JPS6317439B2 - - Google Patents

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JPS6317439B2
JPS6317439B2 JP14526878A JP14526878A JPS6317439B2 JP S6317439 B2 JPS6317439 B2 JP S6317439B2 JP 14526878 A JP14526878 A JP 14526878A JP 14526878 A JP14526878 A JP 14526878A JP S6317439 B2 JPS6317439 B2 JP S6317439B2
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reaction solution
reaction
atp
ifo
μmoles
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JP14526878A
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Tatsurokuro Tochikura
Setsu Kadowaki
Toshihiro Yano
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素反応により、アデノシン三リン
酸を製造する方法に関する。
生理活性を有するアデノシン三リン酸(以下
ATPとする)は、生化学、臨床試験における反
応基質として、また食品の栄養、風味の強化剤と
して、さらには医薬品として極めて重要な物質で
ある。従来、このATPは発酵法によつて一部生
産されているが、従来の製造方法では、原料面ま
たは発酵工程面で生産コストが高くつくために、
新しい安価な工業的製造法の開発が強く期待され
ている。
本発明者らは、種々の発酵生産方式について研
究した結果、ATPの安価な工業的製造法を見出
し、本発明を完成するに至つた。
本発明は、アデニンにウリジン、シチジン、イ
ノシンまたはグアノシンと無機リン酸とを反応さ
せてATPを製造するに際し、ヌクレオシドリボ
シル基転移酵素活性を有するエルウイニア
(Erwinia)属、エシエリチア(Escherichia)
属、バチルス(Bacillus)属あるいはコリネバク
テリウム(Corynebacterium)属に属する微生物
菌体処理物と、リン酸転移酵素活性を有するサツ
カロミセス(Saccharomyces)属に属する微生
物またはその菌体処理物とを、前者の1量(蛋白
量として)に対して後者を1〜4倍量(乾燥菌体
重量として)の割合で存在させ、さらに発酵性糖
類を存在させて、反応液を微アルカリ性に保つこ
とを特徴とするATPの製造法である。
ウリジン、シチジン、イノシンまたはグアノシ
ンは調味料工業で大量に副生される。
無機リン酸としては、たとえばリン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウムなど
のリン酸塩またはリン酸やポリリン酸が使用され
る。
本発明においては、ヌクレオシドリボシル基転
移酵素活性を有する微生物菌体処理物とリン酸転
移酵素活性を有する微生物またはその菌体処理物
を使用するのであるが、ヌクレオシドリボシル基
転移酵素活性を有する微生物菌体処理物として
は、Escherichiacoli IFO 3806、Erwinia
carotovora IFO 3057、Erwinia aroideae IFO
3830、Bacillus sphericus IFO 3525、
Corynebacterium spedonicum IFO 12188など
の菌体磨砕物、乾燥菌体、超音波処理菌体、溶剤
処理菌体、無細胞抽出液、部分精製酵素標品、固
定化酵素標品が用いられ、菌株は本酵素活性を有
する菌であればいずれの菌でもよい。
リン酸転移酵素活性を有する微生物またはその
菌体処理物としては、Saccharomyces
cerevisiae IFO 635、Saccharomyces
carlsbergensis IFO 641、Saccharomyces sake
kyokaiNo.7、Saccharomyces sake kyokaiNo.8
などの乾燥菌体、菌体磨砕物、超音波処理菌体、
溶剤処理菌体が用いられ、本酵素活性を有する菌
株であればいずれの菌でも使用できる。
発酵性糖類としては、たとえばグルコース、ガ
ラクトース、フルクトース、乳糖、マンノース、
リボースおよびこれらのリン酸エステル化合物
(たとえば果糖二リン酸)が使用される。
前記ヌクレオシドリボシル基転移酵素活性を有
する微生物菌体処理物と、リン酸転移酵素活性を
有する微生物またはその菌体処理物との割合は、
前者の1量(酵素蛋白量として)に対して後者を
1〜4倍量(乾燥菌体重量として)にすることが
必要である。これ以外の割合では反応が進まない
か、あるいは反応が進行しても収率が非常に悪
い。
反応液は微アルカリ性に保つことが必要であ
り、PH7.2〜8.5が好ましい。ヌクレオシドリボシ
ル基転移酵素(ヌクレオシドホスホリラーゼ)
は、中性から微アルカリ性で強く作用するが、酸
性側では作用せず、一方、リン酸転移酵素は酸性
