JPH07225231A - アルツハイマー病の診断方法 - Google Patents
アルツハイマー病の診断方法Info
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- JPH07225231A JPH07225231A JP5181273A JP18127393A JPH07225231A JP H07225231 A JPH07225231 A JP H07225231A JP 5181273 A JP5181273 A JP 5181273A JP 18127393 A JP18127393 A JP 18127393A JP H07225231 A JPH07225231 A JP H07225231A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 アルツハイマー病の個体をスクリーニングす
る方法、アルツハイマー病に特徴的なカルシウム依存性
中性プロテイナーゼのアイソフォームと免疫化学的に反
応する抗体、およびアルツハイマー病を治療もしくは予
防するのに有効な薬剤をスクリーニングする方法を開示
する。 【構成】 アルツハイマー病および対照の、特に試料中
のμCANPの76kDaアイソフォーム／80kDaのアイソフォー
ムの比率の測定結果に基づいて、上記の方法を実施す
る。
る方法、アルツハイマー病に特徴的なカルシウム依存性
中性プロテイナーゼのアイソフォームと免疫化学的に反
応する抗体、およびアルツハイマー病を治療もしくは予
防するのに有効な薬剤をスクリーニングする方法を開示
する。 【構成】 アルツハイマー病および対照の、特に試料中
のμCANPの76kDaアイソフォーム／80kDaのアイソフォー
ムの比率の測定結果に基づいて、上記の方法を実施す
る。
Description
【０００１】
【産業上の技術分野】本発明は米国政府の援助によって
行われた。したがって米国政府は本発明に所定の権利を
有する。
行われた。したがって米国政府は本発明に所定の権利を
有する。
【０００２】本発明はアルツハイマー病について患者を
スクリーニングするのに抗体を利用する医薬診断方法に
関する。
スクリーニングするのに抗体を利用する医薬診断方法に
関する。
【０００３】
【従来の技術】シナプスの消失および神経細胞の死は、
アルツハイマー病の知的機能障害の程度に非常によく相
関している（Terryら、Ann. Neurol. 30巻572〜580頁19
91年；Hamosら、Ann. Neurol.39巻355頁 1991年；Dekos
kyおよびScheff, Ann.Nerrol.27巻457〜464頁1990
年）。これらの病理所見は生物化学のレベルではまだ解
明されていないが、アルツハイマー病の多くの推定病因
因子が細胞のカルシウムホメオスタシスを障害する共通
性を有しており（Khachaturian, Z.S., Aging 1(1)巻17
〜34頁1989年）、アルツハイマー組織におけるこのよう
な障害についていくつかの証拠がある（Colvin, R.A.
ら、Brain Res. 543巻139〜147頁1991年；Peterson, C.
S, N.Engl.J.Med.312（16）巻1063〜1064頁1985年；Pet
erson & Goldman,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 83巻2758〜
2762頁1986年Rizopoulos, E. ら、BrainRes. Bull. 21
巻825〜828頁1988年；Peterson, C.ら、Neurosci. Let
t.121巻239〜243頁1991年；IacopinoおよびChristakos,
Proc. Natl, Acad. Sci. USA 87巻4078〜4082頁1990
年；Gibson, G.E.ら、Biol. Psychiatry 22巻1079〜108
6頁1987年）。
アルツハイマー病の知的機能障害の程度に非常によく相
関している（Terryら、Ann. Neurol. 30巻572〜580頁19
91年；Hamosら、Ann. Neurol.39巻355頁 1991年；Dekos
kyおよびScheff, Ann.Nerrol.27巻457〜464頁1990
年）。これらの病理所見は生物化学のレベルではまだ解
明されていないが、アルツハイマー病の多くの推定病因
因子が細胞のカルシウムホメオスタシスを障害する共通
性を有しており（Khachaturian, Z.S., Aging 1(1)巻17
〜34頁1989年）、アルツハイマー組織におけるこのよう
な障害についていくつかの証拠がある（Colvin, R.A.
ら、Brain Res. 543巻139〜147頁1991年；Peterson, C.
S, N.Engl.J.Med.312（16）巻1063〜1064頁1985年；Pet
erson & Goldman,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 83巻2758〜
2762頁1986年Rizopoulos, E. ら、BrainRes. Bull. 21
巻825〜828頁1988年；Peterson, C.ら、Neurosci. Let
t.121巻239〜243頁1991年；IacopinoおよびChristakos,
Proc. Natl, Acad. Sci. USA 87巻4078〜4082頁1990
年；Gibson, G.E.ら、Biol. Psychiatry 22巻1079〜108
6頁1987年）。
【０００４】カルシウム依存性中性プロテイナーゼ（CA
NP：Calcium Activated Neutral Proteinases）は、伝
達機構の制御に関与する一群のプロテイナーゼである
（Pontremoli, S.ら、Proc, Natl, Acad. Sci. USA 87
巻370〜3707頁1990年；Piggott,M.A.ら、Brain Res. 56
5巻42〜47頁1991年；Adunsky, A.ら、J.Neuroimmunolog
y33巻167〜172頁1991年；Suzuki & Ohno, Cell Struct.
Funct. 15巻１〜６頁1990年；Murachi, I.,Biochm. In
ternatl. 18(2)巻263〜294頁1989年）。CANPによる限定
的なタンパク質分解反応は、カルシウム依存性プロテイ
ンキナーゼとプロテインホスファターゼと神経伝達物質
酵素を含む重要な酵素群の制御ならびに膜および膜骨格
タンパク質の機能の制御に関与している（Togari, A.
ら、Biochem.Biophys. Res. Commun.134(2)巻749〜754
頁1968年；Kishimoto, A.ら、J. Biol. Chem. 258巻115
6〜1164頁1983年；Tallant, E. A.ら、Biochem. 27巻22
05〜2211頁1988年；Nixon, R.A., Ann. N.Y. Acad. Sc
i. 568巻198〜208頁1989年）。興奮性アミノ酸神経毒
（excitatoxicity）と虚血の場合に起こるCANPの異常な
活性化は、急速な不可逆性のニューロン障害を誘発する
（Siman,R.ら、J. Nerrosci.９巻1579〜1590頁1989年；
Siman,R.,"Neurotoxicity of Excitatory Amino Acid
s", A. Guidotti編集、Raven Press社、New York, 145
〜161頁1990年；Lee, K.S.ら、Proc. Natl. Acad. USA
88巻7233〜7347頁1991年）。しかし以前の報告は、CANP
の全活性はアルツハイマー病の脳では有意に変化してい
ないことを指摘している（Kawashima, S.ら、Biomed. R
es. 10(1)巻17〜23頁1989年；Mantle &Perry, J. Neuro
l. Sci. 102巻220〜224頁1991年；Nilsson, E.ら、Neur
obiol.Aging 11巻425〜431頁1990頁）。
NP：Calcium Activated Neutral Proteinases）は、伝
達機構の制御に関与する一群のプロテイナーゼである
（Pontremoli, S.ら、Proc, Natl, Acad. Sci. USA 87
巻370〜3707頁1990年；Piggott,M.A.ら、Brain Res. 56
5巻42〜47頁1991年；Adunsky, A.ら、J.Neuroimmunolog
y33巻167〜172頁1991年；Suzuki & Ohno, Cell Struct.
Funct. 15巻１〜６頁1990年；Murachi, I.,Biochm. In
ternatl. 18(2)巻263〜294頁1989年）。CANPによる限定
的なタンパク質分解反応は、カルシウム依存性プロテイ
ンキナーゼとプロテインホスファターゼと神経伝達物質
酵素を含む重要な酵素群の制御ならびに膜および膜骨格
タンパク質の機能の制御に関与している（Togari, A.
ら、Biochem.Biophys. Res. Commun.134(2)巻749〜754
頁1968年；Kishimoto, A.ら、J. Biol. Chem. 258巻115
6〜1164頁1983年；Tallant, E. A.ら、Biochem. 27巻22
05〜2211頁1988年；Nixon, R.A., Ann. N.Y. Acad. Sc
i. 568巻198〜208頁1989年）。興奮性アミノ酸神経毒
（excitatoxicity）と虚血の場合に起こるCANPの異常な
活性化は、急速な不可逆性のニューロン障害を誘発する
（Siman,R.ら、J. Nerrosci.９巻1579〜1590頁1989年；
Siman,R.,"Neurotoxicity of Excitatory Amino Acid
s", A. Guidotti編集、Raven Press社、New York, 145
〜161頁1990年；Lee, K.S.ら、Proc. Natl. Acad. USA
88巻7233〜7347頁1991年）。しかし以前の報告は、CANP
の全活性はアルツハイマー病の脳では有意に変化してい
ないことを指摘している（Kawashima, S.ら、Biomed. R
es. 10(1)巻17〜23頁1989年；Mantle &Perry, J. Neuro
l. Sci. 102巻220〜224頁1991年；Nilsson, E.ら、Neur
obiol.Aging 11巻425〜431頁1990頁）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】CANPは主として細胞中
に不活性の前駆体型アイソフォームとして存在しており
（Suzuki & Ohno, Cell Struct. Funct. 15巻１〜６頁1
990年；Suzuki, K.ら、FEBS Lett. 220巻271頁1987
年）、カルシウムの存在下アミノ末端配列の自己消化反
応によって活性化される（Suzuki, K.ら、J. Biochem.9
0巻1787〜1793頁1981年；Inomata, M.ら、I. Biochem.
98巻407〜416頁1985年；Zimmerman & Schlaepfer, Bioc
hem. Biophys. Acta 1078巻192〜198頁1991年；Suzuki,
K.ら、FEBS Lett. 220巻271頁1987年）。CANPの生体内
での作用は、酵素活性測定法で測定することが困難であ
る。というのはこの測定法ではin vitro系で上記の前駆
体型アイソフォームも活性化され、さらに酵素活性が不
安定なこと、および細胞質中に含有されている各種の阻
害因子と活性化因子によって影響を受ける（Mellgren &
Murachi編集、Intracellular Calcium-dependent Prote
olysis, CRC Press社、MA,１〜276頁1990年）。
に不活性の前駆体型アイソフォームとして存在しており
（Suzuki & Ohno, Cell Struct. Funct. 15巻１〜６頁1
990年；Suzuki, K.ら、FEBS Lett. 220巻271頁1987
年）、カルシウムの存在下アミノ末端配列の自己消化反
応によって活性化される（Suzuki, K.ら、J. Biochem.9
0巻1787〜1793頁1981年；Inomata, M.ら、I. Biochem.
98巻407〜416頁1985年；Zimmerman & Schlaepfer, Bioc
hem. Biophys. Acta 1078巻192〜198頁1991年；Suzuki,
K.ら、FEBS Lett. 220巻271頁1987年）。CANPの生体内
での作用は、酵素活性測定法で測定することが困難であ
る。というのはこの測定法ではin vitro系で上記の前駆
体型アイソフォームも活性化され、さらに酵素活性が不
安定なこと、および細胞質中に含有されている各種の阻
害因子と活性化因子によって影響を受ける（Mellgren &
Murachi編集、Intracellular Calcium-dependent Prote
olysis, CRC Press社、MA,１〜276頁1990年）。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記の問題点のいくつか
を回避するために、本発明の発明者らは、赤血球中に存
在することがすでに証明されている自己消化による活性
化型および未分解の前駆体型に対応する、μCANPのアイ
ソフォームを、死後のヒトの脳の中に同定した。本発明
は、組織におけるμCANPの前駆体型（80kDaアイソフォ
ーム）に対する活性化型（76kDaアイソフォーム）の比
率が生体内（in vivo）でのCANPの機能の指標を反映す
るという発見に関する。
を回避するために、本発明の発明者らは、赤血球中に存
在することがすでに証明されている自己消化による活性
化型および未分解の前駆体型に対応する、μCANPのアイ
ソフォームを、死後のヒトの脳の中に同定した。本発明
は、組織におけるμCANPの前駆体型（80kDaアイソフォ
ーム）に対する活性化型（76kDaアイソフォーム）の比
率が生体内（in vivo）でのCANPの機能の指標を反映す
るという発見に関する。
【０００７】特に、本発明は、（ａ）アルツハイマー病
の疑いがある個体から組織の試料を入手し；次いで
（ｂ）前記組織試料における、μCANPの76kDaアイソフ
ォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測定し；76k
Da／80kDaの比率がアルツハイマー病でない個体の対照
群に比べて増大する場合は、アルツハイマー病の疑いが
ある個体がアルツハイマー病であると確認する；ことか
らなる個体のアルツハイマー病の診断方法に関する。
の疑いがある個体から組織の試料を入手し；次いで
（ｂ）前記組織試料における、μCANPの76kDaアイソフ
ォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測定し；76k
Da／80kDaの比率がアルツハイマー病でない個体の対照
群に比べて増大する場合は、アルツハイマー病の疑いが
ある個体がアルツハイマー病であると確認する；ことか
らなる個体のアルツハイマー病の診断方法に関する。
【０００８】また本発明は、（ａ）アルツハイマー病の
疑いがある個体から組織の試料を入手し；次いで（ｂ）
μCANPの76kDaアイソフォーム／76kDa、78kDaおよび80k
Daのアイソフォームの合計量の相対比率を測定し；76kD
a／76kDa＋78kDa＋80kDaの比率がアルツハイマー病でな
い個体の対照群に比べて増大する場合は、アルツハイマ
ー病の疑いがある個体がアルツハイマー病であると確認
する；ことからなる個体のアルツハイマー病の診断方法
に関する。
疑いがある個体から組織の試料を入手し；次いで（ｂ）
μCANPの76kDaアイソフォーム／76kDa、78kDaおよび80k
Daのアイソフォームの合計量の相対比率を測定し；76kD
a／76kDa＋78kDa＋80kDaの比率がアルツハイマー病でな
い個体の対照群に比べて増大する場合は、アルツハイマ
ー病の疑いがある個体がアルツハイマー病であると確認
する；ことからなる個体のアルツハイマー病の診断方法
に関する。
【０００９】また本発明は、１つ以上の容器が密封状態
で入っている搬器からなり、第一容器に、μCANPの76kD
aアイソフォームとμCANPの80kDaアイソフォームと免疫
反応性のある検出可能な抗体が入っている、アルツハイ
マー病の疑いがある個体のアルツハイマー病を診断する
のに有用なキットに関する。別の容器には、μCANPの76
kDaアイソフォームとμCANPの80kDaアイソフォームと免
疫反応性のある前記の検出可能な抗体と免疫反応性のあ
る検出可能なように標識を付けた抗体が入っていること
が好ましい。さらに別の容器にはμCANPの76kDaアイソ
フォームとμCANPの80kDaアイソフォームを分離する物
質が入っていることが好ましい。
で入っている搬器からなり、第一容器に、μCANPの76kD
aアイソフォームとμCANPの80kDaアイソフォームと免疫
反応性のある検出可能な抗体が入っている、アルツハイ
マー病の疑いがある個体のアルツハイマー病を診断する
のに有用なキットに関する。別の容器には、μCANPの76
kDaアイソフォームとμCANPの80kDaアイソフォームと免
疫反応性のある前記の検出可能な抗体と免疫反応性のあ
る検出可能なように標識を付けた抗体が入っていること
が好ましい。さらに別の容器にはμCANPの76kDaアイソ
フォームとμCANPの80kDaアイソフォームを分離する物
質が入っていることが好ましい。
【００１０】また本発明は、２つ以上の容器が密封状態
で入っている搬器を有し、第一容器に、μCANPの80kDa
アイソフォームと免疫反応性はあるがμCANPの76kDaお
