JPH07218508A - ペルオキシダーゼ標識体のブロッキング試薬及び酵素免疫染色方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 バックグランドの上昇を抑制し、より高感度
な測定方法の提供。また、ペルオキシダーゼの色素形成
を妨害する酵素免疫染色方法のブロッキング剤の提供。 【構成】 ペルオキシダーゼを標識として用いる免疫染
色法において、ブロッキング剤にペルオキシダーゼの色
素形成を妨害する試薬を用いることを特徴とする酵素免
疫染色方法。又、ペルオキシダーゼの色素形成を妨害す
る試薬を含むことを特徴とする酵素免疫染色方法のブロ
ッキング剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はペルオキシダーゼ標識体
（以下POD標識体）のブロッキング試薬及び酵素免疫染
色方法に関し、特にPOD標識体の非特異的な吸着を抑制
するとともに、非特異的に吸着したPOD標識体のペルオ
キシダーゼによる色素形成反応を妨害することによっ
て、バックグランドの上昇を抑制し、より高感度な測定
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体成分などの特定成分を検出する各種
の分析方法が開発されて来ているが、それらの方法の中
で最も精度の高い方法として、該特定成分とこれに対し
て特異的に結合しうる物質、例えば抗原と抗体、ある種
の糖類とレクチン、ビオチンとアビジン、...などの特
異的結合を利用する方法が知られている。例えば電気泳
動した蛋白質生体成分をゲルからニトロセルロース膜な
どの支持体上に転写担持し、標識体たとえば抗体標識体
と反応させシグナルを検出する方法などがある。標識と
してはペルオキシダーゼが好ましく用いられている。こ
のような方法では、対象となる特定成分が微量であるた
め、標識が高感度に検出できることが望まれていた。感
度をあげる方法として、標識体の濃度を上げるという方
法があるが、標識体の濃度を上げると標識体の非特異的
な吸着によってバックグラウンドも上昇し検出が困難に
なるという問題が生ずる。

【０００３】従来、酵素免疫染色法と呼ばれている測定
方法の一例をあげると、まず電気泳動によりゲル上で試
料中の蛋白質を分離する。この泳動ゲルをすみやかにPV
DFなどの膜と密着させて蛋白質を膜上に転写する。これ
を蛋白溶液（例えば0.5％カゼインを含むPBS液など）に
てブロックする。これはPOD標識体の非特異的な膜への
吸着を抑制するために行われる。この後、POD標識体液
と接触させて、膜上に測定対象の蛋白質とPOD標識体の
複合体を形成させる。十分に洗浄したのち、PODの酵素
反応により色素を形成させ、対象の蛋白質を検出するの
である。

【０００４】ところが、POD標識体の非特異的な吸着を
完全になくすことは極めて難しく、POD標識体の非特異
的な吸着は、PODによる発色反応の際にバックグラウン
ドを上昇させシグナルの検出を困難にさせていた。通
常、POD標識体液と接触させた後の洗浄を十分に行うな
どによって対処していたが、それでもPOD標識体の非特
異的な吸着を完全になくすことはできなかった。特に測
定対象物の量が少ない場合、感度を上げる目的でPOD標
識体の濃度を上げると非特異吸着の影響は著しく、POD
標識体の非特異的な吸着を抑制することに主眼をおいて
いた従来の方法では限界があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、POD
標識体の非特異的な吸着を抑制するとともに、非特異的
に吸着したPOD標識体のペルオキシダーゼによる色素形
成反応を妨害することによって、バックグランドの上昇
を抑制し、より高感度な測定方法を提供することにあ
る。

【０００６】本発明の別の目的は、ペルオキシダーゼの
色素形成を妨害する酵素免疫染色方法のブロッキング剤
の提供にある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は、ペ
ルオキシダーゼを標識として用いる免疫染色法におい
て、ブロッキング剤にペルオキシダーゼの色素形成を妨
害する試薬を用いることを特徴とする酵素免疫染色方法
により達成される。

【０００８】ペルオキシダーゼの色素形成を妨害する試
薬がカタラーゼである場合、或いは、ペルオキシダーゼ
の色素形成を妨害する試薬で処理する工程が、ペルオキ
シダーゼ標識体による免疫反応を行わせる前にある場合
は、その効果がより顕著である。尚、本発明の酸素免疫
染色方法はペルオキシダーゼ標識体の酵素反応を0.001
〜0.005％の、通常行われている過酸化水素濃度よりも
低い条件で行うことがより好ましい。