側で強く作用するが、中性から微アルカリ性では
その作用はゆるやかである。したがつて、反応液
を微アルカリ性にすることにより、ヌクレオシド
ホスホリラーゼを強く作用させつつ、リン酸転移
酵素をゆるやかに作用させることができ、これに
よつてATPの収率を高めることができる。
反応温度は10〜45℃、反応時間は5〜40時間が
好ましく、反応は振盪もしくは静置条件下で行な
う。
反応に必要な各成分は、すべて最初から添加混
合して反応させることができるが、好ましい実施
条件としては、ヌクレオシドホスホリラーゼ反応
(リボシル基転移反応)の進行途中において、発
酵性糖類とリン酸転移酵素活性を有する微生物あ
るいはその菌体処理物を添加するのがよく、この
ようにすることにより、ATPの収率を高めるこ
とができる。
生産されたATPの分離、精製は、一般に知ら
れている分離方法、たとえばイオン交換樹脂法、
活性炭吸着法、溶剤抽出沈澱法などの諸方法を併
用して分離、精製することができる。
本発明によれば、調味料工業で大量に副生する
ウリジン、シチジン、イノシンまたはグアノシン
をリボース源とし、他方、工業上安価に供給され
る無機リン酸および発酵性糖類をそれぞれリン酸
源およびエネルギー源として、アデニンから
ATPを効率よく製造することができる。
次に実施例を示す。
実施例 1 反応液1ml当り、グルコース600μmoles、リン
酸カリウム(PH7.4)600μmoles、ウリジン
100μmoles、アデニン50μmoles、
MgSO410μmoles、Erwinia cartovora IFO
3057の無細胞標品7mg(蛋白質量として)および
Saccharomyces cerevisiae IFO 635の乾燥菌体
25mgを含むように調製した。この反応液2mlを28
℃、24時間振盪させ反応を行なつたところ、反応
液1ml当りATP28μmolesを得た。
以上の組成で反応液1000ml中にグルコース108
g、リン酸カリウム95g、ウリジン24.4g、アデ
ニン6.8g、MgSO41.2gをそれぞれ溶かし、
Erwinia cartovora IFO 3057微工研菌寄第9525
号の無細胞標品7g(蛋白質量として)および
Saccharomyces cerevisiae IFO 635微工研菌寄
第9522号の乾燥菌体25gを懸濁させ、28℃、24時
間反応させたところ、ATPが14g生成された。
反応終了後、反応液を短時間加熱処理して固形
分を除去する。上澄液をPH3.5とし、活性炭カラ
ムを通過させ生成ATPを吸着させる。水洗後、
アンモニヤ性50%エタノール溶液で溶出し、
ATP含有区分を分取し、濃縮してPH8に調整し
た。
次に、あらかじめCl型に調整したダウエツクス
1×2樹脂に濃縮液を吸着せしめ、水洗したあと
HCl−NaClの溶媒系で溶出を行ない、ATPの区
分を採取し、活性炭処理で脱塩し、溶液に塩化バ
リウムを加えてバリウム塩として沈澱させ分離し
た。バリウム塩は硫酸ソーダ溶液に溶かしこみ、
バリウムを硫酸バリウムとして除去し、ATPを
ソーダ塩として単離した。収量は、ATP12.6g
(遊離として)であつた。
実施例 2 反応液1ml当り、Erwinia cartovoraの代りに
Escherichia coli IFO 3806の無細胞標品8mg
(蛋白質量として)を添加し、反応時間を22時間
とした以外は実施例1に準じた条件下で反応を行
なつた。その結果、反応液1ml当り
ATP10μmolesを得た。
実施例 3 反応液1ml当り、Erwinia cartovoraの代りに
Bacillus sphericus IFO 3525の無細胞標品を8
mg(蛋白質量として)添加した以外は実施例1に
準じた条件下で反応を行なつた。その結果、反応
液1ml当りATP20μmolesを得た。
実施例 4 反応液1ml当り、Erwinia cartovoraの代りに
Corynebacterium sepedonicum IFO 12188の微
工研菌寄第9524号の無細胞標品7mg(蛋白質量と
して)添加した以外は実施例1に準じた条件で反
応を行なつた。その結果、反応液1ml当り
ATP23μmolesを得た。
実施例 5 反応液1ml当り、Saccharomyces cerevisiae
の代りにSaccharomyces sake KyokaiNo.7の乾
燥菌体25mgを添加した以外は実施例1に準じた条
件下で反応を行なつた。その結果、反応液1ml当
りATP25μmolesを得た。
実施例 6 反応液1ml当り、グルコース600μmoles、リン
酸カリウム(PH7.8)400μmoles、シチジン
100μmoles、アデニン50μmoles、
MgSO410μmoles、Erwinia、carotovora IFO
3057の無細胞標品10mg(蛋白質量として)および
Saccharomyces cerevisiae IFO 635の乾燥菌体
25mgを含む反応液3mlを28℃、12時間振盪反応を
行なつた。その結果、反応液1ml当り
ATP25μmolesを得た。
実施例 7 リン酸カリウム(PH7.2)600μmoles、アデニ
ン75μmoles、ウリジン100μmoles、
MgSO410μmoles、Erwinia carotovora IFO