よび78kDaアイソフォームと免疫反応性のない第一の検
出可能な抗体が入っており、かつ第二容器には、μCANP
の76kDa、78kDaおよび80kDaアイソフォームと免疫反応
性のある第二の検出可能な抗体が入っている、アルツハ
イマー病の疑いがある個体にアルツハイマー病を診断す
るのに有用なキットに関する。上記の第一と第二の検出
可能な抗体には、検出時に識別できる異なる標識で検出
可能なように標識を付けることが好ましい。
で入っている搬器を有し、第一容器に、μCANPの80kDa
アイソフォームと免疫反応性はあるがμCANPの76kDaお
よび78kDaアイソフォームと免疫反応性のない第一の検
出可能な抗体が入っており、かつ第二容器には、μCANP
の76kDa、78kDaおよび80kDaアイソフォームと免疫反応
性のある第二の検出可能な抗体が入っている、アルツハ
イマー病の疑いがある個体にアルツハイマー病を診断す
るのに有用なキットに関する。上記の第一と第二の検出
可能な抗体には、検出時に識別できる異なる標識で検出
可能なように標識を付けることが好ましい。
【００１１】また本発明は、 （ａ）第一の動物の脳の試料を入手し； （ｂ）第一の動物の脳の試料の、μCANPの76kDaアイソ
フォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測定し； （ｃ）第二の動物の脳の試料を、Ca++の水溶液およびア
ルツハイマー病を治療もしくは予防するのに有効である
と推量される薬剤とともにインキュベートし; （ｄ）ステップ（ｃ）で得た組織試料の、μCANPの76kD
aアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測
定し；ステップ（ｄ）で測定した、前記薬剤とインキュ
ベートさせた動物の脳の試料の76kDa／80kDaの比率がス
テップ（ｂ）で得た76kDa／80kDaの比率と比べて減少し
ている場合は、その薬剤がアルツハイマー病を治療また
は予防するのに有効であると確認する；ことからなるア
ルツハイマー病の治療もしくは予防薬をスクリーニング
する方法に関する。
フォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測定し； （ｃ）第二の動物の脳の試料を、Ca++の水溶液およびア
ルツハイマー病を治療もしくは予防するのに有効である
と推量される薬剤とともにインキュベートし; （ｄ）ステップ（ｃ）で得た組織試料の、μCANPの76kD
aアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測
定し；ステップ（ｄ）で測定した、前記薬剤とインキュ
ベートさせた動物の脳の試料の76kDa／80kDaの比率がス
テップ（ｂ）で得た76kDa／80kDaの比率と比べて減少し
ている場合は、その薬剤がアルツハイマー病を治療また
は予防するのに有効であると確認する；ことからなるア
ルツハイマー病の治療もしくは予防薬をスクリーニング
する方法に関する。
【００１２】また本発明は、 （ａ）第一の繊維芽細胞の試料を動物から入手し； （ｂ）第一の繊維芽細胞の試料の、μCANPの76kDaアイ
ソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測定
し； （ｃ）第二の繊維芽細胞の試料を、Ca++の水溶液すなわ
ちカルシウムイオノホアおよびアルツハイマー病の治療
もしくは予防に有効であると推量される薬剤とともにイ
ンキュベートし； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た繊維芽細胞の試料の、μCA
NPの76kDaアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対
比率を測定し；ステップ（ｄ）で測定した前記薬剤とイ
ンキュベートさせた繊維芽細胞の試料の76kDa／80kDaの
比率が、ステップ（ｂ）で得た76kDa／80kDa比率に比較
して減少している場合は、その薬剤がアルツハイマー病
を治療もしくは予防するのに有効であると確認する；こ
とからなるアルツハイマー病の治療もしくは予防薬をス
クリーニングする方法に関する。
ソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測定
し； （ｃ）第二の繊維芽細胞の試料を、Ca++の水溶液すなわ
ちカルシウムイオノホアおよびアルツハイマー病の治療
もしくは予防に有効であると推量される薬剤とともにイ
ンキュベートし； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た繊維芽細胞の試料の、μCA
NPの76kDaアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対
比率を測定し；ステップ（ｄ）で測定した前記薬剤とイ
ンキュベートさせた繊維芽細胞の試料の76kDa／80kDaの
比率が、ステップ（ｂ）で得た76kDa／80kDa比率に比較
して減少している場合は、その薬剤がアルツハイマー病
を治療もしくは予防するのに有効であると確認する；こ
とからなるアルツハイマー病の治療もしくは予防薬をス
クリーニングする方法に関する。
【００１３】カルシウム依存性中性プロテイナーゼ（CA
NP）は、細胞内伝達機構の重要な酵素であり、カルシウ
ムが誘発する細胞障害の重要な媒介物質である。μＭ
（マイクロモル）のカルシウムのレベルを必要とする酵
素（μCANP）は、ニューロン内に多く存在するが、細胞
障害に関連していることが最も多い。μCANPの生体内活
性の変化の指標として、μCANPの活性化型アイソフォー
ム／前駆体型アイソフォームの比率を、死後のヒトの脳
部位で免疫化学的に測定した。この比率は、アルツハイ
マー病の患者由来の前頭葉皮質中では約３倍上昇した
が、ハンチントン病の患者からのものは上昇しなかっ
た。アルツハイマー病では、ニューロンの変性が最少で
あると考えられているアルツハイマー病の脳の他の部位
（被殻と小脳）もμCANPの活性化が有意に増大している
ことを示した。
NP）は、細胞内伝達機構の重要な酵素であり、カルシウ
ムが誘発する細胞障害の重要な媒介物質である。μＭ
（マイクロモル）のカルシウムのレベルを必要とする酵
素（μCANP）は、ニューロン内に多く存在するが、細胞
障害に関連していることが最も多い。μCANPの生体内活
性の変化の指標として、μCANPの活性化型アイソフォー
ム／前駆体型アイソフォームの比率を、死後のヒトの脳
部位で免疫化学的に測定した。この比率は、アルツハイ
マー病の患者由来の前頭葉皮質中では約３倍上昇した
が、ハンチントン病の患者からのものは上昇しなかっ
た。アルツハイマー病では、ニューロンの変性が最少で
あると考えられているアルツハイマー病の脳の他の部位
（被殻と小脳）もμCANPの活性化が有意に増大している
ことを示した。
【００１４】したがって、本発明は、μCANPの活性化型
レベルが増大するのはアルツハイマー病に関連している
という発見に関連している。第１の態様において、本発
明は、 （ａ）アルツハイマー病の疑いがある個体から組織の試
料を入手し； （ｂ）前記組織の試料のμCANPの76kDaアイソフォーム
／80kDaアイソフォームの相対比率を測定し；76kDa／80
kDaの比率がアルツハイマー病でない個体の対照群に比
べて増加している場合は、アルツハイマー病の疑いがあ
る個体がアルツハイマー病であると確認する；ことから
なる、個体のアルツハイマー病の診断方法に関する。
レベルが増大するのはアルツハイマー病に関連している
という発見に関連している。第１の態様において、本発
明は、 （ａ）アルツハイマー病の疑いがある個体から組織の試
料を入手し； （ｂ）前記組織の試料のμCANPの76kDaアイソフォーム
／80kDaアイソフォームの相対比率を測定し；76kDa／80
kDaの比率がアルツハイマー病でない個体の対照群に比
べて増加している場合は、アルツハイマー病の疑いがあ
る個体がアルツハイマー病であると確認する；ことから
なる、個体のアルツハイマー病の診断方法に関する。
【００１５】組織の試料は、脳の生検材料か、またはよ
り好ましくは繊維芽細胞の試料である。脳生検材料の試
料が入手される場合は、前頭葉皮質、被殻または小脳か
ら入手することが好ましい。試料が前頭葉皮質から得ら
れた場合、アルツハイマー病とハンチントン病を識別す
ることができる。神経系の組織を本発明にしたがって診
断する場合、組織約0.1〜約0.5ｇが必要である。
り好ましくは繊維芽細胞の試料である。脳生検材料の試
料が入手される場合は、前頭葉皮質、被殻または小脳か
ら入手することが好ましい。試料が前頭葉皮質から得ら
れた場合、アルツハイマー病とハンチントン病を識別す
ることができる。神経系の組織を本発明にしたがって診
断する場合、組織約0.1〜約0.5ｇが必要である。
【００１６】繊維芽細胞の試料はアルツハイマー病の疑
いがある個体から入手するのが最も好ましい。繊維芽細
胞は、Willens I.ら、Pathobiology 59巻357〜360頁199
1年に記載されている方法にしたがって、個体から入手
できる。なおこの文献の開示事項はすべて本願に援用す
るものとする（細胞培養で繊維芽細胞を増殖させる方法
を教示しているHam & Mckeehan, In Vitro14巻11〜22頁
1978年参照）。診断を行うのに繊維芽細胞が約0.05〜約
0.1g必要である。
いがある個体から入手するのが最も好ましい。繊維芽細
胞は、Willens I.ら、Pathobiology 59巻357〜360頁199
1年に記載されている方法にしたがって、個体から入手
できる。なおこの文献の開示事項はすべて本願に援用す
るものとする（細胞培養で繊維芽細胞を増殖させる方法
を教示しているHam & Mckeehan, In Vitro14巻11〜22頁
1978年参照）。診断を行うのに繊維芽細胞が約0.05〜約
0.1g必要である。
【００１７】上記のような試料を得た後、その試料を生
理的緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離し、次いで得
られた上澄み液をμCANPの76kDaアイソフォーム（活性
化型）と80kDaアイソフォーム（前駆体型）を指標とし
て試験を行う。この上澄み液はまず分画して、潜在して
いる阻害物質を除去することが好ましい。この分画は、
上澄み液をDEAEセルロースのカラムに加え、次いで塩化
カリウムのような塩を含有する緩衝液の濃度を増加させ
ることによって、カラムから溶出させる。
理的緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離し、次いで得
られた上澄み液をμCANPの76kDaアイソフォーム（活性
化型）と80kDaアイソフォーム（前駆体型）を指標とし
て試験を行う。この上澄み液はまず分画して、潜在して
いる阻害物質を除去することが好ましい。この分画は、
上澄み液をDEAEセルロースのカラムに加え、次いで塩化
カリウムのような塩を含有する緩衝液の濃度を増加させ
ることによって、カラムから溶出させる。
【００１８】カラムから溶出した画分を電気泳動法にか
け76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォームに分離
し、次に膜（例えばニトロセルロース）にエレクトロト
ランスファー（electrotransfer）し、76kDa、78kDaお
よび80kDaのアイソフォームの１つ以上と免疫反応性の
ある検出可能な抗体で免疫ブロット分析を行う。この検
出可能な抗体は、本願実施例に記載されているようにし
て検出可能なように標識を付けてもよく、またはこの抗
体と免疫反応性のある二次抗体と反応させて検出しても
よく、例えば一次抗体が第一の動物種由来であり、二次
抗体が第二の動物種由来で第一の動物種由来の抗体と免
疫反応性がある場合がそうである。76kDa、78kDaおよび
80kDaのアイソフォームと免疫反応性のある抗体につい
ては、例えばSamis J.A.ら、Biochem. J. 246巻481〜48
8頁1987年；Elce, J. S.ら、Biochem.J. 261巻1039〜10
42頁1989年に教示されている。なおこれら文献の内容は
すべて本願に援用するものとする。76kDaアイソフォー
ムのみに選択性のある抗体を利用することもできる（Sa
ido, T.C.ら、J. Biochem. 111巻81〜86頁1992年参
照）。なおこの文献の開示事項はすべて本願に援用する
ものとする。
け76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォームに分離
し、次に膜（例えばニトロセルロース）にエレクトロト
ランスファー（electrotransfer）し、76kDa、78kDaお
よび80kDaのアイソフォームの１つ以上と免疫反応性の
ある検出可能な抗体で免疫ブロット分析を行う。この検
出可能な抗体は、本願実施例に記載されているようにし
て検出可能なように標識を付けてもよく、またはこの抗
体と免疫反応性のある二次抗体と反応させて検出しても
よく、例えば一次抗体が第一の動物種由来であり、二次
抗体が第二の動物種由来で第一の動物種由来の抗体と免
疫反応性がある場合がそうである。76kDa、78kDaおよび
80kDaのアイソフォームと免疫反応性のある抗体につい
ては、例えばSamis J.A.ら、Biochem. J. 246巻481〜48
8頁1987年；Elce, J. S.ら、Biochem.J. 261巻1039〜10
42頁1989年に教示されている。なおこれら文献の内容は
すべて本願に援用するものとする。76kDaアイソフォー
ムのみに選択性のある抗体を利用することもできる（Sa
ido, T.C.ら、J. Biochem. 111巻81〜86頁1992年参
照）。なおこの文献の開示事項はすべて本願に援用する
ものとする。
【００１９】76kDaと80kDaのアイソフォームの比率は、
80kDaアイソフォームと、76kDaアイソフォームおよび78
kDaアイソフォームとを識別する検出可能な標識を付け
た抗体で測定することが一層好ましい。80kDaアイソフ
ォームを、自己消化反応で76kDaアイソフォームと78kDa
アイソフォームに変換すると、80kDaアイソフォームの
Ｎ末端が失われる。したがって、80kDaアイソフォーム
のＮ末端領域に対して免疫反応性のある第一の抗体を生
成させて、80kDaアイソフォームとだけ免疫化学的に反
応性のある抗体を得ることができる。第二の抗体は、76
kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォームと免疫化学的
に反応性があるが、全μCANPを定量するのに使用するこ
とができる。78kDaアイソフォームの量は、アルツハイ
マー病の脳内では有意に変化しないので、第二の抗体／
第一の抗体の比率は76kDaアイソフォーム／80kDaアイソ
フォームの比率に相関している。
80kDaアイソフォームと、76kDaアイソフォームおよび78
kDaアイソフォームとを識別する検出可能な標識を付け
た抗体で測定することが一層好ましい。80kDaアイソフ
ォームを、自己消化反応で76kDaアイソフォームと78kDa
アイソフォームに変換すると、80kDaアイソフォームの
Ｎ末端が失われる。したがって、80kDaアイソフォーム
のＮ末端領域に対して免疫反応性のある第一の抗体を生
成させて、80kDaアイソフォームとだけ免疫化学的に反
応性のある抗体を得ることができる。第二の抗体は、76
kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォームと免疫化学的
に反応性があるが、全μCANPを定量するのに使用するこ
とができる。78kDaアイソフォームの量は、アルツハイ
マー病の脳内では有意に変化しないので、第二の抗体／
第一の抗体の比率は76kDaアイソフォーム／80kDaアイソ
フォームの比率に相関している。
【００２０】第一の抗体は、μCANPの最初の21個のＮ末
端アミノ酸の領域に対して免疫反応性があるように生成
させるのが好ましい。μCANPのアミノ酸配列はImajoh,
Sら、Biocliem, 27巻8122〜8128頁1988年に教示されて
いる。なおこの文献の内容はすべて本願に援用するもの
とする。μCANPのアミノ酸配列が与えられたならば、μ
CANPのＮ末端フラグメントを得て、それに対するモノク
ローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を製造するこ
とができる。例えば固相合成法で８つ以上のアミノ酸の
ペプチドフラグメントを作り、そのペプチドフラグメン
トを免疫原性担体に結合し、次いでこの担体によって動
物を免疫化する。より大きなペプチドフラグメントはそ
れ自体で免疫応答を誘発することができる。しかし、多
くの小さな分子はそれ自体で免疫活性を誘発しないの
で、ペプチドを免疫原性担体に結合し、この担体に対す
る抗体の産生を誘発させる。このような免疫原性担体と
しては、限定されないが、ウシ血清アルブミン、ジフテ
リア毒素、破傷風毒素、エデスチン、カサガイヘモシア
ニン、シュードモナス属細菌毒素Ａ、コレラグノイド、
コレラ毒素、百日咳毒素、ウイルスタンパク質、および
インターフェロン類、インターロイキン類または腫瘍壊
死因子のような真核タンパク質のようなタンパク質があ
る。このようなタンパク質は当該技術分野の当業者に知
られている方法によって、天然起源もしくは組換え体起
源から得ることができる。免疫原性担体は、組換え体起
源から得た場合、その分子の免疫原性部分を少なくとも
含有するタンパク質フラグメントで構成されている。本
発明を実施する際に使用される他の公知の免疫原性高分
子物としては、限定されないが、多糖類、tRNA、ポリビ
ニルアミン、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリド
ン、4',4'-ジアミノジフェール-メタン-3',3'-ジカルボ
ン酸と4-ニトロ-2-アミノ安息香酸の混合重縮合物（比
