JPH0720879B2 - ブタ赤痢サブユニットワクチンおよびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は一般にブタ赤痢ワクチンの製造方法に関する。
特に詳しくは、本発明はトレポネーマ・ヒオジセンテリ
エ（Treponema hyodysenteriae）による感染症とブタ赤
痢に関連した病因を防御することが判明しているブタ赤
痢サブユニットワクチンに関する。

ブタの体内で免疫原となり、トレポマーネ・ヒオジセン
テリエ感染症を予防し、ブタ肉を摂取する人々にとつて
有害ではないブタ赤痢ワクチンが切望されている。現
在、これらの特徴の全てを合せて提供する、入手可能な
ワクチンは存在しない。本発明は、T.ヒオジセンテリエ
に起因するブタ赤痢を免疫原防御する。

T.ヒオジセンテリエの不活化全細胞の使用は技術上周知
である。ワクチンと種々な全細胞ワクチン製剤の使用方
法との例は全てデルバート エル．ハリス（Delbert L.
Harris）に付与された米国特許第4,469,672号、第4,20
3,968号，第4,152,414号および第4,152,415号；ロバー
ト エイ．グッドナウ（Robert A.Goodnow）に1979年５
月１日発行された米国特許第4,152,413号；出願人：ナ
ショナル リサーチ デイベロツプメント コーポレー
ション（National Research Development Corporatio
n）のPCT出願第PCT/GB85/00087号、国際公開第WO85/038
75号、および出願人：モベイ コーポレーション（Moba
y Corporation）、1986年４月28日出願のヨーロツパ特
許出願第861058600号に見られる。先行技術の全細胞製
剤とは対照的に、本発明は抗原活性を有することが実証
されているトレポネーマ−ヒオジステリエの外層膜エン
ベロープ（outer envelope）部分からのサブユニツト製
剤を提供する。このサブユニツト製剤の特製決定は、こ
のサブユニツト部分がT.ヒオジステリエの外層膜蛋白質
（OMP）とリポ多糖（LPS）との蛋白質富化炭水化物混合
物から成ること示唆する。

発明の要約 ブタ赤痢に関して経験される問題点を解決するために、
新しい改良されたブタ赤痢ワクチンを提供することが本
発明の目的である。

ワクチン投与ブタをトレポネーマ・ヒオジセンテリエに
よる感染から防御し、ブタ肉を摂取する人々にとつて有
害でないようなブタ赤痢サブユニツトワクチンの製造方
法を提供することが本発明の他の目的である。細菌トレ
ポネーマ・ヒオジセンテリエの外層膜エンベロープから
回収した抗原物質を用いることが本発明のさらに他の目
的である。この抗原物質は２段階方法で得られる。最初
に、細菌細胞を第１遠心分離によつて回収する。この細
菌細胞をリン酸緩衝生理的食塩水（phosphate buffered
saline）（1800ml/回収物４）によつて再懸濁し、第
２遠心分離によつて全細胞の外層膜エンベロープ部分を
細胞質物質から分離する。抗原物質を得るために用いる
のは、外層膜部分のみである。このようにして得られた
この抗原物質を「塩抽出物（salt extract）」と呼ぶこ
とにする。塩抽出物は回収した後に、100×に濃縮す
る。

本発明の上記その他の目的、特徴および利点は、添付の
表および図に説明した、本発明の組成物および好ましい
実施態様についての下記のさらに詳しい説明さら明らか
になると思われる。

図面の簡単な説明 第１図（レーン１と２）は７−マシ−ブルーで染色した
後のトレポネーマ・ヒオジセンテリエ菌株B234の全細胞
溶解物（レーン１）と塩抽出物（レーン２）からのサル
コシル抽出OMPのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）である。キロダル
トンでの分子サイズマーカーを左側に示す。第１図（レ
ーン３と４）はT.ヒオジセンテリエ菌株B204の全細胞溶
解物（レーン３）と塩抽出物（レーン４）からの外層膜
抗原のウエスターンブロツクである。トランスブロツト
した外層膜抗原を回復期ブタ血清（第１抗体）とペルオ
キシダーゼ標識ビオチン−アビジン抗ブタIgG（第２抗
体）で染色した。基質４−クロロ−１−ナフトールを加
えることによつて、バンドを可視化した。キロダルトン
での分子サイズマーカーを左側に示す。第２図はT.ヒオ
ジセンテリエ菌株B204の塩抽出物からのLPS抽出抗原
（レーン１）とサルコシル抽出抗原（レーン２）のウエ
スターンブロツトである。このトランスブロツトした外
層膜抗原は回復期ブタ赤痢血清（第１抗体）ペルオキシ
ダーゼ標識ビオチン−アビジン抗ブタIgG（第２抗体）
によつて染色した。バンドに基質４−クロロ−１−ナフ
トールを加えることによつて、バンドを可視化した。キ
ロダルトンでの分子サイズマーカーを左側に示す。

