JPH07224097A - インターロイキン−６変異体 - Google Patents
インターロイキン−６変異体Info
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- JPH07224097A JPH07224097A JP6014461A JP1446194A JPH07224097A JP H07224097 A JPH07224097 A JP H07224097A JP 6014461 A JP6014461 A JP 6014461A JP 1446194 A JP1446194 A JP 1446194A JP H07224097 A JPH07224097 A JP H07224097A
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- Japan
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- leu
- cys
- interleukin
- mutant
- glu
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）変異
体、および組み換えＤＮＡ技術を用いたその製造法を提
供する。 【構成】アミノ酸配列において、Ｎ−末端から５番目の
Gly から１９番目のLeuまでの欠失、Ｎ−末端から４４
番目のCys から５０番目のCys までの欠失、およびＮ−
末端から７３番目のCys から８３番目のCys までの欠失
から選ばれる少なくとも一つの欠失を有するＩＬ−６変
異体、そのＩＬ−６変異体をコードする遺伝子、その遺
伝子を含む発現ベクター、およびその発現ベクターで形
質転換した酵母（S. pombe）を使用するＩＬ−６変異体
の製造法。
体、および組み換えＤＮＡ技術を用いたその製造法を提
供する。 【構成】アミノ酸配列において、Ｎ−末端から５番目の
Gly から１９番目のLeuまでの欠失、Ｎ−末端から４４
番目のCys から５０番目のCys までの欠失、およびＮ−
末端から７３番目のCys から８３番目のCys までの欠失
から選ばれる少なくとも一つの欠失を有するＩＬ−６変
異体、そのＩＬ−６変異体をコードする遺伝子、その遺
伝子を含む発現ベクター、およびその発現ベクターで形
質転換した酵母（S. pombe）を使用するＩＬ−６変異体
の製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アミノ酸配列に特定の
欠失を有するインターロイキン−６変異体、それをコー
ドするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を有する発現ベクタ
ー、その発現ベクターにより形質転換された形質転換
体、およびその形質転換体を用いた上記インターロイキ
ン−６変異体に関する。
欠失を有するインターロイキン−６変異体、それをコー
ドするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を有する発現ベクタ
ー、その発現ベクターにより形質転換された形質転換
体、およびその形質転換体を用いた上記インターロイキ
ン−６変異体に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞の増殖分化に関与する各種サイトカ
イン類が近年になって種々報告されており、医療にも応
用されるにいたっている。その中でもインターロイキン
−６（ＩＬ−６）は、多くの研究者によってＢＳＦ−
２、ＩＦＮβ２などの名称で研究されてきた。ＩＬ−６
は白血球、上皮細胞、繊維芽細胞などで発現され、抗体
産生細胞の増殖、分化をもたらす因子である。ＩＬ−６
はＢ細胞刺激活性とともに、インターロイキン３と協同
で血小板増殖活性を示すことができるトロンボポエチン
としても注目を浴びている。
イン類が近年になって種々報告されており、医療にも応
用されるにいたっている。その中でもインターロイキン
−６（ＩＬ−６）は、多くの研究者によってＢＳＦ−
２、ＩＦＮβ２などの名称で研究されてきた。ＩＬ−６
は白血球、上皮細胞、繊維芽細胞などで発現され、抗体
産生細胞の増殖、分化をもたらす因子である。ＩＬ−６
はＢ細胞刺激活性とともに、インターロイキン３と協同
で血小板増殖活性を示すことができるトロンボポエチン
としても注目を浴びている。
【０００３】ＩＬ−６の遺伝子配列に関する研究も多く
の研究者によって行われてきたが、その中でChernajovs
kyらはインターフェロンベーター２と命名された２６Ｋ
Ｄａ蛋白質の部分配列を明らかにした(Chernajovsky et
al,1984,DNA,3,297) 。また、Zilberstein らは全長配
列の決定に成功している（EMBO J.,1986,5,2529)。一
方、HiranoらはＢ細胞刺激因子（ＢＳＦ−２）の全遺伝
子配列を決定した(Nature,324,73,1986)。また、Braken
hoffらのＨＧＦの一次構造解析の結果(J.Immunol.,139,
4116,1987)からＨＧＦ、ＩＦＮβ２、２６ＫＤａ蛋白
質、ＢＳＦ−２が同一物質であることが明らかになって
いる。
の研究者によって行われてきたが、その中でChernajovs
kyらはインターフェロンベーター２と命名された２６Ｋ
Ｄａ蛋白質の部分配列を明らかにした(Chernajovsky et
al,1984,DNA,3,297) 。また、Zilberstein らは全長配
列の決定に成功している（EMBO J.,1986,5,2529)。一
方、HiranoらはＢ細胞刺激因子（ＢＳＦ−２）の全遺伝
子配列を決定した(Nature,324,73,1986)。また、Braken
hoffらのＨＧＦの一次構造解析の結果(J.Immunol.,139,
4116,1987)からＨＧＦ、ＩＦＮβ２、２６ＫＤａ蛋白
質、ＢＳＦ−２が同一物質であることが明らかになって
いる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】前記のような多彩な生
理活性を有するＩＬ−６の大量生産については、その医
療上の有用性から多くの開発が進められている。しかし
ながら、細菌内のＩＬ−６の生産量はあまり高くない。
また分子内に４個のシステイン残基があるため、分子間
または分子内の望ましくない結合を自由に形成する可能
性があり、特に精製時において誤ったジスルフィド結合
の形成が起こることが多く、精製を難しくし、回収率を
低下させている。
理活性を有するＩＬ−６の大量生産については、その医
療上の有用性から多くの開発が進められている。しかし
ながら、細菌内のＩＬ−６の生産量はあまり高くない。
また分子内に４個のシステイン残基があるため、分子間
または分子内の望ましくない結合を自由に形成する可能
性があり、特に精製時において誤ったジスルフィド結合
の形成が起こることが多く、精製を難しくし、回収率を
低下させている。
【０００５】ジスルフィド結合を含まないＩＬ−６変異
体としてＩＬ−６中の４個のシステイン残基をすべてセ
リン残基に変換してなるＩＬ−６変異体が知られている
（特表平４−５０３３０１号公報参照）。この変異体は
大腸菌などの細菌を用いた組み換えＤＮＡ技術で製造さ
れている。この変異体は上記システイン残基に起因する
問題点の回避はできるが、ＩＬ−６同様比較的高分子量
のタンパク質であり、その発現量は十分とはいえないも
のであった。
体としてＩＬ−６中の４個のシステイン残基をすべてセ
リン残基に変換してなるＩＬ−６変異体が知られている
（特表平４−５０３３０１号公報参照）。この変異体は
大腸菌などの細菌を用いた組み換えＤＮＡ技術で製造さ
れている。この変異体は上記システイン残基に起因する
問題点の回避はできるが、ＩＬ−６同様比較的高分子量
のタンパク質であり、その発現量は十分とはいえないも
のであった。
【０００６】一方従来、微生物を用いて有用タンパク質
を生産させようとする場合、組み換えＤＮＡの宿主とし
て大腸菌、枯草菌、および酵母サッカロミセス セレビ
ジエなどが汎用されてきた。このような宿主に、目的と
する異種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を含む
発現ベクターを導入し、この発現系を用いて目的とする
タンパク質を多量に製造する方法が広く検討され、既に
一部のタンパク質の製造に実用化されている。
を生産させようとする場合、組み換えＤＮＡの宿主とし
て大腸菌、枯草菌、および酵母サッカロミセス セレビ
ジエなどが汎用されてきた。このような宿主に、目的と
する異種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を含む
発現ベクターを導入し、この発現系を用いて目的とする
タンパク質を多量に製造する方法が広く検討され、既に
一部のタンパク質の製造に実用化されている。
【０００７】組み換えＤＮＡ技術を使用した有用物質の
大量製造を目的とした場合、宿主細胞の選定は重要なポ
イントとなる。したがって、有用物質生産用宿主の選択
範囲を広げておくことは重要である。現在では、上記宿
主・ベクター系以外にもいくつかの系が知られている
［Candida maltosa (J.Bacteriol.,167,561 (Takagi
ら))、Bacillus amyloliquefa-ciens 、Acetobacter ac
eti 、Corynebacterium giutumicum、Pseudomonas puti
daなどがある］。
大量製造を目的とした場合、宿主細胞の選定は重要なポ
イントとなる。したがって、有用物質生産用宿主の選択
範囲を広げておくことは重要である。現在では、上記宿
主・ベクター系以外にもいくつかの系が知られている
［Candida maltosa (J.Bacteriol.,167,561 (Takagi
ら))、Bacillus amyloliquefa-ciens 、Acetobacter ac
eti 、Corynebacterium giutumicum、Pseudomonas puti
daなどがある］。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記ジスル
フィド結合に起因する問題点を解決し、その活性を維持
ないし高めかつ低分子量化する手段、ＩＬ−６の発現量
を高める方策などを提供するものである。また、そのＩ
Ｌ−６変異体を組み換えＤＮＡ技術で製造するための手
段を提供するものである。
フィド結合に起因する問題点を解決し、その活性を維持
ないし高めかつ低分子量化する手段、ＩＬ−６の発現量
を高める方策などを提供するものである。また、そのＩ
Ｌ−６変異体を組み換えＤＮＡ技術で製造するための手
段を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者は、天然のヒト
ＩＬ−６のアミノ酸配列の特定部分を欠失させることに
よりジスルフィド結合に起因する問題点の低減や十分な
解決が可能となり、しかもＩＬ−６の活性を維持ないし
高めることができることを見いだした。このＩＬ−６変
異体は血小板増殖剤、免疫グロブリン産生刺激剤などの
目的で使用することが可能である。