【０００９】別の態様として、ペルオキシダーゼの色素
形成を妨害する試薬を含むことを特徴とする酵素免疫染
色方法のブロッキング剤により達成される。ブロッキン
グ剤は、測定対象の特定成分を膜などの支持体に転写、
吸着させた後、POD標識体の非特異吸着を防止するため
に、あらかじめ測定に影響を与えない蛋白質溶液で処理
することで膜に蛋白質を吸着させる試薬である。本発明
は、ペルオキシダーゼの色素形成を妨害する試薬を用い
る酵素免疫染色方法であるが、特に、ブロッキング試薬
にカタラーゼを含有させることで、非特異的に吸着した
ペルオキシダーゼ標識体の色素形成反応を妨害すること
によって、バックグラウンドの上昇を抑制でき好まし
い。カタラーゼは過酸化水素を分解する酵素であり、非
特異的に吸着したPOD標識体による色素形成を妨害する
効果を有している。

【００１０】上記ブロッキング剤は、カタラーゼを含有
する場合、或いは、カタラーゼを10kU／ml以上含有する
場合は、その効果がより顕著である。

【００１１】更に好ましくは、カタラーゼでペルオキシ
ダーゼ標識体による免疫反応を行う前に処理する。

【００１２】発色反応を行わせる際の過酸化水素濃度は
通常使用されている濃度よりも低い方が好ましく、0.00
1〜0.005％の過酸化水素存在下で行う酵素免疫染色方法
が好ましい。又、発色反応は静置した条件下で行わせた
ほうが結果が良好となる。

【００１３】ブロッキング剤に添加するカタラーゼの濃
度は、好ましくは10万〜50万U／mlである。

【００１４】尚、本発明において、ブロッキング剤にカ
タラーゼを含有させる場合、他の一般的に使用されてい
るブロッキング試薬も添加した方が好ましい。このよう
なブロッキング剤としては、BSA、カゼインナトリウ
ム、動物血清、などがあげられる。使用する濃度は通常
使用されている濃度よりも低い方が結果が良好である。
例えば、BSAは通常１％の濃度で使用されるが、0.2％以
下とした方が好ましい結果が得られる。

【００１５】又、本ブロッキング剤には防菌剤を添加す
ることが好ましい。本目的のためにp-ヒドロキシ安息香
酸メチルを含有させることができる。これ以外にもカタ
ラーゼ及びペルオキシダーゼの酵素活性に影響を与えな
いものであれば適宜好ましい防菌剤を含有させることが
できる。

【００１６】本発明に於て特定成分は支持体に物理的吸
着、化学的結合等により直接的に担持されてもよく、１
つ以上の特異結合物質を介して間接的に担持されてもよ
い。又、特定成分を支持体上に直接もしくは間接的に担
持せしめた後、前記標識体を反応させ前記複合結合体を
形成させてもよいし、或は複合結合体を形成せしめた後
に該複合結合体を支持体上に直接もしくは間接的に担持
せしめてもよい。更に標識体は該特定成分と複合結合体
を形成し、支持体に担持されるが、特定成分と標識体は
直接結合してもよく、１つ以上の他の特異結合物質を介
して結合してもよい。

【００１７】また本発明に於て標識体はペルオキシダー
ゼと抗ペルオキシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複し
て標識したものであってもよい。

【００１８】又、本発明に用いるペルオキシダーゼとし
ては、特に西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)が好まし
く用いられる。

【００１９】複合結合体中のペルオキシダーゼの酵素反
応の基質としては、過酸化水素、芳香族第一級アミン化
合物及びフェノール化合物もしくは活性メチレン化合物
が好ましく用いられる。ペルオキシダーゼと過酸化水素
の作用により芳香族第一級アミン化合物は酸化され、次
いでフェノール化合物もしくは活性メチレン化合物とカ
ップリングして色素が生成、沈着する。

【００２０】このほか、ペルオキシダーゼの酵素免疫染
色に用いられている基質を利用することができる。

【００２１】本発明において、対象とする特定成分は、
その特定成分に特異的に結合する特異結合物質が得られ
る物質又は物質群である。

【００２２】たとえば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、
複合糖質、糖脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗
体等が挙げられる。