第３図は銀染色によつて可視化した塩抽出物のSDS−PAG
Eパターンである。レーン１と２はCF−１マウスにおい
て保護的であつた血清型１と2T.ヒオジセンテリエから
の塩抽出物であり、レーン３と４はマウスにおいて保護
的でなかつた両血清型からの塩抽出物である。

好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は細菌トレポネーマ・ヒオジセンテリエの表面か
ら回収される抗原物質から成るブタ赤痢サブユニツトワ
クチンを提供する。この抗原物質はスピロヘータの細胞
壁の外層膜部分からの蛋白質とリポ多糖（LPS）の両方
を含む。外層膜からの抗原は、レジオネラ・ニユーモフ
イラ（Legionella pneumophila）、インフルエンザ菌
（Haemophilus influenza）、および胸膜肺炎菌（Haemo
philus pleuropneumoniae）を含めた種々なグラム陰性
菌に対する宿主の免疫反応の発生に関係することが知ら
れている。しかし、これまではトレポネーマ・ヒオジセ
ンテリエの外層膜抗原がブタ赤痢に対する抗原であり、
ブタ赤痢に対する宿主の免疫反応に関係することは明ら
かにされていなかつた。

トレポネーマ・ヒオジセンテリエのエンベロープ部分の
抗原活性は、塩抽出物を外層膜蛋白質（OMP）とリポ多
糖（LPS）とにさらに分画し、蛋白質を回復期抗血清に
対して反応させることによつて測定した。一般に、細菌
を嫌気性条件下での発酵によつて増殖させ、遠心分離に
よつて回収し、リン酸緩衝生理的食塩水中で洗浄し、第
２遠心分離によつて回収する。エンベロープ分画（塩抽
出物）が第２遠心分離工程中に細胞壁から取出され、超
遠心分離によつてペレツト化される。ペレツトを２部分
に分割した。第１部分はＮ−ラウロイルサルコシン酸ナ
トリウム（サルコシル）と、超遠心分離によつて回収さ
れたOMPとによつて処理した。第２部分はフエノール−
水によつて抽出して、エンベロープのLPS部分を得た。
エンベロープの両部分と、トレポネーマ・ヒオジセンテ
リエのサンコシル抽出全細胞とに対して不連続SDSスラ
ブゲル電気泳動法を用いて、SDS−PAGEを実施した。抗
原のゲルから紙への電気泳動移動はウエスターンブロツ
ト法によつて実施した。第１図と第２図に示したよう
な、トランスブロツトした蛋白質と炭水化物に回復期ブ
タ血清を反応させることによつて、抗原を確認した。

下記の例によつて説明するような好ましい実施態様に従
つて、T.ヒオジセンテリエの全細胞からの塩抽出物の分
離方法を示す。下記の例が本発明の範囲の限界を意図す
るものではなく、抗原性塩を製造・単離する代替方法が
考えられ、このような方法が本発明の意図された範囲内
に入ることは当業者によつて理解されるであろう。

実施例 1.トレポネーマ・ヒオジセンテリエの細菌細胞の調製細
菌細胞の調製は嫌気性スピロヘータ、トレポネーマヒオ
ジセンテリエの使用を含む。

H₂ 10％、CO₂ 10％、N₂ 80％から成る雰囲気下で、
ウシ胎仔血清約2.5％〜５％とブタ糞便抽出物２〜５％
を補充したトプチカーゼ大豆ブロス（trypticase soy b
roth）を含むベンチートツプ発酵器内で増殖させる。37
℃での42時間インキュベーション後に、細菌細胞を遠心
分離（6500rpm、30分間）によつて回収し、リン酸緩衝
生理的食塩中で強度に洗浄する。