ＩＬ−６のアミノ酸配列の特定部分を欠失させることに
よりジスルフィド結合に起因する問題点の低減や十分な
解決が可能となり、しかもＩＬ−６の活性を維持ないし
高めることができることを見いだした。このＩＬ−６変
異体は血小板増殖剤、免疫グロブリン産生刺激剤などの
目的で使用することが可能である。
【００１０】本発明は、ヒトインターロイキン−６のア
ミノ酸配列において、Ｎ−末端から５番目のGly から１
９番目のLeu までの欠失、Ｎ−末端から４４番目のCys
から５０番目のCys までの欠失、およびＮ−末端から７
３番目のCys から８３番目のCys までの欠失から選ばれ
る少なくとも一つの欠失を有するアミノ酸配列からなる
インターロイキン−６変異体、である。
ミノ酸配列において、Ｎ−末端から５番目のGly から１
９番目のLeu までの欠失、Ｎ−末端から４４番目のCys
から５０番目のCys までの欠失、およびＮ−末端から７
３番目のCys から８３番目のCys までの欠失から選ばれ
る少なくとも一つの欠失を有するアミノ酸配列からなる
インターロイキン−６変異体、である。
【００１１】本発明のＩＬ−６変異体は、２か所のシス
テイン残基間のジスルフィド結合によって生じているポ
リペプチドのループを除去することによって本来の立体
構造をよく保つという特徴を有し、また他の１か所の欠
失も活性に対する影響が少ない。これにより、タンパク
質の低分子化も同時に行われ医薬品としてより有効とな
ると考えられる。
テイン残基間のジスルフィド結合によって生じているポ
リペプチドのループを除去することによって本来の立体
構造をよく保つという特徴を有し、また他の１か所の欠
失も活性に対する影響が少ない。これにより、タンパク
質の低分子化も同時に行われ医薬品としてより有効とな
ると考えられる。
【００１２】天然ヒトＩＬ−６は１８４個のアミノ酸残
基を有するタンパク質であり、そのアミノ酸配列および
そのＤＮＡ配列は公知である。その配列を図１に示す。
このアミノ酸配列において、Ｎ−末端から５番目のGly
から１９番目のLeu までの欠失、Ｎ−末端から４４番目
のCys から５０番目のCys までの欠失、およびＮ−末端
から７３番目のCys から８３番目のCys までの欠失、の
３か所（それぞれの位置を図１下線部分に示す）の内少
なくとも１か所欠失したものが本発明のＩＬ−６変異体
である。
基を有するタンパク質であり、そのアミノ酸配列および
そのＤＮＡ配列は公知である。その配列を図１に示す。
このアミノ酸配列において、Ｎ−末端から５番目のGly
から１９番目のLeu までの欠失、Ｎ−末端から４４番目
のCys から５０番目のCys までの欠失、およびＮ−末端
から７３番目のCys から８３番目のCys までの欠失、の
３か所（それぞれの位置を図１下線部分に示す）の内少
なくとも１か所欠失したものが本発明のＩＬ−６変異体
である。
【００１３】後述の実施例の活性データが示すように、
特にＮ−末端から５番目のGly から１９番目のLeu まで
の欠失（さらに、加えてＮ−末端から４４番目のCys か
ら５０番目のCys までの欠失を有していてもよい）ＩＬ
−６変異体が高い活性を有する。Ｎ−末端から４４番目
のCys から５０番目のCys までの欠失を有するＩＬ−６
変異体が次に高い活性を有する。Ｎ−末端から７３番目
のCys から８３番目のCys までの欠失は特に高い活性を
もたらすものではない（特に、さらに加えて他の欠失の
１〜２を有するもの）が、この部分の欠失はタンパク質
の分子量を下げてＩＬ−６変異体の製造を容易にすると
考えられる。
特にＮ−末端から５番目のGly から１９番目のLeu まで
の欠失（さらに、加えてＮ−末端から４４番目のCys か
ら５０番目のCys までの欠失を有していてもよい）ＩＬ
−６変異体が高い活性を有する。Ｎ−末端から４４番目
のCys から５０番目のCys までの欠失を有するＩＬ−６
変異体が次に高い活性を有する。Ｎ−末端から７３番目
のCys から８３番目のCys までの欠失は特に高い活性を
もたらすものではない（特に、さらに加えて他の欠失の
１〜２を有するもの）が、この部分の欠失はタンパク質
の分子量を下げてＩＬ−６変異体の製造を容易にすると
考えられる。
【００１４】本発明ＩＬ−６変異体で好ましいものは、
Ｎ−末端から５番目のGly から１９番目のLeu までの欠
失、およびＮ−末端から４４番目のCys から５０番目の
Cysまでの欠失から選ばれる少なくとも１つの欠失を有
するＩＬ−６変異体である。特に好ましい本発明ＩＬ−
６変異体は、Ｎ−末端から５番目のGly から１９番目の
Leu までの欠失、およびＮ−末端から４４番目のCys か
ら５０番目のCys までの欠失の２つの欠失を有するＩＬ
−６変異体である。
Ｎ−末端から５番目のGly から１９番目のLeu までの欠
失、およびＮ−末端から４４番目のCys から５０番目の
Cysまでの欠失から選ばれる少なくとも１つの欠失を有
するＩＬ−６変異体である。特に好ましい本発明ＩＬ−
６変異体は、Ｎ−末端から５番目のGly から１９番目の
Leu までの欠失、およびＮ−末端から４４番目のCys か
ら５０番目のCys までの欠失の２つの欠失を有するＩＬ
−６変異体である。
【００１５】後述配列番号１〜７に本発明ＩＬ−６変異
体７種のアミノ酸配列、およびそのＤＮＡ配列を示す。
本発明のＤＮＡ配列はこの配列表に記載されたＤＮＡ配
列に限定されるものではないが、この配列表に記載され
たＤＮＡ配列が好ましい。なお、表１に実施例で製造し
た本発明ＩＬ−６変異体名、欠失アミノ酸番号、および
対応する配列表記載配列番号を示す。
体７種のアミノ酸配列、およびそのＤＮＡ配列を示す。
本発明のＤＮＡ配列はこの配列表に記載されたＤＮＡ配
列に限定されるものではないが、この配列表に記載され
たＤＮＡ配列が好ましい。なお、表１に実施例で製造し
た本発明ＩＬ−６変異体名、欠失アミノ酸番号、および
対応する配列表記載配列番号を示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】前記したようにＮ−末端から７３番目のCy
s から８３番目のCys までの欠失は特に高い活性をもた
らすものではなく、活性の面からはこの部分は存在して
いた方がよいと考えられる。本発明ＩＬ−６変異体にお
いてＮ−末端から７３番目のCys から８３番目のCys ま
での部分が存在している場合、この部分のジスルフィド
結合の存在による問題は、場合により前記公知の発明
（特表平４−５０３３０１号公報参照）を適用すること
で解決できると考えられる。すなわち、この部分のシス
テイン残基をすべてセリン残基に変換することができ
る。Ｎ−末端から４４番目のCys から５０番目のCys ま
での部分が存在する本発明ＩＬ−６変異体においても同
様である。
s から８３番目のCys までの欠失は特に高い活性をもた
らすものではなく、活性の面からはこの部分は存在して
いた方がよいと考えられる。本発明ＩＬ−６変異体にお
いてＮ−末端から７３番目のCys から８３番目のCys ま
での部分が存在している場合、この部分のジスルフィド
結合の存在による問題は、場合により前記公知の発明
（特表平４−５０３３０１号公報参照）を適用すること
で解決できると考えられる。すなわち、この部分のシス
テイン残基をすべてセリン残基に変換することができ
る。Ｎ−末端から４４番目のCys から５０番目のCys ま
での部分が存在する本発明ＩＬ−６変異体においても同
様である。
【００１８】本発明のＩＬ−６変異体は、よく知られた
ペプチドの液相合成法や固相合成法で製造することが可
能である。しかしその分子量が比較的高い点を考慮する
と組み換えＤＮＡ技術で製造する方が有利であると考え
られる。本発明者はこのような現状に鑑み、組み換えＤ
ＮＡ技術およびＰＣＲ法を用いて上記構成アミノ酸の欠
損したＩＬ−６変異体を構築し、菌体内での生産能、安
定性の向上、活性の上昇および生物活性の変化につき鋭
意研究したところ、これらの目的に叶う上記ＩＬ−６変
異体を組み換えＤＮＡ技術で製造するための方法を見い
だした。
ペプチドの液相合成法や固相合成法で製造することが可
能である。しかしその分子量が比較的高い点を考慮する
と組み換えＤＮＡ技術で製造する方が有利であると考え
られる。本発明者はこのような現状に鑑み、組み換えＤ
ＮＡ技術およびＰＣＲ法を用いて上記構成アミノ酸の欠
損したＩＬ−６変異体を構築し、菌体内での生産能、安
定性の向上、活性の上昇および生物活性の変化につき鋭
意研究したところ、これらの目的に叶う上記ＩＬ−６変
異体を組み換えＤＮＡ技術で製造するための方法を見い
だした。
【００１９】本発明は、上記ＩＬ−６変異体を組み換え
ＤＮＡ技術で製造するための上記ＩＬ−６変異体のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を有
する発現ベクター、その発現ベクターで形質転換された
形質転換体、およびその形質転換体を用いる上記ＩＬ−
６変異体の製造方法に関する下記の発明である。
ＤＮＡ技術で製造するための上記ＩＬ−６変異体のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を有
する発現ベクター、その発現ベクターで形質転換された
形質転換体、およびその形質転換体を用いる上記ＩＬ−
６変異体の製造方法に関する下記の発明である。
【００２０】前記インターロイキン−６変異体をコード
するＤＮＡ配列。上記ＤＮＡ配列を有する発現ベクタ
ー。上記発現ベクターにより形質転換された形質転換
体。上記形質転換体を培地にて培養し、培養物中に前記
インターロイキン−６変異体を生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とするインターロイキン−６変異体
の製造方法。
するＤＮＡ配列。上記ＤＮＡ配列を有する発現ベクタ
ー。上記発現ベクターにより形質転換された形質転換
体。上記形質転換体を培地にて培養し、培養物中に前記
インターロイキン−６変異体を生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とするインターロイキン−６変異体
の製造方法。
【００２１】本発明者は、前記ＩＬ−６変異体の大量製
造の目的のため、宿主の選択肢としてシゾサッカロミセ
ス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）［以下、S.
pombe という］を用いることを見いだした。S.pombe は
分裂酵母 Schizosaccharomyces属の酵母である。本酵母
は酵母類の中では動物細胞に近い性質を示すことが知ら
れており、たとえばその糖鎖については動物細胞のもの
と類似していることが報告されている。その結果、生物
学的に高い活性を示すと共に、構造上安定な前記ＩＬ−
６変異体を効率よく創生することができた。本発明は、
S.pombe で発現しうる上記発現ベクター、S.pombe を宿
主とする上記形質転換体、およびその形質転換体を用い
た上記ＩＬ−６変異体の製造方法である。
造の目的のため、宿主の選択肢としてシゾサッカロミセ
ス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）［以下、S.