較的高分子量）（Sela, M., Science 166巻1365〜1374
頁1969年参照）のような非代謝性合成ポリマー、もしく
は糖脂質類、脂質類または炭水化物類がある。免疫原性
担体としてはタンパク質が好ましい。
端アミノ酸の領域に対して免疫反応性があるように生成
させるのが好ましい。μCANPのアミノ酸配列はImajoh,
Sら、Biocliem, 27巻8122〜8128頁1988年に教示されて
いる。なおこの文献の内容はすべて本願に援用するもの
とする。μCANPのアミノ酸配列が与えられたならば、μ
CANPのＮ末端フラグメントを得て、それに対するモノク
ローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を製造するこ
とができる。例えば固相合成法で８つ以上のアミノ酸の
ペプチドフラグメントを作り、そのペプチドフラグメン
トを免疫原性担体に結合し、次いでこの担体によって動
物を免疫化する。より大きなペプチドフラグメントはそ
れ自体で免疫応答を誘発することができる。しかし、多
くの小さな分子はそれ自体で免疫活性を誘発しないの
で、ペプチドを免疫原性担体に結合し、この担体に対す
る抗体の産生を誘発させる。このような免疫原性担体と
しては、限定されないが、ウシ血清アルブミン、ジフテ
リア毒素、破傷風毒素、エデスチン、カサガイヘモシア
ニン、シュードモナス属細菌毒素Ａ、コレラグノイド、
コレラ毒素、百日咳毒素、ウイルスタンパク質、および
インターフェロン類、インターロイキン類または腫瘍壊
死因子のような真核タンパク質のようなタンパク質があ
る。このようなタンパク質は当該技術分野の当業者に知
られている方法によって、天然起源もしくは組換え体起
源から得ることができる。免疫原性担体は、組換え体起
源から得た場合、その分子の免疫原性部分を少なくとも
含有するタンパク質フラグメントで構成されている。本
発明を実施する際に使用される他の公知の免疫原性高分
子物としては、限定されないが、多糖類、tRNA、ポリビ
ニルアミン、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリド
ン、4',4'-ジアミノジフェール-メタン-3',3'-ジカルボ
ン酸と4-ニトロ-2-アミノ安息香酸の混合重縮合物（比
較的高分子量）（Sela, M., Science 166巻1365〜1374
頁1969年参照）のような非代謝性合成ポリマー、もしく
は糖脂質類、脂質類または炭水化物類がある。免疫原性
担体としてはタンパク質が好ましい。
【００２１】μCANPのＮ末端フラグメントを、単独もし
くは免疫原性結合物の一部として用いて免疫化させた動
物から血液を採取し、ポリクローナル血清を単離する
（Vitto and Nixon, J. Neurochem. 47巻1039〜1051頁1
986年参照）。あるいは、モノクローナル抗体をケーラ
ーとミルシュタインの公知の方法（Nature 256巻495〜4
97頁1975年）にしたがって作ることができ、この方法で
は、免疫化させた動物の脾臓を取り出してその細胞を不
死細胞系（immortal cell line）と融合させてハイブリ
ドーマ細胞が得られる。このハイブリドーマをHAT選択
培地中でサブクローン化し、得られたクローンを、免疫
原性活性については80kDaのアイソフォームでスクリー
ニングし、免疫反応性の欠如については76kDaと78kDaの
アイソフォームでスクリーニングすることによって、所
望の抗体を分泌するハイブリドーマを得ることができ
る。
くは免疫原性結合物の一部として用いて免疫化させた動
物から血液を採取し、ポリクローナル血清を単離する
（Vitto and Nixon, J. Neurochem. 47巻1039〜1051頁1
986年参照）。あるいは、モノクローナル抗体をケーラ
ーとミルシュタインの公知の方法（Nature 256巻495〜4
97頁1975年）にしたがって作ることができ、この方法で
は、免疫化させた動物の脾臓を取り出してその細胞を不
死細胞系（immortal cell line）と融合させてハイブリ
ドーマ細胞が得られる。このハイブリドーマをHAT選択
培地中でサブクローン化し、得られたクローンを、免疫
原性活性については80kDaのアイソフォームでスクリー
ニングし、免疫反応性の欠如については76kDaと78kDaの
アイソフォームでスクリーニングすることによって、所
望の抗体を分泌するハイブリドーマを得ることができ
る。
【００２２】μCANPのＮ末端フラグメントとしては、下
記のアミノ酸配列［SEQ ID NO.1］：
記のアミノ酸配列［SEQ ID NO.1］：
【００２３】
【化１】 Ala Gly Ile Ala Ala Lys Leu Ala Lys Asp Arg Glu Ala Ala Glu Gly Leu 1 5 10 15 Gly Ser His Glu 20 で示される最初の21個のアミノ酸が最も好ましい。
【００２４】本発明を実施するのに用いられる抗体は、
それ自体公知の方法で検出可能に標識を付けることがで
きる。当該技術分野の当業者に公知の多くの各種の標識
と標識を付ける方法がある。本発明で使用できる標識の
タイプの例としては、限定はされないが、酵素類、放射
性同位元素類、染料類、蛍光化合物類、化学発光化合物
類、生物発光化合物類および金属キレート類がある。当
該技術分野の当業者は、抗体に結合させるのに適切なそ
の他の標識を知っているか、またはこのような標識を日
常の実験を利用して確認することができる。これらの標
識の抗体との結合は、当該技術分野当業者にとって通常
公知の標準の方法を用いて達成することができる。
それ自体公知の方法で検出可能に標識を付けることがで
きる。当該技術分野の当業者に公知の多くの各種の標識
と標識を付ける方法がある。本発明で使用できる標識の
タイプの例としては、限定はされないが、酵素類、放射
性同位元素類、染料類、蛍光化合物類、化学発光化合物
類、生物発光化合物類および金属キレート類がある。当
該技術分野の当業者は、抗体に結合させるのに適切なそ
の他の標識を知っているか、またはこのような標識を日
常の実験を利用して確認することができる。これらの標
識の抗体との結合は、当該技術分野当業者にとって通常
公知の標準の方法を用いて達成することができる。
【００２５】抗体に検出可能になる標識を付けることが
できる方法の一つは、抗体に酵素を結合させる方法であ
る。さらにこの酵素は、後にその基質と反応すると、例
えば分光測定法、蛍光分析法または視覚によって検出可
能な化学物質を生成するように基質と反応する。抗体に
検出可能になる標識を付けるのに使用することができる
酵素としては、限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ、ブドウ状球菌のヌクレアーゼ、Δ-V-ステロイド
イソメラーゼ、酵母アルコールデヒドログナーゼ、α-
グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イ
ソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、アスパルギナーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレ
アーゼ、カタラーゼ、グルコース-VI-リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエス
テラーゼがある。
できる方法の一つは、抗体に酵素を結合させる方法であ
る。さらにこの酵素は、後にその基質と反応すると、例
えば分光測定法、蛍光分析法または視覚によって検出可
能な化学物質を生成するように基質と反応する。抗体に
検出可能になる標識を付けるのに使用することができる
酵素としては、限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ、ブドウ状球菌のヌクレアーゼ、Δ-V-ステロイド
イソメラーゼ、酵母アルコールデヒドログナーゼ、α-
グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イ
ソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、アスパルギナーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレ
アーゼ、カタラーゼ、グルコース-VI-リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエス
テラーゼがある。
【００２６】またこれらの抗体は、放射性同位元素で標
識を付けて、ガンマカウンターもしくはシンチレーショ
ンカウンターを使用するような手段またはオートラジオ
グラフィーによってその放射性同位元素を測定すること
ができる。本発明の目的に対して特に有用な同位元素に
は3Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、または鉛、
水銀、タリウム、テクネチウムもしくはインジウムの放
射性同位元素（203Ｐｂ、198Ｈｇ、201Ｔｌ、99mＴｃ、
111Ｉｍ）がある。
識を付けて、ガンマカウンターもしくはシンチレーショ
ンカウンターを使用するような手段またはオートラジオ
グラフィーによってその放射性同位元素を測定すること
ができる。本発明の目的に対して特に有用な同位元素に
は3Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、または鉛、
水銀、タリウム、テクネチウムもしくはインジウムの放
射性同位元素（203Ｐｂ、198Ｈｇ、201Ｔｌ、99mＴｃ、
111Ｉｍ）がある。
【００２７】これら抗体に蛍光化合物で標識を付けるこ
ともできる。蛍光化合物で標識を付けたアネキシンは適
切な波長の光を照射すると、アネキシンの存在はその染
料の蛍光によって検出することができる。最も普通に用
いられる標識用蛍光化合物は、フルオレセイン、イソチ
オシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコ
シアニン、アロフィコシアニン、O-フタルアルデヒドお
よびフルオレサミンである。
ともできる。蛍光化合物で標識を付けたアネキシンは適
切な波長の光を照射すると、アネキシンの存在はその染
料の蛍光によって検出することができる。最も普通に用
いられる標識用蛍光化合物は、フルオレセイン、イソチ
オシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコ
シアニン、アロフィコシアニン、O-フタルアルデヒドお
よびフルオレサミンである。
【００２８】またこれらの抗体は、152Ｅuなどのような
ランタン系列の発蛍光金属を用いて検出可能になる標識
を付けることができる。これらの金属は、ジエチレント
リアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン-四酢
酸（EDTA）のような金属キレート化合物を用いて抗体に
結合させることができる。
ランタン系列の発蛍光金属を用いて検出可能になる標識
を付けることができる。これらの金属は、ジエチレント
リアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン-四酢
酸（EDTA）のような金属キレート化合物を用いて抗体に
結合させることができる。
【００２９】また標識付けはＭＲＩ（磁気共鳴画像法）
システムで検出可能な常磁性造影剤によって行うことも
できる。ＭＲＩシステムで検出できる診断用試薬とし
て、接合体を提供できるガドリニウム、コバルト、ニッ
ケル、マグネシウムもしくは鉄の錯体が使用できる。上
記のシステムでは、生物中の原子の核スピンベクトルを
調節するために、強力な磁場が用いられる。次いでその
磁場を除いて核をその最初の状態に戻す。この過程を観
察し記録する。
システムで検出可能な常磁性造影剤によって行うことも
できる。ＭＲＩシステムで検出できる診断用試薬とし
て、接合体を提供できるガドリニウム、コバルト、ニッ
ケル、マグネシウムもしくは鉄の錯体が使用できる。上
記のシステムでは、生物中の原子の核スピンベクトルを
調節するために、強力な磁場が用いられる。次いでその
磁場を除いて核をその最初の状態に戻す。この過程を観
察し記録する。
【００３０】またこれらの抗体は、化学発光化合物と結
合させることによって検出可能になる標識を付けること
ができる。この化学発光化合物で標識を付けた抗体の存
在は、化学反応中に生じる発光の存在を検出することに
よって測定される。特に有用な標識付け用化学発光化合
物は、ルミノール、イソルミノール、シアロマチック
（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾー
ル、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
合させることによって検出可能になる標識を付けること
ができる。この化学発光化合物で標識を付けた抗体の存
在は、化学反応中に生じる発光の存在を検出することに
よって測定される。特に有用な標識付け用化学発光化合
物は、ルミノール、イソルミノール、シアロマチック
（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾー
ル、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００３１】同様に生物発光化合物もこれらの抗体に標
識を付けるのに使用することができる。生物発光は生物
系に見られる化学発光の一種であり、生物系では触媒タ
ンパク質が化学発光反応の効率を増大する。生物発光タ
ンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって
測定される。標識付けを目的とする重要な生物発光化合
物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンで
ある。
識を付けるのに使用することができる。生物発光は生物
系に見られる化学発光の一種であり、生物系では触媒タ
ンパク質が化学発光反応の効率を増大する。生物発光タ
ンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって
測定される。標識付けを目的とする重要な生物発光化合
物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンで
ある。
【００３２】本発明で用いると感度が一層増大する他の
方法は、抗体を低分子量のハプテン類に結合する方法で
ある。次いでこれらハプテン類は第二の反応によって特
異的に検出することができる。例えばこの場合、ビオチ
ン（アビジンと反応する）またはジニトロフェニル、ピ
リドキサールおよびフルオレサミン（特定の抗ハプテン
抗体と反応する）のようなハプテン類を通常使用する。
増幅法はこれらなどの標識に容易に適用することができ
る。
方法は、抗体を低分子量のハプテン類に結合する方法で
ある。次いでこれらハプテン類は第二の反応によって特
異的に検出することができる。例えばこの場合、ビオチ
ン（アビジンと反応する）またはジニトロフェニル、ピ
リドキサールおよびフルオレサミン（特定の抗ハプテン
抗体と反応する）のようなハプテン類を通常使用する。
増幅法はこれらなどの標識に容易に適用することができ
る。
【００３３】これら検出可能な抗体はキットを製造する
のに理想的に適している。このようなキットは、バイア
ルびん、試験管などのような１つ以上の容器を密封状態
で区分して入れる搬器からなり、前記容器には各々、検
定法の別個の要素が入っている。例えば、ある容器には
μCANPすべてのアイソフォームに特異的で検出可能な抗
体が入っており、別の容器には例えばμCANPの76kDa、7
8kDaおよび80kDaのアイソフォームの標準系列希釈溶液
が入っている。検出可能な抗体は検出可能なように標識
を付けることができる。さらに別の容器には、μCANPの
76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォームの電気泳動
分離を実施するのに用いる物質（試薬）が入っている。
μCANPの標準溶液は、組織試料のμCANPを電気泳動で分
離するのに用い、かつμCANPの76kDa、78kDaおよび80kD
aのアイソフォームの濃度を横軸に対しプロットし、検
出シグナルを縦軸に、プロットした標準曲線を作成する
のに用いられる。脳または繊維芽細胞のような組織試料
の上澄み液から得た試験結果をこのような図表から算出
して、μCANPの76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォ
ームの濃度が得られ、したがって個体がアルツハイマー
病なのか否かが示される。またさらに別の容器には、μ
CANPの76kDaアイソフォームとμCANPの80kDaアイソフォ
ームに対して免疫反応性のある検出可能な抗体に対して
免疫反応性のある検出可能なように標識が付けられた抗
体が入っている。
のに理想的に適している。このようなキットは、バイア
ルびん、試験管などのような１つ以上の容器を密封状態
で区分して入れる搬器からなり、前記容器には各々、検
定法の別個の要素が入っている。例えば、ある容器には
μCANPすべてのアイソフォームに特異的で検出可能な抗
体が入っており、別の容器には例えばμCANPの76kDa、7
8kDaおよび80kDaのアイソフォームの標準系列希釈溶液
が入っている。検出可能な抗体は検出可能なように標識
を付けることができる。さらに別の容器には、μCANPの
76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォームの電気泳動
分離を実施するのに用いる物質（試薬）が入っている。
μCANPの標準溶液は、組織試料のμCANPを電気泳動で分
離するのに用い、かつμCANPの76kDa、78kDaおよび80kD
aのアイソフォームの濃度を横軸に対しプロットし、検
出シグナルを縦軸に、プロットした標準曲線を作成する
