JPH07231793A

JPH07231793A - ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法

Info

Publication number: JPH07231793A
Application number: JP31599694A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Yamada; 秀明山田; Yasuhisa Asano; 泰久浅野; Yasuhiro Mihara; 康博三原; Takashi Udagawa; 隆宇多川
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1993-12-27
Filing date: 1994-11-28
Publication date: 1995-09-05
Anticipated expiration: 2020-05-25
Also published as: JP3651036B2

Abstract

(57)【要約】【目的】微生物を用いて、異性体の副生を伴うことな
く、安定かつ効率的に、ヌクレオシド−５’−燐酸エス
テルを製造する方法を提供する。【構成】エンテロバクタ−属、エシェリヒア属、モル
ガネラ属、クレブシエラ属、セラチア属、クロモバクテ
リウム属またはセデシア属に属し、ヌクレオシドならび
にポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミ
ル燐酸（塩）からなる群から選択される燐酸供与体から
ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有
する微生物を、ｐＨ４．０〜６．５でヌクレオシドなら
びにびポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカル
バミル燐酸（塩）からなる群から選択される燐酸供与体
に作用せしめ、生成するヌクレオシド−５’−燐酸エス
テルを採取する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明はヌクレオシド−５’−
燐酸エステルの製造法に関する。ヌクレオシド−５’−
燐酸エステルは、調味料、医薬ならびにそれらの原料と
して有用である。

【０００２】

【従来の技術】ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生
化学的な製造法としては、燐酸供与体としてパラニトロ
フェニル燐酸を用い、ヌクレオシドを燐酸化する方法
（特公昭３９−２９８５８号）、無機燐酸を用いる方法
（特公昭４２−１１８６号）、アセチル燐酸を用いる方
法（特開昭５６−８２０９８号）、アデノシン三燐酸
（ＡＴＰ）を使用する方法（特開昭６３−２３００９４
号）が知られている。また、本発明者らは、ポリ燐酸を
用いる方法を開発している（特開昭５３−５６３９０
号）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法にあっては使用する基質が高価であったり、不安
定であったりして、安定したヌクレオシド−５’−燐酸
エステルの生産を行うためには、不利であった。ま
た、本発明者らが開発してきたポリ燐酸を用いる方法
も、その後の詳細な検討の結果、生成物としてヌクレオ
シド−５’−燐酸エステルのみならず、２’−、３’−
ヌクレオチド異性体を副生することが判明し、実用に供
するには困難であることが明らかになった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、安定
したヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産を行うた
めに種々の検討を加えた結果、ヌクレオシドならびにポ
リ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐
酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体に、弱酸
性条件下（ｐＨ４．０〜６．５）にて特定の微生物を作
用させることにより、２’−、３’−ヌクレオチドの副
生を伴うことなく、効率的にヌクレオシド−５’−燐酸
エステルを生産可能なることを発見し、本発明を完成す
るに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、エンテロバクター
属、エシェリヒア属、モルガネラ属、クレブシエラ属、
セラチア属、クロモバクテリウム属又はセデシア属に属
し、ヌクレオシドならびにポリ燐酸（塩）、フェニル燐
酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選
択された燐酸供与体よりヌクレオシド−５’−燐酸エス
テルを生成する能力を有する微生物を、ｐＨ４．０〜
６．５の条件下でヌクレオシドならびにポリ燐酸
（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐酸
（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体に作用させ
て、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめ、
これを採取することを特徴とするヌクレオシド−５’−
燐酸エステルの製造法を提供するものである。

【０００６】

【作用】本発明において使用される微生物は、エンテロ
バクター属、エシェリヒア属、モルガネラ属、クレブシ
エラ属、セラチア属、クロモバクテリウム属またはセデ
シア属に属し、ヌクレオシドならびにポリ燐酸（塩）、
フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりな
る群より選択された燐酸供与体からヌクレオシド−５’
−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物であり、
例えば、次のような微生物が使用される。

【０００７】 Escherichia blattae JCM 1650 Serratia ficaria ATCC 33105 Klebsiella planticola IFO 14939 (ATCC 33531) Klebsiella pneumoniae IFO 3318 (ATCC 8724) Klebsiella terrigena IFO 14941 (ATCC 33257) Morganella morganii IFO 3168 Enterobacter aerogenes IFO 12010 Enterobacter aerogenes IFO 13534 (ATCC 13048) Chromobacterium fluviatile IAM 13652 Chromobacterium violaceum IFO 12614 Cedecea lapagei JCM 1684 Cedecea davisiae JCM 1685 Cedecea neteri JCM 5909

