JPH0723326B2 - 一価抗体フラグメントをテクネチウムで迅速に放射性標識する方法 - Google Patents
一価抗体フラグメントをテクネチウムで迅速に放射性標識する方法Info
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- JPH0723326B2 JPH0723326B2 JP2514034A JP51403490A JPH0723326B2 JP H0723326 B2 JPH0723326 B2 JP H0723326B2 JP 2514034 A JP2514034 A JP 2514034A JP 51403490 A JP51403490 A JP 51403490A JP H0723326 B2 JPH0723326 B2 JP H0723326B2
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、１種以上のペンダントスルフヒドリル基を内
在配位子として使用して、テクネチウム−99m（Tc−99
m）で、直接且つ迅速に一価抗体フラグメントを放射性
標識する方法及びそのキット、特に放射［標識］免疫検
出するために患者に注射するのにほぼ直接使用できる、
滅菌のTc−99m標識抗体フラグメント溶液を調製するた
めに、FabまたはFab′抗体フラグメントを放射性標識す
る方法及びキットに関する。
在配位子として使用して、テクネチウム−99m（Tc−99
m）で、直接且つ迅速に一価抗体フラグメントを放射性
標識する方法及びそのキット、特に放射［標識］免疫検
出するために患者に注射するのにほぼ直接使用できる、
滅菌のTc−99m標識抗体フラグメント溶液を調製するた
めに、FabまたはFab′抗体フラグメントを放射性標識す
る方法及びキットに関する。
Tc−99mイオンを直接抗体及び抗体フラグメントと結合
させる従来技術は、米国特許出願第07/176,421号、同第
07/364,373号及び同第07/392,280号に記載されている。
これらの出願では、抗体及び抗体フラグメントを、Tc−
99及びRe−186/188を含む種々の放射性同位体で直接放
射性標識する改良方法について開示且つ請求している。
させる従来技術は、米国特許出願第07/176,421号、同第
07/364,373号及び同第07/392,280号に記載されている。
これらの出願では、抗体及び抗体フラグメントを、Tc−
99及びRe−186/188を含む種々の放射性同位体で直接放
射性標識する改良方法について開示且つ請求している。
欧州特許出願第A2/0 237 150号（NeoRX Corp.）及びPCT
出願第WO 88/07382号（Centocor Cardiovascular Imagi
ng Partners,L.P.）は各々、抗体または抗体フラグメン
トをTc−99mで放射性標識する方法について開示してい
るが、FabまたはFab′フラグメントの標識については、
標識条件は最適化されておらず、開示された条件は不便
であり、定量的な標識はできなかった。
出願第WO 88/07382号（Centocor Cardiovascular Imagi
ng Partners,L.P.）は各々、抗体または抗体フラグメン
トをTc−99mで放射性標識する方法について開示してい
るが、FabまたはFab′フラグメントの標識については、
標識条件は最適化されておらず、開示された条件は不便
であり、定量的な標識はできなかった。
シンチグラフィー画像検出（imaging）をするために患
者に直接に注射するのにすぐに準備できる溶液を製造す
るために、数分間以内にFab及びFab′フラグメントを安
定に放射性標識する直接法に関する研究が依然として必
要であった。
者に直接に注射するのにすぐに準備できる溶液を製造す
るために、数分間以内にFab及びFab′フラグメントを安
定に放射性標識する直接法に関する研究が依然として必
要であった。
本発明の目的 従って、本発明の第一の目的は、迅速且つ便利で患者に
直接注射するためにすぐに準備できる標識フラグメント
をつくる、一価（例えば、FabまたはFab′など）抗体フ
ラグメントを直接放射性標識する方法を提供することで
ある。
直接注射するためにすぐに準備できる標識フラグメント
をつくる、一価（例えば、FabまたはFab′など）抗体フ
ラグメントを直接放射性標識する方法を提供することで
ある。
本発明のもう１つの目的は、長期間の貯蔵でも安定であ
るが、放射性抗体フラグメントの滅菌溶液を製造するた
めにTc−99mジェネレータから流出した滅菌生理食塩水
と直接混合し得る、FabまたはFab′抗体フラグメントを
標識するための『簡易（instant）』Tc−99m標識キット
を提供することである。
るが、放射性抗体フラグメントの滅菌溶液を製造するた
めにTc−99mジェネレータから流出した滅菌生理食塩水
と直接混合し得る、FabまたはFab′抗体フラグメントを
標識するための『簡易（instant）』Tc−99m標識キット
を提供することである。
以下の明細書及び付記請求項により、本発明の目的及び
長所が当業者に明らかになるであろう。
長所が当業者に明らかになるであろう。
発明の概要 前記目的は、 少なくとも１個の遊離スルフヒドリル基を有する一価抗
体フラグメントをシンチグラフィー画像検出するための
１単位投与量と、抗体フラグメント1mg当たり10〜150μ
ｇのSn量の塩化第一スズと、塩化第一スズの30〜40倍モ
ル過剰の酒石酸塩との、生理食塩水を含む0.04〜0.06M
酢酸塩緩衝液pH4.5〜5.0の第１の滅菌溶液であって、不
活性ガスでパージされている各試薬を用いて該溶液を調
製する； 第１の滅菌溶液を不活性ガス雰囲気下に保つか、又は第
１の滅菌溶液を0.08〜0.1Mの庶糖液とし次いで糖含有溶
液を凍結乾燥する； 第１の滅菌溶液又はその凍結乾燥物を、Tc−99mパーテ
クネテートのシンチグラフィー画像検出有効量を含む第
２の滅菌溶液と混合する工程からなり、周囲温度で５分
間以内にTc−99mで抗体フラグメントを実質的に定量的