【００２３】また本発明に使用し得る特異結合物質は、
特定成分又は他の特異結合物質と特異的に結合できる物
質であり、特定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。た
とえば、蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチ
ン、プロテインＡ、アビジン、ビオチン、レセプター、
補酵素、酵素の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等
が挙げられる。支持体としては、セルロースアセテー
ト、ニトロセルロースPVDF等の膜、ポリアクリルアミド
等のゲル状支持体、ＴＬＣプレート等のシリカゲル担体
等が挙げられる。また組織化学染色においては、組織そ
のものも使用できる。

【００２４】支持体に担持された特定成分とPOD標識体
との複合結合体上に色素を生成沈着せしめるには発色用
基質液中に支持体を浸漬させれば良い。発色用基質液
は、例えば適当なpＨの緩衝液中に過酸化水素、色素前
駆体例えば芳香族第一級アミン化合物及び活性メチレン
化合物を溶解し、調製される。活性メチレン化合物は、
少量の親水性の有機溶剤たとえばメタノール、エタノー
ル、DMF等に溶解して加えても良い。芳香族第一級アミ
ン化合物と活性メチレン化合物とのモル比は１対100か
ら100対１が適当であり、１対10から10対１が好まし
い。これ以外のペルオキシダーゼ標識体を用いた酵素免
疫染色用の基質も用いることができる。

【００２５】酵素反応により支持体上に色素が充分生成
沈着した後、未反応物質を洗い流し、反応を停止する。

【００２６】生成色素についての情報は、目視にて、も
しくは技術的に公知な方法たとえば分光光度計を用いて
読み取る事ができる。

【００２７】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はその実施例によりその範囲を限定される
ものではない。

【００２８】実施例１ あらかじめメタノールに浸漬後、リン酸緩衝液（以下PB
Sと略す）中に保管していたポリビニリデンジフルオリ
ド(PVDF)膜（MILLIPORE社製）上に、PBSにて段階希釈し
たマウス抗体（IgG1）をスポットした。３〜50ng／spot
(φ３mm)。これをブロッキング試薬として0.5％カゼイ
ン−PBS溶液を用いて、前記のPVDF膜を浸漬し、室温で
２時間ブロッキングを行なった。ブロッキング試薬の組
成は以下に示す。

【００２９】 ＜ブロッキング試薬＞ 0.5％カゼイン−PBS カゼインナトリウム(和光純薬製) 0.5ｇ PBS pＨ7.4 99.5ｇ p-ヒドロキシ安息香酸メチル(和光純薬製) 100mg 次いで以下に示す組成のペルオキシダーゼ標識抗体液に
浸し、室温で２時間免疫反応をさせた。

【００３０】 ＜ペルオキシダーゼ標識抗体液＞ HRP標識抗マウスIgG1ウサギ抗体(カッペル社製) 2ml 0.5％カゼイン−PBS 98ml p-ヒドロキシ安息香酸メチル(和光純薬製) 100mg p-ヒドロキシ安息香酸(和光純薬製) 50mg 次に、PVDF膜をHRP標識抗体液から取りだし、0.05％Twe
en20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート)−
PBS溶液にて５回洗浄し、以下に示す発色用基質反応液
中に浸漬した。

【００３１】 ＜発色用基質反応液＞ 溶液Ａ メタノール(99％) 20ml 4-クロロ-1-ナフトール(和光純薬製) 60mg 溶液Ｂ PBS(pＨ7.4) 100ml N-エチル-N-β-メタンスルホンアミドエチル-3-メチル -4-アミノアニリン3/2硫酸１水塩 20mg 溶液Ｃ 過酸化水素水(31％) 5μl 溶液Ａ，Ｂは使用する直前に調製し、溶液Ａ，Ｂ，Ｃを
混合して発色用基質反応液とする。

【００３２】発色用基質反応液中に浸漬したPVDF膜は静
置して15分間反応させ、蒸留水で洗浄・乾燥後、各Spot
の反射濃度を島津製フライングスポットスキャナCS-900
0にて測定し、これを比較例１とした。

【００３３】さらにブロッキング試薬として以下に示す
39万U／mlのカタラーゼを含有する0.5％カゼイン・PBS
溶液を使用し、同様の操作を行なった。これを本発明の
例１とした。

【００３４】 ＜本発明ブロッキング試薬＞ 0.5％カゼイン-PBS 97ml p-ヒドロキシ安息香酸メチル(和光純薬製) 100mg カタラーゼ(I)（ベーリンガーマンハイム社製）130万U／ml 3ml 尚、島津製フライングスポットスキャナCS-9000の測定条件は、 スリット幅 ２mm×0.4mm 測定波長 650nm 未使用のPVDF膜を０とし、それぞれの相対値を測定し、
結果を表１に示す。