のに用いられる。脳または繊維芽細胞のような組織試料
の上澄み液から得た試験結果をこのような図表から算出
して、μCANPの76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォ
ームの濃度が得られ、したがって個体がアルツハイマー
病なのか否かが示される。またさらに別の容器には、μ
CANPの76kDaアイソフォームとμCANPの80kDaアイソフォ
ームに対して免疫反応性のある検出可能な抗体に対して
免疫反応性のある検出可能なように標識が付けられた抗
体が入っている。
【００３４】あるいは、キットには、μCANPの80kDaア
イソフォームだけに免疫反応性のある第一の検出可能な
抗体と、μCANPのすべてのアイソフォームに免疫反応性
のある第二の検出可能な抗体とが入った容器を区分して
密封状態で入れた搬器が入っている。好ましい実施態様
では、第一と第二の検出可能な抗体に、異なる検出法で
識別できる異なる標識で標識を付ける。さらに別の容器
には、μCANPの76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォ
ームの標準系列希釈溶液が入っている。
イソフォームだけに免疫反応性のある第一の検出可能な
抗体と、μCANPのすべてのアイソフォームに免疫反応性
のある第二の検出可能な抗体とが入った容器を区分して
密封状態で入れた搬器が入っている。好ましい実施態様
では、第一と第二の検出可能な抗体に、異なる検出法で
識別できる異なる標識で標識を付ける。さらに別の容器
には、μCANPの76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォ
ームの標準系列希釈溶液が入っている。
【００３５】あるいは、キットには、μCANPの80kDaア
イソフォームのみに免疫反応性のある第一の検出可能な
抗体と、μCANPの76kDaアイソフォームに免疫反応性の
ある第二の検出可能な抗体とが入った容器手段を区分し
て密封状態で入れた搬器が入っている。好ましい実施状
態では、第一と第二の検出可能な抗体は、異なる検出法
で識別できる異なる標識を付ける。さらに別の容器に
は、μCANPの76kDaと80kDaのアイソフォームの標準系列
希釈溶液が入っている。
イソフォームのみに免疫反応性のある第一の検出可能な
抗体と、μCANPの76kDaアイソフォームに免疫反応性の
ある第二の検出可能な抗体とが入った容器手段を区分し
て密封状態で入れた搬器が入っている。好ましい実施状
態では、第一と第二の検出可能な抗体は、異なる検出法
で識別できる異なる標識を付ける。さらに別の容器に
は、μCANPの76kDaと80kDaのアイソフォームの標準系列
希釈溶液が入っている。
【００３６】μCANPアイソフォームを分離／同定する手
段には、μCANPを電気泳動で分離するのに利用できるス
ラブゲルがはいっている。このようなスラブゲルとして
は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミ
ドゲルが好ましい。
段には、μCANPを電気泳動で分離するのに利用できるス
ラブゲルがはいっている。このようなスラブゲルとして
は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミ
ドゲルが好ましい。
【００３７】μCANPのアイソフォームの測定方法を実施
する際には、アイソフォームの特定の濃度、インキュベ
ーションの時間、および他の測定条件は、μCANPアイソ
フォームの濃度、試料の種類などを含む各種の因子によ
って変えることができる。当該技術分野の当業者は、日
常の実験法を利用して操作条件と最適測定条件を決定す
ることができる。
する際には、アイソフォームの特定の濃度、インキュベ
ーションの時間、および他の測定条件は、μCANPアイソ
フォームの濃度、試料の種類などを含む各種の因子によ
って変えることができる。当該技術分野の当業者は、日
常の実験法を利用して操作条件と最適測定条件を決定す
ることができる。
【００３８】検出可能な抗体の検出、したがってμCANP
のアイソフォームの検出は、例えば検出可能な抗体に放
射性ガンマ線エミッターで標識を付けた場合、シンチレ
ーションカウンターで行われ、または検出可能な標識が
蛍光エミッターの場合、蛍光光度計で行われる。酵素の
標識の場合、検出はその酵素に対する基質を利用する比
色法で行われる。定量はアイソフォームの標準物と比較
することによって行うことができる。
のアイソフォームの検出は、例えば検出可能な抗体に放
射性ガンマ線エミッターで標識を付けた場合、シンチレ
ーションカウンターで行われ、または検出可能な標識が
蛍光エミッターの場合、蛍光光度計で行われる。酵素の
標識の場合、検出はその酵素に対する基質を利用する比
色法で行われる。定量はアイソフォームの標準物と比較
することによって行うことができる。
【００３９】76kDa／80kDaの相対比率を測定するのに、
本願に記載の第一と第二の抗体を用いる場合は、これら
２つの抗体は、個別に検出できる２つの異なる標識で検
出可能になる標識を付けることができる。この実施態様
において、上記の比率は、両者の抗体とともに一回イン
キュベーションするこによって得ることができる。μCA
NPアイソフォームを含有する試料は、ニトロセルロース
もしくはポリ二フツ化ビニリデンの膜（Immobilon-P）
のような固相担体に固定化し、検出可能になる標識を付
けた第一と第二の抗体と反応させ、次いで結合した標識
の量を測定する。洗浄、攪拌、振盪、濾過などの他のス
テップは、通常の測定法または特別な場合に必要な測定
法に付け加えてもよい。
本願に記載の第一と第二の抗体を用いる場合は、これら
２つの抗体は、個別に検出できる２つの異なる標識で検
出可能になる標識を付けることができる。この実施態様
において、上記の比率は、両者の抗体とともに一回イン
キュベーションするこによって得ることができる。μCA
NPアイソフォームを含有する試料は、ニトロセルロース
もしくはポリ二フツ化ビニリデンの膜（Immobilon-P）
のような固相担体に固定化し、検出可能になる標識を付
けた第一と第二の抗体と反応させ、次いで結合した標識
の量を測定する。洗浄、攪拌、振盪、濾過などの他のス
テップは、通常の測定法または特別な場合に必要な測定
法に付け加えてもよい。
【００４０】以下に一層詳細に記載するように、μCANP
の活性化が、アルツハイマー病の特徴である神経原線維
変化とβ-アミロイドの生成を起こさせるということの
証拠がある。したがってμCANPの活性化を阻害する薬剤
は、アルツハイマー病に特微的な神経異常を治療するか
または予防するのに有効である。したがって本発明は、 （ａ）第一の動物の脳の試料、好ましくは脳皮質のスラ
イスを入手し； （ｂ）第一の動物の脳の試料の、μCANPの76kDaのアイ
ソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測定
し； （ｃ）第二の動物の脳の試料を、Ca++水溶液およびアル
ツハイマー病を治療もしくは予防するのに有効であると
推量される薬剤とともにインキュベートし； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た組織試料の、μCANPの76kD
aアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測
定し；ステップ（ｄ）で測定した、前記薬剤とインキュ
ベートさせた動物の脳の試料の76kDa／80kDa比率が、ス
テップ（ｂ）で得た76kDa／80kDa比率に比較して減少し
ている場合はその薬剤がアルツハイマー病を治療もしく
は予防するのに有効であると確認する；ことからなる、
アルツハイマー病の治療もしくは予防薬をスクリーニン
グする方法に関する。
の活性化が、アルツハイマー病の特徴である神経原線維
変化とβ-アミロイドの生成を起こさせるということの
証拠がある。したがってμCANPの活性化を阻害する薬剤
は、アルツハイマー病に特微的な神経異常を治療するか
または予防するのに有効である。したがって本発明は、 （ａ）第一の動物の脳の試料、好ましくは脳皮質のスラ
イスを入手し； （ｂ）第一の動物の脳の試料の、μCANPの76kDaのアイ
ソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測定
し； （ｃ）第二の動物の脳の試料を、Ca++水溶液およびアル
ツハイマー病を治療もしくは予防するのに有効であると
推量される薬剤とともにインキュベートし； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た組織試料の、μCANPの76kD
aアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測
定し；ステップ（ｄ）で測定した、前記薬剤とインキュ
ベートさせた動物の脳の試料の76kDa／80kDa比率が、ス
テップ（ｂ）で得た76kDa／80kDa比率に比較して減少し
ている場合はその薬剤がアルツハイマー病を治療もしく
は予防するのに有効であると確認する；ことからなる、
アルツハイマー病の治療もしくは予防薬をスクリーニン
グする方法に関する。
【００４１】第一と第二の脳の試料は、動物の脳から死
亡直前に入手するか、またはアルツハイマー病の個体か
ら死後に入手するのが好ましい。
亡直前に入手するか、またはアルツハイマー病の個体か
ら死後に入手するのが好ましい。
【００４２】あるいは、本発明は、 （ａ）第一の繊維芽細胞の試料を動物から入手し； （ｂ）第一の繊維芽細胞の試料の、μCANPの76kDaのア
イソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測定
し； （ｃ）第二の繊維芽細胞の試料を、Ca++の水溶液すなわ
ちカルシウムイオノホアおよびアルツハイマー病を治療
もしくは予防するのに有効であると推量される薬剤とと
もにインキュベートし； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た繊維芽細胞の試料の、μCA
NPの76kDaアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対
比率を測定し；ステップ（ｄ）で測定した、前記薬剤と
インキュベートさせた繊維芽細胞の試料の76kDa／80kDa
比率がステップ（ｂ）で得た76kDa／80kDa比率に比べて
減少している場合はその薬剤がアルツハイマー病を治療
もしくは予防するのに有効であると確認する；ことから
なる、アルツハイマー病の治療もしくは予防薬をスクリ
ーニングする方法に関する。
イソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測定
し； （ｃ）第二の繊維芽細胞の試料を、Ca++の水溶液すなわ
ちカルシウムイオノホアおよびアルツハイマー病を治療
もしくは予防するのに有効であると推量される薬剤とと
もにインキュベートし； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た繊維芽細胞の試料の、μCA
NPの76kDaアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対
比率を測定し；ステップ（ｄ）で測定した、前記薬剤と
インキュベートさせた繊維芽細胞の試料の76kDa／80kDa
比率がステップ（ｂ）で得た76kDa／80kDa比率に比べて
減少している場合はその薬剤がアルツハイマー病を治療
もしくは予防するのに有効であると確認する；ことから
なる、アルツハイマー病の治療もしくは予防薬をスクリ
ーニングする方法に関する。
【００４３】両方の方法のステップ（ｂ）において、各
組織の試料が第一に緩衝液中でホモジナイズされ次に遠
心分離されて上澄み液が得られ、次いで上澄み液のμCA
NPの76kDaアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対
比率が測定される。この場合、μCANPの76kDaアイソフ
ォーム／80kDaアイソフォームの相対比率は、 （ｅ）上澄み液のμCANPをゲル電気泳動によって分離
し； （ｆ）分離された、μCANPの76kDaアイソフォームおよ
びμCANPの80kDaアイソフォームを、これらと免疫反応
性のある少なくとも１つの検出可能な抗体と反応させ； （ｇ）μCANPの76kDaアイソフォームと80kDaアイソフォ
ームに結合した検出可能な抗体の量を測定して、各アイ
ソフォームに対する相対値を得て；次いで （ｈ）76kDaアイソフォームに対する相対値を、80kDaア
イソフォームに対する相対値で割算して前記比率を得
る；ことによって測定される。
組織の試料が第一に緩衝液中でホモジナイズされ次に遠
心分離されて上澄み液が得られ、次いで上澄み液のμCA
NPの76kDaアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対
比率が測定される。この場合、μCANPの76kDaアイソフ
ォーム／80kDaアイソフォームの相対比率は、 （ｅ）上澄み液のμCANPをゲル電気泳動によって分離
し； （ｆ）分離された、μCANPの76kDaアイソフォームおよ
びμCANPの80kDaアイソフォームを、これらと免疫反応
性のある少なくとも１つの検出可能な抗体と反応させ； （ｇ）μCANPの76kDaアイソフォームと80kDaアイソフォ
ームに結合した検出可能な抗体の量を測定して、各アイ
ソフォームに対する相対値を得て；次いで （ｈ）76kDaアイソフォームに対する相対値を、80kDaア
イソフォームに対する相対値で割算して前記比率を得
る；ことによって測定される。
【００４４】あるいは、μCANPの76kDaアイソフォーム
／80kDaアイソフォームの相対比率は、 （ｅ）前記上澄み液を第一と第二の検出可能な抗体と反
応させ（但し第一の検出可能な抗体はμCANPの80kDaア
イソフォームとだけ免疫反応性があり、第二の検出可能
な抗体は、μCANPの76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソ
フォームと免疫反応性があり）； （ｆ）μCANPのそれぞれのアイソフォームに結合した検
出可能な第一と第二の抗体の量を測定して相対値を得
て；次いで （ｇ）76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォームに対
する相対値を、80kDaアイソフォームに対する相対値で
割算して前記比率を得る；ことによって測定される。
／80kDaアイソフォームの相対比率は、 （ｅ）前記上澄み液を第一と第二の検出可能な抗体と反
応させ（但し第一の検出可能な抗体はμCANPの80kDaア
イソフォームとだけ免疫反応性があり、第二の検出可能
な抗体は、μCANPの76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソ
フォームと免疫反応性があり）； （ｆ）μCANPのそれぞれのアイソフォームに結合した検
出可能な第一と第二の抗体の量を測定して相対値を得
て；次いで （ｇ）76kDa、78kDaおよび80kDaのアイソフォームに対
する相対値を、80kDaアイソフォームに対する相対値で
割算して前記比率を得る；ことによって測定される。
【００４５】80kDaアイソフォームの76kDaアイソフォー
ムへの変換反応はカルシウム依存性である。したがっ
て、ステップ（ｃ）では、組織の試料は、第一にカルシ
ウムおよび薬剤とともに、76kDa／80kDa比率を変化させ
るのに充分な時間インキュベートする。一般に、薬剤と
カルシウムは、約５〜約60分間、組織試料とインキュベ
ートさせる。カルシウムの濃度は０〜５mMの範囲内が好
ましい。薬剤の濃度は0.001〜約1000μMの範囲内が好ま
しい。組織の試料は最初に薬剤とともに約４℃でインキ
ュベートし、次にカルシウムおよび薬剤とともに約30℃
でインキュベートする。繊維芽細胞を用いる場合、A231
87のようなカルシウムイオノホアが、１〜100μMの濃度
範囲で用いられる。この場合、組織試料を緩衝液中でホ
モジナイズし次に遠心分離して上澄み液を得て、次いで
前記上澄み液の、μCANPの76kDaアイソフォーム／80kDa
アイソフォームの相対比率を測定する。
ムへの変換反応はカルシウム依存性である。したがっ
て、ステップ（ｃ）では、組織の試料は、第一にカルシ
ウムおよび薬剤とともに、76kDa／80kDa比率を変化させ
るのに充分な時間インキュベートする。一般に、薬剤と
カルシウムは、約５〜約60分間、組織試料とインキュベ
ートさせる。カルシウムの濃度は０〜５mMの範囲内が好
ましい。薬剤の濃度は0.001〜約1000μMの範囲内が好ま
しい。組織の試料は最初に薬剤とともに約４℃でインキ
ュベートし、次にカルシウムおよび薬剤とともに約30℃
でインキュベートする。繊維芽細胞を用いる場合、A231
87のようなカルシウムイオノホアが、１〜100μMの濃度
範囲で用いられる。この場合、組織試料を緩衝液中でホ
モジナイズし次に遠心分離して上澄み液を得て、次いで
前記上澄み液の、μCANPの76kDaアイソフォーム／80kDa
アイソフォームの相対比率を測定する。
【００４６】本発明を実施する際に、ヒトμCANPに対し
て生成させたモノクローナル抗体（Samis, J.A.ら、Bio
chem. J. 246巻481〜488頁1987年；Elce, J.S.ら、Bioc
hem.J.261巻1039〜1042頁 1989年；これらの文献の内容
はすべて本願に援用するものとする）を、ヒト脳の抽出
物におけるμCANPの大サブユニットの３つのアイソフォ
ームを、ウエスタンブロット分析法によって検出するの
に利用する。これらのアイソフォーム（アイソザイム）
は、ヒト赤血球のアイソザイム（Samis, J.A.ら、Bioch
em. J. 246巻481〜488頁1987年；Elce, J. S.ら、Bioch
em. J. 261巻1039〜1042頁1989年；Samisら、Biochem.
