JPS61241665A - 安定化された固相試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は自己免疫扶患診断用試薬に関し、さらに詳しく
は安定化された固相試薬に関する。

（従来の技術） 従来から、抗原や抗体を不溶性支持体゛に結合させた固
相試薬は、多くの免疫学的測定用として利用されている
。たとえば、抗体をポリスチレン球のような不溶性支持
体に結合させた固相試薬はサンドイッチ的酵素免疫測定
に有用であり、そのような固相試薬はキットとして市販
されている。このような固相試薬はたいてい牛血消アル
ブミンなどの血清蛋白質を含む水溶液中に浸漬されてい
るが、時に不明の理由により活性が低下したり、沈澱を
生成したシすることが知られている。また、このような
固相試薬は輸送上乾燥できれば有利であるが、乾燥させ
ると活性を保持できないことが判っている。

また、抗原をマイクロプレートのような不溶性支持体に
結合させた固相試薬は、種々の抗体を測定する試薬とし
て有用であり、たとえば、自己免疫疾患に出現する自己
抗体は、その自己抗体が特異的に反応する抗原を不溶性
支持体に結合させておき、検体中の自己抗体を反応させ
た後、酵素や蛍光物質を抗ヒトイムノグロブリンに標識
した試薬を使って測定されている。しかし、このような
自己抗体の測定では、抗原を不溶性支持体に結合させた
後、直ちにあるいは少なくとも１週間以内に用いるのが
従来からの方法であり、特に不安定な抗原の場合必須の
操作方法と考えられていた。

したがって、従来の自己抗体の測定では測定毎に抗原と
不溶性支持体に結合させる操作が必要であり、測定を煩
雑なものにしていた。

さらに、特開昭５８−１２３４５９号公報には、抗原や
抗体を固相担体に結合させた固相試薬をグリセリン、エ
チレングリコールなどの保護剤で処理した後、乾燥して
なる安定化された固相試薬が開示され、特開昭５９−１
７４７６０号公報には、ＫＮＡ抗原もしくはＳｍ抗原（
膠原病に出現する自己抗体でめる抗ＥＮＡ抗体、抗Ｓｍ
抗体が特異的に反応する抗原）をアばノ基もしくはチオ
ール基を含む物質および二価性試薬を介して固相担体に
結合させた固相試薬が開示されている。しかし、これら
の方法をもってしても、いまだ満足できる安定化された
固相試薬は得られず、なおかつ、特に不安定な抗原や抗
体に対してはなおさら安定化を困難としていた。

一方、特開昭５９−２０６７６１号公報には担体上に感
作された酸素標識抗体あるいは同抗原、抗体又は抗原の
表面を卵白、ウシ血清アルブミン又はゼラチンを含む洗
浄液で洗浄することによシ、乾燥による酵素標識抗体あ
るいは同抗原の活性低下又は抗体、抗原の活性低下を防
ぐことが記載されている。しかし、自己抗体に特異的に
反応する抗原を長期間活性維持させることについては開
示されていない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、このような現状に鑑み自己抗体に特異的
に反応し得る抗原を不溶性支持体に結合させた固相試薬
であって、長期間安定であシ、かつ輸送上有利とされる
乾燥状態で保存が可能な固相試薬を開発するべく鋭意研
究した結果、自己抗体に特異的に反応し得る抗原を不溶
性支持体に結合させる際、糖類、キレート剤、卵白アル
ダずン、ゼラチン、フィコールのいずれか１種または２
種以上の水溶液単独かもしくはこれらと牛血清アルブミ
ンとの混合溶液にて処理すると、結合させた抗原や抗体
が極めて安定化されることを見出し、本発明を完成し′
ｆｃ。

（問題点を解決するための手段） すなわち本発明は自己抗体に特異的に反応し得る抗原中
を不溶性支持体に結合させた固相試薬であって、糖類、
キレート剤、卵白アルダばン、ゼラチンおよびフィコー
ルからなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物
の水溶液で処理されたことを特徴とする安定化された固
相試薬である。

