本出願人らの研究によれば、クロトキシン錯体
は腫瘍細胞膜同志を結合することができるので、該クロ
トキシン錯体の作用のために限定的な工程はサブユニッ
トＡ及びＢを解離させることである。該クロトキシン錯
体のこのような異なった作用に関する説明は、該錯体の
解離を促進させる腫瘍細胞膜のレベルに局部的な物理化
学的条件が存在するということにある。腫瘍細胞内で優
勢なこの条件は、正常な細胞の近くで、クロトキシン錯
体の顕著な解離を生じさせるのには充分でない。

（ｅ） 腫瘍細胞の原形質膜が変化することは1958年以
来知られており、発癌性物質が原形質膜のもつ機能の多
くを変化させ、その結果、細胞膜に見られる多形態性の
変化を創り出すことを示唆する充分な証拠がある。1967
年にストッカー（Stocker）は、付着性の変化と接触阻
害の欠如について述べたが、これらのことは悪性腫瘍に
おける不変の性質ではないように思われる（ワラック
（wallach）1973）。類似の現象が電気的分離（electri
c uncoupling）においても発生する（wallch,1973）。
腫瘍細胞において余り顕著ではない接触成長阻害（スト
ッカー（Stocker）,1967）及び紡錘糸形成能力（fusoge
nic capacity）（オカダ（Okada）,1969;ポスト（Post
e）,1970）が大きくなるのと平行して悪性度が高くなる
ように思われる。新生物（腫瘍）細胞の表面潜在能力の
変化を観察した（wallach,1973）。同じく浸透性（シル
ベン、他（Sylven et al.）,1962）及び免疫の変化をも
観察した。新しい抗原や胚芽抗原の出現、及び臓器中で
の或る選択的抗原の欠失が数多くの実験的腫瘍及び自然
の腫瘍に観察された。クロトキシン錯体の解離は、クロ
トキシンＡの各種カルボン酸塩を共同的に滴定すること
により促進することができる。該クロトキシン錯体を解
離させるためには約４のpH値が必要であるが、これら諸
結果は等量で得られるものであることを銘記しておかな
ければならない。細胞内での優勢な条件は静止状態であ
る。従って、等量で計算した解離度は、特に、拡散バリ
ヤーで制約された容積内で勾配が生ずると、可成り修正
されることになる。

（ｆ） 腫瘍細胞の原形質膜付近においてクロトキシン
錯体が解離すると、クロトキシンＢが原形質膜に結合し
て、該膜を構成するリン脂質が加水分解するという結果
を生ずる。ホスホリパーゼA₂による加水分解生成物、特
に、リソホスファチド（前掲の構造式II）は洗浄作用を
有する（この点に関して、リソ誘導体という名称はこの
物質の細胞溶解性能に由来する）。熱力学及び幾何学的
理由から、前記生成物を安定した薄層構造で束ねること
が妨げられる。モデル系（リポソーム）において、リソ
誘導体（リン脂質100ミリモルにつき１乃至３ミリモ
ル）を添加すると、例えば、浸透性における著しい乱れ
を生じさせ、又、蔗糖とカプセル化した陽イオン（通
常、不浸透性）の放出及びリソ誘導体の高い濃度が薄層
構造の破壊とミセル状凝集体の形成を決定する。細胞膜
を形成するリン脂質が長鎖脂肪酸（炭素数16乃至24）を
含むことを念頭に置けば、加水分解生成物（前掲の構造
式II及びIII）は必ずしも該薄膜を放棄せず、又、これ
らの生成物の相対濃度の増加は変化をもたらして、細胞
原形質をマーキングする酵素の培地内への放出及び、形
態的変化（ミトコンドリアと細胞原形質の網状組織の膨
張と破壊）を生じさせて、細胞の溶解に導く。

現在の所、上述の変化が酵素の内在性（internalizatio
n）から生ずるものか、或は、組成物内の急激な変化及
び浸透性の変化によるイオン力から生ずるものかは不明
である。

結論 腫瘍細胞の溶解を生ずる機構はクロトキシンＢの酵素活
性の結果であると説明することができる。しかしなが
ら、更に興味を呼び起こす点はクロトキシン錯体の攻撃
目標（ターゲット）選定機構である。クロトキシン錯体
が不活性クロトキシンＢの循環析出物として作用し、ク
ロトキシン錯体の解離を促進する物理化学的条件を有す
る細胞膜に対してのみその活性を現わす。このようにし
て、これらの細胞はクロトキシンＢにより攻撃を受ける
ものと考えられる。このような状況により、腫瘍細胞は
クロトキシンＢと結合するためのより有効な代替ターゲ
ットとなる。

更に、ホルファチジルイノシトールが酵素により攻撃さ
れやすいリン脂質に属するものであることを重要事項と
して指摘することができる。現在、細胞増殖を誘発する
決定的な信号は、細胞膜ホスホリパーゼＣによるトリホ
スホイノシチドの加水分解である。加水分解生成物はイ
ノシトール−トリ−ホルフェイトで、この化合物は第二
のメッセンジャーとして、又、蛋白質のホスホリル化で
触媒として作用する蛋白質キナーゼＣを活性化する役目
をもつジグリセリドとして作用することができる。ホス
ファチジルイノシトールに作用する場合、ホスホリパー
ゼA₂の加水分解生成物は、対応する溶解誘導体（lysode
rivative）であり、この物質は細胞膜内で生成するホス
ホリパーゼＣにとって適切な基質とはならず、それゆ
え、細胞増殖機構の妨げとなる。

ナショナル・キャンサー・インスチチュート（National
Cancer Institute（NCI）,U.S.A）の定式化した実験計
画案に従って、抗腫瘍活性を評価するために、ハツカネ
ズミの黒色腫瘍B16、結腸腫瘍26、リッジウェイ骨肉
腫、及び、ルイス癌腫を用いた。これら全ての場合、未
処理制御と比較した活性を示すために、20％を超える平
均生存期間の増加、及び／又は、50％以上の局部成長の
抑制を必要とした。この要件は、後程わかるように、こ
の毒素（トキシン）の作用に対してハツカネズミが独特
の感応性を有するので、通常必要とされる要件（25％を
超える平均生存時間、60％を超える成長抑制）よりも幾
分低いものである。

平均生存時間は、黒色腫B16を使用して90日経過後、55
乃至80％の生存検体が150％乃至300％の増加を示した。
また、結腸腫瘍26については、60乃至80％の生存検体が
約200％の増加、更に、骨肉腫およびルイス癌腫につい
ては、170乃至200％の増加を示した。

クロトキシン錯体を４日置きに筋肉注射で投与した。結
果は疾病の段階により異なった。腫瘍の移植直後に治療
を施した動物体は病状が進んでから治療を施した動物体
に比べてはるかに良好な反応を示した。

3. 薬物動態学 I¹²⁵で標識したクロトキシンＢを用いて、薬物動態の検
討を行った。或る場合には、無水酢酸と反応させること
により、クロトキシンＡのH³又はC¹⁴を用いて該錯体を
二重標識した。

吸収 経口投与は効果がないことがわかった。I¹²⁵でクロトキ
シンＢに標識を施し、クロトキシンＡで錯体を形成した
のち、該鎖体をスフィンゴミエリン・リポソームでカプ
セル化して投与した。このような状況下で、基質中のク
ロトキシンの測定可能なレベルは、経口投与後に検出で
きたが、吸収量は著しく変化した。従って、経口投与は
取りやめた。

ハツカネズミとウサギに静脈注射による投与を行なった
のち原形質（プラズマ）の濃度は急激に減少し、約30分
以内で最初の量の２％に達した。約30％は尿中で回収さ
れた。

筋肉注射による投与の後、原形質の濃度は注射後約30分
でピークに達したことが観察された。１時間以内で、原
形質の濃度は最初の量の約10％にまで減少し、その痕跡
のみが尿中で検出された。