に標識化する、Tc−99m標識一価抗体フラグメントの、
滅菌した、注射可能な溶液を製造する方法を提供するこ
とにより達成される。
体フラグメントをシンチグラフィー画像検出するための
１単位投与量と、抗体フラグメント1mg当たり10〜150μ
ｇのSn量の塩化第一スズと、塩化第一スズの30〜40倍モ
ル過剰の酒石酸塩との、生理食塩水を含む0.04〜0.06M
酢酸塩緩衝液pH4.5〜5.0の第１の滅菌溶液であって、不
活性ガスでパージされている各試薬を用いて該溶液を調
製する； 第１の滅菌溶液を不活性ガス雰囲気下に保つか、又は第
１の滅菌溶液を0.08〜0.1Mの庶糖液とし次いで糖含有溶
液を凍結乾燥する； 第１の滅菌溶液又はその凍結乾燥物を、Tc−99mパーテ
クネテートのシンチグラフィー画像検出有効量を含む第
２の滅菌溶液と混合する工程からなり、周囲温度で５分
間以内にTc−99mで抗体フラグメントを実質的に定量的
に標識化する、Tc−99m標識一価抗体フラグメントの、
滅菌した、注射可能な溶液を製造する方法を提供するこ
とにより達成される。
前述の方法で使用するためのキットも提供される。
発明の詳細な説明 本発明者らは、少なくとも１個、好ましくは多くの、空
間的に隣接し安定化した遊離スルフヒドリル基を含む一
価（例えば、FabまたはFab′など）抗体フラグメントの
『簡易』標識キット及び方法のための試薬及び条件を顕
著に改善した。抗体フラグメントの溶液と、市販のジェ
ネレータからすぐに利用し得るパーテクネテートを周囲
温度で約５分間混合すると、実質的に定量的に標識でき
る。
間的に隣接し安定化した遊離スルフヒドリル基を含む一
価（例えば、FabまたはFab′など）抗体フラグメントの
『簡易』標識キット及び方法のための試薬及び条件を顕
著に改善した。抗体フラグメントの溶液と、市販のジェ
ネレータからすぐに利用し得るパーテクネテートを周囲
温度で約５分間混合すると、実質的に定量的に標識でき
る。
慣用試薬及び手順に関する詳細は、本明細書中に参照と
して含まれる３つの特許明細書に記載されているので、
ここでは繰り返さない。
して含まれる３つの特許明細書に記載されているので、
ここでは繰り返さない。
放射性標識すべき一価抗体フラグメントは、抗原［腫
瘍、感染性外傷、微生物、寄生虫、心筋梗塞、血餅、ア
テローム性動脈硬化溶菌斑または通常の臓器若しくは組
織から産生された抗原またはこれに関連する抗原を含む
がこれに制限されない］と結合するフラグメントである
と考えられている。本明細書中で使用する『一価抗体フ
ラグメント』という用語は、通常、二価フラグメントま
たは完全免疫グロブリンを分解して得られるFab及びFa
b′フラグメントを表すものと理解される。しかしなが
ら一価フラグメントは、免疫グロブリンの超可変抗原−
結合領域を保持し且つFab′フラグメントと同一または
これより小さいサイズを有する任意のフラグメントも含
み得る。これらの例としては、抗原結合部位を取り込む
か、そうでなければ天然の免疫グロブリンフラグメント
と実質的に同一方法で標的賦形剤（targeting vehicle
s）としてin vivoで機能する、一本鎖または多鎖の、
遺伝子工学的に処理した蛋白質及び／または組換体蛋白
質が挙げられる。
瘍、感染性外傷、微生物、寄生虫、心筋梗塞、血餅、ア
テローム性動脈硬化溶菌斑または通常の臓器若しくは組
織から産生された抗原またはこれに関連する抗原を含む
がこれに制限されない］と結合するフラグメントである
と考えられている。本明細書中で使用する『一価抗体フ
ラグメント』という用語は、通常、二価フラグメントま
たは完全免疫グロブリンを分解して得られるFab及びFa
b′フラグメントを表すものと理解される。しかしなが
ら一価フラグメントは、免疫グロブリンの超可変抗原−
結合領域を保持し且つFab′フラグメントと同一または
これより小さいサイズを有する任意のフラグメントも含
み得る。これらの例としては、抗原結合部位を取り込む
か、そうでなければ天然の免疫グロブリンフラグメント
と実質的に同一方法で標的賦形剤（targeting vehicle
s）としてin vivoで機能する、一本鎖または多鎖の、
遺伝子工学的に処理した蛋白質及び／または組換体蛋白
質が挙げられる。
Fab′抗体フラグメントは、通常完全免疫グロブリンを
ペプシン消化して製造したＦ（ab′）２フラグメントを
還元分解して通常且つ都合良く製造される。チオール還
元剤［例えば、システイン、メルカプトエタノール、ジ
チオスレイトール（DTT）、グルタチオン等］で分解す
ると都合が良い。少なくとも１個の遊離スルフヒドリル
基を含む分解したＦ（ab′）２フラグメントは、本明細
書中では、『Fab′−SH』と記載する。Fab抗体フラグメ
ントは通常及び都合の良いことに、好ましくはチオール
還元剤の存在下、完全免疫ブロブリンのパパイン消化に
より製造できる。分裂したＦ（ab）２は、本明細書中で
は『Fab−SH』と記載する。
ペプシン消化して製造したＦ（ab′）２フラグメントを
還元分解して通常且つ都合良く製造される。チオール還
元剤［例えば、システイン、メルカプトエタノール、ジ
チオスレイトール（DTT）、グルタチオン等］で分解す
ると都合が良い。少なくとも１個の遊離スルフヒドリル
基を含む分解したＦ（ab′）２フラグメントは、本明細
書中では、『Fab′−SH』と記載する。Fab抗体フラグメ
ントは通常及び都合の良いことに、好ましくはチオール
還元剤の存在下、完全免疫ブロブリンのパパイン消化に
より製造できる。分裂したＦ（ab）２は、本明細書中で
は『Fab−SH』と記載する。
Ｆ（ab′）２フラグメントの還元は、pH5.5〜7.5、好ま
しくはpH6.0〜7.0で、より好ましくはpH6.4〜6.8で、最
も好ましくは約pH6.6で、例えばクエン酸塩、酢酸塩ま
たはリン酸塩緩衝液、好ましくはリン酸塩で干渉させた
生理食塩水中、好都合には不活性ガス雰囲気下で実施す
るのが好ましい。慎重に実施しないと、チオール還元で
フラグメントの軽い（Ｌ）鎖と重い（Ｈ）鎖とが分離し
てしまうのは公知であり、この反応は、フラグメントの
