JPH07236482A - アルカリプロテアーゼ、その製造方法、およびそのプロテアーゼを生産する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 バチルス属に属する新菌株；その菌株、その
突然変異株又は遺伝子操作株を培養して得られ、以下の
性質を有するアルカリプロテアーゼ；およびその製造方
法： (1) カゼインを基質とし３０℃で１０分間反応させた至
適ｐＨが１１〜11.5付近、(2) ｐＨ１０で反応させた至
適作用温度が５５℃付近、(3) ｐＨ１０で１０分間処理
した活性半減温度が約４６〜４９℃、(4) ＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動法による分子量が29,100±1,000
、(5) ショ糖密度勾配等電点電気泳動により測定した
等電点が 9.4〜9.5 。 【効果】 本酵素は公知のバチルス属の生産するアルカ
リプロテアーゼに比べて、各種界面活性剤に対する安定
性に優れ、洗剤の補助剤などに好適に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な細菌アルカリプ
ロテアーゼに関し、さらに詳しく言えば新規なアルカリ
プロテアーゼ、その製造方法、およびそのプロテアーゼ
を生産する微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術およびその課題】近年、環境汚染が問題と
なり、リン酸塩の使用が規制されるに伴って、酵素を配
合して洗浄力を高めた洗剤が開発され、現在はプロテア
ーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ等を配合した
酵素入り洗剤が上市されている。

【０００３】中でもアルカリプロテアーゼは、衣類に付
着する有機汚垢の１０〜４０％を占め、洗剤成分だけで
は除去しきれないタンパク質の汚れを効率よく分解し洗
浄力を高めるため、洗剤成分として不可欠になってい
る。

【０００４】洗剤用プロテアーゼとしては洗剤（界面活
性剤）使用条件のアルカリ性ｐＨ域で酵素活性を示す従
来微生物由来のアルカリプロテアーゼが数多く知られて
いる。これらの酵素は一般に固形洗剤配合用酵素として
は、充分な安定性を有しているが、液体洗剤中または高
濃度の洗剤成分存在下では安定性は充分でなく、短時間
で失活する。

【０００５】そのため、(1) 新しい界面活性剤の開発、
(2) 安定化剤の添加、(3) 酵素のマイクロカプセル化等
により酵素の液体洗剤中での安定性を向上させる技術が
多数開示されている（特開平2-41398 号、米国特許第42
87082 号、英国特許第2021142 号、特開昭62-596号、特
開昭63-137996 号、特公昭60-55118号、特開平5-252949
号等）。しかし、酵素の安定化技術と共に、酵素自体の
液体洗剤中での安定性が従来品よりもより優れたものが
強く求められている。

【０００６】従って、本発明は、洗剤成分中において優
れた安定性を有する新規なアルカリプロテアーゼおよび
それを生産する微生物を提供することを目的とする。さ
らに、本発明は、洗濯時における比較的低濃度の界面活
性剤を含む洗剤溶液中での安定性に優れたアルカリプロ
テアーゼおよびそれを生産する微生物を提供することを
目的とする。さらに、本発明は、効率良く安価に供給で
きるアルカリプロテアーゼおよびそれを生産する微生物
を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の目
的を達成すべく種々の界面活性剤添加系での実験を実施
し、洗剤共存下で生育する菌の中からスクリーニングを
行なった結果、宮城県下の土壌から分離したバチルス属
の１菌株の生産する等電点の異なる複数プロテアーゼの
うち高等電点側に存在するプロテアーゼが前記の条件を
満足することを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】