標識されたクロトキシンＢは、主として肝臓に集中し
（ハバーマン（Habermann）,1972;フレンケル−コンラ
ート他（Fraenkel−Conrat et al）,1976）、肝臓内で
分解された、アミノ酸のプールへと移動する。投与後６
乃至８時間経過すると、導入した標識は、ほぼ完全に消
失する。

ハバーマン（Habermann）他の研究（1972）の結果によ
れば、クロトキシンＢ或はクロトキシンＡとの錯大は、
静脈注射により投与を行なったハツカネズミの大脳又は
脊髄で測定可能な標識の量が無視し得る程度のものであ
るので、脳−血液関門を通過しない。ハバーマン（Habe
rmann）及びロード（Raude）は大脳室にクロトキシン注
射をすると発作を起こすことを明らかにした。

上記のデータはクロトキシンが広範に分布することを示
唆するが、その半減期は短かく、又、持続性のある組織
集中も現れない。

生物体が該錯体を代謝作用で分解する速度が早いため、
標識を施したクロトキシン錯体（I¹²⁵−クロトキシン
Ｂ）をアルビカン種ハツカネズミに多量投与して、その
分布を調べた。220μｇのクロトキシン錯体を静脈注射
により投与してから30乃至60分経過後、２グループの動
物を犠牲にして、異なる器官及び組織における濃度又は
標識を調べた。濃度はフェントモル（10^-12モル）で表
わす。

生体内変換 生体内変換は肝臓内で主に起こる。

排泄及び最終代謝産物 生体内変換生成物はアミノ酸であり、生物体によって用
いられる代謝プールに入る。

細胞培養に関する研究 腫瘍細胞の溶解を生ずる機構は、クロトキシンＢの酵素
活性の結果として説明できる。しかしながら、最も興味
ある点はクロトキシン錯体によるターゲット選択機構
（悪性細胞）である。

該クロトキシン錯体は不活性クロトキシンＢの循環析出
物として作用し、明確に規定された物理化学的状況を有
する細胞に対してのみ活性を現わし、この活性がクロト
キシン錯体の解離を生ずるとともに、クロトキシンＢの
攻撃に曝露される細胞を生ずるものと考えられる。この
ような状況下で、新生組織細胞はクロトキシンＢを捕獲
するためのより有効な代替「ターゲット」となる。

クロトキシン錯体の細胞毒性作用を、ヒト腫瘍細胞系
（lines）Hs578T（ATCC HTB 126）乳癌、SK−LU−１（A
TCC HTB 57）肺腺癌及びＵ−87MG（ATCC HTB 14）膠芽
腫により試験した。

細胞をダルベッコモデイファイドイーグル培地（DMEM）
及び、10％のウシ胎児血清を添加したハム栄養培地F12
（DMEM:F12）の１対１の混合物１ミリリットル中ウエル
（well）当り約５×10⁴個の細胞を用いて、24穴の培養
皿に播き（plated）、37℃で空気中５％のCO₂を含み、9
0％以下の湿度で培養した。培養物の様子は、位相差顕
微鏡（phase−contrast microscope）を用いて定期的に
監視した。

細胞を播いてから１日後、細胞のクロトキシンは、10％
FBSを含むDMEM:F12に溶解し、適当な量を培養物に足し
て１つのウエル当り2.0ミリリットルの総量とした。

処理の１日後及び３日後に、細胞を顕微鏡で観察した。

３日間の培養後、培層物中に残っている細胞の数を測定
するため、培養液を吸引し、ウエルを等張食塩水溶液で
すすぎ、細胞をトリプシン−EDTA（ウエル当り0.5ミリ
リットル）ではがした。トリプシンを10％のFBSを含む
0.5ミリリットルのDMEM:F12で中和し、各ウエルの全量
を9.0ミリリットルの等張食塩水溶液に加え、コルター
係数器（Coulter counter）で、計数した。

全ての腫瘍細胞系は、クロトキシンの細胞毒性作用に感
受性があった。細胞系SK−LU−１及びHs57 8Tでは、見
かけのIC₅₀値は、約４マイクログラム／ミリリットルで
あったが、9.5マイクログラム／ミリリットル以上の濃
度のクロトキシンで処理されたウエルは、実験の終りに
おいて、主として細胞の破片を含んでいた。中間の濃度
のクロトキシンで処理した細胞の多くは、死んだようだ
った。このように、細胞毒性は相対的な細胞数に基づい
て明らかにされるものよりおそらく強かった。Ｕ−87MG
細胞は、より高いクロトキシン濃度、見かけのIC₅₀値が
9.5マイクロミリグラム／ミリリットルを要求し、クロ
トキシン濃度16.9マイクログラム／ミリリットル以上で
処理された細胞は死んだように見えた。

逆に、正常ヒトケラチン細胞（Keratinocytes）の培養
物は、クロトキシンの細胞毒性作用には感受性は、より
低かった。血清を含まないKGMTM培地（カリフォルニア
州サンディエゴ所在のクロネチクス・コーポレーション
製のケラチン細胞生長培地）中に維持されている培養物
（NHEK−47）は、クロトキシン濃度2.3〜12.7マイクロ
グラム／ミリリットルで処理後の細胞数においても実質
的差は見られなかった。見かけの破壊は、未処理の細胞
培養物に著しい変化は与えない。更に、最も低い濃度で
処理したときの毒性効果は、顕微鏡では明らかではなか
った。しかし、顕微鏡による観察及び細胞の計数は、と
もに、17〜30マイクログラム／ミリリットル、見かけの
IC₅₀値が20〜30マイクログラム／ミリリットルのクロト
キシン濃度で処理した後には、細胞はほとんど存在しな
かった。

従って、クロトキシンは、比較的低い濃度（２〜12マイ
クログラム／ミリリットル）で、これらのヒト腫瘍細胞
に対して毒性があり、正常ヒト表皮ケラチン細胞（epid
ermal keratinocytes）より、腫瘍細胞に毒性が強いよ
うに見える。13マイクログラム／ミリリットルの単一の
クロトキシン濃度は、SK−LU−１及びHs57 8T細胞の培
養物中全ての細胞を、Ｕ−87 MG細胞の培養物中85％の
細胞を、そして、正常ヒトケラチン細胞の培養物中わず
か11〜16％の細胞を死滅させる。

クロトキシン錯体の細胞毒性作用を、スルホローダミン
Ｂによる蛋白質／バイオマス系に基づくミクロ培養アッ
セイを用いるいくつかのヒト腫瘍細胞系列のパネル（pa
nel）に関するナショナル・キャンサー・インスティテ
ュート・ディベロップメンタル・セラピューティクス・
プログラム（National Cancer Institute Developmenta
l Therapeutics Program）による試験管内で（in vtr
o）試験した。