本発明では膠原病などの自己免疫疾患患者に、′出現す
る自己抗体が特異的に反応する抗原を用いる。

これらの抗原は極めて不安定でアシ、再現性の高い自己
抗体の測定には、安定化された固相抗原が必要とされて
いる。これらの抗原の具体的な例としては、ＫＮＡ抗原
、ＢｍＭ、原、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、クリシデ
ィアルシリエのキネドプラストなどが挙げられ、これら
の抗原の安定化された固相試薬は抗Ｆ！ＮＡ抗体、抗Ｄ
ＮＡ抗体などの自己抗体の測定に有用である。

以下の説明では、自己抗体に特異的に反応し得る抗原を
単に抗原と記す。

まず抗原を結合させる不溶性支持体としては、ポリスチ
レンチューブ、ポリスチレン球、シリコーン片、マイク
ロプレートなどが挙げられるが、本発明では特にマイク
ロプレートが好適である。

マイクロプレートにはポリスチレン製マイクロプレート
、ポリ塩化ビニール製マイクロプレートなどが挙げられ
る。

これらの不溶性支持体に抗原を結合させるには次のよう
にして実施する。まず、抗原を適当な溶媒、たとえば生
食水、リン酸緩衝液に５〜１．０００μＰ／ｍ！、好ま
しくは２０〜２００μＰ／ｍｌとなるように溶解し、不
溶性支持体と共に浸漬する。この時、不溶性支持体はポ
リ’Ｉ、−リジン、メチル化牛血清アルブミンなどで前
処理されていてもよい。これらの前処理は、たとえば２
本鎖ＤＮＡ抗原などでは該抗原が結合し易くなるため有
用である。抗原を不溶性支持体と共に浸漬する時間は、
１時間から２０時間、好ましくは３時間から１６時間で
ある。

時間が短かくても抗原が十分結合しないし、長過ぎても
かえって抗原が劣化する。このようにして浸漬した後、
抗原の溶液を除去し、生食水などで洗浄して抗原結合不
溶性支持体が得られる。

次いで糖類、キレート剤、卵白アルダばン、ゼラチンお
よびフィコールからなる群から選ばれた１種または２種
以上の化合物水溶液で前記不溶性支持体を処理する。

本発明では抗原を不溶性支持体と共に浸漬する際に、こ
れらの物質を添加しても良いが、浸漬後抗原を除去し洗
浄した後に実施する方が好適である。

ここで、糖類としては特にα−シクロデキストリン、β
−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、テキ
ストラン、サッカロース、マンニット、ソルビットが好
適である。また、キレート剤としては、エチレンジアミ
ン四酢酸またはその塩、クエン酸ナトリウムなどが挙げ
られるが、特にエチレンジアミン四酢酸またはその塩が
好適である。

また、本発明では糖類、キレート剤、卵白アルブミン、
ゼラチンおよびフィコールからなる群から選ばれた１ｓ
まｆｃは２種以上の化合物の水溶液と牛血清アルブミン
との混合溶液にて前記不溶性支持体を処理することによ
り、さらに好適に実施される。午血清アルプばンを併用
することにより、抗原の保護効果と、非特異結合の防止
効果がより増幅される。

糖類、キレート剤、卵白アルブミン、ゼラチンまたはフ
ィコールの使用濃度としては、０．０５〜５５〜５重量
％しくは０．５〜２東量チであシ、牛血清アルブミンの
使用濃度は０．００１〜３重量％、好ましくは０．２〜
１重量％である。これらの水溶液にて前記不溶性支持体
を処理するには、これらの水溶液の適当量を前記不溶性
支持体にＱ”０〜２５°Ｃ１好ましくは２°Ｃ〜８°Ｃ
にて、数１０分〜−夜、好ましくは３０分〜１時間浸漬
することによシ達成される。

このようにして浸漬後、前記水溶液を除去し、生食水な
どで洗浄して安定化された固相試薬を得る。

得られた固相試薬は、この壕までも良いが、真空乾燥、
凍結乾燥などにより乾燥する方が好適である。このよう
にして得られた固相試薬は低温で保存すれば６ケ月から
１年間は保存可能である。

さらに、このようにして得られた固相試薬と酵素標識し
た抗ヒトイムノグロブリン試薬もしくは抗ヒトイムノグ
ロブリンを結合させた赤血球試薬と適当な緩衝液試薬を
セットすることにより、膠原病などの自己免疫疾患に出
現する種々の自己抗体を測定するための試薬組成物が提
供される。このような試薬組成物は、前記のようにして
得られた固相試薬が安定であるために、測定を随時実施
でき、極めて簡便な自己抗体の測定を可能にする。