完全性を損なわないように慎重に制御すべきである。
しくはpH6.0〜7.0で、より好ましくはpH6.4〜6.8で、最
も好ましくは約pH6.6で、例えばクエン酸塩、酢酸塩ま
たはリン酸塩緩衝液、好ましくはリン酸塩で干渉させた
生理食塩水中、好都合には不活性ガス雰囲気下で実施す
るのが好ましい。慎重に実施しないと、チオール還元で
フラグメントの軽い（Ｌ）鎖と重い（Ｈ）鎖とが分離し
てしまうのは公知であり、この反応は、フラグメントの
完全性を損なわないように慎重に制御すべきである。
システインは、このようなジスルフィド還元にも好適で
あり、システインに対し同様の酸化ポテンシャルを備え
る他のチオールも都合良く使用され得る。ジスルフィド
還元剤対蛋白質の比は、鎖内ジスルフィド結合安定性の
関数であり、個々の場合で最適化されねばならない。Ｆ
（ab′）２抗体フラグメントの分解は、10〜30mM、好ま
しくは約20mMのシステインで、蛋白質濃度約10mg/mlで
都合良く実施できる。
あり、システインに対し同様の酸化ポテンシャルを備え
る他のチオールも都合良く使用され得る。ジスルフィド
還元剤対蛋白質の比は、鎖内ジスルフィド結合安定性の
関数であり、個々の場合で最適化されねばならない。Ｆ
（ab′）２抗体フラグメントの分解は、10〜30mM、好ま
しくは約20mMのシステインで、蛋白質濃度約10mg/mlで
都合良く実施できる。
Ｆ（ab′）２フラグメントを公知のジスルフィド結合還
元剤で還元すると、短時間、通常１時間未満（精製を含
む）で、分析により１〜３個の遊離スルフヒドリル基を
有するFab′が得られる。スルフヒドリル基は、放射性
金属の結合を促進するために抗体フラグメント中に導入
され得る。Traut試薬（イミノチオラン）をこの目的の
ために使用することは好ましくないが、幾つかの隣接ス
ルフヒドリル基を含むオリゴペプチドを使用するのは有
効である。特に、メタロチオネインまたは、好ましくは
そのＣ−未満ヘキサペプチドフラグメント（以後、“MC
TP"と呼称する）を使用すると都合が良い。
元剤で還元すると、短時間、通常１時間未満（精製を含
む）で、分析により１〜３個の遊離スルフヒドリル基を
有するFab′が得られる。スルフヒドリル基は、放射性
金属の結合を促進するために抗体フラグメント中に導入
され得る。Traut試薬（イミノチオラン）をこの目的の
ために使用することは好ましくないが、幾つかの隣接ス
ルフヒドリル基を含むオリゴペプチドを使用するのは有
効である。特に、メタロチオネインまたは、好ましくは
そのＣ−未満ヘキサペプチドフラグメント（以後、“MC
TP"と呼称する）を使用すると都合が良い。
次いでFab−SHまたはFab′−SHフラグメントを、過剰の
還元剤を含む低分子量部分をトラップする、短いサイジ
ングゲルカラムを通過させると都合が良い。このような
サイジングゲルカラムの好適な例としては、例えば、Se
phadex Ｇ−25、Ｇ−50（Pharmacia）、Fractogel TSK
HW55（EM Science）などのデキストラン、Ｐ−４、Ｐ
−６（BioRad）などのポリアクリルアミド等が挙げられ
る。FabまたはFab′フラグメントが最適範囲で製造で
き、ジスルフィド分解に通常それ程敏感でないＬ鎖−Ｈ
鎖分解を最小化するように条件を調節するために、分解
は、例えばサイズ排除HPLCによりモニターできる。
還元剤を含む低分子量部分をトラップする、短いサイジ
ングゲルカラムを通過させると都合が良い。このような
サイジングゲルカラムの好適な例としては、例えば、Se
phadex Ｇ−25、Ｇ−50（Pharmacia）、Fractogel TSK
HW55（EM Science）などのデキストラン、Ｐ−４、Ｐ
−６（BioRad）などのポリアクリルアミド等が挙げられ
る。FabまたはFab′フラグメントが最適範囲で製造で
き、ジスルフィド分解に通常それ程敏感でないＬ鎖−Ｈ
鎖分解を最小化するように条件を調節するために、分解
は、例えばサイズ排除HPLCによりモニターできる。
サイジングゲルカラムからの溶離液を、約0.03〜0.07、
好ましくは約0.05M酢酸塩緩衝液pH約4.5で安定化し、約
0.1〜0.3、好ましくは約0.15M生理食塩水溶液とし、好
ましくは不活性ガス（例えば、アルゴンなど）でパージ
した。通常、溶液の抗体フラグメント濃度を、約0.5〜5
mg/ml、好ましくは約１〜3mg/mlで操作すると都合が良
い。
好ましくは約0.05M酢酸塩緩衝液pH約4.5で安定化し、約
0.1〜0.3、好ましくは約0.15M生理食塩水溶液とし、好
ましくは不活性ガス（例えば、アルゴンなど）でパージ
した。通常、溶液の抗体フラグメント濃度を、約0.5〜5
mg/ml、好ましくは約１〜3mg/mlで操作すると都合が良
い。
次いで、安定化したFab−SHまたはFab′−SHフラグメン
トをスズイオン、好ましくは塩化第一スズと、スズイオ
ンの安定化剤と混合する。スズイオンは、その二水和物
として容易に入手可能であるか、金属スズ（例えば、薄
片、粒子、粉末、削り屑等）に水性の酸（例えば、HCl
など）を接触させることによりin situで製造し得る。
通常スズは、SnCl2の形、好都合には約0.01NのHCl中の
溶液の形で、フラグメント1mg当たり約10〜150μｇ、好
ましくは約123μｇのSnの比で添加する。スズイオンの
溶液は、SnCl・2 H2Oを6N HClに溶解し、次いで得られ
た溶液をアルゴンでパージした滅菌H2Oで希釈すること
により製造すると都合が良い。
トをスズイオン、好ましくは塩化第一スズと、スズイオ
ンの安定化剤と混合する。スズイオンは、その二水和物
として容易に入手可能であるか、金属スズ（例えば、薄
片、粒子、粉末、削り屑等）に水性の酸（例えば、HCl
など）を接触させることによりin situで製造し得る。
通常スズは、SnCl2の形、好都合には約0.01NのHCl中の
溶液の形で、フラグメント1mg当たり約10〜150μｇ、好
ましくは約123μｇのSnの比で添加する。スズイオンの
溶液は、SnCl・2 H2Oを6N HClに溶解し、次いで得られ