〔腫瘍細胞系〕の結果及びそれと異なる細胞系に対する
マイクログラム／ミリリットルによる対応するTGI（〜I
G₅₀）値を以下に示した。

（ａ） 白血病 〔CCRF−CEM,HL−60（TB）,K−562〕＝5.3＋／−0.5 〔MOLT−４〕＝35.0 （ｂ） 非小細胞（Non−Small Cell）肺癌 〔EKVX,H0P−18,HOP−62〕＝3.2＋／−0.1 〔NCI−H 460,NCI−H 522,NCI−H 23,HOP−92〕 ＝5.3＋／−0.6 〔NCI−H 322,A 549〕＝14.9＋／−0.8 （ｃ） 小細胞（Small Cell）肺癌 〔DMB−273,DMB−144〕＝4.8＋／−0.3 （ｄ） 結腸癌 〔COLO 205〕＝18.7 〔DLD−1,HCT−15,SW−620,HCT−115,KM12〕 ＝27.2＋／−2.9 〔HCC−2998,HT−29,KM20 L2〕＝51.0＋／−5.0 （ｅ） シーエヌエス（CNS）癌 〔XF−498〕＝1.2 〔SF−268,SNB−75,U−251,SNB−78,SF−295〕 ＝4.7＋／−0.9 〔SNB−19,SF−539〕＝8.3＋／−0.6 （ｆ） 黒色腫 〔MALME−3M,SK−MEL−５〕＝3.2＋／−0.6 〔SK−MEL−28,M−19−MEL,UACC−62,UACC−257〕 ＝5.0＋／−0.5 〔SK−MEL−2,LOXI MVI〕＝6.6＋／−0.5 （ｇ） 卵巣癌 〔IGROVl,OVCAR−8,OVCAR−3,SK−OV−3,OVCAR−４〕 ＝6.4＋／−1.1 〔OVCAR−５〕＝38.5 （ｈ） 腎臓癌 〔RXF−393L〕＝3.8 〔SN 12C,CAKI−1,UO−31〕＝5.8＋／−0.6 〔A 498〕＝8.39 上記の結果は、クロトキシンは異なった腫瘍細胞系に関
して顕著な選択性は示さないが、用いた細胞系によって
応答が異なることを示している。

このように、結腸癌系が、クロトキシンに対して最も抵
抗性があるように見える。

試験した白血病系の間では、その選択性は、３種の系統
で同様であるが、そのうちの１系統（MOLT−４）は、結
腸癌系統と同程度に抵抗性があるように見える。

CNS癌の６つの系統（SNB−19及びSF−539以外）、黒色
腫の６つの系統（SK−MEL−２及びLOX IMVI以外）及び
小細胞肺癌の２つの系統は、IC₅₀の見地からより感受性
が高いように見える。試験した非小細胞肺癌系では、3.
2マイクログラム／ミリリットル〔EKVX,HOP−18,HOP−6
2〕から14.9マイクログラム／ミリリットル〔NCI−H 32
2,A 549〕のIC₅₀値と伴に、その感受性が変化する。中
間の感受性は、卵巣及び腎臓癌の系統で見られた。

ナジヤ ナジヤ アトラ毒液から得られる心臓毒素（カ
ルジオトキシン）を、クロトキシン：カルジオトキシン
＝1:3のモル比で添加すると、試験した腫瘍細胞系のほ
とんどに対して様々な程度に細胞毒性を増加させた。

〔腫瘍細胞系〕、マイクログラム／ミリリットルでのTG
I（〜IG₅₀）及び（クロトキシンに関するｎ倍減少）の
結果を下記に示す。

（ａ） 白血病 〔HL−60（TB）〕＝0.72（７倍） 〔Ｋ−562,CCRF−CEM〕＝1.97＋／−0.2（2.7倍） 〔MOLT−４〕＝5.73（6.1倍） （ｂ） 非小細胞肺癌 〔EKVX,HOP−18,HOP−62,NCI−H 460,NCI−H 522〕 ＝0.69＋／−0.16（５〜７倍） 〔HOP−92〕＝2.36（２倍） 〔NCI−H 322,A 549〕＝4.2＋／−0.2（３倍） （ｃ） 小細胞肺癌 〔DMB 114〕＝2.92（1.6倍） 〔DMB 273〕＝0.55（９倍） （ｄ） 結腸癌 〔COLO 205,DLD−1,HCT−15,HCT−115,KM 12, HCC−2998,SW 620〕＝4.75＋／−1.2（６倍） 〔HT−29,KM20 L2〕＝19.4（３倍） （ｅ） シーエヌエス（CNS）癌 〔SF−539,SF−268,SNB−75,XF 498,U 251〕 ＝0.48＋／−0.88（10倍） 〔SNB−78〕＝1.1（４倍） 〔SF−295〕＝2.09（２倍） 〔SNB−19〕＝8.4（増強なし） （ｆ） 黒色腫 〔MALME−3M,SK−MEL−28,SK−MEL−5,UACC−257, UACC−62〕＝0.51＋／−0.02（10倍） 〔LOXIMVI,M−19−MEL〕＝1.74＋／−0.12（４倍） （ｇ） 卵巣癌 〔IGROV 1〕＝1.92（３倍） 〔OVCAR−8,OVCAR−3,OVCAR−４〕 ＝2.6＋／−1.5（2.5倍） 〔OVCAR−5,SK−OV−３〕＝4.78＋／−0.09（８倍） （ｈ） 腎臓癌 〔CAKI−1,RXF−393L〕＝0.8＋／−0.1（５〜７倍） 〔SN 12C,UO−31〕＝3.5＋／−0.2（1.6倍） 〔A 498〕＝5.38（1.5倍） 実験結果によって示されるように、クロトキシン−カル
ジオトキシン混合物は、本研究で用いた腫瘍細胞系のい
くつかに対し、細胞毒性を増強させる。

混合物は、特にCNS癌の５種の細胞系及び黒腫瘍の５種
の細胞系に対してより強力な細胞毒性作用を示す。IC₅₀
がクロトキシン単独で測定される場合より10倍低い。

CNS癌の他の系統に関してはクロトキシン−カルジオト
キシン混合物に対してより感受性の低い細胞系統である
SNB−19もまた、クロトキシンに対してより感受性が低
かった。SF−539系統（クロトキシンに対してより感受
性が低い）は、クロトキシン−カルジオトキシンに対し
て最も感受性の高いものの１つであり、IC₅₀が、２倍し
か減少しない。

同様のことが、黒色腫にいくつかの系統で観察される。
クロトキシンに対して感受性の低いSK−MEL−２及びLOX
IMVI系統は、クロトキシン−カルジオトキシンに対し感
受性が低いが、クロトキシンに対し、かなり感受性のＭ
−19−MEL系統は、IC₅₀が３倍しか低下せず、混合物に
対し感受性がより低いうちの１つである。白血病の群で
は、IC₅₀値の減少は、異なる系統で７倍（HL−60（T
B））から３倍（Ｋ−562,CCRF−CEM）で変動し、クロト
キシンに対して感受性が低いのは（MOLT−４）、また、
IC₅₀値の減少が６倍であるにもかかわらず、クロトキシ
ン−カルジオトキシンに対しても感受性が低い。

非小細胞肺癌の群では、IC₅₀値は、５種の細胞系でのク
ロトキシンのIC₅₀値に比べて５〜８倍の中程度の減少し
かない。クロトキシンに対しかなり感受性のあるNCI−H
23及びHOP−92系統は、クロトキシン−カルジオトキシ
ンそれぞれの1.2倍及び２倍しかIC₅₀値の減少を示さな
い。結局、クロトキシンに対し感受性が低いNCI−H 322
及びA 549系統は、IC₅₀値が４倍減少するにもかかわら
ずクロトキシン−カルジオトキシンに対し感受性が低
い。

小細胞肺癌の群では、DMS 114系統は、クロトキシン及
びクロトキシン−カルジオトキシンに対しほぼ同様の感
受性を示すが、DMS 273,（DMS 114の同等のクロトキシ
ンに対する感受性を持っている）は、クロトキシン−カ
ルジオトキシンでほぼ９倍のIC₅₀値の減少を示す。

結腸癌の群では、７種の細胞系統でのクロトキシン単独
のIC₅₀値に比べて６倍もIC₅₀値の減少がある。クロトキ
シンに対しより感受性の低いものの１つであり、クロト
キシン−カルジオトキシンのおよそ10倍のIC₅₀値の減少
を示すHCC 2998系統で特に明らかである。クロトキシン
に対して感受性の低いHT−29及びKM20L2系統も、クロト
キシン−カルジオトキシンに対し、2.5倍のみのIC₅₀値
の減少で、感受性が低い。