【０００８】上記の微生物は、炭素源、窒素源、無機イ
オン等を含む通常の栄養培地中に培養される。炭素源と
しては、グルコース、フラクトース、シュクロース、マ
ルトースなどの糖類の他、クエン酸、フマール酸、グル
コン酸などの有機酸、エタノール、グリセリンなどのア
ルコール類が使用される。窒素源としては、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのア
ンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガスが好適で
ある。無機イオンとしては、例えば第一鉄イオン、マグ
ネシウムイオン、マンガンイオン、燐酸イオン、カリウ
ムイオンが、必要に応じて、添加される。さらに、必要
に応じ、アミノ酸、ビタミン等またはこれらを含有する
酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリ
カー、大豆蛋白加水分解物等の有機栄養源が添加され
る。

【０００９】上記の微生物の培養は、常法によって行わ
れる。例えば、培地のｐＨを５〜８とし、微生物を接種
後、２０〜４０℃にて５〜７２時間、好気的に培養すれ
ばよい。

【００１０】上記の微生物を、ヌクレオシドならびにポ
リ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐
酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体に作用せ
しめヌクレオシド−５’−燐酸エステルを得る方法とし
ては、かくして得られた培養液、培養液から分離した微
生物菌体、その乾燥菌体、菌体破砕物或いはその自己消
化物などの菌体処理物を、水性媒体中にて、ヌクレオシ
ドとポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およびカルバ
ミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体と
を接触させればよい。この際、反応のｐＨを４．０〜
６．５の範囲の弱酸性に調整することが必要である。

【００１１】燐酸供与体として用いられるポリ燐酸
（塩）としては、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐
酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ燐酸、又はそれらの混
合物もしくはそれらのナトリウム塩、カリウム塩、ある
いはそれらの塩混合物などが、フェニル燐酸（塩）とし
ては、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリ
ウム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル燐酸無水物、又はそれらの混
合物などが、カルバミル燐酸（塩）としては、カルバミ
ル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カル
バミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウ
ム、又はそれらの混合物などが使用可能である。燐酸供
与体の使用濃度は、燐酸受容体であるヌクレオシドの濃
度によって決定される。通常、ヌクレオシドの１〜５倍
量の添加が望ましい。

【００１２】使用するヌクレオシドとしては、プリンヌ
クレオシド類として、プリンリボシド、イノシン、グア
ノシン、アデノシン、キサントシン等、ピリミジンヌク
レオシド類として、ウリジン、シトシン等が挙げられ
る。使用するヌクレオシドに対応して、５’−プリンリ
ボチド、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−
アデニル酸、５’−キサンチル酸、５’−ウリジル酸、
５’−シチジル酸などが生成する。

【００１３】反応液に添加するヌクレオシドの濃度とし
ては、０．１〜１０ｇ／ｄＬが望ましいが、水に難溶性
のヌクレオシドを使用する場合には、硼酸あるいはジメ
チルスルフォオキシドなどの溶解助剤を添加するとよ
い。

【００１４】反応は、通常、温度２０〜６０℃、望まし
くは３０〜４０℃で、ｐＨ４．０〜６．５、望ましくは
ｐＨ４．５〜６．０の弱酸性側が好結果を与える。この
適当なｐＨ範囲は、従来、報告されているヌクレオシド
−５’−燐酸エステルの生産方法におけるｐＨとは異な
る範囲であって、この点にも本発明の特徴がある。

【００１５】反応には、靜置あるいは攪拌の何れの方法
をも採用し得る。反応時間は、使用する微生物の活性、
基質の濃度などの条件によって異なるが、１〜１００時
間が望ましい。

【００１６】反応液中に生成したヌクレオシド−５’−
燐酸エステルの分離は、通常のイオン交換樹脂を用いる
方法や、その他の通常に行われる分離方法が用いられ
る。

【００１７】

【実施例】以下、本発明の実施例を詳細に説明する。な
お、本実施例において、原料のヌクレオシドおよび生成
したヌクレオシド−５’−燐酸エステルは、高速液体カ
ラムクロマトグラフ法（ＨＰＬＣ、High Performance L
iquid Chromatography) により、下記の機器および条件
下に分析した。カラム：コスモジル５Ｃ₁₈−ＡＲ(4.6×150mm)［ナカラ
イテスク社製品］移動層：5 mM Potassium phosphate (pH 2.8): Methano
l = 95:5 流速：1.0 mL／分温度：室温検出：ＵＶ 245nm

【００１８】（実施例１）ペプトン１ｇ／ｄＬ、酵母エ
キス０．５ｇ／ｄＬ、食塩１ｇ／ｄＬを含有する栄養
培地（ｐＨ７．０）を５００ｍＬ容坂口フラスコに５０
ｍＬ入れ、１２０℃にて２０分加熱殺菌した。これに、
斜面培養した表１に示す微生物を接種し、３０℃にて１
６時間培養した。かくして得られた培養液より遠心分離
によって菌体を回収し、菌体を酢酸バッファー液（ｐＨ
５．０）に懸濁し、菌体懸濁液を調製した。