【発明の開示】すなわち、本発明は以下の新規アルカリ
プロテアーゼ、その製造方法および新菌株を提供する。 １） 以下の性質を有するアルカリプロテアーゼ。 （１）作用：タンパク質を加水分解する。 （２）至適ｐＨ：カゼインを基質として３０℃で、１０
分間反応させた場合、至適作用ｐＨは１１〜11.5付近に
ある。 （３）至適温度：カゼインを基質としてｐＨ１０で反応
させた場合、至適作用温度は５５℃付近にある。 （４）耐熱性：ｐＨ１０で１０分間処理した場合、活性
が半減する温度はおよそ４６〜４９℃である。 （５）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法に
より測定した分子量は、29,100±1,000 である。 （６）等電点：ショ糖密度勾配等電点電気泳動により測
定した等電点は、 9.4〜9.5 である。 （７）界面活性剤に対する安定性 ２００nkat／mlの濃度で0.2 ％ｎ−ドデシルベンゼンス
ルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）水溶液（４０℃）中で６
０分間インキュベートした場合、残存活性はおよそ６０
％を示す。 ２） Ｎ末端アミノ酸配列の４９残基が配列番号１で示
される前記１に記載のアルカリプロテアーゼ。 ３） バチルス属に属し前記１または２に記載するアル
カリプロテアーゼの生産能を有する微生物またはその突
然変異株もしくは遺伝子操作株を培養し、前記培養液か
ら目的とするアルカリプロテアーゼを採取することを特
徴とする前記１または２に記載のアルカリプロテアーゼ
の製造方法。 ４） アルカリプロテアーゼの生産能を有する微生物ま
たはその突然変異株もしくは遺伝子操作株がバチルスｓ
ｐ. TS50093 株（工業技術院生命工学工業技術研究所受
託番号FERM P-14104）またはその突然変異株もしくは遺
伝子操作株である前記３に記載の製造方法。 ５） 前記１または２に記載するアルカリプロテアーゼ
生産能を有するバチルス属に属する微生物またはその突
然変異株もしくは遺伝子操作株。 ６） 微生物がバチルスｓｐ. TS50093 株（工業技術院
生命工学工業技術研究所受託番号FERM P-14104）である
前記５に記載の微生物またはその突然変異株もしくは遺
伝子操作株。

【０００９】

【微生物およびその培養】本発明の酵素を生産する菌株
について以下に述べるとおり形態観察、生理的性状試験
および菌体成分の分析等を行ない、分類と同定のための
文献（P.H.A.Sneath, N.S.Mair, M.E.Sharpe and J.G.H
olt : "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology"
Vol.2 (1986) Williams & Wilkins；R.E.Gordon, W.C.
Haynes andC.H.Pang : "The Genus Bacillus" (1973),
U.S.Department of Agriculture；D.Fritze, J.Flossdo
rf and D.Claus : Int. J. Syst. Bacteriol., 40, 92
(1990) ）を参考にして同定を試みた。本発明の菌株は
カタラーゼ陽性のグラム陽性桿菌で、その集落形状や細
胞形態などからバチルス（Bacillus）に属する細菌と考
えられたが、バチルス属に特有の胞子形成能は認められ
なかった。

【００１０】しかし、菌体成分を分析したところ、いず
れの分析結果もバチルス属細菌の特徴と一致した。これ
らの結果から前記細菌は胞子形成能を失ったバチルス属
の細菌であると考えられ、他の公知の菌株と明らかに相
違し、新規な菌と認定された。本発明者らは本菌株をバ
チルス TS50093株と命名した。本発明菌株は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-14104号と
して寄託している。

【００１１】

【菌学的性質】本発明に係る新菌株 TS50093株は、以下
に示す菌学的性質を示す。

【００１２】Ａ：形態的性質 (a)細胞の形：桿菌。 (b)細胞の大きさ：0.8 〜1.1 ×2.4 〜4.5 μｍ（ｐＨ
９に調整したＳＣＤ寒天斜面培地で３０℃１日培養
後）、0.8 〜1.0 ×4.4 〜8.8 μｍ（ｐＨ９に調整した
ＳＣＤブイヨン培地で３０℃，２日培養後）。 (c)鞭毛の着性状態：周毛（ｐＨ９に調整したＳＣＤ寒
天斜面培地で３０℃１日培養後）。 (d)グラム染色性：陽性。 (e)胞子の形成：下記表に示す培地（ｐＨ９）および温
度条件下で１か月インキュベートし、観察したが、いず
れの条件でも胞子の形成は認められなかった。