J. 246巻、481〜487頁1987年）と同一の80kDa、78kDaお
よび76kDaの分子量を、SDSポリアクリルアミドゲル上に
示す（図1(A)）。カルシウムを添加することによって、
ヒト赤血球のμCANPをin vitroで活性化すると、その酵
素によって精製スペクトリンが加水分解されて、Gly26-
Leu27のペプチド結合において80kDaアイソフォームのＮ
末端分解が起こり76kDaアイソフォームが生成する（μC
ANPの76kDaアイソフォームは、自己消化で生成しSDS-PA
GEで分離してDF-immobilon膜に移され、William Lane氏
の好意によってthe Harvard University Microchemistr
y Facilityにてエドマン法でＮ末端分析がなされた）
（図１(B)）。80kDaのμCANPアイソフォームの、78kDa
と76kDaのアイソフォームへの変換反応は30秒間以内で
ほぼ完了した。酵素の活性は、80kDaのμCANPが存在し
ない場合にも保持され、76kDaアイソフォームの量に比
例したままであり、76kDaアイソフォームが酵素として
活性であるという他の新しいデータ（Pontremoli, S.
ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 123(1)巻331〜33
7頁1984年；Inomata, M.ら、Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 138(2)巻638〜643頁1986年）を裏付けている
（図２）。ヒト脳μCANPは無細胞抽出物中では不安定で
あるが、μCANPの80kDaアイソフォームの76kDaアイソフ
ォームへの変換反応は、カルシウムとともにインキュベ
ートしたヒトの新皮質のスライス中で証明することがで
きた（図３）。μCANPの自己消化は、80kDaアイソフォ
ームのＮ末端の先端消失を、ポリペプチドの最初の21個
のアミノ酸に対するポリクローナル抗体を用いて証明す
ることによって確認された［ヒト肝臓cDNAから推測され
たμCANPのＮ末端の先端のアミノ酸配列に相当する34量
体の合成ペプチド（Imajohら、Biochem. 27巻8122頁198
8年、この文献の内容はすべて本願に援用するものとす
る）を、すでに報告されているように（Vitto & Nixon,
J. Neurochem. 47巻1039〜1051頁1986年）、非結合型
を用いて２カ月齢のニュージーランドウサギを免疫化し
た］。この34量体のアミノ酸配列は次の通りである。す
なわち［SEQ ID No.2］
て生成させたモノクローナル抗体（Samis, J.A.ら、Bio
chem. J. 246巻481〜488頁1987年；Elce, J.S.ら、Bioc
hem.J.261巻1039〜1042頁 1989年；これらの文献の内容
はすべて本願に援用するものとする）を、ヒト脳の抽出
物におけるμCANPの大サブユニットの３つのアイソフォ
ームを、ウエスタンブロット分析法によって検出するの
に利用する。これらのアイソフォーム（アイソザイム）
は、ヒト赤血球のアイソザイム（Samis, J.A.ら、Bioch
em. J. 246巻481〜488頁1987年；Elce, J. S.ら、Bioch
em. J. 261巻1039〜1042頁1989年；Samisら、Biochem.
J. 246巻、481〜487頁1987年）と同一の80kDa、78kDaお
よび76kDaの分子量を、SDSポリアクリルアミドゲル上に
示す（図1(A)）。カルシウムを添加することによって、
ヒト赤血球のμCANPをin vitroで活性化すると、その酵
素によって精製スペクトリンが加水分解されて、Gly26-
Leu27のペプチド結合において80kDaアイソフォームのＮ
末端分解が起こり76kDaアイソフォームが生成する（μC
ANPの76kDaアイソフォームは、自己消化で生成しSDS-PA
GEで分離してDF-immobilon膜に移され、William Lane氏
の好意によってthe Harvard University Microchemistr
y Facilityにてエドマン法でＮ末端分析がなされた）
（図１(B)）。80kDaのμCANPアイソフォームの、78kDa
と76kDaのアイソフォームへの変換反応は30秒間以内で
ほぼ完了した。酵素の活性は、80kDaのμCANPが存在し
ない場合にも保持され、76kDaアイソフォームの量に比
例したままであり、76kDaアイソフォームが酵素として
活性であるという他の新しいデータ（Pontremoli, S.
ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 123(1)巻331〜33
7頁1984年；Inomata, M.ら、Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 138(2)巻638〜643頁1986年）を裏付けている
（図２）。ヒト脳μCANPは無細胞抽出物中では不安定で
あるが、μCANPの80kDaアイソフォームの76kDaアイソフ
ォームへの変換反応は、カルシウムとともにインキュベ
ートしたヒトの新皮質のスライス中で証明することがで
きた（図３）。μCANPの自己消化は、80kDaアイソフォ
ームのＮ末端の先端消失を、ポリペプチドの最初の21個
のアミノ酸に対するポリクローナル抗体を用いて証明す
ることによって確認された［ヒト肝臓cDNAから推測され
たμCANPのＮ末端の先端のアミノ酸配列に相当する34量
体の合成ペプチド（Imajohら、Biochem. 27巻8122頁198
8年、この文献の内容はすべて本願に援用するものとす
る）を、すでに報告されているように（Vitto & Nixon,
J. Neurochem. 47巻1039〜1051頁1986年）、非結合型
を用いて２カ月齢のニュージーランドウサギを免疫化し
た］。この34量体のアミノ酸配列は次の通りである。す
なわち［SEQ ID No.2］
【００４７】
【化２】 Ser Glu Glu Ile Ile Thr Pro Val Tyr Cys Thr Gly Val Ser Ala Gln 1 5 10 15 Val Gln Lys Gln Arg Ala Arg Glu Leu Gly Leu Gly Arg His Glu Asn 20 25 30 Ala Ile
【００４８】この34量体に対して製造した抗血清は、ヒ
トの脳から30,000xgの遠心分離で得た上澄み液抽出物の
ウェスタンブロット分析を行った際に、μCANPの80kDa
アイソフォームと特異的に反応した。
トの脳から30,000xgの遠心分離で得た上澄み液抽出物の
ウェスタンブロット分析を行った際に、μCANPの80kDa
アイソフォームと特異的に反応した。
【００４９】アルツハイマー病の脳内でのμCANP活性化
の相対的状態を評価するために、死亡の直前に痴呆の診
断を受けて、アルツハイマー病の神経病理学的な診断基
準に合致した22個の個体、ならびに臨床上の神経疾患
（Khachaturian Z.S.、Arch. Neurol.、42巻1097〜1105
頁、1985年）およびアルツハイマー病の神経病理学的特
徴（Mirra S.S.ら、Neurology、41巻479〜486頁、1991
年）がない17の個体由来の脳組織の抽出物を免疫検定す
ることによって、前記の３つのμCANPアイソフォームを
定量分析した。このアルツハイマー病群と対照群は、個
体の年齢（それぞれ75.8±2.0歳対68.9±2.6歳）および
脳試料採取までの死後の時間経過（それぞれ12.2±1.3
時間対12.0±1.8時間）について釣合いをとった。
の相対的状態を評価するために、死亡の直前に痴呆の診
断を受けて、アルツハイマー病の神経病理学的な診断基
準に合致した22個の個体、ならびに臨床上の神経疾患
（Khachaturian Z.S.、Arch. Neurol.、42巻1097〜1105
頁、1985年）およびアルツハイマー病の神経病理学的特
徴（Mirra S.S.ら、Neurology、41巻479〜486頁、1991
年）がない17の個体由来の脳組織の抽出物を免疫検定す
ることによって、前記の３つのμCANPアイソフォームを
定量分析した。このアルツハイマー病群と対照群は、個
体の年齢（それぞれ75.8±2.0歳対68.9±2.6歳）および
脳試料採取までの死後の時間経過（それぞれ12.2±1.3
時間対12.0±1.8時間）について釣合いをとった。
【００５０】細胞質中の80kDa μCANPの含有量は、アル
ツハイマー病グループの方が対照グループよりかなり低
かった（22.7±1.5％対37.2±2.2％、p<0.001、対応の
ないｔ−検定法）。これに対して自己消化で活性化され
た（76kDa）μCANPは、アルツハイマー病の脳では対照
群（26.6±2.2％）より約２倍まで（41.2±1.6％）増加
した（p<0.001）。78kDa μCANPアイソフォームは変化
しなかった。個体の脳試料に対する76kDa/80kDa μCANP
の比率は、アルツハイマー病グループの方が高く、ほぼ
３倍であった（2.20±0.39対0.81±0.10）。３つのμCA
NPアイソフォームの合計は変化しなかった（表１）。
ツハイマー病グループの方が対照グループよりかなり低
かった（22.7±1.5％対37.2±2.2％、p<0.001、対応の
ないｔ−検定法）。これに対して自己消化で活性化され
た（76kDa）μCANPは、アルツハイマー病の脳では対照
群（26.6±2.2％）より約２倍まで（41.2±1.6％）増加
した（p<0.001）。78kDa μCANPアイソフォームは変化
しなかった。個体の脳試料に対する76kDa/80kDa μCANP
の比率は、アルツハイマー病グループの方が高く、ほぼ
３倍であった（2.20±0.39対0.81±0.10）。３つのμCA
NPアイソフォームの合計は変化しなかった（表１）。
【００５１】
【表１】 μCANPの含量（μg/mgタンパク質） ─────────────────────────────────── 前頭葉皮質 被殻 小脳 ─────────────────────────────────── 対照 5.67±0.41 6.61±0.53 5.89±0.43 (17) ( 8) (14) アルツハイマー病 5.36±0.29 5.98±0.33 5.74±0.49 (22) (21) (21) ハンチントン病 5.97±0.46 5.95±0.47 5.90±0.43 (12) (14) (16) ─────────────────────────────────── すでに報告されている免疫定量法（Takeuchi K.S.ら、
J. Neurochem.、92巻526〜532頁、1992年）で測定した
対照の個体、およびアルツハイマー病（AD）とハンチン
トン病の患者由来の脳各部位のμCANP含量。μCANPは実
施例１に記載したようにして、0.5ｇの脳の試料からDEA
E-セルロースクロマトグラフィーで部分的に精製して得
た。全μCANP含有量は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法と免疫ブロット分析法を行った後、デンシトメ
ーターで定量した。免疫ブロット上のμCANPの量は、免
疫ブロット上のヒト赤血球μCANPの既知量を変化させて
免疫染色強度を測定することによって作成した標準曲線
から計算した。免疫定量法の変動をできるだけ小さく制
御するため、脳の試料を含有するすべての免疫ブロット
とともに、標準量のμCANPも分析した。試験結果は、平
均値±括弧内に示す数のS.E.Mで表してある。
J. Neurochem.、92巻526〜532頁、1992年）で測定した
対照の個体、およびアルツハイマー病（AD）とハンチン
トン病の患者由来の脳各部位のμCANP含量。μCANPは実
施例１に記載したようにして、0.5ｇの脳の試料からDEA
E-セルロースクロマトグラフィーで部分的に精製して得
た。全μCANP含有量は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法と免疫ブロット分析法を行った後、デンシトメ
ーターで定量した。免疫ブロット上のμCANPの量は、免
疫ブロット上のヒト赤血球μCANPの既知量を変化させて
免疫染色強度を測定することによって作成した標準曲線
から計算した。免疫定量法の変動をできるだけ小さく制
御するため、脳の試料を含有するすべての免疫ブロット
とともに、標準量のμCANPも分析した。試験結果は、平
均値±括弧内に示す数のS.E.Mで表してある。
【００５２】細胞質中の画分中のμCANPアイソフォーム
の異常な比率は、その細胞分布のシフトによるものでは
なかった（表２）。全μCANPの約30％が、対照グループ
とアルツハイマー病のグループの両者の膜画分に結合し
ている（表２）。この画分中の76kDa μCANPがより高い
比率で見られるのは、μCANPが主に膜上で活性化される
という推測と一致している（Inomata M.ら、J. Biol. C
hem.、264(31)巻18838〜18843頁、1969年；Pontremol
S.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun.、128(1)巻331
〜338頁、1985年）。興味深いことであるが、対照の脳
由来の細胞質中の画分の76kDa/80kDaアイソフォームの
比率は、対照の脳の対応する膜画分中の該比率と有意に
相関関係がある（ｒ＝0.839、p<0.005）が、この関係は
アルツハイマー病の脳では阻害されている（ｒ＝0.07
7）。
の異常な比率は、その細胞分布のシフトによるものでは
なかった（表２）。全μCANPの約30％が、対照グループ
とアルツハイマー病のグループの両者の膜画分に結合し
ている（表２）。この画分中の76kDa μCANPがより高い
比率で見られるのは、μCANPが主に膜上で活性化される
という推測と一致している（Inomata M.ら、J. Biol. C
hem.、264(31)巻18838〜18843頁、1969年；Pontremol
S.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun.、128(1)巻331
〜338頁、1985年）。興味深いことであるが、対照の脳
由来の細胞質中の画分の76kDa/80kDaアイソフォームの
比率は、対照の脳の対応する膜画分中の該比率と有意に
相関関係がある（ｒ＝0.839、p<0.005）が、この関係は
アルツハイマー病の脳では阻害されている（ｒ＝0.07
7）。
【００５３】
【表２】 ─────────────────────────────────── 対照（N=8） ＡＤ（N=9） ─────────────────────────────────── 細胞質ゾルの画分 μCANP含量 μg/mgタンパク質 1.52±0.15 1.60±0.12 (69.7±3.9)# (73.0 ±3.3) アイソフォーム含量 全体に対する％ 80 kDa 31.3±2.0 24.4 ±1.4** 78 kDa 38.0±0.8 36.4 ±1.3 76 kDa 30.7±2.5 39.2 ±2.6* ─────────────────────────────────── 膜の画分 μCANP含量、μg/mgタンパク質 0.65±0.08 0.59±0.07 (30.3 ±3.9) (27.0±3.3) アイソフォーム含量 全体に対する％ 80 kDa 18.2 ±1.3*** 17.5 ±1.3***,**** 78 kDa 41.5 ±1.3* 39.4 ±1.0 76 kDa 40.4 ±1.8*** 43.1 ±1.7*** ─────────────────────────────────── 対照とアルツハイマー病の患者の前頭葉皮質におけるμ
CANPアイソフォームの細胞内分布。脳組織のホモジネー
トを15,000xgで４℃にて30分間遠心分離に付して、細胞
質（上澄み液）画分と膜（ペレット）画分を得た。これ
らの画分中のμCANP含量は、表１の凡例で先に記載した
のと同様にして免疫定量法で定量した。データは平均±
S.E.Mで表してある。括弧内の数字は、細胞質画分と膜
画分の合計に対する平均百分率を示す（μCANP含量±S.