た溶液をアルゴンでパージした滅菌H2Oで希釈すること
により製造すると都合が良い。
スズイオン用の安定化剤を溶液中に存在させると都合が
良い。還元剤がスズイオンであるとき、アスコルビン酸
塩は、還元したパーテクネテートがキレート化剤に特異
的に充填するのを促進し且つTcO2の形成を最小化し得る
ことは公知である。他のポリカルボン酸［例えば、酒石
酸塩、クエン酸塩、フタル酸塩、イミノ二酢酸塩、エチ
レンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五
酢酸（DTPA）等］も使用し得る。ポリカルボン酸を例と
して参照したが、アニオン及び／またはヒドロオキシの
酸素含有種［例えば、サリチル酸塩、アセチルアセトネ
ート、ヒドロオキシ酸、カテコール、グリコール及び他
のポリオール類（例えば、グルコヘプトネートなど）
等］もこのような作用を与える。このような安定化剤の
例としては、アスコルビン酸塩、クエン酸塩及び酒石酸
塩が好ましいが、酒石酸塩がより好ましい。
良い。還元剤がスズイオンであるとき、アスコルビン酸
塩は、還元したパーテクネテートがキレート化剤に特異
的に充填するのを促進し且つTcO2の形成を最小化し得る
ことは公知である。他のポリカルボン酸［例えば、酒石
酸塩、クエン酸塩、フタル酸塩、イミノ二酢酸塩、エチ
レンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五
酢酸（DTPA）等］も使用し得る。ポリカルボン酸を例と
して参照したが、アニオン及び／またはヒドロオキシの
酸素含有種［例えば、サリチル酸塩、アセチルアセトネ
ート、ヒドロオキシ酸、カテコール、グリコール及び他
のポリオール類（例えば、グルコヘプトネートなど）
等］もこのような作用を与える。このような安定化剤の
例としては、アスコルビン酸塩、クエン酸塩及び酒石酸
塩が好ましいが、酒石酸塩がより好ましい。
このような助剤の詳細な役割は知られていないが、これ
らはスズイオンをキレート化し、スズイオンを安定化す
ることにより、偶発的な反応を防ぎ及び／または還元を
促進し得るらしく、且つこれらの助剤はキレート化で
き、それにより還元したパーテクネテートの特定の酸化
状態を安定化でき、よってこれらのテクネチウムイオン
を蛋白質の１個以上のチオール基及び他の隣接配位子と
の、より安定と考えられるキレート化状態に転移させる
ための転移キレート化剤（transchelating agents）と
して作用するらしい。このような助剤を本明細書中では
『安定剤』と呼称する。安定剤対スズイオンのモル比
は、約30:1〜40:1である。
らはスズイオンをキレート化し、スズイオンを安定化す
ることにより、偶発的な反応を防ぎ及び／または還元を
促進し得るらしく、且つこれらの助剤はキレート化で
き、それにより還元したパーテクネテートの特定の酸化
状態を安定化でき、よってこれらのテクネチウムイオン
を蛋白質の１個以上のチオール基及び他の隣接配位子と
の、より安定と考えられるキレート化状態に転移させる
ための転移キレート化剤（transchelating agents）と
して作用するらしい。このような助剤を本明細書中では
『安定剤』と呼称する。安定剤対スズイオンのモル比
は、約30:1〜40:1である。
安定剤（例えば、NaK酒石酸塩など）の約0.1Mの濃度の
緩衝液、好ましくは酢酸ナトリウムpH約5.5中に溶解し
た液を、アルゴンでパージした滅菌H2Oで製造する。SnC
l2溶液の１容積と、安定剤溶液の十分量とを混合し、ス
ズイオンに対し30〜40モル過剰にし、次いで得られた溶
液を滅菌過し、アルゴンでパージした。
緩衝液、好ましくは酢酸ナトリウムpH約5.5中に溶解し
た液を、アルゴンでパージした滅菌H2Oで製造する。SnC
l2溶液の１容積と、安定剤溶液の十分量とを混合し、ス
ズイオンに対し30〜40モル過剰にし、次いで得られた溶
液を滅菌過し、アルゴンでパージした。
滅菌した、安定化したSnCl2溶液を、滅菌Fab′−SHまた
はFab−SH溶液と混合し、フラグメント1mg当たり約10〜
150μｇ、好ましくは約123μgSnの終濃度とする。必要
により、pHを約4.5〜4.8に調節する。
はFab−SH溶液と混合し、フラグメント1mg当たり約10〜
150μｇ、好ましくは約123μgSnの終濃度とする。必要
により、pHを約4.5〜4.8に調節する。
フラグメントと安定化したスズイオンとの溶液を、例え
ば、フラグメント約1.25mg/バイアルの単位投与量で滅
菌バイアルに計量するのが都合がよく、次いでこのバイ
アルを低温、好ましくは液体窒素中で縮め、シールし且
つ保存するかまたは、凍結乾燥した。後者の場合には、
滅菌バイアル中に計量する前に、糖（例えば、トレハロ
ースまたは庶糖、好ましくは庶糖など）で約0.09モルの
溶液とした。バイアル中の物質を次いで凍結乾燥し、不
活性ガス、好ましくはアルゴンで真空をパージし、凍結
乾燥物を含むバイアルを縮め、シールし、場合によりフ
リーザー中で保存した。凍結乾燥条件は慣用であり、当
業者には公知である。シールした凍結乾燥物及びシール
し液体窒素中で保存した溶液の両方は、少なくとも９箇
月間安定であり、パーテクネテートと混合する際、Tc−
99mイオンで迅速且つ定量的に標識されるべきその機能
を保持する。
ば、フラグメント約1.25mg/バイアルの単位投与量で滅
菌バイアルに計量するのが都合がよく、次いでこのバイ
アルを低温、好ましくは液体窒素中で縮め、シールし且
つ保存するかまたは、凍結乾燥した。後者の場合には、
滅菌バイアル中に計量する前に、糖（例えば、トレハロ
ースまたは庶糖、好ましくは庶糖など）で約0.09モルの
溶液とした。バイアル中の物質を次いで凍結乾燥し、不
活性ガス、好ましくはアルゴンで真空をパージし、凍結
乾燥物を含むバイアルを縮め、シールし、場合によりフ
リーザー中で保存した。凍結乾燥条件は慣用であり、当
業者には公知である。シールした凍結乾燥物及びシール
し液体窒素中で保存した溶液の両方は、少なくとも９箇
月間安定であり、パーテクネテートと混合する際、Tc−