pombe という］を用いることを見いだした。S.pombe は
分裂酵母 Schizosaccharomyces属の酵母である。本酵母
は酵母類の中では動物細胞に近い性質を示すことが知ら
れており、たとえばその糖鎖については動物細胞のもの
と類似していることが報告されている。その結果、生物
学的に高い活性を示すと共に、構造上安定な前記ＩＬ−
６変異体を効率よく創生することができた。本発明は、
S.pombe で発現しうる上記発現ベクター、S.pombe を宿
主とする上記形質転換体、およびその形質転換体を用い
た上記ＩＬ−６変異体の製造方法である。
【００２２】本発明の組み換えＤＮＡ技術による製造方
法によって、ＩＬ−６の持つ生理活性をより増強あるい
は保持し、より安定な構造を持つと共に、分裂酵母によ
り大量に発現させることが可能となった。
法によって、ＩＬ−６の持つ生理活性をより増強あるい
は保持し、より安定な構造を持つと共に、分裂酵母によ
り大量に発現させることが可能となった。
【００２３】本発明の発現ベクターは、ＩＬ−６変異体
をコードするＤＮＡ配列に加え、さらに真核細胞宿主内
において機能する複製開始点、および動物細胞ウイルス
由来のプロモーター領域を含むことが好ましい。さらに
この動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域はＳＶ４
０あるいはサイトメガロウイルス由来のプロモーター領
域であることが好ましい。また、本発明の発現ベクター
は、さらに加えてネオマイシン耐性遺伝子領域、LEU ２
遺伝子領域、およびURA ３遺伝子領域の少なくとも１種
を含むことが好ましい。ＩＬ−６変異体をコードするＤ
ＮＡ配列を除き、このような遺伝子領域を有する発現ベ
クターやその構築手段としてはたとえば本発明者らの発
明にかかわる特開平５−１５３８０号公報に記載されて
いる。
をコードするＤＮＡ配列に加え、さらに真核細胞宿主内
において機能する複製開始点、および動物細胞ウイルス
由来のプロモーター領域を含むことが好ましい。さらに
この動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域はＳＶ４
０あるいはサイトメガロウイルス由来のプロモーター領
域であることが好ましい。また、本発明の発現ベクター
は、さらに加えてネオマイシン耐性遺伝子領域、LEU ２
遺伝子領域、およびURA ３遺伝子領域の少なくとも１種
を含むことが好ましい。ＩＬ−６変異体をコードするＤ
ＮＡ配列を除き、このような遺伝子領域を有する発現ベ
クターやその構築手段としてはたとえば本発明者らの発
明にかかわる特開平５−１５３８０号公報に記載されて
いる。
【００２４】本発明の発現ベクターで形質転換される宿
主の微生物としては、前記分裂酵母S.pombe に限られ
ず、大腸菌などの細菌、分裂酵母S.pombe 以外の酵母、
あるいは動物細胞などのいずれでもよい。しかし、前記
のように分裂酵母S.pombe が最も好ましい。
主の微生物としては、前記分裂酵母S.pombe に限られ
ず、大腸菌などの細菌、分裂酵母S.pombe 以外の酵母、
あるいは動物細胞などのいずれでもよい。しかし、前記
のように分裂酵母S.pombe が最も好ましい。
【００２５】次に本発明を実施例をもって具体的に説明
するが、実施例は具体的認識を得るために挙げたもので
あり、本発明を限定するものではない。
するが、実施例は具体的認識を得るために挙げたもので
あり、本発明を限定するものではない。
【００２６】
【実施例】以下の実施例、参考例において使用した方法
やキットは特に言及しない限り以下のものを使用した。 ＤＮＡの精製および回収：ガラスビーズ法（旭硝子
（株）製「ＤＮＡ ＰＲＥＰ」（商品名）使用）。 ライゲーション：ライゲーションキット（宝酒造（株）
販売）を使用。
やキットは特に言及しない限り以下のものを使用した。 ＤＮＡの精製および回収：ガラスビーズ法（旭硝子
（株）製「ＤＮＡ ＰＲＥＰ」（商品名）使用）。 ライゲーション：ライゲーションキット（宝酒造（株）
販売）を使用。
【００２７】「参考例１」 ［ベクターpRL2M の作製］公知の方法で調製したベクタ
ーpcD4B （特開平５−１５３８０号公報参照）を制限酵
素SacIで消化後、末端をT4 DNAポリメラーゼで平滑化
し、さらに制限酵素BamHI で消化した後、フェノール抽
出およびエタノール沈殿によって核酸分画を回収した。
さらにアガロースゲル電気泳動後、ガラスビーズ法によ
って約4500塩基対に相当するＤＮＡを精製した。
ーpcD4B （特開平５−１５３８０号公報参照）を制限酵
素SacIで消化後、末端をT4 DNAポリメラーゼで平滑化
し、さらに制限酵素BamHI で消化した後、フェノール抽
出およびエタノール沈殿によって核酸分画を回収した。
さらにアガロースゲル電気泳動後、ガラスビーズ法によ
って約4500塩基対に相当するＤＮＡを精製した。
【００２８】別に、やはり公知の方法で調製した、ヒト
リポコルチンＩ遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクターpcDl
ipoI（特開平５−１５３８０号公報参照）を制限酵素Xm
nIおよびBamHI で消化した後、フェノール抽出およびエ
タノール沈殿によって核酸分画を回収した。さらにアガ
ロースゲル電気泳動後約1300塩基対に相当するＤＮＡを
精製した。
リポコルチンＩ遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクターpcDl
ipoI（特開平５−１５３８０号公報参照）を制限酵素Xm
nIおよびBamHI で消化した後、フェノール抽出およびエ
タノール沈殿によって核酸分画を回収した。さらにアガ
ロースゲル電気泳動後約1300塩基対に相当するＤＮＡを
精製した。
【００２９】両ＤＮＡをライゲーションした後、大腸菌
ＤＨ５（東洋紡（株）販売）を形質転換した。得られた
形質転換体よりベクターを調製し、目的とするベクター
pRL2L （図２）を持った形質転換体をスクリーニングし
た。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から
目的のベクターであることを確認した。
ＤＨ５（東洋紡（株）販売）を形質転換した。得られた
形質転換体よりベクターを調製し、目的とするベクター
pRL2L （図２）を持った形質転換体をスクリーニングし
た。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から
目的のベクターであることを確認した。
【００３０】このリポコルチンＩ発現ベクターpRL2L を
制限酵素EcoRI およびHidIIIで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約5000塩基対に相当するバンドを切出して精製した。
別に、公知のベクターpUC19 を制限酵素EcoRI およびHi
dIIIで消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動より約60塩基対に相当
するバンドを切出し、ゲルから抽出精製した。
制限酵素EcoRI およびHidIIIで消化し、フェノール抽
出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動によ
り約5000塩基対に相当するバンドを切出して精製した。
別に、公知のベクターpUC19 を制限酵素EcoRI およびHi
dIIIで消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動より約60塩基対に相当
するバンドを切出し、ゲルから抽出精製した。
【００３１】これら両者の断片をライゲーションの後、
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターpRL2M
（図３）をスクリーニングした。部分塩基配列の確認お
よび制限酵素地図の作製から目的のベクターであること
を確認した。
大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターpRL2M
（図３）をスクリーニングした。部分塩基配列の確認お
よび制限酵素地図の作製から目的のベクターであること
を確認した。
【００３２】「参考例２」 ［ベクターpTL2M の作製］ベクターpRL2M をテンプレー
トとし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-TTGACTAG
TTATTAATAGTA-3' およびオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド 5'-CTAGAATTCACATGTTTGAAAAAGTGTCTTTATC-3' を合成
プライマーとして、 Taqポリメラーゼを用いたＰＣＲに
よって目的断片を増幅した。制限酵素SpeIおよびEcoRI
で末端を調節し、フェノール抽出、エタノール沈澱の
後、アガロースゲル電気泳動により約600 塩基対に相当
するバンドを切出し、ガラスビーズ法で精製した。
トとし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5'-TTGACTAG
TTATTAATAGTA-3' およびオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド 5'-CTAGAATTCACATGTTTGAAAAAGTGTCTTTATC-3' を合成
プライマーとして、 Taqポリメラーゼを用いたＰＣＲに
よって目的断片を増幅した。制限酵素SpeIおよびEcoRI
で末端を調節し、フェノール抽出、エタノール沈澱の
後、アガロースゲル電気泳動により約600 塩基対に相当
するバンドを切出し、ガラスビーズ法で精製した。
【００３３】別に、ベクターpRL2M を制限酵素SpeIおよ
びEcoRI で消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の
後、アガロースゲル電気泳動より約4500塩基対に相当す
るバンドを切出して精製した。これら両者の断片をライ
ゲーションの後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とす
るベクターpTL2M （図４）をスクリーニングした。部分
塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベ
クターであることを確認した。
びEcoRI で消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の
後、アガロースゲル電気泳動より約4500塩基対に相当す
るバンドを切出して精製した。これら両者の断片をライ
ゲーションの後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とす
るベクターpTL2M （図４）をスクリーニングした。部分
塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベ
クターであることを確認した。
【００３４】「参考例３」 ［ヒトＩＬ−６遺伝子のクローニング］"human periphe
ral blood monocyte (LPS-activated)" (CLONETECH社
製) のｃＤＮＡライブラリーからヒトＩＬ−６ｃＤＮＡ
をオリゴヌクレオチドプローブ法により単離した。ＤＮ
Ａプローブは T.Hirano ら(Hirano,T. et al. Nature,3
24,73-76,1986)により決定されたヒトＩＬ−６の遺伝子
配列に基いて、ＤＮＡ自動合成機（Model 381A、アプラ
イドバイオシステム社) を用いて合成した。
ral blood monocyte (LPS-activated)" (CLONETECH社
製) のｃＤＮＡライブラリーからヒトＩＬ−６ｃＤＮＡ
をオリゴヌクレオチドプローブ法により単離した。ＤＮ
Ａプローブは T.Hirano ら(Hirano,T. et al. Nature,3
24,73-76,1986)により決定されたヒトＩＬ−６の遺伝子
配列に基いて、ＤＮＡ自動合成機（Model 381A、アプラ
イドバイオシステム社) を用いて合成した。
【００３５】合成したＮ端プローブは、 5' CAA CAC CAG GAG CAG CCC CAG GGA GAA GGC AAC TGG
ACC GAA GGC GCT 3' （上記文献中の塩基配列 No.52-99 に対応するアンチセ
ンス）であり、合成したＣ端プローブは、 5' ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG
TTC CTG CAG TCC 3' （上記文献中の塩基配列 No.598-645 に対応する) であ
る。
ACC GAA GGC GCT 3' （上記文献中の塩基配列 No.52-99 に対応するアンチセ
ンス）であり、合成したＣ端プローブは、 5' ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG
TTC CTG CAG TCC 3' （上記文献中の塩基配列 No.598-645 に対応する) であ
る。
【００３６】ｃＤＮＡライブラリーは "λgt 10"をクロ
ーニングベクターとして作成されたものであるので、感
染大腸菌として "Ｃ600"を用い、プラークハイブリダイ
ゼーションにより単離した。具体的な単離方法は CLONE
TECH社の添付マニュアルに従った。
ーニングベクターとして作成されたものであるので、感
染大腸菌として "Ｃ600"を用い、プラークハイブリダイ
ゼーションにより単離した。具体的な単離方法は CLONE
TECH社の添付マニュアルに従った。
【００３７】まず大腸菌 "Ｃ600"の単一コロニーを10ml
のＬＢ培地（0.5% yeast extract,1%peptone,1%NaCl ）
で一晩培養後、ＳＭバッファー (0.1M NaCl,8mM MgSO4・
7H2O,50mM Tris-HCl pH7.5,0.01%ゼラチン) で 1/105希
釈したファージライブラリー0.1ml に、ＳＭバッファー
0.3ml、 "Ｃ600" 0.6mlを加え、37℃で20分間振蘯した
後、３mlのＬＢアガロースを加え混合後ただちにＬＢプ
レート（90mmシャーレ) にまき、10枚分作成した。37℃
で一晩静置したところ１プレートに約１万プラーク出現
した。
のＬＢ培地（0.5% yeast extract,1%peptone,1%NaCl ）
で一晩培養後、ＳＭバッファー (0.1M NaCl,8mM MgSO4・
7H2O,50mM Tris-HCl pH7.5,0.01%ゼラチン) で 1/105希
釈したファージライブラリー0.1ml に、ＳＭバッファー
0.3ml、 "Ｃ600" 0.6mlを加え、37℃で20分間振蘯した
後、３mlのＬＢアガロースを加え混合後ただちにＬＢプ
レート（90mmシャーレ) にまき、10枚分作成した。37℃
で一晩静置したところ１プレートに約１万プラーク出現
した。
【００３８】４℃で１時間放置後ニトロセルロースフィ
ルターをプレートにのせレプリカをとった。次いで1.5M
NaCl/0.5M NaOH 溶液、1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl pH
8.0溶液に浸し、次いでＳＳＣ（0.15M NaClと0.015Mク
エン酸ナトリウムを含むpH7.0のバッファー）で３回洗
浄し、風乾させた後 80 ℃、真空で乾燥させた。ハイブ
リダイゼーション溶液で２時間室温放置後、10万cpm の
32ＰラベルのＣ端プローブをハイブリダイゼーション溶
液に加え65℃一晩放置、翌日ＳＳＣで60℃で10分、50℃
で30分３〜４回フィルターを洗浄し、100-200cpmになる
まで繰り返した。最後に風乾し、オートラジオグラフィ
ーを行った。
ルターをプレートにのせレプリカをとった。次いで1.5M
NaCl/0.5M NaOH 溶液、1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl pH
8.0溶液に浸し、次いでＳＳＣ（0.15M NaClと0.015Mク
エン酸ナトリウムを含むpH7.0のバッファー）で３回洗
浄し、風乾させた後 80 ℃、真空で乾燥させた。ハイブ
リダイゼーション溶液で２時間室温放置後、10万cpm の
32ＰラベルのＣ端プローブをハイブリダイゼーション溶
液に加え65℃一晩放置、翌日ＳＳＣで60℃で10分、50℃
で30分３〜４回フィルターを洗浄し、100-200cpmになる
まで繰り返した。最後に風乾し、オートラジオグラフィ
ーを行った。
【００３９】２回目、３回目のスクリーニングも同様の
方法で行った。ただし、２回目、３回目のスクリーニン
グではＮ端、Ｃ端プローブの両方を用いた。３回目のス
クリーニング後に、ＩＬ−６を持つシングルプラークを
爪楊枝で取り、ＳＭバッファー１mlに懸濁し、ＬＢプレ
ート上にまき、全面溶菌させた。ＳＭバッファー４mlを
加えてファージを採取し、４mlのＮＺＹＣＭ培地で大腸
菌 "Ｃ600"に感染させた。これからMolecular Cloning