卵巣癌の群では、５つの細胞系統で1.5〜2.5倍でIC₅₀値
のわずかな減少しかなく、クロトキシン単独で得られる
値に比べてOVCAR−５系統で８倍の減少である。腎臓癌
の群では、CAKI−１及びRXF−3993L系統で５〜７倍のIC
₅₀値の著しい減少があり、SN12C,UO−31及びA 498系統
で、1.5〜1.6倍のわずかな減少がある。

動物での研究 ナショナル・キャンサー・インスティテュート（N.C.I.
−U.S.A.）の通常の実験計画書に従い、腫瘍メラノーマ
B16、結腸腫瘍26及びリッジウェイの骨肉腫を用い、ク
ロトキシン錯体の抗腫瘍活性を評価した。これらの研究
は、クロトキシン錯体の内在的な神経毒性に対するマウ
スの極度に高い感受性の問題を提起した。従って、この
場合、20％以上の平均生存時間における増加及び／又は
50％以上の局部成長の阻害を要求し、非処理対照群と比
べて高い抗腫瘍活性を示す。

マウスに、腫瘍を移植後４日毎に30〜40ナノグラム／グ
ラム体重で皮下注射を行い、この処理を90日間続けた。

メラノーマB16では、50〜200％の平均生存時間の増加が
あり、90日後に55〜80％が生存した。

結腸腫瘍26では、80〜100％の平均生存時間の増加があ
り、90日後に60〜80％が生存した。

リッジウェイの骨肉腫では70〜100％の平均生存時間の
増加があった。

高い死亡率（動物の20〜45％）は、マウスに関しては、
クロトキシンの高い神経毒性の結果であった。しかし、
この高い感受性は種の特異なものであり、一般的な現象
ではない。事実、ラットは、静脈内投与で100マイクロ
グラム／グラム体重で容易に耐えられるし、皮下投与で
は600マイクログラム／グラム体重ほど多くても耐えら
れる。

クロトキシンのより少い用量（＜10ナノグラム／グラム
体重）、即ち10日及び11日毎の10〜20ナノグラム／グラ
ム体重の腹腔内投与（たとえば10日及び11,20及び21日
等に）は、平均生存時間（10〜20％）の著しい増加は起
こらなかった。

もう１つの一連の実験を、クロトキシンを毎日、腹腔内
（i.p.）又は筋肉内（i.m.）に投与することによるネズ
ミ又はヒトの異なるタイプの腫瘍に対するクロトキシン
の抗腫瘍活性を評価するため行った。

（１） ネズミ赤血白血病 ７×10⁶個細胞／ミリリットルの密度でハンクス平均化
食塩溶液（Hanks balanced salt solution）中に懸濁さ
れたネズミ赤血白血病細胞（クロン（clone）DS−19）
をマウス（雄、20−23グラム）２匹当り30DBAになるよ
うに右うしろ足近くに皮下注射した（0.1ミリリットル
又は、およそ７×10⁶個細胞）（第０日）。４日目に、
動物を３つの群即ち、対照群、低用量摂取処理群及び高
用量摂取処理群に無作為抽出をし、そして処理を開始し
た。クロトキシンを腹部の左側の低い部に0.5M NaCl0.5
〜0.7ミリリットルの容量で腹腔内投与した。

処理を毎日行い、実験の全期間（30日）にわたり、段々
に用量を増加した。

低用量摂取群の動物に対しては、４日目に0.0195ミリグ
ラム／キログラムで処理を開始し、段々に0.75ミリグラ
ム／キログラムに増加した。

高用量摂取群の動物に対しては、４日目に0.065ミリグ
ラム／キログラムで処理を開始し、段々に1.56ミリグラ
ム／キログラムに増加した。

対照群は、同じ容量の殺菌した0.15M NaClを注射した。

体重を毎日記録し、腫瘍容積を２〜３日おきに、バーニ
アー・キャリパー（Vernier caliper）によって測定し
た。動物が死亡又は犠牲にしたとき、腫瘍を細かく切り
分け、重さを測り、そして組織学的試験のため臓器とと
もに固定した。

対照群のマウスの50％が23日で死亡し、残りの全ては30
日で死亡した。腫瘍は、すぐに増殖し、８〜12グラムに
達し、マウスの全体重の約60％にもなった。それらは多
量の有系分裂細胞（170/10HPF）を有する高度に植皮性
の（anaplastic）細胞から成り、筋肉及び骨に浸潤（in
filtrating）していた。脾臓は、シート状に腫瘍の浸潤
している多くの部分が見られた。

低用量摂取処理されたマウスでは、４匹だけが８〜10グ
ラムの腫瘍のかたまりが生成した。顕微鏡的に、腫瘍は
筋肉に浸潤することなく、結合組織に囲まれているよう
だった。有系分裂は、ほとんどなく（約59/10PHF）、脾
臓では、散在した高度に拡大した腫瘍細胞の小さな群が
見られた。腫瘍細胞の減少率（％）は、８日目で54％、
11日目で68％、15日目で53％、18〜23日目で48％であっ
た。

高用量摂取処理されたマウスの３匹だけで、腫瘍が1.0
グラム以上となり、全ての動物で観察の全期間中対照群
と比べて75〜82％の間の減少があった。１匹は、完全な
軽快（full remission）を示し、それは、処理せずに更
に60日間維持され、その後犠牲にされた。腫瘍の組織学
的証拠は見られなかった。

（２） MET−Ａ MET−Ａ細胞（１×10⁵個）を24匹のB6マウスに腹腔内注
射をし、１日目にその動物を無作為抽出し、２つの群、
即ち、対照群と処理群に分けた。

0.5M NaCl中のクロトキシンを実験の全期間（30日）中
に単独の高用量摂取により投与した。

処理は１日目に開始し、１日目から９日目までは0.16ミ
リグラム／キログラムで腹腔内投与（i.p.）、0.16ミリ
グラム／キログラムで腹腔内投与（i.m.）で、10日目か
ら30日目までは、0.32ミリグラム／キログラムで筋肉内
投与を行った。

対照群は、同容量の0.15M NaClの注射をした。

体重を３日毎に記録した。

対照群のマウスの50％が18日目に死亡し、残りの対照群
のマウスの全部が25日目に死亡した。剖検により、典型
的な腹水腫瘍の進展が示された。

処理を受けたマウスのうち１匹だけが７日目に死亡した
が、死亡の原因は不明である。残りの11匹のマウスの処
理は、30日目まで続けられ、それらは、更に、45日間観
察を続けた。腫瘍の進展の所見は観察されなかったが、
それらを犠牲にした。病理学的報告は、否定的だった。
従って、高用量レベルでのクロトキシンによる処理は、
腫瘍の完全な軽快をもたらした。処理されたマウスにお
いて、毒性の所見は観察されなかった。

（３） MX−１ヒト移植乳癌（Humam Mammary Carcinom
a Xenograft） MX−１ヒト乳癌を無胸腺症の雌のヌードマウス（スイス
Nu/Nu）で育てた。それを切り取り、およそ30.0ミリグ
ラムの小片に切った。その小片を０日目に24匹のスイス
Nu/Nu雌マウスの鼠径部中に穿刺により腋部の皮下に移
植した。腫瘍がおよそ100ミリグラムに成長したとき（1
0日）、動物を無作為に抽出して12匹の群に分け、処理
を開始した。

クロトキシンを実験の全期間中（34日）毎日、0.5M NaC
lで筋肉内注射により投与し、次のように段々に用量を
増加した。

10〜12日目 0.04ミリグラム／キログラム 13〜15日目 0.08ミリグラム／キログラム 16〜18日目 0.125ミリグラム／キログラム 19〜21日目 0.32ミリグラム／キログラム 22〜24日目 0.48ミリグラム／キログラム 25〜34日目 0.8ミリグラム／キログラム 対照群の動物には、同容量の殺菌した0.15M NaClで筋肉
内注射した。体重を処理の期間中毎日記録した。