99mイオンで迅速且つ定量的に標識されるべきその機能
を保持する。
抗体フラグメントの１単位投与量を標識するには、液体
窒素中で凍結した溶液のバイアルを緩やかに暖めること
により室温に戻すかまたは、凍結乾燥したバイアルを必
要により室温にし、次いでシールを不活性ガス、好まし
くはアルゴン下で壊す。パーテクネテートの好適な画像
検出量の滅菌生理食塩水溶液をバイアルに添加し、内容
物を混合する。抗体フラグメントの上述の単位投与量を
標識する際、パーテクネテート量は通常約１〜100mCi/
抗体フラグメントmgであり、反応時間は約0.1〜10分で
ある。上述の蛋白質及びスズイオンの好ましい濃度で
は、パーテクネテートの量は、好ましくは約５〜20mCi/
mgであり、反応時間は約１〜５分である。これは、通常
30分〜数時間のインキュベーションが必要であり、場合
により高温及び／または追加の精製が必要であった従来
技術より有効な『簡易』標識法である。
窒素中で凍結した溶液のバイアルを緩やかに暖めること
により室温に戻すかまたは、凍結乾燥したバイアルを必
要により室温にし、次いでシールを不活性ガス、好まし
くはアルゴン下で壊す。パーテクネテートの好適な画像
検出量の滅菌生理食塩水溶液をバイアルに添加し、内容
物を混合する。抗体フラグメントの上述の単位投与量を
標識する際、パーテクネテート量は通常約１〜100mCi/
抗体フラグメントmgであり、反応時間は約0.1〜10分で
ある。上述の蛋白質及びスズイオンの好ましい濃度で
は、パーテクネテートの量は、好ましくは約５〜20mCi/
mgであり、反応時間は約１〜５分である。これは、通常
30分〜数時間のインキュベーションが必要であり、場合
により高温及び／または追加の精製が必要であった従来
技術より有効な『簡易』標識法である。
パーテクネテートは通常、生理食塩水溶液中、最も一般
的にはNaTcO4の形で市販のジェネレータから得られる。
新型ジェネレータの供給者により示唆されたように、ま
たは通常の当業者には明らかなように、他の形のパーテ
クネテートも使用し得、手順を好適に変形し得る。通常
パーテクネテートは、場合によりpH約３〜７、好ましく
はpH約3.5〜5.5、より好ましくは約4.5〜5.0に緩衝させ
た生理食塩水（例えば、0.9％『生理学的』滅菌生理食
塩水）中、約0.2〜20mCi/mlの活性で使用する。好適な
緩衝液としては、例えば酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸
塩、リン酸塩等が挙げられる。
的にはNaTcO4の形で市販のジェネレータから得られる。
新型ジェネレータの供給者により示唆されたように、ま
たは通常の当業者には明らかなように、他の形のパーテ
クネテートも使用し得、手順を好適に変形し得る。通常
パーテクネテートは、場合によりpH約３〜７、好ましく
はpH約3.5〜5.5、より好ましくは約4.5〜5.0に緩衝させ
た生理食塩水（例えば、0.9％『生理学的』滅菌生理食
塩水）中、約0.2〜20mCi/mlの活性で使用する。好適な
緩衝液としては、例えば酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸
塩、リン酸塩等が挙げられる。
本発明の方法により、常に、酸化に対し非常に安定で且
つ生理食塩水及び血清中での転移キレート化に対し耐性
のある形で、標識を抗体フラグメントに実質的に定量的
に取り込むことができる。本発明の方法によりTc−99m
で標識すると、Fab′に対しTc−99mの100％の取り込み
と、免疫反応性の＞95％の不変性（retention）が（分
析モニターの検出範囲内で）共に知見される。上述の製
造した放射性抗体溶液は、正しく滅菌した、発熱物質を
含まないバイアル中であれば、直接に注射できるように
なっている。またテクネチウム結合後、遊離スルフヒド
リル基を安定化するためにブロックする必要はない。さ
らに、標識フラグメントの免疫反応性は、１日の血清イ
ンキュベーション後でも殆ど減少せず、これにより、こ
の抱合体は、少なくとも24時間までは完全に実施可能な
画像検出剤であることが知見された。
つ生理食塩水及び血清中での転移キレート化に対し耐性
のある形で、標識を抗体フラグメントに実質的に定量的
に取り込むことができる。本発明の方法によりTc−99m
で標識すると、Fab′に対しTc−99mの100％の取り込み
と、免疫反応性の＞95％の不変性（retention）が（分
析モニターの検出範囲内で）共に知見される。上述の製
造した放射性抗体溶液は、正しく滅菌した、発熱物質を
含まないバイアル中であれば、直接に注射できるように
なっている。またテクネチウム結合後、遊離スルフヒド
リル基を安定化するためにブロックする必要はない。さ
らに、標識フラグメントの免疫反応性は、１日の血清イ
ンキュベーション後でも殆ど減少せず、これにより、こ
の抱合体は、少なくとも24時間までは完全に実施可能な
画像検出剤であることが知見された。
得られたTc−99m放射性標識抗体フラグメントは、腫瘍
及び外傷に於ける非−侵入性シンチグラフィー画像検出
法に於いて好適であり、実際便利で且つ有効であること
は当業者にも明らかである。腫瘍、感染性外傷、微生
物、寄生虫、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化溶
菌斑または通常の臓器若しくは組織により産生されたか
またはこれに関連した抗原と特異的に結合し、且つ外部
検出できるように医薬的に不活性な放射性同位体で標識
した抗体フラグメントをヒト患者に非経口的に注入し、
放射性標識した抗体または抗体フラグメントを局在化さ
せ、且つターゲットでないバックグラウンドをはっきり
させるのに十分な時間後、放射性標識抗体フラグメント
の部位または付着部位を外部画像検出カメラにより検出
する、特に、腫瘍、感染性外傷、微生物、寄生虫、心筋
梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化溶菌斑または通常の