【００１３】

【表１】 培 地 培養条件 胞子形成 普通寒天培地（精製水） ３０℃ − 普通寒天培地（精製水） ４５℃ − 土壌侵出液寒天培地 ３０℃ − 土壌侵出液寒天培地 ４５℃ − 普通寒天培地（土壌侵出液） ３０℃ − 普通寒天培地（土壌侵出液） ４５℃ − 普通寒天培地（ミネラルウォーター） ３０℃ − 1/10普通寒天培地（ミネラルウォーター） ３０℃ − Ｌ培地¹⁾（精製水） ３０℃ − Ｌ培地（ミネラルウォーター） ３０℃ − 1/10Ｌ培地（ミネラルウォーター） ３０℃ − ＴＡ寒天培地²⁾（精製水） ３０℃ − ＴＡ寒天培地²⁾（精製水）³⁾ ３０℃ 生育せず ＡＫ寒天培地²⁾（精製水） ３０℃ − ＡＫ寒天培地²⁾（精製水）³⁾ ３０℃ 生育せず トリプトソイ寒天培地（精製水） ３０℃ − １）Bacto trypton １％，Yeast extract 0.5 ％，Ｎａ
Ｃｌ 0.5％，Ｎａ₂ ＣＯ₃ 0.3 ％。 ２）亀井ら：J. Antibact. Antifung. Agents., 19, 61
(1991) 記載の培地。 ３）細菌に６０℃，１０分間の加熱処理を行なった後、
培養。

【００１４】(f)運動性：運動性あり。 (g)酸素に対する態度：好気性。 (h)嫌気下での生育：生育しない。

【００１５】Ｂ：各種培地（ｐＨ９）での生育状況 (i)ゼラチン液化：陽性。 (j)デンプン分解：陽性。 (k)クエン酸の利用：利用しない。 (l)プロピオン酸塩の利用：利用しない。

【００１６】Ｃ：生理学的性質 (m)カタラーゼ：陽性。 (n)ＶＰテスト：陰性。 (o)卵黄反応：陰性。 (p)硝酸塩還元：陰性。 (q)糖類からの酸およびガスの生成

【００１７】

【表２】 ＮＤ：データなし。

【００１８】(r)生育のｐＨ範囲：ｐＨ5.7 で生育しな
い。ｐＨ6.8 （ニュートリエントブロス）で生育しな
い。ｐＨ7.5 で生育微弱。ｐＨ8.0 〜9.5 で生育良好。 (s)塩化ナトリウムに対する耐性：５％および７％Ｎａ
Ｃｌ存在下で生育する。 (t)生育の温度範囲：１０℃以下および５０℃以上で生
育しない。３０〜４０℃で生育良好。

【００１９】Ｄ：菌体成分および菌体脂肪酸組成 本発明の菌株および比較のためバチルス・アルカロフィ
ルス(B. alcalophilus）の菌株の菌体成分および菌体脂
肪酸組成を、各々表３および４に示す。

【００２０】

【表３】 本菌株 B.alcalophilus TS50093 (JCM5262) 細胞壁のジアミノ酸 meso-DAP meso-DAP キノン系 MK-6,MK-7 MK-7,MK-6 菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％） 41 40 meso-DAP：meso−ジアミノピメリン酸

【００２１】

【表４】 菌体脂肪酸組成（％） 本菌株 B.alcalophilus TS50093 (JCM5262) iso-14:0 3.7 0.4 14:0 1.6 1.8 iso-15:0 16.7 33.9 anteiso-15:0 52.7 32.4 15:0 2.0 − iso-16:0 5.6 2.6 16:0 5.8 8.9 16:1 1.6 0.7 iso-17:0 0.9 4.1 anteiso-17:0 5.5 6.7 17:0 0.4 0.8 18:0 0.3 0.4 18:1(n-9) 0.4 1.2 18:1(n-11) − 0.3

【００２２】

【酵素の取得法】上記本発明のTS50093 株は、等電点の
異なるプロテアーゼを２〜３種類生産するが（後述の実
施例１参照）、それらの中で高等電点側に存在するプロ
テアーゼが、本発明の前記特徴を有するものであった。
TS50093 株を用いて本発明のアルカリプロテアーゼを得
るには、菌株を適当な培地に接種し、常法に従って培養
すればよい。

【００２３】なお、本発明アルカリプロテアーゼを製造
するために用いる微生物は、上記TS50093 株に限らず、
本発明のアルカリプロテアーゼの生産性を有するもので
ある限り如何なる菌株であっても良い。また、TS50093
株についても、その自然または人工的突然変異株や遺伝
子操作株も包含される。