腫瘍の容積をバーニアー・キャリパーで、週に２回測定
した。一度測定し（長さ×広さ）、腫瘍の容積を式（長
さ×広さ^２×0.5）により計算した。腫瘍成長阻止率（T
umor growth inhibition）を、それぞれの群の最初の容
積に対する実験中の腫瘍容積における変化を決定するこ
とにより評価し、つづいて、処理群／対照群の比率を計
算した。

処理された動物中の腫瘍は、穏やかな効果から完全な退
行（３例）の応答の幅を示し、クロトキシンによる処理
は、対照群のマウス中の腫瘍に対して腫瘍成長が80％ま
で低下した。実験中に２匹が死亡したが、両方とも明ら
かに処理とは関係なかった。

臨床研究 下記のケース・ヒストリー（case histories）は、本発
明の化合物の臨床効果を具体的に示す、進行段階の癌患
者の群の代表例である。

実施例１ 左乳腺腫瘍の乳房切除術を、1986年４月１日に受けた51
才の女性。病理学所見は、転移を示す９つのリンパ節を
もつ湿潤した管状癌であった。1986年４月から８月ま
で、彼女は化学療法剤（エンドキサン、５−FU,メソト
レキセート）及びタモキシフェン（Tamoxiphen）による
治療を受けた。肝シンチレーショングラフ（1986年９月
３日）は、不規則な境界（limits）を持つ放射性同位体
の吸収の減少した１ケ所の部分と、右葉と同様の性質を
もついくつかの部位をもつ左葉の損失（expense）が、
主に高い増加を示す。高シンチレーショングラフ（1986
年９月20日）は、上部第三右上腕骨（the upper third
of the right humerus）、L4及びL5腰椎、右腸骨櫛及び
右大腿骨の大転子における放射性同位体の増加した吸収
のいくつかの焦点（focus）を示す。

彼女は、1986年の11月に、クロトキシンによる非経口的
治療を開始し、1987年２月まで続けた。

治療を開始して２週間後、痛みが減少し、患者は、通常
の活発性（activity）をとりもどした。骨シンチレーシ
ョングラフ（1978年１月５日）は、正常の所見だった。
肝シンチレーショングラフ（1987年１月９日）は、右葉
のみに、放射性同位体の減少した吸収の部位をもつ広く
散らばったヘパトメガリア（hepatomegalia）を示し
た。残っている乳腺の乳房造影法（1987年２日27日）
は、わずかなジストロフィーを示した。患者は、追加の
治療を受けることなく活発な（active）生活を続け、定
期的に様子を見るため通院した。骨シンチレーショング
ラフ（1988年６月７日、1989年５月３日）は、正常だっ
た。肝シンチレーショングラフ（1988年７月７日、1989
年５月15日）は、臓器は均一に大きくなっているが、放
射性同位体は均一に分布していた。

実施例２ CATスキャン（1985年２月）によれば、不規則な境界を
もつ直径８センチメートルで、膵臓の上部峡部位から成
り、内臓周囲及び血管周囲の境界の損失（loss）を示す
腔（antrum）−幽門−十二指腸領域を前及び外に位置を
変えた（displacing forward and outward）、腹部腫瘍
塊をもつ46才の女性。更に、別の後腹膜結節像もあっ
た。エコグラフィーによる研究（1985年８日）は、不規
則な境界及び、置き変えられた（displacing）大きな脈
管（vessels）を持つ峡及び体（body）を持つ膵臓癌
（８×10センチメートル）の所見を示した。試験的な開
腹術（1985年11月22日）では、腹膜後腔及び大きな管
（vessels）に固定された膵臓を含み、結腸間膜に湿潤
し、腸間膜の根部に多数のリンパ腺症をもつ腫瘍が見ら
れた。腫瘍は切り取らなかったが、病理研究用に標本を
取った。その結果は、おそらく膵臓起源の結合識形成性
の未分化の癌であった。線状加速器（linear accelerat
or）による放射線照射（4,000ラド、1986年１月から２
月）後、満足な反応は得られず、患者に従来の治療法で
は、治療の可能性が無いことを告げた。

彼女は1986年５月にクロトキシンによる非経口的治療を
始め、1986年８月まで続けた。

彼女は、治療開始後１ケ月で、活発な生活（active lif
e）を取り戻し、一般的な良い状態にあり、観察のため
定期的に通院した（returned）。新しいCATスキャン（1
987年11月17日）は、明瞭な境界をもたない胃の腔洞の
後部壁に接触しているが、膵臓の残り部分は含まない膵
臓の上部にのみ低密度の部分が見られた。大きな管（ve
ssels）の変位（displacement）は観察されなかった。
患者は、いかなる追加の治療をも受けずに活発な生活を
続けた。

実施例３ 涙嚢腺癌のため、左眼球を摘出した（1982年12月５日）
58才の女性。CATスキャン（1984年５月）は、左眼球孔
の底部に腫瘍の再発を示し、放射線治療を行った（6,00
0ラド、1984年５月15日から７月３日）。1984年11月か
ら1985年３月まで、彼女は化学療法による治療（５−F
U,ドキソルビシン及びシクロホスファミド）を受け、19
85年の５月に、追加のサイクルの化学療法治療を受け、
その時から、他のいかなる治療も受けなかった。1986年
４月に、彼女は眉（intercilliary）部に5.5×3.5セン
チメートルの病巣を呈し、その病巣は堅く、表面部及び
深部の平面（planes）にくっついており、リンパ節中に
転移を伴っていた。右側には、２×３センチメートルの
下顎及び3.5×３センチメートルの耳介前方に、そし
て、左側には、２×２センチメートルの下顎及び耳介部
分の前後に小さいいくつかの転移があった。

彼女は、1986年５月にクロトキシンによる非経口的治療
を始め、1987年１月まで続け、次いで、1987年４月から
10日毎にクロトキシン0.3ミリグラムを病巣内注射し
た。

1986年９月に、主な病巣は、４×３センチメートルであ
った。それは段々に消失し、1987年４月に、それは完全
に軽快した。リンパ腺症は、大きさ及び数も減少し、そ
れらのうちの３つは、完全に消失した。これにより、患
者は美容上の理由により放棄していた社会生活をとり戻
した。患者は、1988年10月まで、どんな追加の治療も受
けなかった。1988年10月に腫瘍が再発したが、リンパ節
のみであった。彼女が、化学療法剤による治療を拒んだ
ので、リンパ節を放射線治療し、ひきつづく２回のCAT
スキャン（1988年10月18日及び1989年６月２日）で示さ
れるように優れた結果をもたらした。1989年７月に出現
した新しいリンパ節転移は、放射線により治療した。骨
シンチレーショングラフ（1989年８月）では、左眼球孔
に放射性同位体のいくらか増加した吸収が見られたが、
それが、腫瘍の再発によるものか否かは明らかではな
く、現在研究中である。患者は良好な一般的状態にあ
り、活発な生活を続けている。

実施例４ 痛みがあり、ベッドに寝ている35才の女性。彼女の右下
肢は曲がっており（flexed）、内部及び外部の閉塞筋
（internal and external obturator muscles）をも
ち、右臀筋極大（maximus）により後に限定されている
（limited at the back）彼女の位部の骨盤の13×10×
８センチメートルの腫瘍のため歩くことができなかっ
た。病理学所見は、球状細胞（round cells）をもつ脂
肪肉腫であった。1986年６月23日に（15日間の間をあけ
て）２連のシスプラチン180ミリグラムでの治療を行っ
た。1986年９月９日に、CATスキャンは、70％の腫瘍の
大きさの増加を示し、骨盤中に成長し、嚢に置き換って
いた。