臓器若しくは組織の画像検出法に於いて、放射性標識抗
体フラグメントとして本発明の方法により作成したTc−
99m標識抗体フラグメントを使用することにより改良す
ることができる。このような方法は当業界では公知であ
る。
及び外傷に於ける非−侵入性シンチグラフィー画像検出
法に於いて好適であり、実際便利で且つ有効であること
は当業者にも明らかである。腫瘍、感染性外傷、微生
物、寄生虫、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化溶
菌斑または通常の臓器若しくは組織により産生されたか
またはこれに関連した抗原と特異的に結合し、且つ外部
検出できるように医薬的に不活性な放射性同位体で標識
した抗体フラグメントをヒト患者に非経口的に注入し、
放射性標識した抗体または抗体フラグメントを局在化さ
せ、且つターゲットでないバックグラウンドをはっきり
させるのに十分な時間後、放射性標識抗体フラグメント
の部位または付着部位を外部画像検出カメラにより検出
する、特に、腫瘍、感染性外傷、微生物、寄生虫、心筋
梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化溶菌斑または通常の
臓器若しくは組織の画像検出法に於いて、放射性標識抗
体フラグメントとして本発明の方法により作成したTc−
99m標識抗体フラグメントを使用することにより改良す
ることができる。このような方法は当業界では公知であ
る。
標識フラグメントは、公知方法［例えば、Martin,Jr.,
らの米国特許第4,782,840号、またはGoldenbergの米国
特許出願第06/943,561号に記載の方法］による内部操作
可能なまたは内部観察検出条件（modalities）での、腫
瘍及び外傷の検出且つその境界の限定にも使用できる。
前述のシンチグラフィー内部操作可能な、内部観察法
は、放射［標識］免疫検出という用語に総て含まれる。
らの米国特許第4,782,840号、またはGoldenbergの米国
特許出願第06/943,561号に記載の方法］による内部操作
可能なまたは内部観察検出条件（modalities）での、腫
瘍及び外傷の検出且つその境界の限定にも使用できる。
前述のシンチグラフィー内部操作可能な、内部観察法
は、放射［標識］免疫検出という用語に総て含まれる。
一価抗体フラグメント［例えば、Fab′−SHまたはFab−
SHフラグメントなど］を、ジェネレータで製造したパー
テクネテートを用いてTc−99mで放射性標識するのに使
用するキット［本明細書中で請求した、種々の変形も含
む遺伝子キットの例は、通常当業者には明らかである］
は、通常、抗原［例えば、腫瘍、感染性外装、微生物、
寄生虫、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化溶菌斑
または通常臓器若しくは組織と関連する抗原］と特異的
に結合する抗体フラグメント１単位投与量当たり約0.01
〜10mg、好ましくは約１〜2mgを含み、且つこのフラグ
メントは、少なくとも１個、好ましくは複数の隣接遊離
スルフヒドリル基を含み、フラグメント1mg当たりスズ
イオン約10〜150μｇと、スズイオンに対し30〜40モル
過剰の安定剤（例えば、酒石酸塩など）とを含む。この
キットの構成成分は、個々にシールした滅菌バイアル中
に、溶液または凍結乾燥物の形で提供され、使用前に、
抗体または抗体フラグメント1mg当たりTc−99mパーテク
ネテート約２〜100mCiを混合する。通常このキットは、
放射性標識工程を実施するために、１種以上の補助試
薬、緩衝液、フィルター、バイアル、カラムを組み合わ
せて使用及び／または提供される。
SHフラグメントなど］を、ジェネレータで製造したパー
テクネテートを用いてTc−99mで放射性標識するのに使
用するキット［本明細書中で請求した、種々の変形も含
む遺伝子キットの例は、通常当業者には明らかである］
は、通常、抗原［例えば、腫瘍、感染性外装、微生物、
寄生虫、心筋梗塞、血餅、アテローム性動脈硬化溶菌斑
または通常臓器若しくは組織と関連する抗原］と特異的
に結合する抗体フラグメント１単位投与量当たり約0.01
〜10mg、好ましくは約１〜2mgを含み、且つこのフラグ
メントは、少なくとも１個、好ましくは複数の隣接遊離
スルフヒドリル基を含み、フラグメント1mg当たりスズ
イオン約10〜150μｇと、スズイオンに対し30〜40モル
過剰の安定剤（例えば、酒石酸塩など）とを含む。この
キットの構成成分は、個々にシールした滅菌バイアル中
に、溶液または凍結乾燥物の形で提供され、使用前に、
抗体または抗体フラグメント1mg当たりTc−99mパーテク
ネテート約２〜100mCiを混合する。通常このキットは、
放射性標識工程を実施するために、１種以上の補助試
薬、緩衝液、フィルター、バイアル、カラムを組み合わ
せて使用及び／または提供される。
上述の記載は単なる説明であり、上述の本発明の方法に
於いて多くの変更が考えられ得る。
於いて多くの変更が考えられ得る。
当業者にはさらに工夫することなく、上述の記載より、
本発明をその最大限の範囲で使用することができるだろ
う。従って、以下の好ましい特定の態様は本発明を説明
するものであり、本発明の開示を限定するものではな
い。以下の実施例に於いて、総ての温度はセルシウム度
に校正されていない。他に記載しない限り、総ての部及
び百分率は重量を表す。
本発明をその最大限の範囲で使用することができるだろ
う。従って、以下の好ましい特定の態様は本発明を説明
するものであり、本発明の開示を限定するものではな
い。以下の実施例に於いて、総ての温度はセルシウム度
に校正されていない。他に記載しない限り、総ての部及
び百分率は重量を表す。
実施例１ Tc−99m−抗−CEA−Fab′ A.標識キット 以下の溶液を製造した。
（Ｉ） 0.075M SnCl2の溶液を、3350mg SnCl・2 H2Oを
６ Ｎ HCl1mlに溶解して製造し、次いで得られた溶液
をアルゴンでパージした滅菌H2Oで希釈した。
６ Ｎ HCl1mlに溶解して製造し、次いで得られた溶液