【００１９】イノシン２ｇ／ｄＬ、ピロ燐酸１０ｇ／ｄ
Ｌ、ＭｇＳＯ₄ ２ｍＭを、酢酸バッファー液に溶解し、
これに上記の菌体懸濁液を菌体湿重量で５ｇ／ｄＬとな
るように添加し、ｐＨを５．０に調整、維持しながら、
３０℃で５時間反応させた。生成した５’−イノシン酸
量を表１に示した。なお、何れの菌株についても、
２’−イノシン酸、３’−イノシン酸の副生は、ほとん
ど認められなかった。

【００２０】

【表１】

【００２１】（実施例２）実施例１で調製した菌株を用
い、反応液中のイノシンに代えて、グアノシンを使用し
て同様に反応を行った。生成した５’−グアニル酸量を
表２に示した。

【００２２】

【表２】

【００２３】（実施例３）実施例１で調製した菌株懸濁
液を用い、反応液中のピロ燐酸に代えて、トリポリ燐酸
（試薬）または「ポリゴンＰ」［商品名、ポリ燐酸、千
代田化学（株）製品］を用い、イノシンと反応させた。
生成した５’−イノシン酸量を表３に示した。

【００２４】

【表３】

【００２５】（実施例４）実施例１で調製した菌体懸濁
液を用い、ｐＨ３〜８のバッファー液中で、イノシン１
ｇ／ｄＬ、ピロ燐酸ナトリウム５ｇ／ｄＬ、硫酸マグネ
シウム２ｍＭを含む反応液を調製し、この反応液中、３
０℃で１時間反応した。図１に示す如く、反応に使用し
たEscherichia blattae JCM 1650、Serratia ficaria A
TCC 33105、Klebsiella pneumoniae IFO 3318、Morganel
la morganii IFO 3168、Enterobacter aerogenes IFO 1
2010、Chromobacterium fluviatile IAM 13652、Cedece
a lapagei JCM 1684の各菌株の何れもが、ｐＨ５．０〜
５．５の範囲において、最も効率的に５’−イノシン酸
を生成した。

【００２６】（実施例５）実施例１にて調製した菌体懸
濁液を用い、ｐＨ５．０の酢酸バッファー液中でイノシ
ン１ｇ／ｄＬ、ピロ燐酸ナトリウム５ｇ／ｄＬ、硫酸マ
グネシウム２ｍＭを含む反応液を調製し、この反応液
中、１５〜６０℃において反応を行った。図２に示す如
く、反応に使用したEscherichia blattae JCM 1650、Kl
ebsiella pneumoniae IFO 3318、Morganella morganii
IFO 3168、 Enterobacter aerogenesIFO 12010 、Chrom
obacterium fluviatile IAM 13652、 Cedecea lapagei J
CM 1684の各菌株の何れもが３０〜４０℃の範囲で、Ser
ratia ficaria ATCC 33105 はは５５℃付近において、
最も効率的に５' −イノシン酸を生成した。

【００２７】（実施例６）実施例１で調製した菌株を用
い、反応液中のイノシンに代えて、ウリジンまたはシチ
ジンを、燐酸供与体としてフェニル燐酸ジナトリウムを
使用して同様に反応を行った。生成した５’−ウリジル
酸量または５’−シチジル酸量を表４に示した。

【００２８】

【表４】

【００２９】（実施例７）実施例１で調製した菌株を用
い、反応液中のイノシンに代えて、ウリジンまたはシチ
ジンを、燐酸供与体としてカルバミル燐酸ジナトリウム
を使用して同様に反応を行った。生成した５’−ウリジ
ル酸量または５’−シチジル酸量を表５に示した。

【００３０】

【表５】

【００３１】

【発明の効果】ヌクレオシドならびにポリ燐酸（塩）、
フェニル燐酸（塩）およびカルバミル燐酸（塩）よりな
る群より選択された燐酸供与体に、ヌクレオシド−５’
−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物を作用せ
しめ、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを取得する本
発明の方法は、異性体の副生を伴うことなく、安定、か
つ、効率よくヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成
し、採取し得るという効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】反応ｐＨと５’−イノシン酸の生成量との関係
を示す線図である。

【図２】反応温度と５’−イノシン酸の生成量との関係
を示す線図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 19/32 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｐ 19/32 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エンテロバクター属、エシェリヒア属、
モルガネラ属、クレブシエラ属、セラチア属、クロモバ
クテリウム属又はセデシア属に属し、ヌクレオシドなら
びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミ
ル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体より
ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有
する微生物を、ｐＨ４．０〜６．５の条件下でヌクレオ
シドならびにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）およ
びカルバミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸
供与体に作用させてヌクレオシド−５’−燐酸エステル
を生成せしめ、これを採取することを特徴とするヌクレ
オシド−５’−燐酸エステルの製造法。