の方法に従ってファージＤＮＡを単離した。これをEcoR
I で切断後、ＩＬ−６ｃＤＮＡインサートを単離し、市
販のpUC19 （宝酒造（株）販売）をEcoRI で切断したも
のとこのＩＬ−６ｃＤＮＡインサートを連結し、pAG9-8
-1を作成した。
方法で行った。ただし、２回目、３回目のスクリーニン
グではＮ端、Ｃ端プローブの両方を用いた。３回目のス
クリーニング後に、ＩＬ−６を持つシングルプラークを
爪楊枝で取り、ＳＭバッファー１mlに懸濁し、ＬＢプレ
ート上にまき、全面溶菌させた。ＳＭバッファー４mlを
加えてファージを採取し、４mlのＮＺＹＣＭ培地で大腸
菌 "Ｃ600"に感染させた。これからMolecular Cloning
の方法に従ってファージＤＮＡを単離した。これをEcoR
I で切断後、ＩＬ−６ｃＤＮＡインサートを単離し、市
販のpUC19 （宝酒造（株）販売）をEcoRI で切断したも
のとこのＩＬ−６ｃＤＮＡインサートを連結し、pAG9-8
-1を作成した。
【００４０】「参考例４」 ヒトＩＬ−６の発現ベクターの作製 参考例３で製造したヒトＩＬ−６ｃＤＮＡ全長を含むベ
クターpAG9-8-1をテンプレートとし、オリゴデオキシリ
ボヌクレオチド 5' ATCGCATGCCAGTACCCCCAGGAGAAGA 3'
およびオリゴデオキシリボヌクレオチド 5' TGAAAATCTT
CTCTCATCCG 3'を合成プライマーとして、Taq ポリメラ
ーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅した。
クターpAG9-8-1をテンプレートとし、オリゴデオキシリ
ボヌクレオチド 5' ATCGCATGCCAGTACCCCCAGGAGAAGA 3'
およびオリゴデオキシリボヌクレオチド 5' TGAAAATCTT
CTCTCATCCG 3'を合成プライマーとして、Taq ポリメラ
ーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅した。
【００４１】制限酵素SphIおよびHindIII で末端を調節
し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロース
ゲル電気泳動により約1000塩基対に相当するバンドを切
出し、ガラスビーズ法で精製した。別に、参考例２で作
製したベクターpTL2M を制限酵素AflIIIおよびHindIII
で消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガ
ロースゲル電気泳動より約5000塩基対に相当するバンド
を切出してで精製した。これら両者の断片をライゲーシ
ョンの後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベク
ターpTL26m（図５）をスクリーニングした。部分塩基配
列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクター
であることを確認した。
し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロース
ゲル電気泳動により約1000塩基対に相当するバンドを切
出し、ガラスビーズ法で精製した。別に、参考例２で作
製したベクターpTL2M を制限酵素AflIIIおよびHindIII
で消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガ
ロースゲル電気泳動より約5000塩基対に相当するバンド
を切出してで精製した。これら両者の断片をライゲーシ
ョンの後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベク
ターpTL26m（図５）をスクリーニングした。部分塩基配
列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクター
であることを確認した。
【００４２】「実施例１」 ＩＬ−６変異体(IL-6a')遺伝子およびその発現ベクター
（pTL26a')の作製 以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。 1) 5' GCATGCCAGTACCACCAACCTCTTCAGAACGTATTGACAAACAG
ATTCGGTACATCCT 3' 2) 5' CGTACGGTCATGGTGGTTGGAGAAGTCTTGCATAACTGTTTGTC
TAAGCCATGTAGGAGC 3'
（pTL26a')の作製 以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。 1) 5' GCATGCCAGTACCACCAACCTCTTCAGAACGTATTGACAAACAG
ATTCGGTACATCCT 3' 2) 5' CGTACGGTCATGGTGGTTGGAGAAGTCTTGCATAACTGTTTGTC
TAAGCCATGTAGGAGC 3'
【００４３】１）と２）を各々リン酸化した後（宝酒造
（株）販売 タカラ カイネーションキットを使用）、
クレノー(KLENOW)バッファーを用いて70℃、20分でアニ
ーリングした。また参考例４にて作製したベクターpTL2
6mを制限酵素TaqI、およびEcoRI にて消化し、フェノー
ル抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動
より約900 塩基対に相当するバンドを回収（ガラスビー
ズ法による、以下同様）した。
（株）販売 タカラ カイネーションキットを使用）、
クレノー(KLENOW)バッファーを用いて70℃、20分でアニ
ーリングした。また参考例４にて作製したベクターpTL2
6mを制限酵素TaqI、およびEcoRI にて消化し、フェノー
ル抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動
より約900 塩基対に相当するバンドを回収（ガラスビー
ズ法による、以下同様）した。
【００４４】アニーリングを終えた上記ＤＮＡフラグメ
ントとゲルより抽出したフラグメント（Taq1,EcoR1フラ
グメント）をベクターpUC19 のマルチクローニングサイ
トのEcoR1 、SphIサイトに挿入（ライゲーション) し
た。ＩＬ−６をコードしている部分のシークエンスを確
認後、EcoRI およびSphIにて消化し、フェノール抽出、
エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約96
0 塩基対に相当するバンドを回収した。
ントとゲルより抽出したフラグメント（Taq1,EcoR1フラ
グメント）をベクターpUC19 のマルチクローニングサイ
トのEcoR1 、SphIサイトに挿入（ライゲーション) し
た。ＩＬ−６をコードしている部分のシークエンスを確
認後、EcoRI およびSphIにて消化し、フェノール抽出、
エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約96
0 塩基対に相当するバンドを回収した。
【００４５】一方、参考例２で作製したベクターpTL2M
を制限酵素SphIとSpeIにて消化し、フェノール抽出、エ
タノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約650 塩
基対のバンドを回収した。さらにpTL2M をSpeIおよびEc
oRI にて消化し、フェノール抽出、エタノール沈殿の後
アガロースゲル電気泳動より約960 塩基対のバンドを回
収した。これら回収したフラグメント３本をライゲート
した後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクタ
ーpTL26a' をスクリーニングした。部分塩基配列の確認
および制限酵素地図の作製から目的のベクターであるこ
とを確認した。IL-6a'の構造遺伝子部分およびアミノ酸
配列は配列表配列番号１のとおりである。
を制限酵素SphIとSpeIにて消化し、フェノール抽出、エ
タノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約650 塩
基対のバンドを回収した。さらにpTL2M をSpeIおよびEc
oRI にて消化し、フェノール抽出、エタノール沈殿の後
アガロースゲル電気泳動より約960 塩基対のバンドを回
収した。これら回収したフラグメント３本をライゲート
した後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクタ
ーpTL26a' をスクリーニングした。部分塩基配列の確認
および制限酵素地図の作製から目的のベクターであるこ
とを確認した。IL-6a'の構造遺伝子部分およびアミノ酸
配列は配列表配列番号１のとおりである。
【００４６】「実施例２」 ＩＬ−６変異体(IL-6C1)遺伝子およびその発現ベクター
（pTL26C1)の作製 以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。 1)5' TTGACTAGTTATTAATAGTA 3' 2)5' TGTCTCCTTTCTCAGGGCTGA 3' 3)5' GAAAGCAGCAAAGAGGCACTG 3' 4)5' TAGCGGAGTGTATACTGGCT 3'
（pTL26C1)の作製 以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。 1)5' TTGACTAGTTATTAATAGTA 3' 2)5' TGTCTCCTTTCTCAGGGCTGA 3' 3)5' GAAAGCAGCAAAGAGGCACTG 3' 4)5' TAGCGGAGTGTATACTGGCT 3'
【００４７】参考例４にて作製したベクターpTL26mをテ
ンプレートとして上記プライマー１）、２）を用いてＰ
ＣＲを行った。クロロホルム処理、エタノール沈殿の後
ブランチング処理（宝酒造（株）販売 タカラ ブラン
チングキットを使用、以下同様）をし、フェノール、ク
ロロホルム処理、エタノール沈殿をした。その後Ｔ４ポ
リヌクレオチドカイネースを用いてカイネーション処理
を行いエタノール沈殿を行った。さらに制限酵素SpeIに
て消化した後アガロースゲル電気泳動を行い、約750 塩
基対に相当するバンドを回収し、これをフラグメントＡ
とした。
ンプレートとして上記プライマー１）、２）を用いてＰ
ＣＲを行った。クロロホルム処理、エタノール沈殿の後
ブランチング処理（宝酒造（株）販売 タカラ ブラン
チングキットを使用、以下同様）をし、フェノール、ク
ロロホルム処理、エタノール沈殿をした。その後Ｔ４ポ
リヌクレオチドカイネースを用いてカイネーション処理
を行いエタノール沈殿を行った。さらに制限酵素SpeIに
て消化した後アガロースゲル電気泳動を行い、約750 塩
基対に相当するバンドを回収し、これをフラグメントＡ
とした。
【００４８】一方上記プライマー３）、４）を用いて上
記と全く同様のことを行いアガロースゲル電気泳動を行
い約1600塩基対に相当するバンドを回収し、これをフラ
グメントＢとした。
記と全く同様のことを行いアガロースゲル電気泳動を行
い約1600塩基対に相当するバンドを回収し、これをフラ
グメントＢとした。
【００４９】これらとは別に参考例２で作製したベクタ
ーpTL2M をSpeIおよびEcoRI にて消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約
960塩基対のバンドを回収した。この回収したフラグメ
ントおよび上記フラグメントＡとフラグメントＢ３本を
ライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的と
するベクターpTL26C1 をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。IL-6C1の構造遺伝子部分およ
びアミノ酸配列は配列表配列番号２のとおりである。
ーpTL2M をSpeIおよびEcoRI にて消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約
960塩基対のバンドを回収した。この回収したフラグメ
ントおよび上記フラグメントＡとフラグメントＢ３本を
ライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的と
するベクターpTL26C1 をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。IL-6C1の構造遺伝子部分およ
びアミノ酸配列は配列表配列番号２のとおりである。
【００５０】「実施例３」 ＩＬ−６変異体(IL-6C2)遺伝子およびその発現ベクター
(pTL26C2) の作製 以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。 1)5' TTGACTAGTTATTAATAGTA 3' 2)5' TCCATCTTTTTCAGCCATCTT 3' 3)5' CTGGTGAAAATCATCACTGGT 3' 4)5' TAGCGGAGTGTATACTGGCT 3'
(pTL26C2) の作製 以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。 1)5' TTGACTAGTTATTAATAGTA 3' 2)5' TCCATCTTTTTCAGCCATCTT 3' 3)5' CTGGTGAAAATCATCACTGGT 3' 4)5' TAGCGGAGTGTATACTGGCT 3'
【００５１】参考例４にて作製したpTL26mをテンプレー
トとして上記プライマー１）、２）を用いてＰＣＲを行
った。クロロホルム処理、エタノール沈殿の後ブランチ
ング処理をし、フェノール、クロロホルム処理、エタノ
ール沈殿をした。その後Ｔ４ポリヌクレオチドカイネー
スを用いてカイネーション処理を行いエタノール沈殿を
行った。さらに制限酵素SpeIにて消化したのちアガロー
スゲル電気泳動を行い、約840 塩基対に相当するバンド
を回収し、これをフラグメントＡとした。
トとして上記プライマー１）、２）を用いてＰＣＲを行
った。クロロホルム処理、エタノール沈殿の後ブランチ
ング処理をし、フェノール、クロロホルム処理、エタノ
ール沈殿をした。その後Ｔ４ポリヌクレオチドカイネー
スを用いてカイネーション処理を行いエタノール沈殿を
行った。さらに制限酵素SpeIにて消化したのちアガロー
スゲル電気泳動を行い、約840 塩基対に相当するバンド
を回収し、これをフラグメントＡとした。
【００５２】一方上記プライマー３）、４）を用いて上
記と全く同様のことを行いアガロースゲル電気泳動を行
い約1500塩基対に相当するバンドを回収し、これをフラ
グメントＢとした。
記と全く同様のことを行いアガロースゲル電気泳動を行
い約1500塩基対に相当するバンドを回収し、これをフラ
グメントＢとした。
【００５３】これらとは別に参考例２で作製したベクタ
ーpTL2M をSpeIおよびEcoRI にて消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約
960塩基対のバンドを回収した。この回収したフラグメ
ントおよび上記フラグメントＡとフラグメントＢ３本を
ライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的と
するベクターpTL26C2 をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。IL-6C2の構造遺伝子部分およ
びアミノ酸配列は配列表配列番号３のとおりである。
ーpTL2M をSpeIおよびEcoRI にて消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約
960塩基対のバンドを回収した。この回収したフラグメ
ントおよび上記フラグメントＡとフラグメントＢ３本を
ライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的と
するベクターpTL26C2 をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。IL-6C2の構造遺伝子部分およ
びアミノ酸配列は配列表配列番号３のとおりである。
【００５４】「実施例４」 ＩＬ−６変異体(IL-6C3)遺伝子およびその発現ベクター
(pTL26C3) の作製 以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。 1)5' TTGACTAGTTATTAATAGTA 3' 2)5' TCCATCTTTTTCAGCCATCTT 3' 3)5' CTGGTGAAAATCATCACTGGT 3' 4)5' TAGCGGAGTGTATACTGGCT 3'
(pTL26C3) の作製 以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。 1)5' TTGACTAGTTATTAATAGTA 3' 2)5' TCCATCTTTTTCAGCCATCTT 3' 3)5' CTGGTGAAAATCATCACTGGT 3' 4)5' TAGCGGAGTGTATACTGGCT 3'