をアルゴンでパージした滅菌H2Oで希釈した。
（II） 0.1M NaK酒石酸塩の0.05M NaAc溶液pH5.5
を、アルゴンでパージした滅菌H2Oで製造した。
を、アルゴンでパージした滅菌H2Oで製造した。
（III） 溶液I1容積を、溶液II26容積と混合し、得ら
れた溶液を滅菌過し、アルゴンでパージした。
れた溶液を滅菌過し、アルゴンでパージした。
（IV） Ｆ（ab′）２フラグメントのペプシン分解によ
り癌胎児性抗原（CEA）に特異結合するネズミモノクロ
ナールIgG1抗体から製造した抗−CEA−Fab′−SH溶液
を、20mMシステインでFab′−SHに還元した。過剰のシ
ステインをゲル過して除去し、次いでFab′−SHを、
生理食塩水中0.15Mの0.05M NaOAc緩衝液pH4.5で安定さ
せた（2mg/ml）。次いで得られた溶液を滅菌過し、ア
ルゴンでパージした。
り癌胎児性抗原（CEA）に特異結合するネズミモノクロ
ナールIgG1抗体から製造した抗−CEA−Fab′−SH溶液
を、20mMシステインでFab′−SHに還元した。過剰のシ
ステインをゲル過して除去し、次いでFab′−SHを、
生理食塩水中0.15Mの0.05M NaOAc緩衝液pH4.5で安定さ
せた（2mg/ml）。次いで得られた溶液を滅菌過し、ア
ルゴンでパージした。
（Ｖ） 溶液IIIの十分量と溶液IVとを混合し、Fab′−
SH1mg当たりSn123μｇの終濃度とし、pH4.5〜4.8に調節
した。
SH1mg当たりSn123μｇの終濃度とし、pH4.5〜4.8に調節
した。
アルゴン下で、溶液Ｖを滅菌バイアル（1.25mg Fab′−
SH/バイアル）に充填し、縮め、クリンプ−シールし、
液体窒素中で保存した。
SH/バイアル）に充填し、縮め、クリンプ−シールし、
液体窒素中で保存した。
あるいは、溶液Ｖを庶糖で0.09Mとし、得られた溶液
を、アルゴン下滅菌バイアル（1.25mg Fab′−SH/バイ
アル）に充填し、凍結乾燥した。真空をアルゴンでパー
ジし、凍結乾燥物を含むバイアルを縮め、バイアルをク
リンプ−シールした。
を、アルゴン下滅菌バイアル（1.25mg Fab′−SH/バイ
アル）に充填し、凍結乾燥した。真空をアルゴンでパー
ジし、凍結乾燥物を含むバイアルを縮め、バイアルをク
リンプ−シールした。
B.標識フラグメント 上記Ａで製造した液体窒素中で保存したフラグメントの
バイアルを緩やかに暖めるかまたは凍結乾燥物のバイア
ルを選択した。ジェネレータからの滅菌生理食塩水の過
テクネチウム酸ナトリウム10mCiの滅菌溶液を、Fab′−
SHのバイアルに注入し、スズイオンを安定化させ、緩や
かに攪拌して混合した。５分間で標識は定量に達し、得
られたTc−99m標識フラグメントの溶液は、患者にすぐ
に注射できるものであった。
バイアルを緩やかに暖めるかまたは凍結乾燥物のバイア
ルを選択した。ジェネレータからの滅菌生理食塩水の過
テクネチウム酸ナトリウム10mCiの滅菌溶液を、Fab′−
SHのバイアルに注入し、スズイオンを安定化させ、緩や
かに攪拌して混合した。５分間で標識は定量に達し、得
られたTc−99m標識フラグメントの溶液は、患者にすぐ
に注射できるものであった。
実施例２ 腫瘍の画像検出 実施例１で（液体窒素中で保存したFab′−SH溶液を用
いて）製造したTc−99m標識抗−CEA−Fab′の１単位投
与量の滅菌溶液を、３年前に結腫癌で『治療』手術を受
けた、CEA力価が次第に高くなった患者に静脈注射し
た。注入２時間後のシンチグラフィー画像検出により、
初期腫瘍の除去部位の骨盤に抗体フラグメントが局在化
しているのが示された。続く外科手術により、1.0×0.5
cmの癌があるのが認められ、これを成功裏に除去した。
いて）製造したTc−99m標識抗−CEA−Fab′の１単位投
与量の滅菌溶液を、３年前に結腫癌で『治療』手術を受
けた、CEA力価が次第に高くなった患者に静脈注射し
た。注入２時間後のシンチグラフィー画像検出により、
初期腫瘍の除去部位の骨盤に抗体フラグメントが局在化
しているのが示された。続く外科手術により、1.0×0.5
cmの癌があるのが認められ、これを成功裏に除去した。
実施例３ 腫瘍の画像検出 実施例１で（凍結乾燥物から）製造したTc−99m標識−
抗−CEA−Fab′の１単位投与量の滅菌溶液を、生検によ
り悪性であると判明した３×2cmの直腸ポリープのある
患者に静脈注射した。注入２時間後の画像検出により、
初期腫瘍、右肝葉及び左肺の下葉に抗体フラグメントが
局在化しているのが示された。針生検により肝臓と肺の
両方に腫瘍があること確認した。外科手術を実施して、
アジュバント放射線治療を実施するという当初の計画を
断念し、一時的に軽減する化学療法を始めた。
抗−CEA−Fab′の１単位投与量の滅菌溶液を、生検によ
り悪性であると判明した３×2cmの直腸ポリープのある
患者に静脈注射した。注入２時間後の画像検出により、
初期腫瘍、右肝葉及び左肺の下葉に抗体フラグメントが
局在化しているのが示された。針生検により肝臓と肺の
両方に腫瘍があること確認した。外科手術を実施して、
アジュバント放射線治療を実施するという当初の計画を
断念し、一時的に軽減する化学療法を始めた。
上述の実施例で使用した条件と、本発明の総称的または
特定的に記載された反応体及び／または操作条件とを入
れ換えて上述の実施例を繰り返しても、同様に成功し
た。
特定的に記載された反応体及び／または操作条件とを入
れ換えて上述の実施例を繰り返しても、同様に成功し
た。
上記記載より、当業者には、本発明の本質的な特徴を確
認するのは容易であり且つ本発明の趣旨及び範囲を逸脱
することなく、本発明を種々の変更及び改質して本発明
に種々の用法及び条件を改造し得る。
認するのは容易であり且つ本発明の趣旨及び範囲を逸脱
することなく、本発明を種々の変更及び改質して本発明
に種々の用法及び条件を改造し得る。
フロントページの続き (56)参考文献 国際公開7382（1988）（ＷＯ，Ａ)
Claims (9)
- 【請求項１】少なくとも１個の遊離スルフヒドリル基を