2.サブユニツトワクチンに用いる抗原物質（塩抽出物）
の調整 サブユニツトワクチンに用いる抗原物質を得るために、
工程１で説明した方法によつて得た細菌細胞を第２遠心
分離（6500rpm、30分間）によつて取出し、上清を保留
した。この上清はワクチンに用いる抗原物質を含む。回
収した後に、塩抽出物をアミコン限外過装置（Amicon
Ultrafiltration Unit）内でYM10膜を用いて100×に濃
縮し、無菌0.45μｍ膜に通して過し、アリコートに等
分し、分析し、液体窒素中に凍結貯蔵する。

塩抽出物の特性決定には５種類の分析法がルーチンに用
いられる。これらを次に挙げる： （１） 酵素結合イムノソルベント分析法（ELISA）で
の種々なポリクローナル抗体とモノクローナル抗体に対
する抗原反応、 （２） インビトロでのヘンル腸上皮（Henle intestin
al epithelial）（HIE）細胞に対するトレポネーマヒオ
ジセンテリエの付着を阻害する洗浄抗原の能力、 （３） 銀染色によつて染色した後のブタ赤痢サブユニ
ツトSDS−PAGEプロフイル、 （４） QAEイオン交換クロマトグラフイーによる分離
後の蛋白質プロフイル、および （５） CFIマウスとブタにおける免疫原性 ELISAに用いる抗体を次に挙げる：回復期B204ブタ血清
＃38（1:50希釈）、ウサギB204度免疫血清（1:100希
釈）および非暴露ブタ血清PIC（1:50希釈）。ELISAでの
種々の抗体に対する洗浄抗原の反応は回復期B204ブタ血
清＃38に対して高い光学濃度（O.D.）反応（＞1.0）、
他の血清に対しては低い反応（＜0.4）を示す。

インビトロ付着阻害分析法は組織培養プレートへHIE407
細胞を接種し、それらをプラスチツク表面に付着させる
ことを含む。最小必須培地（MEM）1.7ml中の塩抽出物0.
3ml量を上皮細胞に加え、インキユベートする。インキ
ユベーション後に、上皮細胞をすすぎ洗いし、MEM1.3ml
中のT.ヒオジセンテリエの対数期培養物0.7mlを上皮細
胞に加え、インキユベートする。上皮細胞をもう一度す
すぎ洗いし、顕微鏡検査のためにライトの染料（Wright
s stain）で染色した。結果は、塩抽出物によつて予備
処理しない対照上皮細胞に比べて、塩抽出物がT.ヒオジ
センテリエの上皮細胞への付着能力を阻害することを示
す。

塩抽出物はCFIマウスモデルにおいて免疫原性であるこ
とが判明している。生後21日間CFIマウスを、合衆国食
品医薬品省によつて公認されたRibiアジユバントのよう
な注射可能なアジユバントに混入した塩抽出物0.15ml量
で腹膣内（IP）高度免疫化する。または、実験のため
に、フロインドアジユバントまたはMVPアジユバントを
用いることができる。マウスに１日目と14日目にワクチ
ンを注射し、次にT.ヒオジセンテリエ10⁷〜10⁸細胞によ
り、第２回予防接種後10日目と14日目に胃内で試験す
る。さらに10日間インキユベーシヨンした後に、マウス
を剖検し、盲腸内の病巣を調べる。塩抽出物を予防接種
したマウスは対照すなわちブタ赤痢に典型的な病巣を発
現する非予防接種マウスに比べて、病巣の発現から保護
されている。

この塩抽出物はブタにおいて免疫原活性を示した。生後
６週間ブタをフロインド完全アジユバントまたはRibiア
ジユバントに混入した塩抽出物2.5mlによつて１日目と1
4日目に筋肉内高度免疫化する。次に、ブタを28日目に
T.ヒオジセンテリエ10⁷〜10⁸細胞によつて試験する。30
日間インキユベーションし、その間に赤痢の臨床徴候に
関してブタを観察した後に、ブタを剖検し、結腸と盲腸
内の病巣を検査する。塩抽出物を予防接種したブタは予
防接種を受けず、ブタ赤痢の典型的な病巣を発現した対
照ブタに比べて、T.ヒオジステリエによる感染から保護
されている。さらに、予防接種を受けたブタはこの疾患
の臨床徴候を示さないが、これらのブタの糞便中にはこ
の菌が存在することも存在しないこともある。