【００５５】実施例２にて作製したpTL2C1をテンプレー
トとして上記プライマー１）、２）を用いてＰＣＲを行
った。クロロホルム処理、エタノール沈殿の後ブランチ
ング処理をし、フェノール、クロロホルム処理、エタノ
ールを沈殿をした。その後Ｔ４ポリヌクレオチドカイネ
ースを用いてカイネーション処理を行いエタノール沈殿
を行った。さらに制限酵素SpeIにて消化したのちアガロ
ースゲル電気泳動を行い、約800 塩基対に相当するバン
ドを回収し、これをフラグメントＡとした。
トとして上記プライマー１）、２）を用いてＰＣＲを行
った。クロロホルム処理、エタノール沈殿の後ブランチ
ング処理をし、フェノール、クロロホルム処理、エタノ
ールを沈殿をした。その後Ｔ４ポリヌクレオチドカイネ
ースを用いてカイネーション処理を行いエタノール沈殿
を行った。さらに制限酵素SpeIにて消化したのちアガロ
ースゲル電気泳動を行い、約800 塩基対に相当するバン
ドを回収し、これをフラグメントＡとした。
【００５６】一方上記プライマー３）、４）を用いて、
参考例４にて得たベクターpTL26mをテンプレートとして
上記と全く同様のことを行いアガロースゲル電気泳動を
行い約1500塩基対に相当するバンドを回収し、これをフ
ラグメントＢとした。
参考例４にて得たベクターpTL26mをテンプレートとして
上記と全く同様のことを行いアガロースゲル電気泳動を
行い約1500塩基対に相当するバンドを回収し、これをフ
ラグメントＢとした。
【００５７】これらとは別に参考例２で作製したベクタ
ーpTL2M をSpeIおよびEcoRI にて消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約
960塩基対のバンドを回収した。この回収したフラグメ
ントおよび上記フラグメントＡとフラグメントＢ３本を
ライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的と
するベクターpTL26C3 をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。IL-6C3の構造遺伝子部分およ
びアミノ酸配列は配列表配列番号４のとおりである。
ーpTL2M をSpeIおよびEcoRI にて消化し、フェノール抽
出、エタノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約
960塩基対のバンドを回収した。この回収したフラグメ
ントおよび上記フラグメントＡとフラグメントＢ３本を
ライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的と
するベクターpTL26C3 をスクリーニングした。部分塩基
配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクタ
ーであることを確認した。IL-6C3の構造遺伝子部分およ
びアミノ酸配列は配列表配列番号４のとおりである。
【００５８】「実施例５」 ＩＬ−６変異体(IL-6a'C1)遺伝子、およびその発現ベク
ター(pTL26a'C1) の作製
ター(pTL26a'C1) の作製
【００５９】実施例１にて得たpTL26a' を制限酵素SpeI
とTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行
い、約680 塩基対に相当するバンドを回収した。また実
施例２にて得たpTL26C1 を制限酵素EcoRI とTaqIにて消
化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約880 塩基
対に相当するバンドを回収した。さらに参考例２で作製
したベクターpTL2M を制限酵素SpeIとEcoRI にて消化し
たのちアガロースゲル電気泳動を行い、約4400塩基対に
相当するバンドを回収した。
とTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行
い、約680 塩基対に相当するバンドを回収した。また実
施例２にて得たpTL26C1 を制限酵素EcoRI とTaqIにて消
化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約880 塩基
対に相当するバンドを回収した。さらに参考例２で作製
したベクターpTL2M を制限酵素SpeIとEcoRI にて消化し
たのちアガロースゲル電気泳動を行い、約4400塩基対に
相当するバンドを回収した。
【００６０】これら３本のフラグメントをライゲートし
た後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするpTL26a'C
1 をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制
限酵素地図の作製から目的のベクターである事を確認し
た。IL-6a'C1の構造遺伝子部分およびアミノ酸配列は配
列表配列番号５のとおりである。
た後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするpTL26a'C
1 をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制
限酵素地図の作製から目的のベクターである事を確認し
た。IL-6a'C1の構造遺伝子部分およびアミノ酸配列は配
列表配列番号５のとおりである。
【００６１】「実施例６」 ＩＬ−６変異体(IL-6a'C2)遺伝子、およびその発現ベク
ター(pTL26a'C2) の作製
ター(pTL26a'C2) の作製
【００６２】実施例１にて得たpTL26a' を制限酵素SpeI
とTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行
い、約680 塩基対に相当するバンドを回収した。また実
施例３にて得たpTL26C2 を制限酵素EcoRI とTaqIにて消
化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約870 塩基
対に相当するバンドを回収した。さらに参考例２で作製
したベクターpTL2M を制限酵素SpeIとEcoRI にて消化し
たのちアガロースゲル電気泳動を行い、約4400塩基対に
相当するバンドを回収した。
とTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行
い、約680 塩基対に相当するバンドを回収した。また実
施例３にて得たpTL26C2 を制限酵素EcoRI とTaqIにて消
化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約870 塩基
対に相当するバンドを回収した。さらに参考例２で作製
したベクターpTL2M を制限酵素SpeIとEcoRI にて消化し
たのちアガロースゲル電気泳動を行い、約4400塩基対に
相当するバンドを回収した。
【００６３】これら３本のフラグメントをライゲートし
た後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクター
pTL26a'C2 をスクリーニングした。部分塩基配列の確認
および制限酵素地図の作製から目的のベクターであるこ
とを確認した。IL-6a'C2の構造遺伝子部分およびアミノ
酸配列は配列表配列番号６のとおりである。
た後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクター
pTL26a'C2 をスクリーニングした。部分塩基配列の確認
および制限酵素地図の作製から目的のベクターであるこ
とを確認した。IL-6a'C2の構造遺伝子部分およびアミノ
酸配列は配列表配列番号６のとおりである。
【００６４】「実施例７」 ＩＬ−６変異体(IL-6a'C3)遺伝子、およびその発現ベク
ター(pTL26a'C3) の作製
ター(pTL26a'C3) の作製
【００６５】実施例１にて得たpTL26a' を制限酵素SpeI
とTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行
い、約680 塩基対に相当するバンドを回収した。また実
施例４にて得たpTL26C3 を制限酵素EcoRI とTaqIにて消
化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約850 塩基
対に相当するバンドを回収した。さらに参考例２で作製
したpTL2M を制限酵素SpeIとEcoRI にて消化したのちア
ガロースゲル電気泳動を行い、約4400塩基対に相当する
バンドを回収した。これら３本のフラグメントをライゲ
ートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベ
クターpTL26a'C3をスクリーニングした。部分塩基配列
の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターで
あることを確認した。IL-6a'C3の構造遺伝子部分および
アミノ酸配列は配列表配列番号７のとおりである。
とTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行
い、約680 塩基対に相当するバンドを回収した。また実
施例４にて得たpTL26C3 を制限酵素EcoRI とTaqIにて消
化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約850 塩基
対に相当するバンドを回収した。さらに参考例２で作製
したpTL2M を制限酵素SpeIとEcoRI にて消化したのちア
ガロースゲル電気泳動を行い、約4400塩基対に相当する
バンドを回収した。これら３本のフラグメントをライゲ
ートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベ
クターpTL26a'C3をスクリーニングした。部分塩基配列
の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターで
あることを確認した。IL-6a'C3の構造遺伝子部分および
アミノ酸配列は配列表配列番号７のとおりである。
【００６６】「実施例８」 ＩＬ−６およびＩＬ−６変異体の発現
【００６７】S.pombe のロイシン要求性株、leu1-32h
-(ATCC38399)を最少培地で0.8 ×１０７細胞数／ｍｌに
なるまで生育させた。集菌、洗菌後109 細胞数／mlにな
るように0.1 モル酢酸リチウム（pH5.0)に懸濁し、30℃
で60分間インキュベートした。その後、上記懸濁液 100
μl にベクターpAL7（Okazaki,K.et.al. Nucleic Acids
Res.18,6485）をPstIで切断したＤＮＡを１μｇ、実施
例１〜７で得たベクター各々２μｇをＴＥ（トリスEDT
A）15μl に溶かして加え、50%(W/V)ポリエチレングリ
コールPEG4000 水溶液を 290μl 加えよく混合したのち
30℃で60分間、43℃で15分間、室温で10分間の順にイン
キュベートした。
-(ATCC38399)を最少培地で0.8 ×１０７細胞数／ｍｌに
なるまで生育させた。集菌、洗菌後109 細胞数／mlにな
るように0.1 モル酢酸リチウム（pH5.0)に懸濁し、30℃
で60分間インキュベートした。その後、上記懸濁液 100
μl にベクターpAL7（Okazaki,K.et.al. Nucleic Acids
Res.18,6485）をPstIで切断したＤＮＡを１μｇ、実施
例１〜７で得たベクター各々２μｇをＴＥ（トリスEDT
A）15μl に溶かして加え、50%(W/V)ポリエチレングリ
コールPEG4000 水溶液を 290μl 加えよく混合したのち
30℃で60分間、43℃で15分間、室温で10分間の順にイン
キュベートした。
【００６８】遠心によりPEG4000 を除去し、培養液１μ
l に懸濁した。このうち 100μl を分取し、 900μl の
培養液を加えて、32℃30分間インキュベートした。うち
300μl を最少寒天培地にスプレッドした。32℃で３日
間インキュベートし、形質転換体をＧ４１８（ネオマイ
シン）を含むプレートに移し、さらに32℃で５日間培養
した。得られたものがＩＬ−６およびＩＬ−６変異体の
形質転換体である。
l に懸濁した。このうち 100μl を分取し、 900μl の
培養液を加えて、32℃30分間インキュベートした。うち
300μl を最少寒天培地にスプレッドした。32℃で３日
間インキュベートし、形質転換体をＧ４１８（ネオマイ
シン）を含むプレートに移し、さらに32℃で５日間培養
した。得られたものがＩＬ−６およびＩＬ−６変異体の
形質転換体である。
【００６９】これらの形質転換体を２％グルコース、１
％イースト抽出液、２％ペプトン、およびＧ４１８を 2
00μg/mlを含む液体培地（ＹＰＤ培地）50mlで32℃、３
日間培養した。その培養液から菌体を 106細胞/ml 程度
になるようにＹＰＤ培地１リットルに植える。32℃、３
日間培養した後集菌、洗菌し、50ミリモルNaCl、５ミリ
モルＥＤＴＡを含む50ミリモルトリス塩酸緩衝液(pH7.
5) に懸濁し、超音波破砕を行った。超音波破砕後１％
ＳＤＳ存在下に80℃、10分間熱処理した後、遠心分離し
て上清を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）（ＴＥＦＣＯ16％
ゲルを使用）によって発現の様子を調べた。
％イースト抽出液、２％ペプトン、およびＧ４１８を 2
00μg/mlを含む液体培地（ＹＰＤ培地）50mlで32℃、３
日間培養した。その培養液から菌体を 106細胞/ml 程度
になるようにＹＰＤ培地１リットルに植える。32℃、３
日間培養した後集菌、洗菌し、50ミリモルNaCl、５ミリ
モルＥＤＴＡを含む50ミリモルトリス塩酸緩衝液(pH7.
5) に懸濁し、超音波破砕を行った。超音波破砕後１％
ＳＤＳ存在下に80℃、10分間熱処理した後、遠心分離し
て上清を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）（ＴＥＦＣＯ16％
ゲルを使用）によって発現の様子を調べた。
【００７０】ヒトＩＬ−６およびＩＬ−６変異体に相当
する分子量15,000〜21,000附近の位置にコントロールS.
pombe/pTL2M （コントロール）からの抽出液には見られ
ない明瞭なバンドが検出できた（図６）。各ＩＬ−６変
異体の発現量は、デンシトメーターにて測定したとこ
ろ、どれも全菌体タンパク質の10wt％以上であり、中で
もIL-6C1およびIL-6a'C1については25wt％と発現量が増
大していることが確認された。また、ヒトＩＬ−６特異
的な抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、ヒ
トＩＬ−６であることを確認した（図７）。
する分子量15,000〜21,000附近の位置にコントロールS.
pombe/pTL2M （コントロール）からの抽出液には見られ
ない明瞭なバンドが検出できた（図６）。各ＩＬ−６変
異体の発現量は、デンシトメーターにて測定したとこ
ろ、どれも全菌体タンパク質の10wt％以上であり、中で
もIL-6C1およびIL-6a'C1については25wt％と発現量が増
大していることが確認された。また、ヒトＩＬ−６特異
的な抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、ヒ
トＩＬ−６であることを確認した（図７）。
【００７１】図６は各変異体を発現している酵母粗抽出
液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図であり、１〜９の各レーンは以
下の通りである。 １；S.pombe ／pTL2M （コントロール） ２；S.pombe ／pTL26m ３；S.pombe ／pTL26a' ４；S.pombe ／pTL26a'C1 ５；S.pombe ／pTL26a'C2 ６；S.pombe ／pTL26a'C3 ７；S.pombe ／pTL26C1 ８；S.pombe ／pTL26C2 ９；S.pombe ／pTL26C3
液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図であり、１〜９の各レーンは以
下の通りである。 １；S.pombe ／pTL2M （コントロール） ２；S.pombe ／pTL26m ３；S.pombe ／pTL26a' ４；S.pombe ／pTL26a'C1 ５；S.pombe ／pTL26a'C2 ６；S.pombe ／pTL26a'C3 ７；S.pombe ／pTL26C1 ８；S.pombe ／pTL26C2 ９；S.pombe ／pTL26C3
【００７２】図７は各変異体を発現している酵母粗抽出
液のウエスタンブロッティング図であり、１〜９の各レ
ーンは以下の通りである。 １；S.pombe ／pTL2M （コントロール） ２；S.pombe ／pTL26m ３；S.pombe ／pTL26a' ４；S.pombe ／pTL26a'C1 ５；S.pombe ／pTL26a'C2 ６；S.pombe ／pTL26a'C3 ７；S.pombe ／pTL26C1 ８；S.pombe ／pTL26C2 ９；S.pombe ／pTL26C3