患者は、1986年９月にクロトキシンによる非経口的治療
を始め、1986年11月まで続けた。

治療開始後１ケ月で、膿瘍の大きさが30％減少し、痛み
が消え、患者は歩けるようになった。次の月で腫瘍はや
わらかくなり、大きさも、更に20％減少した。患者は、
ほとんど普通に歩けるようになり、いくらか体重も増え
た。治療の中止後３ケ月で、患者は制御できない併発感
染（intercurrent infection）により死亡した。

実施例５ 45才の男性は、1986年２月１日に開腹術を受け、診断
は、腹膜後腔の侵入（invasion）を伴う膵臓腺腫であ
る。腫瘍は除去しなかった。何も治療を行わず、鎮痛剤
のみを飲んだ。患者は３ケ月で20キログラム体重が減少
し、痛みがありベットに寝たきりだった。

彼は、1986年４月にクロトキシンによる非経口的治療を
始め、1986年７月まで続けた。

治療を開始後15日で、痛みが消え、鎮痛剤の消費が減少
し、患者は困難を伴わずに歩いた。腹部の痛みがほとん
どなくなったので、彼は、あご骨−顔の外科（maxillar
y−facial surgeyr）に関する専門家として仕事に復帰
し、1986年５月末に、彼は全ての鎮痛剤治療をやめた。
エコグラフによる研究（ecographic study）（1986年９
月）は、正常な大きさの膵臓頭部及び直径18ミリメート
ルの正規の境界をもつ増加したエコゲニシティー（ecog
enicity）を示し、膵臓体は、23×26×30ミリメートル
のハイエコゲニック・マス（hyecogenic mass）を示
し、腹膜後腔にはないことを示した。更に、CATスキャ
ン及び腹洞（celiac trunk）の選択的アーテリオグラフ
ィーによる研究は、腫瘍のかたまりは、その大きさが65
％減少し、腹膜後腔への湿潤が消失したことを示した。
しかしながら、彼は、いくつかの腹部の障害をもち、胃
腸病専門医の助言を受けた。専門医は彼に、内蔵ブロッ
キング（splanchnic blocking）による胃−十二指腸−
膵切除術（gastroduodenopanc−reatectomy）を行うこ
とを提案した。何人かの医師の意見にもかかわらず、外
科手術は９月20日に行われ、その４日後に、術後合併症
のため患者は死亡した。

実施例６ 重要な腹水症を呈し、腹部穿刺（1986年２月14日）によ
り液体2,000ミリリットルを除去した40才の男性。細胞
学的試験の結果は、腹腔中皮腫（peritoneal mesotheli
oma）であった。試験的開腹術を1986年２月15日に行
い、大網膜（major epiploon）、頭頂部及び臓側の腹膜
上に多数の移転があった。病理学所見は、乳頭型（papi
llar type）の中皮腫であった。腫瘍学者は、患者が通
常の状態にない（彼は、体重が18キログラムを減少して
いた）こと及び病気が進行段階にあることを考慮して化
学療法に反対し、テガファーＲ（Tegafur R）及びデル
チゾンＲ（Deltisone R）による苦痛を緩和する処置の
みを施した。

クロトキシンの非経口的治療を1986年４月に開始し、19
86年の６月まで続けた。治療の開始から30日後、腹水症
は顕著に減少し、腹部穿刺はもう必要なかった。1986年
５月中に腹水症は消え、患者は体重が58から78キログラ
ムに増加し（彼の正常の体重は76キログラム）、通常の
生活を取り戻した。彼は、1986年６月中回復を続け、ス
ポーツ（テニス）さえした。７月末に、患者は良好な一
般状態にあったが、腹水症が再び見られた。腹部穿刺
（1986年９月１日）により、1,800ミリリットルの液体
を除去したが、細胞学的試験では、腫瘍細胞は見られな
かった。そこで、腫瘍学者は、化学療法治療を決定し、
患者はシスプラチン（1986年10月23日）の投与を受け
た。その後すぐに、抑制できない胆汁の嘔吐、脱水症及
び体重の減少が現われた。これらの症状にもかかわら
ず、シスプラチンの第二連の投与が、1986年11月18日に
行われた。新たな試験的開腹術を行った（1987年２月３
日）。病理学所見では、悪性組織は見られなかった。患
者は特別な治療を受けずに病院に残り、そして1987年３
月19日に死亡した。

実施例７ 39才の女性は、12×６センチメートルの腫瘍が腹膜下の
骨盤空間を占め、肛門起子（anus elevator）、膣、膀
胱及びオステオマスキュラー・プレイン（osteomuscula
r planes）の背部に固く癒着していたため開腹術を受け
た（1985年10月24日）。腫瘍を除去することができなか
ったので、生検を行い、病理学的所見では、未分化の紡
錘細胞肉腫であった。CATスキャン（1985年12月３日）
では、不明瞭な境界を持ち、膀胱後及び直腸旁の空間を
占める固型の腫瘍であり、膀胱の後側方側は、腫瘍のか
たまりによって圧迫されていた。患者は放射線治療を受
けた（7,000ラド、1985年12月３日から1986年２月10日
まで）。しかし、新しいCATスキャン（1986年３月３
日）は、腫瘍が、膀胱の右前側方壁に向って進行してお
り、上に向って、多数の固型膀胱後の小結節形成があ
り、リンパ腺症と混じった不明瞭な固型像によって腹膜
後の空間が占められている。患者は、著しい表面の静脈
循環をもつ右下肢の浮腫、体温の低下及び右足のチアノ
ーゼ及び筋肉の内部に痛みがある。

クロトキシンにより非経口的治療を1986年５月に開始
し、1986年７月まで続けた。

治療開始から20日後、彼女の右足の痛みはなくなり、浮
腫は著しく減少した。1986年６月に、浮腫は完全に消
え、患者は体重が増え、気分が路くなり、彼女の仕事に
戻った。CATスキャン（1986年７月24日）は、腫瘍のか
たまりは消失し、膀胱の右後側膜で厚さが増加している
のみであり、それは、術後効果であろう。他には何も治
療を行わなかった。患者は、現在のところ良好な臨床状
態で活発に仕事をし、彼女の体重は50キログラム（彼女
の通常の体重は48キログラムであった）であり、観察の
ために定期的に通院した。

実施例８ 永久的な頭痛があり、彼の足では立てず、せきをすると
き及びのみこむときに困難を伴い、右一点に向う斜視が
ある５才の男子。CATスキャン（1986年４月11日）は、
脳幹又は小脳中には病理学的像は示さなかった。心室−
腹膜誘導値（ventricle−pertioneal derivation valu
e）は、インストールし（installed（1986年５月）、そ
して彼は病院に残った。1986年６月１月に、脳アーテリ
オグラフィーは、脳幹で停止（stop）を示し、新しいCA
Tスキャン（1986年６月４月）は、著しい上方天膜閉塞
性水頭症をもつ脳幹の腫瘍（おそらく神経膠腫）を示し
た。病理学的確認はせずに、患者は、放射線治療を受け
（5,00ラド、1986年６月10から６月30日）、彼の一般状
態は、いくらか改善を見せた。２つのひき続いてのCAT
スキャンによる研究（1986年７月30日及び８月８日）
は、橋延髄空洞領域中、特に、ほとんど全てのポンテイ
ン断片（pontine segment）を占める右側に丸い低密度
障害（hypodense lesion）が見られた。第４室は、中心
線に関し変形し、下方に変位し、幹周囲槽（peri trunk
cisternae）は虚脱し、そして凸状の蜘網膜下空間は、
具体的には描けなかった（not visualized）。診断は、
わずかなマス効果（mass effect）を伴う橋延髄空洞領
域の膨張性の損傷であった。1986年９月15日に、患者は
手術を受け生検を行った。病理学的所見は、優勢な星状
細胞の成分（component）を持つ混合神経膠腫（進行度I
II）であった。患者は、四肢麻酔、えん下困難、呼吸困
難、発熱、括約筋の失禁、右眼の一点に向う斜視及びま
ぶたの垂下が残った。彼の体重は16キログラムであり、
食事は鼻−胃カテーテルで取った。1986年10月20日に、
新たなCATスキャンは、中位のマス効果と損傷周囲の浮
腫をもつポンテイン（pontine）中脳領域を占める低
い、不均一な密度の大きな損傷を湿し、横方向への洞の
拡大及び不均整を示し、第三室は、中心線で広がってお
り、第四室はつぶれ、変形していた。基底の槽（basal
cisternae）はつぶれ、凸状のシルビアン槽（silvian c
istern）及び蜘網膜下空間は、具体的に見られなかた
（not visualized）。