3057の無細胞標品10mg(蛋白質量として)を含む
反応液0.9mlを28℃、4時間反応させた後、果糖
二リン酸(FDP)100μmolesを添加して1mlとな
し、さらにSaccharomyces carlsbergensis IFO
641微工研菌寄第9523号の乾燥菌体25mgを加えて、
16時間(総反応時間20時間)反応を行なつた。そ
の結果、反応液1ml当りATP32μmolesを得た。
実施例 8 反応液1ml当り、リン酸カリウム(PH7.4)
600μmoles、アデニン60μmoles、シチジン
100μmoles、MgSO410μmoles、Erwinia
aroideae IFO 3830の無細胞標品10mg(蛋白質量
として)を含む反応液0.9mlを28℃、8時間反応
させた後、果糖二リン酸100μmolesを添加して1
mlとし、さらにSaccharomyces cerevisiae
IFO635の乾燥菌体25mgを加えて16時間反応を行
なつた。その結果、反応液1ml当り
ATP20μmolesを得た。
実施例 9 リン酸二カリウム(PH7.6)400μmoles、アデ
ニン75μmoles、ウリジン100μmoles、
MgSO410μmoles、Erwinia carotovora IFO
3057の無細胞抽出物のポリアクリルアミドゲル固
定化標品10mg(蛋白質量として)を含む反応液
0.9mlを28℃、4時間反応を行させた後、果糖二
リン酸100μmoles添加して1mlとなし、さらに
Saccharomyces cerevisiae IFO 635の乾燥菌体
25mgを加えて16時間反応を行なつた。その結果、
反応液1ml当りATP15μmolesを得た。
実施例 10 リン酸カリウム(PH7.8)400μmoles、アデニ
ン30μmoles、ウリジン50μmoles、
MgSO410μmoles、Erwinia carotovora IFO
3057から部分精製したヌクレオシドホスホリラー
ゼのポリアクリルアマイドゲル固定化標品8mg
(蛋白質量として)を含む反応液0.9mlを28℃、4
時間反応させた後、果糖二リン酸100μmoles添加
して1mlとなし、さらにSaccharomyces
carlsbergensis IFO 641の乾燥菌体25mgを加えて
16時間反応を行なつた。その結果、反応液1ml当
りATP8μmolesを得た。
実施例 11 反応液1ml当り、リン酸カリウム(PH7.2)
600μmoles、アデニン60μmoles、イノシン
100μmoles、MgSO410μmoles、Erwinia
aroideae IFO 3830の無細胞標品10mg(蛋白質量
として)を含む反応液を28℃、8時間反応させた
後、グルコース100μmolesを添加して、さらに
Saccharomyces cerevisiae IFO 635の乾燥菌体
25mgを加えて15時間反応を行なつた。その結果、
反応液1ml当りATP18μmolesを得た。
実施例 12 反応液1ml当り、リン酸カリウム(PH7.5)
600μmoles、アデニン50μmoles、グアノシン
70μmoles、MgSO410μmoles、Erwinia
carotovora IFO 3057の無細胞標品7mg(蛋白質
量として)を含む反応液を28℃、8時間反応させ
た後、グルコース100μmolesを添加して、さらに
Saccharomyces cerevisiae IFO 635の乾燥菌体
30mgを加えて16時間反応を行なつた。その結果、
反応液11ml当りATP27μmolesを得た。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 アデニンにウリジン、シチジン、イノシンま
    たはグアノシンと無機リン酸とを反応させアデノ
    シン三リン酸を製造するに際し、ヌクレオシドリ
    ボシル基転移酵素活性を有するエルウイニア
    (Erwinia)属、エシエリチア(Escherichia)
    属、バチルス(Bacillus)属あるいはコリネバク
    テリウム(Corynebacterium)属に属する微生物
    菌体処理物と、リン酸転移酵素活性を有するサツ
    カロミセス(Saccharomyces)属に属する微生
    物またはその菌体処理物とを、前者の1量(蛋白
    量として)に対して後者を1〜4倍量(乾燥菌体
    重量として)の割合で存在させ、さらに発酵性糖
    類を存在させ、反応液を微アルカリ性に保つこと
    を特徴とするアデノシン三リン酸の製造法。
JP14526878A 1978-11-27 1978-11-27 Preparation of adenine nucleotide Granted JPS5571495A (en)

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JPS60210995A (ja) * 1984-04-04 1985-10-23 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd アデノシン−5′−三燐酸の製造法

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