以下、酵素標識した抗ヒトイムノグロブリンおよび抗ヒ
トイムノグロブリンを結合させた赤血球試薬の製造方法
およびそれらを用いた自己抗体の測定法について説明す
る。

まず、酵素標識した抗ヒトイムノグロブリンは公知方法
により容易に製造されるが市販品を用いても良い。ここ
で用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフ
ォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられ
る。これらの酵素に抗ヒトイムノグロブリンを標識する
にはたとえば酵素の糖類を過ヨウ素酸で酸化してアルデ
ヒド基ｔ−ｉｔ出させ、抗ヒトイムノグロブリンのアミ
７基と結合させることにより容易に製造できる。ここで
抗ヒトイムノグロブリンとしては、抗ヒトイムノグロブ
リンＧ１抗ヒトイムノグロブリンＭ１抗ヒトイムノグロ
ブリンＡなどが挙げられる。

次に、抗ヒトイムノグロブリンを赤血球に結合させるに
は、ヒツジ、ニワトリなどの赤血球をホルマリン固定し
、タンニン酸処理後洗浄し２、抗ヒトイムノグロブリン
を加えて室温で数時間接触させることにより実施される
。こうして得られた抗ヒトイムノグロブリン感作赤血球
は適当な緩衝液に浮遊させて用いるか、必要ならば凍結
乾燥しても良い。

得られた酵素標識した抗ヒトイムノグロブリン試薬もし
くは抗ヒトイムノグロブリン感作赤血球を用いて自己抗
体を測定するには次のようにして行う。

まず、前記の抗原を結合させた固相試薬に、ＳＬ取りウ
マテなどの膠原病患者の血清を反応させ、血清中の自己
抗体を結合させる。しかる後、酵素様識した抗ヒトイム
ノグロブリンもしくは抗ヒトイムノグロブリン感作赤血
球を反応させると、前記固相試薬上には、自己抗体の量
に応じて酵素標識抗ヒトイムノグロブリンもしくは抗ヒ
トイムノグロブリン感作赤血球が結合する。これらの結
合した酵素量もしくは赤血球量を、前者では酵素の基質
を加えて反応させ、生成した生成物の量を分光光度計に
より、後者では、肉眼により測定もしくは判定すること
により、患者血清中の自己抗体量を間接的に測定するこ
とができる。

（実施例） 以下、実施例を用いて本発明を説明するが、もとより本
発明はこれｑ実施例に限定されるものではない。

実施例Ｉ ＦｉＮＡ抗原を２００μグ／ｍｌとなるようにリン酸緩
衝液に溶解し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１
００μｌ宛分注し、４°Ｃに１６時間放置し洗浄した。

しかる後α−シクロデキストリンの１チ水溶液を１００
μｌ宛分注し、４°Ｃに１時間放置し、洗浄後真空乾燥
した。対照として、α−シクロデキストリンの替りに１
％グリセロール（従来方法）を用いたものと無処理のも
のを調製した。

これらのマイクロプレートを４°Ｃに６ケ月間保存し、
ＫＮＡ抗原の活性を調べた。ＥＮＡ抗原の活性測定はペ
ルオキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリンを用いるＫ
ＬＩＳＡ法により行った。その結果を第１表に示した。

第１表より、本発明方法が、従来方法や無処理よりも優
れていることが明らかである。

第１表 実施例２ 実施−１の刊ＮＡ抗原の替りに２本鎖ＤＮＡ抗原を３０
μ２／ｍ／の濃度で用いた以外は実施例１と同様にして
行った。その結果、本発明方法では４°Ｃで３ケ月間、
２本鎖ＤＮＡ抗原の活性が保持されたが、１％グリセロ
ールや無処理では全く活性が認められなかった。