クロトキシンによる非経口的治療を1986年11月に始め、
1987年３月まで続けた。

患者は徐々に回復し、治療の45日後には、彼の一般状態
は改善された。発熱、えん下困難、呼吸困難及びまぶた
の垂下はなくなった。右眼の一点に向う斜視はかなり改
善された。彼は自分で全ての手足を動かし、体重が増え
（15キログラム）、歩くこと及び話すことができるよう
になった。新しいCATスキャン（1986年12月13日）は、
研究の間中、大きさが著しく減少している球場隆起帽
（bulboprotuberantial cap）の損傷を示し、脳室排液
法によりコントロールされた水頭症を示した。患者は家
に帰り、家族生活及び社会生活をとり戻した。彼は、体
重が増加し、背が伸び、そして1987年１月には、彼の友
人たちと遊び、スイミングプールで入浴し、自動車に乗
った。1987年２月９日に行ったCATスキャンは、脳室排
液法によりコントロールされた水頭症を示した。腫瘍が
残っているという決定的な証拠はなく、隆起した第四室
の底部の変形が示された。治療の中止後、彼はゆっくり
と、1986年６月の状態に戻っていった。患者は一定の
（regular）一般状態にあったが、四肢麻痺、えん下困
難、呼吸困難及び長く断続的な期間の発熱があった。19
87年４月下旬に行ったCATスキャンは、70％の腫瘍の再
発を報告した。

実施例９ 管肉腫（ductal carcinoma）が左乳腺に湿潤したので19
77年７月に乳房切開術を受け、そして1977年７月から12
月まで5,000ラドの放射線照射を浮けた40才の女性。198
0年に、管理（control）乳房造影法は、彼女の右乳房に
病理学像を報告した。眼窩リンパ節の除去を伴う乳房切
開術が行われ、病理学所見は、転移を示す２つのリンパ
節を有する湿潤した管肉腫であった。彼女は化学療法治
療を浮け（11サイクルのCMF,1980年６月から９月）、２
ケ月毎に観察のため通院した。1986年２月に、頭皮に堅
くて痛みのある隆起が発見された。1986年３月14日に行
ったCATスキャンは、頭蓋冠及び第２腰椎（L II）中の
転移を示し、これは、同じ週に行われた骨シンチレーシ
ョングラフの結果とも一致した。頭蓋冠生検を行い、病
理学所見は、不十分に分化した腺癌による骨及び結合組
織への湿潤であった。その時の臨床試験は４×４センチ
メートルの頭蓋頂骨癌であり、堅く、痛みがあることを
示した。

クロトキシンによる非経口的治療を、1986年４月に始
め、1986年７月まで続けた。

治療の45日後、頭蓋頂骨の損傷の完全な軽快が現われ、
患者は通常の活動性をとり戻した。Ｘ線による研究（19
86年８月５日）は、正常と報告し、CATスキャン（1986
年８月22日）は、頭蓋冠における損傷の進展がないこと
及び第２腰椎（L II）における損傷のカルシウム再沈着
を報告した。1986年10月に、CATスキャンは、脊柱中の
渙散性の損傷はないこと、及び頭蓋冠中の渙散性の損傷
の安定化を示した。1987年３月に行ったCATスキャン
は、骨損傷のカルシウム再沈着を報告し、骨シンチレー
ショングラフは正常と報告した。

調剤は下記の商業化されている技法により行うことがで
きる：通常の添加剤（即ち、生理学的溶液）を含む水性
賦形剤などを用いて調合した液状薬剤；局部鎮痛薬のよ
うな他の薬剤を必要に応じて含む溶液；その他。

本発明の目的並びに利点を以下の実施例において示す
が、これらの実施例で詳述する反応生成物及びその量、
並びに、諸条件及びその他効果の詳細は単なる例示であ
り、本発明の範囲を限定するものではない。

〔調製例〕

Ｉ 粗製錯体の製造 500mgの粗製毒液を5mlの0.2M塩化ナトリウム溶液、1mM
のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、及び20mM,pH
4.0の蟻酸アンモニウムの緩衝液中に懸濁させた。この
溶液を、４℃で冷凍した“Sorvall RC 2−B"遠心分離機
で20分間、10,000gで遠心分離し、黄色がかって僅かに
濁った上澄液を吸引して、出発物質を調製した。

その後の操作は、２℃乃至４℃の冷却室内で行った。

工程1:出発物質を、上昇流に適合させ、且つ、0.1mMエ
チレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含む0.1M,pH4.5の
蟻酸アンモニウム緩衝液と予め平衡にさせた、大きさが
85×2.5cm（417ml）の「Sephadex G−75」カラム（スエ
ーデン、ウプサラ所在のフアルマシア社製）内にアプラ
イした。同一の緩衝液を用いて溶出を行ない、流速0.8
〜1.0ml/cm²/hourで3.0〜3.2mlの留分を集めた。該粗製
錯体をKav値〔Kav＝（Ve・V₀）（V₀−Vt）〕が0.44で溶
出した。

粗製錯体を含む留分を併せ、（ａ）凍結乾燥と（ｂ）ダ
イヤフロー（Diaflo）UM−10メンブラン（アメリカ合衆
国、マサチューセッツ州ブルーミントン所在のAmicon C
o.製）を備えたチェンバー内で窒素圧下で限外濾過を行
なって最終容積が約10mlとなるようにすることにより濃
縮される。

II 粗製錯体からのサブユニットＡ及びＢの分離 工程2:工程１で得た試料を酢酸によりpH3.5に調製し、
寸法が８×2cmで0.1M,pH3.5の蟻酸アンモニウム緩衝液
と予め平衡にさせた「CM−Sephadex C−50」カラム（ス
エーデン、ウプサラ所在のフアルマシア社製）にアプラ
イした。250mlの0.1M,pH3.5の蟻酸アンモニウム緩衝液
を用いて溶出を開始し、サブユニットＡを溶離した。こ
のサブユニットＡは、これらの諸条件では交換体により
保持されない。更に、350mlの0.1〜1.0Mの凹状モル濃度
勾配を有する,pH3.5の蟻酸アンモニウムを用い、最後に
200mlの1.0〜3.0M,pH3.5の直線状勾配を用いて溶出を継
続し、流速34ml/cm²/hourで5mlの留分を集めた。溶出線
図を描き、溶出留分の280nmでの吸収を測定した。この
条件で溶離した蛋白の最終ピークはサブユニットＢに対
応する。

III サブユニットの精製 工程3: サブユニットＡの精製 工程２で最初に溶出したピークに相当する留分はサブユ
ニットＡを含んでいる。この留分を、他のサブユニット
Ａを含む留分と一緒にして、1,000ml（×３回）の10mM
のリン酸カリウム（pH6.9）で透析した。別に、この一
緒にした留分を、Diaflo UM−05メンブラン（アメリカ
合衆国、マサチューセッツ州、ダンバース所在のAmicon
Co.製）上で、且つ、10mMのリン酸カリウム緩衝液（pH
6.9）で平衡にさせ、窒素圧下でsephadex G−25カラム
（スエーデン国ウプサラ所在のPharmacia Ltd製）のク
ロマトグラフにより限外濾過して濃縮した。