有する一価抗体フラグメントをシンチグラフィー画像検
出するための１単位投与量と、抗体フラグメント1mg当
たり10〜150μｇのSn量の塩化第一スズと、塩化第一ス
ズの30〜40倍モル過剰の酒石酸塩との、生理食塩水を含
む0.04〜0.06M酢酸塩緩衝液pH4.5〜5.0の第１の滅菌溶
液であって、不活性ガスでパージされている各試薬を用
いて該溶液を調製する； 第１の滅菌溶液を不活性ガス雰囲気下に保つか、又は第
１の滅菌溶液を0.08〜0.1Mの庶糖液とし次いで糖含有溶
液を凍結乾燥する； 第１の滅菌溶液又はその凍結乾燥物を、Tc−99mパーテ
クネテートのシンチグラフィー画像検出有効量を含む第
２の滅菌溶液と混合する工程からなり、周囲温度で５分
間以内にTc−99mで抗体フラグメントを実質的に定量的
に標識化する、Tc−99m標識一価抗体フラグメントの、
滅菌した、注射可能な溶液を製造する方法。 - 【請求項２】前記一価抗体フラグメントがFab−SHまた
はFab′−SHフラグメントである請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】前記抗体フラグメントが、腫瘍マーカーに
特異的に結合する請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記抗体フラグメントが、感染性外傷、微
生物または寄生虫に関する抗原に特異的に結合する請求
項１に記載の方法。 - 【請求項５】前記抗体フラグメントが、心筋梗塞、血餅
またはアテローム性動脈硬化溶菌斑に関連する抗原に特
異的に結合する請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】前記抗体フラグメントが、通常の臓器また
は組織に関する抗原に特異的ぴ結合する請求項１に記載
の方法。 - 【請求項７】不活性ガスがアルゴンである請求項１〜６
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】前記抗体フラグメントが、腫瘍、感染性外
傷、微生物、寄生虫、心筋梗塞、血餅、アテローム性動
脈硬化溶菌斑または通常の臓器若しくは組織により産生
された抗原またはこれに関する抗原と特異的に結合する
請求項１に記載の第１の滅菌溶液を不活性ガス雰囲気下
に含むシールした滅菌容器。 - 【請求項９】抗体フラグメントが請求項８に記載された
ものであり、0.08〜0.1Mの庶糖液とした請求項１に記載
の第１の滅菌溶液の凍結乾燥物を含むシールした滅菌容
器。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US40824189A | 1989-09-18 | 1989-09-18 | |
| US408,241 | 1989-09-18 | ||
| PCT/US1990/005196 WO1991004056A1 (en) | 1989-09-18 | 1990-09-18 | Method for rapidly radiolabeling monovalent antibody fragments with technetium |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04505455A JPH04505455A (ja) | 1992-09-24 |
| JPH0723326B2 true JPH0723326B2 (ja) | 1995-03-15 |
Family
ID=23615452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2514034A Expired - Fee Related JPH0723326B2 (ja) | 1989-09-18 | 1990-09-18 | 一価抗体フラグメントをテクネチウムで迅速に放射性標識する方法 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0419203B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0723326B2 (ja) |
| KR (1) | KR960015611B1 (ja) |
| AT (1) | ATE110281T1 (ja) |
| AU (1) | AU640698B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340250C (ja) |
| DE (1) | DE69011789T2 (ja) |
| DK (1) | DK0419203T3 (ja) |
| ES (1) | ES2063286T3 (ja) |
| FI (1) | FI921146A0 (ja) |
| IE (1) | IE64399B1 (ja) |
| IL (1) | IL95723A (ja) |
| NO (1) | NO920853D0 (ja) |
| WO (1) | WO1991004056A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA907420B (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5346687A (en) * | 1989-08-09 | 1994-09-13 | Rhomed Incorporated | Direct radiolabeling of antibody against stage specific embryonic antigen for diagnostic imaging |
| US5443816A (en) * | 1990-08-08 | 1995-08-22 | Rhomed Incorporated | Peptide-metal ion pharmaceutical preparation and method |
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