【００３５】

【表１】

【００３６】表１から本発明の例１は比較例と比べてバ
ックグラウンドが著しく低下し、かつ同程度の発色濃度
を示すことが確認された。

【００３７】実施例２ あらかじめメタノールに浸漬後、リン酸緩衝液(以下PBS
と略す)中に保管していたポリビニリデンジフルオリドP
VDF膜(MILLIPORE社製)上に、PBSにて段階希釈したヒト
α1-アンチトリプシンをスポットした。13〜100ng／spo
t（φ３mm）。これを表２に示したブロッキング試薬を
使用し、室温で２時間ブロッキングを行なった。

【００３８】

【表２】

【００３９】次いで以下に示す組成のペルオキシダーゼ
標識抗体液に浸し、室温で２時間免疫反応をさせた。

【００４０】 ＜ペルオキシダーゼ標識抗体液＞ １％BSA-PBS 99.8ml p-ヒドロキシ安息香酸メチル(和光純薬製) 100mg p-ヒドロキシ安息香酸(和光純薬製) 50mg Peroxidase conjugate IgG fraction Goat 0.2ml Anti-Human α1-Antitrypsin (CAPPEL社製) 0.2ml PVDF膜をHRP標識抗体液から取りだし、0.05％Tween20
(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート)−PBS
溶液にて5回洗浄し、以下に示す発色用基質反応液中に
浸漬した。

【００４１】 ＜発色用基質反応液＞ 溶液Ａ メタノール(99％) 20ml 4-クロロ-1-ナフトール(和光純薬製) 60mg 溶液Ｂ PBS(pＨ7.4) 100ml N-エチル-N-β-メタンスルホンアミドエチル-3-メチル -4-アミノアニリン3/2硫酸１水塩 20mg 溶液Ｃ 過酸化水素水(31％) 10μl 溶液Ａ，Ｂは使用する直前に調製し、溶液Ａ，Ｂ，Ｃを
混合して発色液とする。発色用基質反応液中に浸漬した
PVDF膜は静置して10分間反応させ、蒸留水で洗浄・乾燥
後、実施例１と同様に各Spotの反射濃度を島津製フライ
ングスポットスキャナCS-9000にて測定した。その結果
を表３に示す。

【００４２】

【表３】

【００４３】表３から、本発明の例２〜５はいずれも著
しく低いバックグラウンドを示した。特に本発明の例２
及び４はバックグラウンドが低く、シグナルも比較例と
同程度を示し、極めて検出が容易になった。この実施例
で示した発色系では、青色の色素が形成される。そのた
め、比較例ではバックグラウンドも青色を示した。とこ
ろが、驚くべきことに本発明の例４と例５ではバックグ
ラウンドが淡い赤色を呈することが判明した。これは予
想しなかった効果である。これにより、本発明の例５で
はシグナルの色素濃度の低下にもかかわらず判別が極め
て容易になった。

【００４４】

【発明の効果】本発明により、バックグランドの上昇を
抑制し、より高感度な測定方法が得られた。又、ペルオ
キシダーゼの色素形成を妨害する酵素免疫染色方法のブ
ロッキング剤が得られた。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペルオキシダーゼを標識として用いる免
   疫染色法において、ブロッキング剤にペルオキシダーゼ
   の色素形成を妨害する試薬を用いることを特徴とする酵
   素免疫染色方法。
2. 【請求項２】 ペルオキシダーゼの色素形成を妨害する
   試薬がカタラーゼであることを特徴とする請求項１記載
   の酵素免疫染色方法。
3. 【請求項３】 ペルオキシダーゼの色素形成を妨害する
   試薬で処理する工程が、ペルオキシダーゼ標識体による
   免疫反応を行わせる前にあることを特徴とする請求項１
   記載の酵素免疫染色方法。
4. 【請求項４】 ペルオキシダーゼの色素形成を妨害する
   試薬を含むことを特徴とする酵素免疫染色方法のブロッ
   キング剤。
5. 【請求項５】 カタラーゼを含有することを特徴とする
   請求項４記載のブロッキング剤。
6. 【請求項６】 カタラーゼを10kU／ml以上含有すること
   を特徴とする請求項５記載のブロッキング剤。
7. 【請求項７】 ペルオキシダーゼ標識体の酵素反応を0.
   001〜0.005％の過酸化水素存在下で行うことを特徴とす
   る請求項１〜３記載の酵素免疫染色方法。