液のウエスタンブロッティング図であり、１〜９の各レ
ーンは以下の通りである。 １；S.pombe ／pTL2M （コントロール） ２；S.pombe ／pTL26m ３；S.pombe ／pTL26a' ４；S.pombe ／pTL26a'C1 ５；S.pombe ／pTL26a'C2 ６；S.pombe ／pTL26a'C3 ７；S.pombe ／pTL26C1 ８；S.pombe ／pTL26C2 ９；S.pombe ／pTL26C3
【００７３】「実施例９」 酵母で発現されたＩＬ−６およびＩＬ−６変異体の精製
【００７４】実施例８で発現されたＩＬ−６およびＩＬ
−６変異体は以下のようにして精製した。ＩＬ−６およ
びＩＬ−６変異体を発現している酵母は、50ミリモルNa
Cl、1.5ミリモルＥＤＴＡを含むトリス塩酸(pH7.5) バ
ッファーに懸濁、1,000 回転５分の遠心上清を、さらに
15,000回転20分の遠心で沈査を得た。この分画を6Mグア
ニジン塩酸にて可溶化した後、バイオゲルｐ６によって
脱塩した。ボイドボリューム分画を直接ＨＰＬＣを用い
た逆相カラムクロマトグラフィーにチャージし精製ＩＬ
−６およびＩＬ−６変異体を得た。
−６変異体は以下のようにして精製した。ＩＬ−６およ
びＩＬ−６変異体を発現している酵母は、50ミリモルNa
Cl、1.5ミリモルＥＤＴＡを含むトリス塩酸(pH7.5) バ
ッファーに懸濁、1,000 回転５分の遠心上清を、さらに
15,000回転20分の遠心で沈査を得た。この分画を6Mグア
ニジン塩酸にて可溶化した後、バイオゲルｐ６によって
脱塩した。ボイドボリューム分画を直接ＨＰＬＣを用い
た逆相カラムクロマトグラフィーにチャージし精製ＩＬ
−６およびＩＬ−６変異体を得た。
【００７５】0.1％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含
む水溶液にて吸着させた後30％アセトニトリルを含む
0.1％ＴＦＡ水溶液にてカラムを洗った。その後80％ま
で上昇させてＩＬ−６およびＩＬ−６変異体を溶出させ
た。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＴＥＦＣＯ16％ゲルを使
用）により検定することができクマシーブリリアントブ
ルー染色により、それぞれ唯一のバンドを確認した（図
８）。
む水溶液にて吸着させた後30％アセトニトリルを含む
0.1％ＴＦＡ水溶液にてカラムを洗った。その後80％ま
で上昇させてＩＬ−６およびＩＬ−６変異体を溶出させ
た。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＴＥＦＣＯ16％ゲルを使
用）により検定することができクマシーブリリアントブ
ルー染色により、それぞれ唯一のバンドを確認した（図
８）。
【００７６】図８は精製された各ＩＬ−６変異体のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ図であり、１〜８の各レーンは以下の通り
である。 １；IL-6（コントロール） ２；IL-6C1 ３；IL-6C2 ４；IL-6C3 ５；IL-6a' ６；IL-6a'C1 ７；IL-6a'C2 ８；IL-6a'C3
Ｓ−ＰＡＧＥ図であり、１〜８の各レーンは以下の通り
である。 １；IL-6（コントロール） ２；IL-6C1 ３；IL-6C2 ４；IL-6C3 ５；IL-6a' ６；IL-6a'C1 ７；IL-6a'C2 ８；IL-6a'C3
【００７７】「実施例１０」 ＩＬ−６およびＩＬ−６変異体の生物学的活性
【００７８】（１）７ＴＤ１細胞の増殖活性測定 100μl の培養液（ＲＰＭＩ１６４０：GABCO 社製）中
にサンプルを10倍ずつ希釈したものをつくり、その中で
２×103 個の７ＴＤ１細胞( マウス−マウスハイブリッ
ド) を37℃で４日間培養した。その後ＭＴＴ（細胞増殖
測定キット：CHEMICON社製）を用いて、細胞数を測定し
た。
にサンプルを10倍ずつ希釈したものをつくり、その中で
２×103 個の７ＴＤ１細胞( マウス−マウスハイブリッ
ド) を37℃で４日間培養した。その後ＭＴＴ（細胞増殖
測定キット：CHEMICON社製）を用いて、細胞数を測定し
た。
【００７９】（２）ＨｅｐＧ２からのフィブリノーゲン
の産生 ２ｘ105 個のＨｅｐＧ２細胞（ヒトヘパトーマ）を24穴
プレートにて１マイクロモルのデキサメタゾン、２％Ｆ
ＣＳ（牛胎児血清）を含んだＭＥＭ培地を用いて24時間
培養した後、種々の濃度のサンプルを含んだ上記培地(5
00μl)に交換して18時間培養した後、同じサンプルを含
んだ培地(400μl)で交換しさらに６時間培養したところ
で培養を終え、培地に産生されたフィブリノーゲン濃度
をＥＬＩＳＡ法により測定した。
の産生 ２ｘ105 個のＨｅｐＧ２細胞（ヒトヘパトーマ）を24穴
プレートにて１マイクロモルのデキサメタゾン、２％Ｆ
ＣＳ（牛胎児血清）を含んだＭＥＭ培地を用いて24時間
培養した後、種々の濃度のサンプルを含んだ上記培地(5
00μl)に交換して18時間培養した後、同じサンプルを含
んだ培地(400μl)で交換しさらに６時間培養したところ
で培養を終え、培地に産生されたフィブリノーゲン濃度
をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００８０】（３）巨核球の増殖促進活性測定 Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨より骨髄細胞を採取し、
10％ Horse serumを含んだイスコフ液にて45分間処理し
て接着細胞を除去した後、２倍ずつ希釈した試料を含ん
だ 100μl のイスコフ液に105 の細胞を含んだ 100μl
のイスコフ液を添加し、６日間、37℃にて培養した。培
養終了後培養、上清を除去した後 180μl の細胞破砕液
（0.2% Triton X-100/1mM EDTA、0.12M NaClを含んだ50
mM HEPESバッファー pH7.5) を添加し、さらに20μl の
アセチルチオコリン（終濃度0.56mM）を添加して室温に
て３時間放置した。その後各20μl を96穴プレートに分
注し、そこに20μl の0.4mM ７−ジエチルアミノ−３−
（４’−マレイミジルフェニル）−４−メチルクマリン
を加えさらに160 μl の希釈溶液（0.2% TritonX-100、
1mM EDTAを含んだ50mM酢酸ナトリウム pH5.0）を添加
後、蛍光強度を測定した(390 nmEX 、450nm EM）。
10％ Horse serumを含んだイスコフ液にて45分間処理し
て接着細胞を除去した後、２倍ずつ希釈した試料を含ん
だ 100μl のイスコフ液に105 の細胞を含んだ 100μl
のイスコフ液を添加し、６日間、37℃にて培養した。培
養終了後培養、上清を除去した後 180μl の細胞破砕液
（0.2% Triton X-100/1mM EDTA、0.12M NaClを含んだ50
mM HEPESバッファー pH7.5) を添加し、さらに20μl の
アセチルチオコリン（終濃度0.56mM）を添加して室温に
て３時間放置した。その後各20μl を96穴プレートに分
注し、そこに20μl の0.4mM ７−ジエチルアミノ−３−
（４’−マレイミジルフェニル）−４−メチルクマリン
を加えさらに160 μl の希釈溶液（0.2% TritonX-100、
1mM EDTAを含んだ50mM酢酸ナトリウム pH5.0）を添加
後、蛍光強度を測定した(390 nmEX 、450nm EM）。
【００８１】（１）〜（３）に示した方法を用いてＩＬ
−６およびＩＬ−６変異体の生物学的活性を測定した。
その結果を表２に示す。表２中の各数値は最大活性の50
％を示すに必要な試料の濃度を表す。
−６およびＩＬ−６変異体の生物学的活性を測定した。
その結果を表２に示す。表２中の各数値は最大活性の50
％を示すに必要な試料の濃度を表す。
【００８２】これからIL-6a'、IL-6C1、IL-6a'C1につい
ては、天然型の活性と同等あるいはそれ以上（２〜８
倍）の活性を持ちながら低分子化に成功したことがわか
る。Cys 44からCys 50までのジスルフィド結合により形
成された領域、およびGly ５からLeu 19の領域は活性に
は直接影響のないことがわかった。IL-6C2、IL-6C3、IL
-6a'C2、IL-6a'C3については、生物学的活性が有意に減
少している。Cys 73とCys 83との間に形成されたジスル
フィド結合は天然のＩＬ−６［表２中「(IL-6)」で示
す］の安定化に重要な役割を果たしていることを示して
いる。
ては、天然型の活性と同等あるいはそれ以上（２〜８
倍）の活性を持ちながら低分子化に成功したことがわか
る。Cys 44からCys 50までのジスルフィド結合により形
成された領域、およびGly ５からLeu 19の領域は活性に
は直接影響のないことがわかった。IL-6C2、IL-6C3、IL
-6a'C2、IL-6a'C3については、生物学的活性が有意に減
少している。Cys 73とCys 83との間に形成されたジスル
フィド結合は天然のＩＬ−６［表２中「(IL-6)」で示
す］の安定化に重要な役割を果たしていることを示して
いる。
【００８３】
【表２】
【００８４】以上の結果をまとめると、Ｎ−末端付近の
15アミノ酸、および／またはCys −Cys によってできる
ペプチドループを欠落させることにより天然型と同等あ
るいはそれ以上の活性を保ちつつ低分子量化することに
成功した。IL-6C1、IL-6a'C1については、産生量の増大
に成功した。発現に都合の悪いコドンを持ったアミノ酸
が除去されたためと考えられる。IL-6a'以外の変異体に
関しては精製効率が向上したが、これはCys の持つＳＨ
基によるジスルフィド結合が除去されたため、３次構造
形成時における誤りが減少したためであろう。またCys
の持つＳＨ基によるジスルフィド結合が除去されたため
に酸化／還元のどちらの状態にも安定に存在できること
が示唆される。さらに酵母を用いて生産すれば大腸菌に
て生産された場合と異なり、発熱などの副作用の原因と
なる大腸菌由来の不純物がなく安全性が高い。
15アミノ酸、および／またはCys −Cys によってできる
ペプチドループを欠落させることにより天然型と同等あ
るいはそれ以上の活性を保ちつつ低分子量化することに
成功した。IL-6C1、IL-6a'C1については、産生量の増大
に成功した。発現に都合の悪いコドンを持ったアミノ酸
が除去されたためと考えられる。IL-6a'以外の変異体に
関しては精製効率が向上したが、これはCys の持つＳＨ
基によるジスルフィド結合が除去されたため、３次構造
形成時における誤りが減少したためであろう。またCys
の持つＳＨ基によるジスルフィド結合が除去されたため
に酸化／還元のどちらの状態にも安定に存在できること
が示唆される。さらに酵母を用いて生産すれば大腸菌に
て生産された場合と異なり、発熱などの副作用の原因と
なる大腸菌由来の不純物がなく安全性が高い。
【００８５】
【発明の効果】天然のＩＬ−６に比較して、低分子量の
ＩＬ−６変異体が得られ、その構造上の安定性が向上し
た。しかも、天然型と同等あるいはそれ以上の生理活性
を保持しているＩＬ−６変異体を得ることができた。
ＩＬ−６変異体が得られ、その構造上の安定性が向上し
た。しかも、天然型と同等あるいはそれ以上の生理活性
を保持しているＩＬ−６変異体を得ることができた。
【００８６】また、組み換えＤＮＡ技術を用いてこのＩ
Ｌ−６変異体を製造することができた。すなわち、酵母
S. pombe内で発現することができる新規なベクターを用
いてS. pombeにより効率よくこのＩＬ−６変異体を産生
させることができ、またその産生量を増大させることが
できた。
Ｌ−６変異体を製造することができた。すなわち、酵母
S. pombe内で発現することができる新規なベクターを用
いてS. pombeにより効率よくこのＩＬ−６変異体を産生
させることができ、またその産生量を増大させることが
できた。
【００８７】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：507 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 変性ｃＤＮＡ 配列 CCA GTA CCA CCA ACC TCT TCA GAA CGT ATT GAC AAA CAG ATT CGG TAC 48 Pro Val Pro Pro Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr 1 5 10 15 ATC CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT 96 Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser 20 25 30 AAC ATG TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC 144 Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn 35 40 45 CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA TTC AAT 192 Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn 50 55 60 GAG GAG ACT TGC CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG 240 Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu 65 70 75 80 GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA 288 Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln 85 90 95 GCC AGA GCT GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG 336 Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln 100 105 110 AAA AAG GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA 384 Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr 115 120 125 AAT GCC AGC CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG 432 Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln 130 135 140 GAC ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG 480 Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln 145 150 155 160 TCC AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG 507 Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 165 配列番号：２ 配列の長さ：531 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 変性ｃＤＮＡ 配列 CCA GTA CCC CCA GGA GAA GAT TCC AAA GAT GTA GCC GCC CCA CAC AGA 48 Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg 1 5 10 15 CAG CCA CTC ACC TCT TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC 96 Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile 20 25 30 CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA GAA AGC AGC AAA GAG 144 Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Glu Ser Ser Lys Glu 35 40 45 GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT 192 Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp 50 55 60 GGA TGC TTC CAA