試料を、10mMのリン酸カリウム緩衝液（pH6.9）で予め
平衡させた「DEAE−Sephadex A−50」カラム（10×1.5c
m）にアプライし、サブユニットＡを200mlの10mMから1.
0Mのリン酸カリウム緩衝液（pH6.9）の直線状勾配に従
って溶出した。精製したサブユニットＡを含む留分を10
0ml（×３回）の0.15M NaClで透析し、上述と同一条件
の限外濾過によって濃縮した。

回収されたサブユニットＡは37.5mgの蛋白質であった。
上記の条件下で得られたサブユニットＡは、寒天ゲル上
で免疫電気永動によりただ１つの沈澱ラインしか示さな
かった。

工程4:ササブユニットＢの精製 サブユニットＢを含む留分（工程２の最終段階で溶出し
たもの）を一緒にして、得られた試料を凍結乾燥する
か、或は、1,000ml（×２回）の0.1M蟻酸アンモニウム
緩衝液（pH3.5）で透析したのち、工程２で述べたのと
同じ緩衝液で予め平衡にさせた「CM−Sephadex C−50」
カラムでクロマトグラフ処理した（但し、この場合に
は、0.1モル迄の蟻酸アンモニウムの凹状勾配が一旦完
結したあとは、3.0Mの蟻酸アンモニウム（pH3.5）で溶
出を継続し、活性留分を濃縮した）。

精製したサブユニットＢを含む留分を1.000ml（×６
回）の0.15MのNaCl溶液で広範に透析した。回収された
サブユニットＢは75mgの蛋白質であった。上記の条件で
得られ、且つ、ドデシル硫酸ナトリウムを用いてポリア
クリルアミドゲル電気泳動に付されたサブユニットＢ
は、分子量14,500（単量体）及び29,000（二量体）に対
応する移動度をもった２つのバンドを呈した。

精製したサブユニットの殺菌処理： NaCl溶液（0.15M）で精製したサブユニットＡ及びＢの
剤を紫外線チエンバー内で「ミリポア（MILLIPORE）
膜」を通して濾過することにより殺菌処理した。

精製したサブユニットから出発する錯体の再構成： サブユニットＡ及びＢは、10^-10Mオーダーの解離定数を
有する錯体を自然に生成し、この錯体はサブユニットを
混合してから５分以内に完成される。

進行した癌の治療にクロトキシン錯体を使用して得られ
た結果から見て、次のような結論に到達する。

基礎研究の観点から： 細胞毒性作用に関して、クロトキシンの細胞毒性が腫瘍
細胞に優先的に生じることを具体的に示している。

クロトキシン錯体の最終代謝産物はアミノ酸である。

クロトキシン錯体の使用にあたっては、動物にも人間に
も顕著な免疫応答は検出されていない。

抗腫瘍活性の広いスペクトル。

急性、亜急性、或いは、慢性的蓄積症状のいずれにつて
も深刻な毒性効果は観察されなかった。

サイコ／オルガニック依存性は発見されていない。

該錯体は、数回の治療を受けている患者について上述の
臨床経験によれば、他の治療と影響し合うことはない。

反適応症はない。静脈注射を行った実験動物は、急性肝
障害を起こし、死んでしまった場合もあった。薬物動態
学によれば、クロトキシン錯体は、低分子量蛋白（P.
M.）であるので、腎臓細管で吸収され、腎障害を起こ
す。

現在まで、以下のような投与経路が試みられ、有効且つ
安全であることが判明している：筋肉内投与、腫瘍内投
与、腫瘍周辺投与、腔内投与、管（fistular）経由投
与、皮内投与、外科的投与、及び、粘膜内投与。

代謝後、いずれの器官内にも蓄積しない。

高尿酸症、高カルシウム症などのような、腫瘍細胞の溶
解に帰すことができるような効果は観察されていない。

投与は毎日行なってよく、特別の投与技術とか適用手順
といったものは要らない。

投与は巡回条件でも行える。

クロトキシンは輸送用の原形質の蛋白質には結合しな
い。

該薬物の使用による溶血現象又は血液凝固による変質は
観察されていない。

心電図検査における変化又は血行力学上の機能不全は記
録されていない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/18 8318−4Ｈ (72)発明者 ルイス アルベルト コスタ アルゼンチン共和国，1425−ブエノス ア イレス，プリメロ ″セ″，ラス リエラ ス 3894 (72)発明者 カルロス マリア コニ モリーナ アルゼンチン共和国，1137−ブエノス ア イレス，テルセロ ″ア″，サルタ 1436 (56)参考文献 特開 昭57−179120（ＪＰ，Ａ)

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞毒性有効量の細胞毒性薬剤及び製薬的
   な担体から成り、細胞毒性薬剤がクロトキシンＢである
   悪性腫瘍を治療するための製薬的組成物。
2. 【請求項２】細胞毒性薬剤にクロトキシンＡサブユニッ
   トを添加することにより、悪性腫瘍細胞との相互作用能
   が増強される細胞毒性薬剤である特許請求の範囲第１項
   記載の製薬的組成物。
3. 【請求項３】有効成分として製薬学的に有効な量のクロ
   トキシン錯体から成り、そのクロトキシン錯体が、クロ
   トキシンＢに対して有効なモル比のクロトキシンＡから
   成っている悪性腫瘍の治療のための製薬的組成物。
4. 【請求項４】クロトキシンＢに対するクロトキシンＡの
   モル比が少くとも１対１である特許請求の範囲第３項記
   載の製薬的組成物。
5. 【請求項５】クロトキシンＢに対するクロトキシンＡの
   モル比が１対１である特許請求の範囲第３項記載の製薬
   的組成物。
6. 【請求項６】クロトキシンＢの細胞毒性作用を増強する
   のに十分な量の心臓毒素類及び渙散性の（lytic）ペプ
   チド類から成る群から選ばれる物質が更に存在する特許
   請求の範囲第１項記載の製薬的組成物。
7. 【請求項７】クロトキシンＢの細胞毒性作用を増強する
   のに十分な量の心臓毒素類及び渙散性の（lytic）ペプ
   チド類から成る群から選ばれる物質が更に存在する特許
   請求の範囲第３項記載の製薬的組成物。
8. 【請求項８】更に存在する物質が、メリチンである特許
   請求の範囲第６項又は第７項に記載の製薬的組成物。
9. 【請求項９】免疫グロブリン類、成長因子類、ペプチド
   ホルモン類、又は他の細胞毒性試薬類に、クロトキシン
   Ｂサブユニットが共有的に結合するのに十分な量の二機
   能性の試薬が更に存在する特許請求の範囲第１項記載の
   製薬的組成物。
10. 【請求項１０】免疫グロブリンが、IgG又はそのフラグ
    メントである特許請求の範囲第９項記載の製薬的組成
    物。
11. 【請求項１１】クロトキシンＢに共有的に結合されるの
    に十分な量の細胞毒性薬剤類が、更に存在する特許請求
    の範囲第３項記載の製薬的組成物。
12. 【請求項１２】クロタルス ドウリッスス テリフィク
    ス（Crotalus durissus terrificus）毒液からのクロト
    キシン錯体と製薬的に許容しうる賦形剤を組み合わせる
    ことから成る悪性腫瘍の治療のための製薬組成物を調製
    する方法。
13. 【請求項１３】錯体がクロトキシンＡ及びクロトキシン
    Ｂが少くとも１対１のモル比の錯体である特許請求の範
    囲第15項の方法。
14. 【請求項１４】組成物が、更に心臓毒素類及び渙散性の
    （lytic）ペプチド類から成る群から選ばれるクロトキ
    シン錯体の細胞毒性作用を増強する試薬を含む特許請求
    の範囲第15項又は16項に記載の方法。