E.Mについて、*、**、および***のマークはそれぞれ対
照の細胞質中のμCANPアイソフォームに対してp<0.05、
p<0.01およびp<0.005であることを示し、****のマーク
はADの細胞質中のμCANPに対してp<0.005であることを
示す）。
CANPアイソフォームの細胞内分布。脳組織のホモジネー
トを15,000xgで４℃にて30分間遠心分離に付して、細胞
質（上澄み液）画分と膜（ペレット）画分を得た。これ
らの画分中のμCANP含量は、表１の凡例で先に記載した
のと同様にして免疫定量法で定量した。データは平均±
S.E.Mで表してある。括弧内の数字は、細胞質画分と膜
画分の合計に対する平均百分率を示す（μCANP含量±S.
E.Mについて、*、**、および***のマークはそれぞれ対
照の細胞質中のμCANPアイソフォームに対してp<0.05、
p<0.01およびp<0.005であることを示し、****のマーク
はADの細胞質中のμCANPに対してp<0.005であることを
示す）。
【００５４】μCANPの異常活性化の程度は、アルツハイ
マー病の脳の場合、すべての死後の時間経過において類
似していた。76kDa/80kDaのアイソフォームの比率につ
いて、死後の時間経過に対して回帰曲線を作成したとこ
ろ、対照（ｒ＝0.355）、アルツハイマー病（ｒ＝0.15
5）または混合グループ（ｒ＝0.148）では、相関関係は
有意でなかった（図４）。しかし、アイソフォーム比率
が死亡してから最初の数時間以内に有意に変化するとい
う可能性は排除することはできない。また、μCANP活性
化の程度は、すべてのグループについて試験した範囲内
で年齢と有意な相関関係はなかった。
マー病の脳の場合、すべての死後の時間経過において類
似していた。76kDa/80kDaのアイソフォームの比率につ
いて、死後の時間経過に対して回帰曲線を作成したとこ
ろ、対照（ｒ＝0.355）、アルツハイマー病（ｒ＝0.15
5）または混合グループ（ｒ＝0.148）では、相関関係は
有意でなかった（図４）。しかし、アイソフォーム比率
が死亡してから最初の数時間以内に有意に変化するとい
う可能性は排除することはできない。また、μCANP活性
化の程度は、すべてのグループについて試験した範囲内
で年齢と有意な相関関係はなかった。
【００５５】いくつかのニューロンは、アルツハイマー
病の新皮質中で変性しているので、ニューロンの変性が
最小か、もしくはないと報告されている（Pro J.D.ら、
Neurology、30巻820〜825頁、1980年；Katzman & Terr
y、"The Neurobiology of Aging"、Katzman & Terry編
集、F.A.Davis Co.社、ニューヨーク、51〜84頁、1983
年）。２つの脳の部分におけるμCANP活性化度を試験し
た。μCANPアイソフォームの76kDa/80kDaの比率はアル
ツハイマー病の症例で、被殻（46％、p<0.005）および
小脳（58％、p<0.005）の両方で有意に増大した（図５
(B)と５(C)）。これに対して、第III期ハンチントン病
の患者由来の前頭葉皮質と小脳では、μCANPアイソフォ
ームの比率は正常であった（図５(A)と５(C)）。進行中
のニューロンの変性がCANPの活性化と関連しているとい
う証拠（Dure L.S.ら、Ann. Neurol.、30巻785〜793
頁、1991年）と一致して、ハンチントン病の患者（HD）
由来の被殻の試料中でCANPの活性化が50％増加した（p<
0.05）（Vonsattel J.P.ら、J. Neuropathol. Exp. Neu
rol.、44巻559〜557頁、1985年；Roos R.A.C.ら、J. Ne
urol. Neurosurg. Psychiatry、48巻422〜425頁、1985
年）が、この試料中ではニューロンの消失が著しい（図
５(B)）。
病の新皮質中で変性しているので、ニューロンの変性が
最小か、もしくはないと報告されている（Pro J.D.ら、
Neurology、30巻820〜825頁、1980年；Katzman & Terr
y、"The Neurobiology of Aging"、Katzman & Terry編
集、F.A.Davis Co.社、ニューヨーク、51〜84頁、1983
年）。２つの脳の部分におけるμCANP活性化度を試験し
た。μCANPアイソフォームの76kDa/80kDaの比率はアル
ツハイマー病の症例で、被殻（46％、p<0.005）および
小脳（58％、p<0.005）の両方で有意に増大した（図５
(B)と５(C)）。これに対して、第III期ハンチントン病
の患者由来の前頭葉皮質と小脳では、μCANPアイソフォ
ームの比率は正常であった（図５(A)と５(C)）。進行中
のニューロンの変性がCANPの活性化と関連しているとい
う証拠（Dure L.S.ら、Ann. Neurol.、30巻785〜793
頁、1991年）と一致して、ハンチントン病の患者（HD）
由来の被殻の試料中でCANPの活性化が50％増加した（p<
0.05）（Vonsattel J.P.ら、J. Neuropathol. Exp. Neu
rol.、44巻559〜557頁、1985年；Roos R.A.C.ら、J. Ne
urol. Neurosurg. Psychiatry、48巻422〜425頁、1985
年）が、この試料中ではニューロンの消失が著しい（図
５(B)）。
【００５６】ハンチントン病の被殻中に見られるμCANP
活性化の小さな増加は、この領域で起こる最終段階の細
胞死またはNMDA受容体の刺激に関連するカルシウムの流
入によって説明することができる。そして、このことは
ハンチントン病におけるニューロンの死の基本的機構で
あると考えられている（Dure L.S.ら、Ann. Neurol.、3
0巻785〜793頁、1991年）。アルツハイマー病の新皮質
における非常に高いレベルのμCANPの活性化と、最小の
ニューロン変性を示す脳の領域における類似の異常と
は、μCANPの活性化は単に最終段階のニューロンの変性
の結果ではなくて、ニューロンの変性より先行してこの
変性に寄与するより広範囲の代謝の変化を反映すること
を示している。この点について、新皮質においてシナプ
スが大きく失われることは、痴呆と相関関係があるが
（Terryら、Ann. Neurol.、30巻572〜580頁、1991年；H
amosら、Ann. Neurol.、39巻355頁、1991年；Dekosky &
Scheff、Ann. Neurol.、27巻457〜464頁、1990年）、
μCANPはシナプスに多く存在する（Peterson C.ら、Neu
rosci. Lett.、121巻239〜243頁、1991年）ので関連が
あり、および神経末端におけるCANPの活性化は末端の変
性と関連があった（Swanson & Vrb va、Devel. Brain R
es.、33巻199〜203頁、1987年；O'Brien R.A.D.ら、Neu
roscience、12巻637〜646頁、1984年）。
活性化の小さな増加は、この領域で起こる最終段階の細
胞死またはNMDA受容体の刺激に関連するカルシウムの流
入によって説明することができる。そして、このことは
ハンチントン病におけるニューロンの死の基本的機構で
あると考えられている（Dure L.S.ら、Ann. Neurol.、3
0巻785〜793頁、1991年）。アルツハイマー病の新皮質
における非常に高いレベルのμCANPの活性化と、最小の
ニューロン変性を示す脳の領域における類似の異常と
は、μCANPの活性化は単に最終段階のニューロンの変性
の結果ではなくて、ニューロンの変性より先行してこの
変性に寄与するより広範囲の代謝の変化を反映すること
を示している。この点について、新皮質においてシナプ
スが大きく失われることは、痴呆と相関関係があるが
（Terryら、Ann. Neurol.、30巻572〜580頁、1991年；H
amosら、Ann. Neurol.、39巻355頁、1991年；Dekosky &
Scheff、Ann. Neurol.、27巻457〜464頁、1990年）、
μCANPはシナプスに多く存在する（Peterson C.ら、Neu
rosci. Lett.、121巻239〜243頁、1991年）ので関連が
あり、および神経末端におけるCANPの活性化は末端の変
性と関連があった（Swanson & Vrb va、Devel. Brain R
es.、33巻199〜203頁、1987年；O'Brien R.A.D.ら、Neu
roscience、12巻637〜646頁、1984年）。
【００５７】脳における広範囲にわたるμCANPの活性化
は、アルツハイマー病の患者の繊維芽細胞において、ス
ペクトリンの分解が増大していることを示す証拠（Pete
rsonC.ら、Neurosci. Lett.、121巻239〜243頁、1991
年）と、プロテインキナーゼＣの含量が減少しているこ
と（Saitoh T.ら、Lab. Invest.、64巻596〜616頁、199
1年）と一致しており、このスペクリンとプロテインキ
ナーゼＣはCANPの好ましい基質である。脳スペクトリン
の分解は、アルツハイマー病の脳の皮質と海馬でも増大
している（Masliah E.ら、Brain Res.、531巻36〜44
頁、1990年）。全CANPの活性がアルツハイマー病の脳で
は有意には変化しないという以前の報告（Kawashima S.
ら、Biomed. Res.、10(1)巻17〜23頁、1989年；Mantle
& Perry、J.Neurol. Sci.、102巻220〜224頁、1991年；
Nilsson E.ら、Neurobiol. Aging.、11巻425〜431頁、1
990年）は、本発明の発明者らの試験結果と一致してる
ので、全CANPプールの測定値は、CANP系の機能的活性を
敏感には反映しないことを示唆している。
は、アルツハイマー病の患者の繊維芽細胞において、ス
ペクトリンの分解が増大していることを示す証拠（Pete
rsonC.ら、Neurosci. Lett.、121巻239〜243頁、1991
年）と、プロテインキナーゼＣの含量が減少しているこ
と（Saitoh T.ら、Lab. Invest.、64巻596〜616頁、199
1年）と一致しており、このスペクリンとプロテインキ
ナーゼＣはCANPの好ましい基質である。脳スペクトリン
の分解は、アルツハイマー病の脳の皮質と海馬でも増大
している（Masliah E.ら、Brain Res.、531巻36〜44
頁、1990年）。全CANPの活性がアルツハイマー病の脳で
は有意には変化しないという以前の報告（Kawashima S.
ら、Biomed. Res.、10(1)巻17〜23頁、1989年；Mantle
& Perry、J.Neurol. Sci.、102巻220〜224頁、1991年；
Nilsson E.ら、Neurobiol. Aging.、11巻425〜431頁、1
990年）は、本発明の発明者らの試験結果と一致してる
ので、全CANPプールの測定値は、CANP系の機能的活性を
敏感には反映しないことを示唆している。
【００５８】シナプス消失と細胞死に関与していること
はさておき、異常なμCANP活性化は神経原線維変化とβ
−アミロイド形成の増大に関連する別の結果をニューロ
ンにもたらす。つまり、細胞骨格タンパク質などCANPの
基質（アミロイド前駆体タンパク質(APP)が含まれる）
の異常プロセシング（Simanら、"Neurotoxicity of Exc
itatory Amino Acids"、A. Guidotti編集、Raven Press
社、ニューヨーク、1990年、145〜161頁；Leeら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、88巻7233〜7347頁、1991
年）、ならびにAPPのプロセシングもしくは分泌にも影
響するカルシウム依存性プロテインキナーゼおよびホス
ファターゼの活性の変化（Togari A.ら、Biochem. Biop
hys. Res. Commun.、134(2)巻749〜754頁、1968年；Kis
himoto A.ら、J. Biol. Chem.、258巻1156〜1164頁、19
83年；Tallant E.A.ら、Biochem.、27巻2205〜2211頁、
1988年；Nixon R.A.、Ann. N.Y. Acad. Sci.、568巻198
〜208頁、1989年）である。この点については、可溶性
（分泌される）APPのレベルの減少が、アルツハイマー
病の患者の脳脊髄液に見出された。予備試験では、アル
ツハイマー病の患者の新皮質のμCANP活性化度は、ヒト
脳中の可溶性APPのレベルと高度に有意な逆相関関係を
示した。これらの試験結果は、β−アミロイドまたはAP
Pのフラグメントがアルツハイマー病に関連する神経変
性に対して重要な役割を持っているという仮説に適合し
ている。β−アミロイドまたはAPPフラグメントの毒性
は、一部がCANP活性化をもたらすと考えられるカルシウ
ムのホメオスタシスの変化を通じて引き起こされる。
はさておき、異常なμCANP活性化は神経原線維変化とβ
−アミロイド形成の増大に関連する別の結果をニューロ
ンにもたらす。つまり、細胞骨格タンパク質などCANPの
基質（アミロイド前駆体タンパク質(APP)が含まれる）
の異常プロセシング（Simanら、"Neurotoxicity of Exc
itatory Amino Acids"、A. Guidotti編集、Raven Press
社、ニューヨーク、1990年、145〜161頁；Leeら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、88巻7233〜7347頁、1991
年）、ならびにAPPのプロセシングもしくは分泌にも影
響するカルシウム依存性プロテインキナーゼおよびホス
ファターゼの活性の変化（Togari A.ら、Biochem. Biop
hys. Res. Commun.、134(2)巻749〜754頁、1968年；Kis
himoto A.ら、J. Biol. Chem.、258巻1156〜1164頁、19
83年；Tallant E.A.ら、Biochem.、27巻2205〜2211頁、
1988年；Nixon R.A.、Ann. N.Y. Acad. Sci.、568巻198
〜208頁、1989年）である。この点については、可溶性
（分泌される）APPのレベルの減少が、アルツハイマー
病の患者の脳脊髄液に見出された。予備試験では、アル
ツハイマー病の患者の新皮質のμCANP活性化度は、ヒト
脳中の可溶性APPのレベルと高度に有意な逆相関関係を
示した。これらの試験結果は、β−アミロイドまたはAP
Pのフラグメントがアルツハイマー病に関連する神経変
性に対して重要な役割を持っているという仮説に適合し
ている。β−アミロイドまたはAPPフラグメントの毒性
は、一部がCANP活性化をもたらすと考えられるカルシウ
ムのホメオスタシスの変化を通じて引き起こされる。
【００５９】CANP系の薬理学的制御は、虚血と血管攣縮
による神経系の障害を抑制するのにin vivoモデルで有
効であるが（Siman R.、"Neurotoxicity of Excitatory
Amino Acids"、A. Guidotti編集、Reven Press社、ニ
ューヨーク、145〜161頁、1990年；Lee K.S.ら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、88巻7233〜7347頁、1991年；Mi
nami N.ら、J. Neurosurg.、76巻111〜118頁、1992
年）、さらにアルツハイマー病の可能性がある治療法と
して検討する価値がある。
による神経系の障害を抑制するのにin vivoモデルで有
効であるが（Siman R.、"Neurotoxicity of Excitatory
Amino Acids"、A. Guidotti編集、Reven Press社、ニ
ューヨーク、145〜161頁、1990年；Lee K.S.ら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、88巻7233〜7347頁、1991年；Mi
nami N.ら、J. Neurosurg.、76巻111〜118頁、1992
年）、さらにアルツハイマー病の可能性がある治療法と
して検討する価値がある。
【００６０】下記の実施例は例証を目的とするものであ
り、本発明の方法と組成物を限定するものではない。当
該技術分野の当業者にとって自明な免疫診断法で通常遭
遇する各種の条件とパラメーターの他の適切な改変は、
本発明の思想と適用範囲内にある。
り、本発明の方法と組成物を限定するものではない。当
該技術分野の当業者にとって自明な免疫診断法で通常遭
遇する各種の条件とパラメーターの他の適切な改変は、
本発明の思想と適用範囲内にある。
【００６１】
【実施例】実施例１ 前頭葉皮質中のμCANPの免疫ブロット分析 図１(A)では、２つの対照（CONT）と２つのアルツハイ
マー病（AD）の患者由来の前頭葉皮質中のμCANPの免疫
ブロット分析の結果を示す。対照またはAD患者由来の前
頭葉皮質（0.5ｇ）を２mMのEGTA、１mMのEDTA、１mMの
ベンズアミジン、１mMのジチオトレイトール、１mMのフ
ェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）および0.32
Ｍのスクロースを含有する20mMトリスHCl pH7.4（緩衝
液Ａ）の10倍容積でホモジナイズした。得られたホモジ
ネートを４℃で30分間、15,000xgで遠心分離し、生成し
た上澄み液を緩衝液Ａで平衡化させたDEAE-セルロース
（DE-52、Whatman）のカラム（1.0×15cm）に注入し
た。そのカラムを緩衝液Ａで充分に洗浄し、０〜３mMま
で段階的に濃度を上昇させたKClで溶出した。μCANP
は、0.15M KClを含有する緩衝液Ａでカラムから溶出し
た。これらの画分は、Laemmli. Nature、227巻680〜685
頁、1970年の方法に従って7.5％SDS-PAGEにかけた。Tow
inら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、76巻4350〜4354
頁、1979年に従って、エレクトロブロッティング法を15
％メタノール、25mMトリスおよび192mMグリシンを含有
するブロッティング緩衝液pH8.3で実施した。４℃にて
2.5時間0.5Aの一定電流を加えることによって、タンパ
ク質類をPVDF-膜（Immobilon、Millipore社）上に電気
泳動によって転移させた。得られたブロットを２mM EGT
A、0.15M NaClを入れた50mMトリス-HCl pH7.4を含有す
る５％のスキムミルク溶液（ブロッキング緩衝液中）と
ともに、室温で１時間インキュベートした。ペルオキシ
ダーゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧを使い、ウサ
ギモノクローナル抗μCANP抗体で免疫ブロット分析を４
℃にて５時間実施した。得られたブロットを50mMトリス
-HCl pH7.5、0.15M NaClで数回洗浄した後、ペルオキシ
ダーゼ活性をH2O2、4-クロロ-1-ナフトールおよびN,N'-
ジメチル-p-フェニレンジアミンによって眼に見えるよ
うにした。図１(A)は、２つの代表的な対照の脳（レー
ン１と２）および２つのADの脳（レーン３と４）の前頭
葉皮質中のμCANPを示す。
マー病（AD）の患者由来の前頭葉皮質中のμCANPの免疫
ブロット分析の結果を示す。対照またはAD患者由来の前
頭葉皮質（0.5ｇ）を２mMのEGTA、１mMのEDTA、１mMの
ベンズアミジン、１mMのジチオトレイトール、１mMのフ
ェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）および0.32
Ｍのスクロースを含有する20mMトリスHCl pH7.4（緩衝
液Ａ）の10倍容積でホモジナイズした。得られたホモジ
ネートを４℃で30分間、15,000xgで遠心分離し、生成し
た上澄み液を緩衝液Ａで平衡化させたDEAE-セルロース
（DE-52、Whatman）のカラム（1.0×15cm）に注入し
た。そのカラムを緩衝液Ａで充分に洗浄し、０〜３mMま
で段階的に濃度を上昇させたKClで溶出した。μCANP
は、0.15M KClを含有する緩衝液Ａでカラムから溶出し
た。これらの画分は、Laemmli. Nature、227巻680〜685
頁、1970年の方法に従って7.5％SDS-PAGEにかけた。Tow
inら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、76巻4350〜4354
頁、1979年に従って、エレクトロブロッティング法を15
％メタノール、25mMトリスおよび192mMグリシンを含有
するブロッティング緩衝液pH8.3で実施した。４℃にて
2.5時間0.5Aの一定電流を加えることによって、タンパ
ク質類をPVDF-膜（Immobilon、Millipore社）上に電気
泳動によって転移させた。得られたブロットを２mM EGT
A、0.15M NaClを入れた50mMトリス-HCl pH7.4を含有す
る５％のスキムミルク溶液（ブロッキング緩衝液中）と
ともに、室温で１時間インキュベートした。ペルオキシ
ダーゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧを使い、ウサ
ギモノクローナル抗μCANP抗体で免疫ブロット分析を４
℃にて５時間実施した。得られたブロットを50mMトリス
-HCl pH7.5、0.15M NaClで数回洗浄した後、ペルオキシ
ダーゼ活性をH2O2、4-クロロ-1-ナフトールおよびN,N'-
ジメチル-p-フェニレンジアミンによって眼に見えるよ
うにした。図１(A)は、２つの代表的な対照の脳（レー
ン１と２）および２つのADの脳（レーン３と４）の前頭
葉皮質中のμCANPを示す。
【００６２】実施例２ μCANPの自己消化産物の免疫ブ
ロット分析 図１(B)はヒト赤血球由来のμCANPの生体外での自己消
化産物の免疫ブロット分析の結果を示す。ヒト赤血球μ
CANPは、すでに報告されているようにして正常な成人の
血液から精製し（Inomata M.ら、J. Biochem.、93巻291
〜294頁、1983年；Fairbanks G.ら、Biochemistry.、10
(13)巻2606頁、1971年）（レーン１）、１μMロイペプ
チン（レーン２）、10μMロイペプチン（レーン３）ま
たは100μMロイペプチン（レーン４）の存在下、5.3mM
CaCl2（最終の遊離カルシウム濃度は50μMであった）、
およびヒト赤血球スペクトリン2.2μg（Bennet V.ら、N
ature、299巻、126頁、1982年）とともに30℃にて30秒
間インキュベートするか、または5.3mM CaCl2およびス
ペクトリン2.2μgとともに30℃にて30秒間インキュベー
トした（レーン５）。
ロット分析 図１(B)はヒト赤血球由来のμCANPの生体外での自己消
化産物の免疫ブロット分析の結果を示す。ヒト赤血球μ
CANPは、すでに報告されているようにして正常な成人の
血液から精製し（Inomata M.ら、J. Biochem.、93巻291
〜294頁、1983年；Fairbanks G.ら、Biochemistry.、10
(13)巻2606頁、1971年）（レーン１）、１μMロイペプ
チン（レーン２）、10μMロイペプチン（レーン３）ま
たは100μMロイペプチン（レーン４）の存在下、5.3mM
CaCl2（最終の遊離カルシウム濃度は50μMであった）、
およびヒト赤血球スペクトリン2.2μg（Bennet V.ら、N
ature、299巻、126頁、1982年）とともに30℃にて30秒
間インキュベートするか、または5.3mM CaCl2およびス
ペクトリン2.2μgとともに30℃にて30秒間インキュベー
トした（レーン５）。
【００６３】図２は、酵素活性とμCANP含量の関係を示
す。ヒト赤血球のμCANPをカルシウムおよびスペクトリ
ンとともにプレインキュベートした後、１mM EGTAを添
加して反応を停止させた。各試料の1/2をSDS/PAGEに加
えて、各μCANPアイソフォームの免疫反応性をBio-Rad
Video Densitometer Model 620を用いて定量した。残り
の1/2の試料は、すでに報告されているのと同様にして
（Takeuchi K.S.ら、J.Neurochem.、92巻526〜532頁、1
992年）、基質としての[14C]アゾカセインおよび４mM C
aCl2（最終の遊離カルシウムの濃度は125μMであった）
を添加することによって、酵素活性を測定するのに用い
た。78kDaアイソフォームは、インキュベーションを１
分間行うことによって完全に消失したことに留意すべき
である。 ○印：プロテアーゼ活性、●印：μCANP 76kDaの含量。
す。ヒト赤血球のμCANPをカルシウムおよびスペクトリ
ンとともにプレインキュベートした後、１mM EGTAを添
加して反応を停止させた。各試料の1/2をSDS/PAGEに加
えて、各μCANPアイソフォームの免疫反応性をBio-Rad
Video Densitometer Model 620を用いて定量した。残り
の1/2の試料は、すでに報告されているのと同様にして
（Takeuchi K.S.ら、J.Neurochem.、92巻526〜532頁、1
992年）、基質としての[14C]アゾカセインおよび４mM C
aCl2（最終の遊離カルシウムの濃度は125μMであった）
を添加することによって、酵素活性を測定するのに用い
た。78kDaアイソフォームは、インキュベーションを１
分間行うことによって完全に消失したことに留意すべき
である。 ○印：プロテアーゼ活性、●印：μCANP 76kDaの含量。
【００６４】図３はヒト脳スライスにおけるμCANPの自
己消化を示す。死後の人の新しい脳（前頭葉皮質）の断
片（200μM）をCaCl2を含有するか（最終濃度５mM）、
または含有しない緩衝液Ａとともに37℃で60分間インキ
ュベートした。次にスライスを緩衝液Ａですすぎ（１ml
ずつ２回）、ホモジナイズし、次に15,000xgで４℃にて
30分間遠心分離した。得られた上澄み液を先に記載した
のと同様にて免疫ブロット分析に付した。ヒト赤血球μ
CANP（レーン１）；インキュベートしていないスライス
由来のヒト脳のμCANP（レーン２）、外因性カルシウム
なしでインキュベートしたスライス由来のヒト脳のμCA
NP（レーン３）、５mM CaCl2とともにインキュベートし
たスライス由来のヒト脳のμCANP（レーン４）または５
mM CaCl2＋10μMロイペプチンとともにインキュベート
したスライス由来のヒト脳のμCANP（レーン５）。
己消化を示す。死後の人の新しい脳（前頭葉皮質）の断
片（200μM）をCaCl2を含有するか（最終濃度５mM）、
または含有しない緩衝液Ａとともに37℃で60分間インキ
ュベートした。次にスライスを緩衝液Ａですすぎ（１ml
ずつ２回）、ホモジナイズし、次に15,000xgで４℃にて
30分間遠心分離した。得られた上澄み液を先に記載した
のと同様にて免疫ブロット分析に付した。ヒト赤血球μ
CANP（レーン１）；インキュベートしていないスライス
由来のヒト脳のμCANP（レーン２）、外因性カルシウム
なしでインキュベートしたスライス由来のヒト脳のμCA
NP（レーン３）、５mM CaCl2とともにインキュベートし
たスライス由来のヒト脳のμCANP（レーン４）または５
mM CaCl2＋10μMロイペプチンとともにインキュベート
したスライス由来のヒト脳のμCANP（レーン５）。
【００６５】実施例３ 対照とアルツハイマー病の脳の
比較 図４は、対照の個体（○）とADの患者（●）由来の前前
頭皮質中のμCANPの76kDa/80kDaのアイソフォームの比
率を死後の時間経過（PMI）に対してプロットしたグラ
フを示す。個体のアイソフォームの免疫定量（図１）
は、表１の凡例に記載したのと同様にして行った。
比較 図４は、対照の個体（○）とADの患者（●）由来の前前
頭皮質中のμCANPの76kDa/80kDaのアイソフォームの比
率を死後の時間経過（PMI）に対してプロットしたグラ
フを示す。個体のアイソフォームの免疫定量（図１）
は、表１の凡例に記載したのと同様にして行った。
【００６６】実施例４ アルツハイマー病の脳およびハ
ンチントン病の脳のアイソフォームレベルの比較 図５は、実施例３に記載したウェスタンブロット免疫定
量法によって測定した対照、アルツハイマー病、および
ハンチントン病（HD）の脳由来の脳部分のμCANPアイソ
フォーム比率（76kDa/80kDa）を示す。(A)前頭葉皮質：
HD（n=12）、対照（n=17）、AD症例（n=22）から得たPM
Iと年齢の平均値±S.E.Mは、10.5±1.9時間および54.6
±3.3歳であった。***p<0.005。(B)被殻：対照（n=
8）、AD（n=21）またはHD（n=14）の患者それぞれのPMI
と年齢の平均値±S.E.Mは、10.6±2.9時間と68.5±1.9
歳、14.8±1.4時間と71.8±2.3歳、または14.1±2.0時
間と６０．１±２．６歳であった。*p<0.05、***p<0.0
5。(C)小脳：対照（n=14）、AD（n=21）またはHD（n=1
6）の患者それぞれのPMIと年齢の平均値±S.E.Mは、7.6
±1.6時間と67.8±4.2歳、13.1±1.7時間と76.0±1.9
歳、または10.6±2.1時間と54.6±3.1歳であった。***p
<0.005。
ンチントン病の脳のアイソフォームレベルの比較 図５は、実施例３に記載したウェスタンブロット免疫定
量法によって測定した対照、アルツハイマー病、および
ハンチントン病（HD）の脳由来の脳部分のμCANPアイソ
フォーム比率（76kDa/80kDa）を示す。(A)前頭葉皮質：
HD（n=12）、対照（n=17）、AD症例（n=22）から得たPM
Iと年齢の平均値±S.E.Mは、10.5±1.9時間および54.6
±3.3歳であった。***p<0.005。(B)被殻：対照（n=
8）、AD（n=21）またはHD（n=14）の患者それぞれのPMI
と年齢の平均値±S.E.Mは、10.6±2.9時間と68.5±1.9
歳、14.8±1.4時間と71.8±2.3歳、または14.1±2.0時
間と６０．１±２．６歳であった。*p<0.05、***p<0.0
5。(C)小脳：対照（n=14）、AD（n=21）またはHD（n=1
6）の患者それぞれのPMIと年齢の平均値±S.E.Mは、7.6
±1.6時間と67.8±4.2歳、13.1±1.7時間と76.0±1.9
歳、または10.6±2.1時間と54.6±3.1歳であった。***p
<0.005。
【００６７】実施例５ アルツハイマー病−線維芽細胞
に於けるカルパイン制御の異常に関する研究 方法 FAD団体からの線維芽細胞を使用した実験を、対照群
（Ｃ）およびADに冒された個体からの線維芽細胞を提供
してくれたJesse Sisken博士（ユニバーシティ・オブ・
ケンタッキー・メディカル・スクール）と協同して行っ
た。１５％FBS(Sigma)を添加したDMEM(Gibco)中で試料
を保存した。細胞を、１７％FBS(Gibco)を添加したDMEM
(Gibco)中、コーニングの１００−mm培養プレートに置
いた。１〜１２日後に、培養はほぼ全面生長に達したと
思われたので収穫した。滅菌したゴム製ポリスマンで表
面から細胞をそっとこすりとった。細胞を遠心管に移し
て遠心分離し、細胞ペレットをFBSを含む培地に再懸濁
し、低温バイアルに移し、再び遠心して凍結した。ある
いは、０.０５％トリプシン−EDTAを加えて細胞を収穫
し、FBS添加培地で中和した。個々のアイソフォームの
免疫分析は表１の説明に記載した方法で行った。結果を
図６（パネルＡおよびＢ）に示す。
に於けるカルパイン制御の異常に関する研究 方法 FAD団体からの線維芽細胞を使用した実験を、対照群
（Ｃ）およびADに冒された個体からの線維芽細胞を提供
してくれたJesse Sisken博士（ユニバーシティ・オブ・
ケンタッキー・メディカル・スクール）と協同して行っ
た。１５％FBS(Sigma)を添加したDMEM(Gibco)中で試料
を保存した。細胞を、１７％FBS(Gibco)を添加したDMEM
(Gibco)中、コーニングの１００−mm培養プレートに置
いた。１〜１２日後に、培養はほぼ全面生長に達したと
思われたので収穫した。滅菌したゴム製ポリスマンで表
面から細胞をそっとこすりとった。細胞を遠心管に移し
て遠心分離し、細胞ペレットをFBSを含む培地に再懸濁
し、低温バイアルに移し、再び遠心して凍結した。ある
いは、０.０５％トリプシン−EDTAを加えて細胞を収穫
し、FBS添加培地で中和した。個々のアイソフォームの
免疫分析は表１の説明に記載した方法で行った。結果を
図６（パネルＡおよびＢ）に示す。
【００６８】結果 Jesse Sisken博士（ユニバーシティ・オブ・ケンタッキ
ー・メディカル・スクール）と協同で、アルツハイマー
病が初期に発現し、染色体２１に遺伝子欠損がある（し
かしAPP部位にはない）ことが判明している大家族アル
ツハイマー病団体（Neeら、Arch.Neurol．40:203-208(1
984)；Tanziら、Science 235:880-884(1987)；Tanzi
ら、Nature 329:156-157(1987)；Tanziら、Nature 331:
528-530(1988)）からの個体からの培養線維芽細胞で、
カルパイン系の研究を開始した。７人の対照群および表
現型が冒された６人の個体についてのこれまでの研究
（２つの実験を図６に示す）により、ＡＤケースに於い
て、潜在性（84kDa）μカルパインアイソフォームに対
する活性化μカルパインアイソフォーム（76kDa）の異
常に高い割合が確認された（p<0.02、ペアードt検
定）。死後のヒト脳に見られる同じタイプの線維芽細胞
に於けるμカルパイン異常がみられることは、この異常
は、ADに於いて広く認められ、終末期の細胞の死の現象
だけに限られるものではないという考えを裏付けてい
る。この様に、線維芽細胞は、キナーゼに対するダウン
ストリーム効果、APP代謝および他のAD−関連プロセス
との関係でカルパイン系の活性を研究するためのモデル
として有用である。
ー・メディカル・スクール）と協同で、アルツハイマー
病が初期に発現し、染色体２１に遺伝子欠損がある（し
かしAPP部位にはない）ことが判明している大家族アル
ツハイマー病団体（Neeら、Arch.Neurol．40:203-208(1