プロテイナーゼＫまたはナトリウム−Ｍ−ペルアイオデ
ート（sodium M−periodate）による塩抽出物の処理はC
FIマウスモデル系によつて測定されたように免疫原性の
低下をもたらし、このことは蛋白質と炭水化物の両方が
抗原の活性部分であることを示唆する。デユボイス（Du
bois）の方法を用いた炭水化物分析は、多量の炭水化物
を含む塩抽出物がCFIマウスにおいて最大の免疫原性度
を示すことを明らかにしている。SDS−PAGEによつて分
離し、銀によつて染色した塩抽出物は防御性である抽出
物とCF−Ｉマウスモデルにおいて非防御性である抽出物
との区別に用いられている。第３図に説明するように、
防御性抽出物のプロフイルは47〜43KDa間に三重バンド
を示し、35〜33KDa、14〜12KDaおよび10〜8KDaには非防
御性抽出物を含むゲルには存在しない３組の二重バンド
を含む。47〜43KDa、14〜12KDaおよび10〜8KDaの範囲内
に存在するバンド（band）は４℃で貯蔵した抽出物では
不安定である。このことはサブユニツトワクチンの活性
成分（viable component）としての蛋白質の重要性を実
証している。

ウエスターンブロツト分析法を用いたスピロヘータの個
々の表面成分間の比較研究は、細菌（organism）からの
塩抽出物中にリポ多糖（LPS）と外層膜蛋白質（OMP）が
含まれることを実証している。塩抽出物を予防接種した
免疫ブタからの抗血清は、T.ヒオジセンテリエのOMP抗
原とLPS抗原を認識する。すなわち、菌株B204とB234の
T.ヒオジセンテリエのリポ多糖分子に対して誘導された
抗血清は塩抽出物の一部である抗原を認識する。T.ヒオ
ジセンテリエからのサルコシル不溶性OMP富化分画を全
細胞溶解物と塩抽出物から調整し、SDS−PAGEによつて
分離し、差異に関して調べた。第１図（レーン１と２）
に示すように、49〜28KDaの範囲内の６〜７蛋白質バン
ドをT.ヒオジセンテリエの両抽出物に関して分析する。
OMPプロフイルはT.ヒオジセンテリエの全細胞溶解物と
塩抽出物で同じであつた。レーン３と４で検出された外
層膜抗原をT.ヒオジセンテリエのサルコシル抽出全細胞
溶解物とサルコシル抽出塩抽出物の両方において回復期
ブタ血清によつて確認した。両抽出物において、血清に
よつて同様なバンドが確認された。第２図に示すよう
に、14KDaにおける塩抽出物のこの拡散染色バンドを、
塩抽出物成分のフエノール−水抽出物後（レーン１）ま
たは塩抽出物成分のサルコシル抽出後（レーン２）のウ
エスターンブロツトにおいて可視化する。この拡散染色
抗原はウエスターンブロツトにおけるT.ヒオジセンテリ
エリポ多糖と同様な染色パターン特徴を示し、これは病
原性種（pathogenic species）においてのみ存在した。
サルコシル抽出物中の炭水化物の存在は種に関係すると
思われる。それ故、OMP分子の炭水化物部分は活性抗原
成分であるように思われる。

塩抽出物のHPLC QAEイオン交換クロマトグラフイーによ
る分析は０〜1.0M NaClランプグラジエント分離（ramp
gradient separation）内で９種類の蛋白質ピークを示
した。これらのピーク内で回収した40分画中の９分画は
ELISAにおいて回復期ブタ血清＃38に対して反応性であ
つた。ELISAにおいて回復期血清に対して高い反応性を
示したこれらの分画の１つ（分画＃12）はCFIマウス
（ｎ＝５）において免疫原性であつた。分画12のウエス
ターンブロツト分析は、均質な度免疫マウス血清に対
して反応した時に92〜16KDa範囲内の12抗原バンドの存
在を実証した。92と16KDaにおける２抗原をニトロセル
ロースからアフイニテイ沈降によつて抽出し、フロイン
ド完全アジユバントに混入し、抗血清の製造のためにウ
サギに注入した。これらの抗原の両方に対して誘導され
た抗血清はELISAでは塩抽出物に対して反応性であり、
ブタ補体（swine complement）の存在下でT.ヒオジセン
テリエに対して殺菌性であることが判明している。