実施例３ ＦｉＮＡ抗原を１５０μｆｌ／ｍｌとなるようにリン酸
緩衝生食水に溶解し、９６穴マイクロプレートの各ウェ
ルに１００μｌ宛分注し、４°Ｃに１６時間放置し洗浄
した。しかる後、牛血清アルブばン１チと、デキストラ
ン、サッカロース、マンニット、ソルビット、エチレン
ジアミン四酢酸、卵白アルブミン、ゼラチンまたはフィ
コールをそれぞれ１チ含科水溶液を調製し各ウェルに添
加した。対照は１％グリセロール（従来方法）と無処理
を用いた。マイクロプレートを４°Ｃに１時間放置し、
洗浄後真空乾燥した。これらのマイクロプレートを４０
°Ｃに１週間保存し、ＫＮＡ抗原の活性を実施例１と同
様にして調べた。その結果を第２表に示した。第２表よ
り、常温以上では極めて不安定であるとされていたＦｉ
ＮＡ抗原が、本発明方法により極めて安定に、その活性
を保持していることが認められた。

第２衣 実施例４ ウサギのイムノグロブリンＧを５０μグ／ｍ／となるよ
うにリン酸緩衝生食水に溶解し、９６穴マイクロプレー
トの各ウェルに１００μｌ宛分注し、４°Ｃに１６時間
放置し洗浄した。しかる後、牛血清アルブミン１チ、β
−シクロデキストリン１％、エチレンジアミン四酢酸１
チを含む水溶液を添加して４°Ｃに１時間放置し、洗浄
後真空乾燥した。このマイクロプレートを４°Ｃに６ケ
月間保存し、ウサギのイムノグロブリンＧの活性を調べ
た。活性の測定ハ、リウマチ因子を反応させた後、ペル
オキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリンＭを反応させ
るＥＬＩＳＡ法によシ行った。その結果、４°Ｃ，６チ
月の保存後も全く活性の低下は認められなかった。

実施例５ 抗ＥＮＡ抗体測定用試薬として次の試薬を調製した。

Ａ）　ＥＮＡ抗原結合固相 ＥＮＡ抗原を１５０ｐｆｌ／ｍｌとなるようにリン酸緩
衝生食水圧溶解し、９６穴マイクロブレ〜トの各ウェル
に１００μｌ宛分注し、４°Ｃに１６時間放置後洗浄し
た。しかる後、α−シクロデキストリンｌチと牛血清ア
ルブミン１チとを含む水溶液を添加し、４°Ｃに１時間
放置し、洗浄後真空乾燥した。

Ｂ）　　ペルオキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリン
Ｇ試薬 カッペル社製を０．５チ牛血清アルブミン加リン酸緩衝
液にて５，０００倍に希釈した。

０）　　０．０２％Ｈ２Ｏ２を含むリン酸、クエン酸緩
衝液Ｄ）　　０．５％牛血清アルブミン加リン酸緩衝液
これらの試薬を用いて膠原病患者血清中の抗Ｆ！ＮＡ抗
体を測定した。まず、試薬Ａ）に患者血清を試薬Ｄ）に
て１００倍に希釈して１００μｌ添加し、室温で１時間
反応させ洗浄した。にに試薬Ｂ）を１００μｌ添加して
同様に反応させ洗浄した。次に、０−フェニレンシアミ
ンを試薬Ｃ）にて３ｍり／ｍｌとなるように溶解し、１
００μｌ宛添加して室温で３０分間反応させ、ｌ規定硫
酸を添加して反応を停止した。各ウェルにおける４９２
ｎｍの吸光度をＥ工Ａオート・リーダー（東洋測器製）
にて測定した。その結果を第３表に示した。

第３表より、膠原病疾患者では抗ＥＮＡ抗体の存在を示
す吸光度の著明な上昇が認められ、本発明方法による試
薬組成物が有用であることが示された。

第３表 （効果） 以上、詳記したように、本発明により、自己抗体に特異
的に反応し得る抗原が結合し、安定化された固相試薬が
提供され、それを用いて任意の時に、極めて簡単に、膠
原病などの自己免疫疾患の診断に重要な自己抗体の測定
が実施できる試薬組放物の提供が可能となる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 自己抗体に特異的に反応し得る抗原を不溶性支持体に結
   合させた固相試薬であって、糖類、キレート剤、卵白ア
   ルブミン、ゼラチンおよびフィコールからなる群から選
   ばれた１種又は２種以上の化合物の水溶液で処理された
   ことを特徴とする安定化された固相試薬。