984)；Tanziら、Science 235:880-884(1987)；Tanzi
ら、Nature 329:156-157(1987)；Tanziら、Nature 331:
528-530(1988)）からの個体からの培養線維芽細胞で、
カルパイン系の研究を開始した。７人の対照群および表
現型が冒された６人の個体についてのこれまでの研究
（２つの実験を図６に示す）により、ＡＤケースに於い
て、潜在性（84kDa）μカルパインアイソフォームに対
する活性化μカルパインアイソフォーム（76kDa）の異
常に高い割合が確認された（p<0.02、ペアードt検
定）。死後のヒト脳に見られる同じタイプの線維芽細胞
に於けるμカルパイン異常がみられることは、この異常
は、ADに於いて広く認められ、終末期の細胞の死の現象
だけに限られるものではないという考えを裏付けてい
る。この様に、線維芽細胞は、キナーゼに対するダウン
ストリーム効果、APP代謝および他のAD−関連プロセス
との関係でカルパイン系の活性を研究するためのモデル
として有用である。
【００６９】本発明について充分に説明したので、本発
明は条件、体系などのパラメーターの広い均等の範囲内
で本発明の適用範囲、またはその実施態様に影響するこ
となく実施できることは、当該技術分野の当業者に理解
されるであろう。本願に引用した特許と刊行物はすべて
本願に採用するものとする。
明は条件、体系などのパラメーターの広い均等の範囲内
で本発明の適用範囲、またはその実施態様に影響するこ
となく実施できることは、当該技術分野の当業者に理解
されるであろう。本願に引用した特許と刊行物はすべて
本願に採用するものとする。
【図１】 （Ａ）は２つの対照（CONT）と２つのアルツ
ハイマー病（AD）の患者由来の前前頭皮質のμCANPの免
疫ブロット分析の結果を示す模式図であり、（Ｂ）はヒ
ト赤血球由来のμCANPのin vitroでの自己消化を示すゲ
ル電気泳動図を示す。
ハイマー病（AD）の患者由来の前前頭皮質のμCANPの免
疫ブロット分析の結果を示す模式図であり、（Ｂ）はヒ
ト赤血球由来のμCANPのin vitroでの自己消化を示すゲ
ル電気泳動図を示す。
【図２】 酵素活性とμCANP含量の関係を示すグラフで
ある。
ある。
【図３】 ヒト脳のスライス（前頭葉皮質）のμCANP自
己消化の免疫ブロット分析の結果を示す模式図である。
己消化の免疫ブロット分析の結果を示す模式図である。
【図４】 対照の個体（○）およびAD患者（●）由来の
前頭葉皮質中のμCANPの76kDa/80kDaのアイソフォーム
の比率を死後の時間経過（PMI）に対してプロットして
示すグラフである。
前頭葉皮質中のμCANPの76kDa/80kDaのアイソフォーム
の比率を死後の時間経過（PMI）に対してプロットして
示すグラフである。
【図５】 （Ａ）は対照、アルツハイマー病（AD）およ
びハンチントン病（HD）の脳の前頭葉皮質におけるμCA
NPアイソフォーム比（76kDa/80kDa）を示す棒グラフで
あり、（Ｂ）は対照、ADおよびHDの脳の被殻におけるμ
CANPアイソフォーム比（76kDa/80kDa）を示す棒グラフ
であり、（Ｃ）は対照、ADおよびHDの脳の小脳における
μCANPアイソフォーム比（76kDa/80kDa）を示す棒グラ
フである。
びハンチントン病（HD）の脳の前頭葉皮質におけるμCA
NPアイソフォーム比（76kDa/80kDa）を示す棒グラフで
あり、（Ｂ）は対照、ADおよびHDの脳の被殻におけるμ
CANPアイソフォーム比（76kDa/80kDa）を示す棒グラフ
であり、（Ｃ）は対照、ADおよびHDの脳の小脳における
μCANPアイソフォーム比（76kDa/80kDa）を示す棒グラ
フである。
【図６】 カナダFAD団体から病気に冒された個体群お
よび対照群から得た線維芽細胞のイムノブロット検定を
示している。潜在的アイソフォーム（84kDa）に対する
活性化されたカルパインアイソフォーム（76kDa）の比
は、FAD団体の表現型が冒されている個体の線維芽細胞
に於いて上昇していることを示している（Ｃ＝対照
群）。
よび対照群から得た線維芽細胞のイムノブロット検定を
示している。潜在的アイソフォーム（84kDa）に対する
活性化されたカルパインアイソフォーム（76kDa）の比
は、FAD団体の表現型が冒されている個体の線維芽細胞
に於いて上昇していることを示している（Ｃ＝対照
群）。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】 カナダの家族性アルツハイマー病に冒されて
いる家系および対照群から得た線維芽細胞のイムノブロ
ット検定を示している。潜在的アイソフォーム（84kD
a）に対する活性化されたカルパインアイソフォーム（7
6kDa）の比は、家族性アルツハイマー病患者群の線維芽
細胞に於いて上昇していることを示している（Ｃ＝対照
群）。
いる家系および対照群から得た線維芽細胞のイムノブロ
ット検定を示している。潜在的アイソフォーム（84kD
a）に対する活性化されたカルパインアイソフォーム（7
6kDa）の比は、家族性アルツハイマー病患者群の線維芽
細胞に於いて上昇していることを示している（Ｃ＝対照
群）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 斎藤 健一 神奈川県横浜市緑区桜台３ 三菱化成アパ ートＡ−404
Claims (22)
- 【請求項１】 （ａ）アルツハイマー病の疑いがある個
体から組織の試料を入手し； （ｂ）前記試料の、μCANPの76kDaアイソフォーム／80k
Daアイソフォームの相対比率を測定し；76kDa／80kDaの
比率がアルツハイマー病でない個体の対照群に比べて増
加している場合は、アルツハイマー病の疑いがある個体
はアルツハイマー病であると確認する；ことからなる、
個体のアルツハイマー病の診断方法。 - 【請求項２】 前記組織の試料が前記個体の脳、前頭葉
皮質または繊維芽細胞から得られる請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 ステップ（ｂ）において、前記組織試料
が最初に緩衝液中でホモジナイズされ、次に遠心分離さ
れて上澄み液を得て、次いでその上澄み液の、μCANPの
76kDaアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率
を測定する請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 μCANPの76kDaアイソフォーム／80kDaア
イソフォームの相対比率が、 （ｃ）μCANPをゲル電気泳動で分離し； （ｄ）分離された、μCANPの76kDaアイソフォームとμC
ANPの80kDaアイソフォームを、これらと免疫反応性のあ
る少なくとも１つの検出可能な抗体と反応させ； （ｅ）μCANPの76kDaアイソフォームと80kDaアイソフォ
ームに結合した検出可能な抗体の量を測定してそれぞれ
の相対値を求め；次いで （ｆ）76kDaアイソフォームに対する相対値を、80kDaア
イソフォームに対する相対値で割算して前記比率を得
る；ことによって測定される請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 前記の検出可能な抗体に検出可能なよう
に標識が付けられ、および検出可能なように標識を付け
た抗体の量がその標識を定量することによって測定され
る請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 前記の検出可能な抗体が、その検出可能
な抗体と免疫反応性であり検出可能なように標識を付け
た二次抗体と反応させることによって測定される請求項
４記載の方法。 - 【請求項７】 （ａ）アルツハイマー病の疑いがある個
体から組織の試料を入手し；次いで （ｂ）μCANPの76kDaのアイソフォーム／76kDa、78kDa
および80kDaアイソフォームの合計量の相対比率を測定
し；76kDa／76kDa＋78kDa＋80kDaの比率がアルツハイマ
ー病でない個体の対照群に比べて増大している場合は、
アルツハイマー病の疑いがある個体がアルツハイマー病
であると確認する；ことからなる、個体のアルツハイマ
ー病の診断方法。 - 【請求項８】 ステップ（ｂ）において、前記の組織試
料が最初に緩衝液中でホモジナイズされ、次に遠心分離
されて上澄み液を得て、次いで前記上澄み液の、μCANP
の76kDaアイソフォーム／76kDa、78kDaおよび80kDaアイ
ソフォームの相対比率を測定する請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 μCANPの76kDaアイソフォーム／76kDa、
78kDaおよび80kDaアイソフォームの相対比率が、 （ｃ）前記上澄み液を、第一と第二の検出可能な抗体と
反応させ（但し第一の検出可能な抗体はμCANPの80kDa
アイソフォームとだけ免疫反応性があり、第二の検出可
能な抗体はμCANPの76kDa、78kDaおよび80kDaアイソフ
ォームと免疫反応性がある）； （ｄ）μCANPのそれぞれのアイソフォームに結合した検
出可能な第一と第二の抗体の量を測定してそれぞれの相
対値を得て；次いで （ｅ）76kDa、78kDaおよび80kDaアイソフォームに対す
る相対値を、80kDaアイソフォームに対する相対値で割
算して前記比率を得る；ことによって測定される請求項
８記載の方法。 - 【請求項１０】 前記第一と第二の検出可能な抗体に検
出可能なように標識が付けられ、次いで検出可能なよう
に標識を付けた抗体の量がそれぞれの標識を定量するこ
とによって測定される請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 前記第一と第二の検出可能な抗体が、
その第一と第二の検出可能な抗体と免疫反応性であり少
なくとも１つの検出可能な標識付き抗体と反応させて、
次いでその標識を定量することによって測定される請求
項９記載の方法。 - 【請求項１２】 １つ以上の容器が密封状態で入ってい
る搬器からなり、前記容器に、μCANPの76kDaアイソフ
ォームおよびμCANPの80kDaアイソフォームと免疫反応
性のある検出可能な抗体が入っている、アルツハイマー
病の疑いがある個体のアルツハイマー病を診断するのに
有用なキット。 - 【請求項１３】 前記の検出可能な抗体に検出可能なよ
うに標識が付けられている請求項１２記載のキット。 - 【請求項１４】 さらに、μCANPの76kDaアイソフォー
ムおよびμCANPの80kDaアイソフォームと免疫反応性の
ある前記検出可能な抗体と免疫反応性のある検出可能な
ように標識が付けられた抗体が入った第二の容器を有す
る請求項１２記載のキット。 - 【請求項１５】 さらに、μCANPの76kDaアイソフォー
ムとμCANPの80kDaアイソフォームを分離する物質が入
っている第三の容器を有する請求項１２記載のキット。 - 【請求項１６】 ２つ以上の容器が密封状態で入ってい
る搬器を有し、第一の容器にはμCANPの80kDaアイソフ
ォームと免疫反応性はあるがμCANPの76kDaおよび78kDa
のアイソフォームと免疫反応性のない第一の検出可能な
抗体が入っており、かつ第二容器にはμCANPの76kDa、7
8kDaおよび80kDaのアイソフォームと免疫反応性のある
第二の検出可能な抗体が入っている、アルツハイマー病
の疑いがある個体のアルツハイマー病を診断するのに有
用なキット。 - 【請求項１７】 前記の第一と第二の検出可能な抗体
に、異なる検出方法で識別できる異なる標識で検出可能
なように標識が付けられている請求項１６記載のキッ
ト。 - 【請求項１８】 μCANPの80kDaアイソフォームにのみ
特異的な第一の検出可能な抗体およびμCANPの76kDaア
イソフォームにのみ特異的な第二の検出可能な抗体が入
っている容器を密封状態で区分して入れてある搬器から
なる、アルツハイマー病の疑いのある個体のアルツハイ
マー病を診断するのに有用なキット。 - 【請求項１９】 第一と第二の検出可能な抗体が、異な
る検出方法で識別できる異なる標識で検出可能なように
標識が付けられている請求項１８記載のキット。 - 【請求項２０】 さらに、μCANPの76kDaと80kDaアイソ
フォームの標準系列希釈溶液が入っている容器を有する
請求項１８記載のキット。 - 【請求項２１】 （ａ）第一の動物の脳または繊維芽細
胞の試料を入手し; （ｂ）第一の動物の脳または繊維芽細胞の試料の、μCA
NPの76kDaアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対
比率を測定し； （ｃ）第二の動物の脳または繊維芽細胞の試料を、Ca++
の水溶液およびアルツハイマー病を治療もしくは予防す
るのに有効であると推量される薬剤とともにインキュベ
ートし； （ｄ）ステップ（ｃ）で得た組織試料の、μCANPの76kD
aアイソフォーム／80kDaアイソフォームの相対比率を測
定し；ステップ（ｄ）で測定した、前記薬剤とインキュ
ベートさせた動物の脳の試料の76kDa／80kDaの比率が、
ステップ（ｂ）で得た76kDa／80kDaの比率に比較して減
少している場合は、その薬剤がアルツハイマー病を治療
もしくは予防するのに有効であると確認する；ことから
なる、アルツハイマー病の治療もしくは予防薬をスクリ
ーニングする方法。 - 【請求項２２】 前記第一と第二の脳の試料が、動物の
脳またはアルツハイマー病の個体から死後直ちに得た脳
皮質のスライスである請求項２１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US92559492A | 1992-07-22 | 1992-07-22 | |
| US925594 | 1992-07-22 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07225231A true JPH07225231A (ja) | 1995-08-22 |
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ID=25451973
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5181273A Pending JPH07225231A (ja) | 1992-07-22 | 1993-07-22 | アルツハイマー病の診断方法 |
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|---|---|
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| JP (1) | JPH07225231A (ja) |
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| CA (1) | CA2101117A1 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004510957A (ja) * | 2000-05-23 | 2004-04-08 | ザ ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア | アルツハイマー病ｌｄｌレセプタータンパク質１の診断 |
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|---|---|---|---|---|
| US5804560A (en) * | 1995-01-06 | 1998-09-08 | Sibia Neurosciences, Inc. | Peptide and peptide analog protease inhibitors |
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|---|---|---|---|---|
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-
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- 1993-07-22 DE DE69321893T patent/DE69321893T2/de not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004510957A (ja) * | 2000-05-23 | 2004-04-08 | ザ ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア | アルツハイマー病ｌｄｌレセプタータンパク質１の診断 |
| JP4851676B2 (ja) * | 2000-05-23 | 2012-01-11 | ザ ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア | アルツハイマー病におけるｌｄｌレセプタータンパク質１（ｌｒｐ−１）の役割 |
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| DE69321893T2 (de) | 1999-05-12 |
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