上記の結果は炭水化物分画が単独でまたは蛋白質分画と
組合されて、抗原活性を示すことを明確に指摘してい
る。このように、本発明の好ましい実施態様によつて、
ブタ赤痢に対して免疫原活性を示すT.ヒオジセンテリエ
の蛋白質／炭水化物抗原分画が単離された。

本発明の方法は主として２工程から成る。第１に、T.ヒ
オジセンテリエの細菌細胞の調整方法．第２に、サブユ
ニツトワクチンに用いられる抗原物質の調整方法。

T.ヒオジセンテリエのある一定の蛋白質／炭水化物サブ
ユニツト抗原とそのブタ赤痢サブユニツトワクチンの調
整方法に関して、本発明を特に示し、説明してきたが、
蛋白質／炭水化物抗原分画を調整単離する代替方法を含
めて、組成と詳細の上記その他の変化が本発明の本質お
よび範囲から逸脱することなくなされうることは当業者
によつて理解されるであろう。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の工程： トレポネーマ・ヒオジセンテリエを増殖させる工程； T.ヒオジセンテリエの細菌細胞を回収する工程； T.ヒオジセンテリエの前記細菌細胞の外層膜エンベロー
   プ部分をT.ヒオジセンテリエの前記細菌細胞の細胞質部
   分から分離する工程；および 前記外層膜エンベロープ部分に注射可能なアジュバンド
   と混合する工程； からなるブタ赤痢サブユニットワクチンの製造方法。
2. 【請求項２】前記細菌T.ヒオジセンテリエの前記増殖工
   程が嫌気性雰囲気下におけるウシ血清2.5−５％とブタ
   糞便抽出物２−５％を補充したトリプチカーゼ大豆ブロ
   ス中での発酵によって前記細菌を増殖させることから成
   る請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】前記細胞T.ヒオジセンテリエの前記回収工
   程が37−42℃における24−42時間のインキュベーション
   後に遠心分離によって回収する工程をさらに含む請求項
   １記載の方法。
4. 【請求項４】前記分離工程がT.ヒオジセンテリエの前記
   回収細菌細胞のリン酸緩衛生理食塩水による洗浄、前記
   生成溶液の遠心分離、それによる前記外層膜エンベロー
   プ部分の前記細胞質部分からの分離をさらに含む請求項
   ３記載の方法。
5. 【請求項５】前記外層膜エンベロープ部分の遠心分離工
   程をさらに含む請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】前記混合工程が前記濃縮外層膜エンベロー
   プ部分とRibiアジュバントとの混合をさらに含む請求項
   ５記載の方法。
7. 【請求項７】トレポネーマ・ヒオジセンテリエの外層膜
   エンベロープ部分と注射可能なアジュバントとを含むブ
   タ赤痢サブユニットワクチン。
8. 【請求項８】前記アジュバンドがRibiである請求項７記
   載のブタ赤痢サブユニットワクチン。
9. 【請求項９】トレポネーマ・ヒオジセンテリエの外層膜
   エンベロープから分離した蛋白質および炭水化物を含む
   抗原性分画と、注射可能なアジュバントとを含むブタ赤
   痢サブユニットワクチン。
10. 【請求項１０】トレポネーマ・ヒオジセンテリエの外層
    膜エンベロープから分離した抗原性の炭水化物と薬理学
    的に受容されるキャリヤーを含み、蛋白質を実質的に含
    まないブタ赤痢ワクチン。
11. 【請求項１１】前記炭水化物が14kDa−16kDaの範囲内の
    分子サイズを有する請求項10記載のブタ赤痢ワクチン。
12. 【請求項１２】前記炭水化物がウエスターンブロット分
    析法における拡散染色バンドを特徴とする請求項記載の
    ブタ赤痢ワクチン。
13. 【請求項１３】抗原性分画である外膜蛋白質および炭水
    化物を含むトレポネーマ・ヒオジセンテリエの外膜エン
    ベロープ部分と注射可能なアジュバントからなるブタ赤
    痢サブユニットワクチンであって、 前記抗原性分画がウエスターンブロット分析法で14−16
    kDa、33−35kDaおよび43−47kDaの染色バンドを有する
    ブタ赤痢サブユニットワクチン。