TCT GGA TTC AAT GAG GAG ACT TGC CTG GTG AAA ATC 240 Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile 65 70 75 80 ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC 288 Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn 85 90 95 AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTC CAG ATG AGT ACA 336 Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr 100 105 110 AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA GAT GCA 384 Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala 115 120 125 ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC CTG CTG ACG AAG CTG 432 Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu 130 135 140 CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG 480 Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu 145 150 155 160 CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA 528 Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln 165 170 175 ATG 531 Met 177 配列番号：３ 配列の長さ：519 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 変性ｃＤＮＡ 配列 CCA GTA CCC CCA GGA GAA GAT TCC AAA GAT GTA GCC GCC CCA CAC AGA 48 Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg 1 5 10 15 CAG CCA CTC ACC TCT TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC 96 Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile 20 25 30 CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC 144 Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn 35 40 45 ATG TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT 192 Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu 50 55 60 CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT 240 Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG AGT 288 Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser 85 90 95 AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC 336 Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile 100 105 110 CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC CCT 384 Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro 115 120 125 GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC 432 Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn 130 135 140 CAG TGG CTG CAG GAC ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG 480 Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys 145 150 155 160 GAG TTC CTG CAG TCC AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG 519 Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 165 170 173 配列番号：４ 配列の長さ：498 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 変性ｃＤＮＡ 配列 CCA GTA CCC CCA GGA GAA GAT TCC AAA GAT GTA GCC GCC CCA CAC AGA 48 Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg 1 5 10 15 CAG CCA CTC ACC TCT TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC 96 Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile 20 25 30 CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA GAA AGC AGC AAA GAG 144 Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Glu Ser Ser Lys Glu 35 40 45 GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT 192 Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp 50 55 60 GGA CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA 240 Gly Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu 65 70 75 80 GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT 288 Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala 85 90 95 GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA 336 Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala 100 105 110 AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC 384 Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser 115 120 125 CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG ACA 432 Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr 130 135 140 ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC AGC CTG 480 Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu 145 150 155 160 AGG GCT CTT CGG CAA ATG 498 Arg Ala Leu Arg Gln Met 165 166 配列番号：５ 配列の長さ：４８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 変性ｃＤＮＡ 配列 ＣＣＡ ＧＴＡ ＣＣＣ ＣＣＡ ＡＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＧＡＡ ＣＧＡ
ＡＴＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＴＴ ＣＧＧ ＴＡＣ 48 Pro Val Pro Pro Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr 1 5 10 15 ATC CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA GAA AGC AGC AAA 96 Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Glu Ser Ser Lys 20 25 30 GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA 144 Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys 35 40 45 GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA TTC AAT GAG GAG ACT TGC CTG GTG AAA 192 Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys 50 55 60 ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG 240 Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTC CAG ATG AGT 288 Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser 85 90 95 ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA GAT 336 Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp 100 105 110 GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC CTG CTG ACG AAG 384 Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys 115 120 125 CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG ACA ACT CAT CTC ATT 432 Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile 130 135 140 CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC AGC CTG AGG GCT CTT CGG 480 Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg 145 150 155 160 CAA ATG 486 Gln Met 162 配列番号：６ 配列の長さ：474 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 変性ｃＤＮＡ 配列 CCA GTA CCC CCA ACC TCT TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC 48 Pro Val Pro Pro Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr 1 5 10 15 ATC CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT 96 Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser 20 25 30 AAC ATG TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC 144 Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn 35 40 45 CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT 192 Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly 50 55 60 CTT TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG 240 Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu 65 70 75 80 AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG 288 Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu 85 90 95 ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC 336 Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr 100 105 110 CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG 384 Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln 115 120 125 AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT 432 Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe 130 135 140 AAG GAG TTC CTG CAG TCC AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG 474 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 145 150 155 158 配列番号：７ 配列の長さ：453 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 変性ｃＤＮＡ 配列 CCA GTA CCC CCA ACC TCT TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC 48 Pro Val Pro Pro Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr 1 5 10 15 ATC CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA GAA AGC AGC AAA 96 Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Glu Ser Ser Lys 20 25 30 GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA 144 Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys 35 40 45 GAT GGA CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA TAC 192 Asp Gly Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr 50 55 60 CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA 240 Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg 65 70 75 80 GCT GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG 288 Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys 85 90 95 GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC 336 Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala 100 105 110 AGC CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG 384 Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met 115 120 125 ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC AGC 432 Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser 130 135 140 CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG 453 Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 145 150 151
ＡＴＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＴＴ ＣＧＧ ＴＡＣ 48 Pro Val Pro Pro Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr 1 5 10 15 ATC CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA GAA AGC AGC AAA 96 Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Glu Ser Ser Lys 20 25 30 GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA 144 Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys 35 40 45 GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA TTC AAT GAG GAG ACT TGC CTG GTG AAA 192 Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys 50 55 60 ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG 240 Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTC CAG ATG AGT 288 Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser 85 90 95 ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA GAT 336 Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp 100 105 110 GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC CTG CTG ACG AAG 384 Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys 115 120 125 CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG ACA ACT CAT CTC ATT 432 Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile 130 135 140 CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC AGC CTG AGG GCT CTT CGG 480 Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg 145 150 155 160 CAA ATG 486 Gln Met 162 配列番号：６ 配列の長さ：474 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 変性ｃＤＮＡ 配列 CCA GTA CCC CCA ACC TCT TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC 48 Pro Val Pro Pro Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr 1 5 10 15 ATC CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT 96 Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser 20 25 30 AAC ATG TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC 144 Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn 35 40 45 CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT 192 Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly 50 55 60 CTT TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG 240 Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu 65 70 75 80 AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG 288 Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu 85 90 95 ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC 336 Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr 100 105 110 CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC AGC CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG 384 Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln 115 120 125 AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT 432 Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe 130 135 140 AAG GAG TTC CTG CAG TCC AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG 474 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 145 150 155 158 配列番号：７ 配列の長さ：453 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 変性ｃＤＮＡ 配列 CCA GTA CCC CCA ACC TCT TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC 48 Pro Val Pro Pro Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr 1 5 10 15 ATC CTC GAC GGC ATC TCA GCC CTG AGA AAG GAG ACA GAA AGC AGC AAA 96 Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Glu Ser Ser Lys 20 25 30 GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT CCA AAG ATG GCT GAA AAA 144 Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys 35 40 45 GAT GGA CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA TAC 192 Asp Gly Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr 50 55 60 CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA 240 Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg 65 70 75 80 GCT GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA AAG 288 Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys 85 90 95 GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT GCC 336 Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala 100 105 110 AGC CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG 384 Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met 115 120 125 ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC AGC 432 Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser 130 135 140 CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG 453 Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 145 150 151
【図１】ヒトＩＬ−６のアミノ酸配列
【図２】pRL2L のベクター構成図
【図３】pRL2M のベクター構成図
【図４】pTL2M のベクター構成図
【図５】pTL26mのベクター構成図
【図６】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図
【図７】ウエスタンブロッティング図
【図８】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＢ ＡＢＹ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:85） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＹ
Claims (14)
- 【請求項１】ヒトインターロイキン−６のアミノ酸配列
において、Ｎ−末端から５番目のGly から１９番目のLe
u までの欠失、Ｎ−末端から４４番目のCys から５０番
目のCys までの欠失、およびＮ−末端から７３番目のCy
s から８３番目のCys までの欠失から選ばれる少なくと
も一つの欠失を有するアミノ酸配列からなるインターロ
イキン−６変異体。 - 【請求項２】ヒトインターロイキン−６のアミノ酸配列
において、Ｎ−末端から５番目のGly から１９番目のLe
u までを欠失しているアミノ酸配列からなるインターロ
イキン−６変異体。 - 【請求項３】ヒトインターロイキン−６のアミノ酸配列
において、Ｎ−末端から４４番目のCys から５０番目の
Cys までを欠失しているアミノ酸配列からなるインター
ロイキン−６変異体。 - 【請求項４】ヒトインターロイキン−６のアミノ酸配列
において、Ｎ−末端から５番目のGly から１９番目のLe
u までを欠失し、かつ、Ｎ−末端から４４番目のCys か
ら５０番目のCys までを欠失しているアミノ酸配列から
なるインターロイキン−６変異体。 - 【請求項５】組み換えＤＮＡ技術によって得られたイン
ターロイキン−６変異体である、請求項１〜４から選ば
れる一のインターロイキン−６変異体。 - 【請求項６】請求項１〜４から選ばれる一のインターロ
イキン−６変異体をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項７】請求項６のＤＮＡ配列を有する発現ベクタ
ー。 - 【請求項８】さらに、真核細胞宿主内において機能する
複製開始点、および動物細胞ウイルス由来のプロモータ
ー領域を含む、請求項７の発現ベクター。 - 【請求項９】真核細胞宿主が酵母シゾサッカロミセス
ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）である、請求項
８の発現ベクター。 - 【請求項１０】動物細胞ウイルス由来のプロモーター領
域が、ＳＶ４０あるいはサイトメガロウイルス由来のプ
ロモーター領域である、請求項８の発現ベクター。 - 【請求項１１】さらに、ネオマイシン耐性遺伝子領域、
LEU ２遺伝子領域、およびURA ３遺伝子領域の少なくと
も一つの領域を含む、請求項７〜１０から選ばれる一の
発現ベクター。 - 【請求項１２】請求項８〜１１から選ばれる一の発現ベ
クターにより形質転換された形質転換体。 - 【請求項１３】宿主が酵母シゾサッカロミセス ポンベ
（Schizosaccharomyces pombe ）である、請求項１２の
形質転換体。 - 【請求項１４】請求項１２または１３の形質転換体を培
地にて培養し、培養物中に請求項１〜４に記載のいずれ
か一のインターロイキン−６変異体を生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とするインターロイキン−６
変異体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01446194A JP3687105B2 (ja) | 1994-02-08 | 1994-02-08 | インターロイキン−６変異体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01446194A JP3687105B2 (ja) | 1994-02-08 | 1994-02-08 | インターロイキン−６変異体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07224097A true JPH07224097A (ja) | 1995-08-22 |
| JP3687105B2 JP3687105B2 (ja) | 2005-08-24 |
Family
ID=11861697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01446194A Expired - Lifetime JP3687105B2 (ja) | 1994-02-08 | 1994-02-08 | インターロイキン−６変異体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3687105B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100426286B1 (ko) * | 1996-01-09 | 2004-06-30 | 주식회사 엘지생명과학 | 효모를이용한인간인터루킨-11의제조방법 |
-
1994
- 1994-02-08 JP JP01446194A patent/JP3687105B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100426286B1 (ko) * | 1996-01-09 | 2004-06-30 | 주식회사 엘지생명과학 | 효모를이용한인간인터루킨-11의제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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