【００２４】人工的突然変異株の調製法としては、慣用
の方法に従って、例えば、原菌株を紫外線照射あるいは
ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の薬剤により人工的突
然変異処理をなし、その突然変異株をスキムミルクを含
む寒天培地に植えて生成するコロニーを単離し、プロテ
アーゼ生産用培地にて培養して生成するプロテアーゼの
同一性をチェックし、生産性の最も優れた菌株を選択す
ればよい。自然突然変異株の調製法としては、慣用の方
法に従って、例えば、普通の栄養培地による培養を行な
い、自然突然変異株のわずかに含まれる培養物を得て、
そこから上記の人工的突然変異株の調製法と同様の方法
によりプロテアーゼ生産性の優れた菌株を選択すればよ
い。

【００２５】また、遺伝子操作株の調製法としては、上
記と同じく慣用の方法に従って行なわれる。例えば、プ
ロテアーゼのアミノ酸配列からＤＮＡ塩基配列を推定
し、そのＤＮＡ塩基配列の特徴的な部分を合成して、さ
らにそのリン酸基のリン原子をラジオアイソトープ³²Ｐ
でラベルする。一方、原菌株より全染色体ＤＮＡを取り
出し適当な制限酵素で切断し、上記のラベルした合成Ｄ
ＮＡとSouthern Hybridyzation method によってハイブ
リダイズする染色体ＤＮＡの断片を選び出す。このよう
にして選び出した染色体ＤＮＡの断片を適当なベクター
に組み込んで、それをプロテアーゼ非生産性の菌株に導
入し、プロテアーゼ生産の有無をチェックする。プロテ
アーゼ生産の確認されたＤＮＡ断片をプラスミド等の適
当なベクターを用いて原菌株または酵素生産性の高い
（タンパク分泌能の高い）菌株に導入することにより生
産性の改良された菌株が得られる。

【００２６】本発明で使用される培地は、本発明のバチ
ルス属の菌が増殖し、アルカリプロテアーゼを生産し得
るものならば任意のものでよい。例えば、炭素源として
はグルコース、マルトース、シュークロース、可溶性デ
ンプン等が用いられ、窒素源としては、大豆かす、ごま
かす、ふすまかす、コーンスティーブリカー等の有機窒
素源が用いられる。また、この他にリン酸塩、ナトリウ
ム塩、カリウム塩、マグネシウム塩等の無機塩類が添加
される。

【００２７】本発明においては、培養は好気的条件下
で、例えば通気撹拌法や振とう培養法で行なう。培養温
度は２０〜４０℃の範囲でよいが、生育の最も良好な３
０〜４０℃が望ましい。初発ｐＨは８〜１１、培養中の
ｐＨは 8.5〜10.5がそれぞれ好ましい。培養時間は１６
〜６０時間程度であり、プロテアーゼ活性が最高に達し
たときに培養を終了すればよい。

【００２８】かくして得られる培養液中からの、目的と
するプロテアーゼの分離精製は一般の酵素の分離精製法
に準じて行なうことができる。すなわち遠心分離法また
はろ過法等によって菌体、培地固形物を除去して上清ま
たはろ液を得ることができる。これらの分離液に可溶性
塩類、親水性有機溶媒を添加し蛋白を沈殿させる塩析
法、溶媒沈殿法、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等により本発
明のプロテアーゼを得る。さらにイオン交換クロマトグ
ラフィおよびゲルろ過クロマトグラフィ等の精製法を組
み合わせ、精製することもできる。

【００２９】

【酵素活性の測定法】本発明においては酵素の活性は以
下の蛍光法またはフェノール法により測定した。なお、
後記の実施例において、特別の記載がない限り、活性測
定はフェノール法により行なった。

【００３０】１．蛍光法：ｐＨ１０の１００ｍＭ Atki
ns-Pantin のホウ酸緩衝液（ＡＰＢＢ）1300μｌに１０
ｍＭのスクシニル−ロイシル−ロイシル−バリル−チロ
シル−４−メチルクマリル−７−アミド（合成基質；Su
c-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA ）のジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）溶液５μｌと酵素溶液５μｌとを加え、３０℃
で１分間、蛍光光度計（日立Fluorresence spectrophot
ometer F3000）を用い、３６０ｎｍの励起光より前記基
質の結合が切断されて生じる７−アミノ−４−メチルク
マリン（ＡＭＣ）の蛍光を、蛍光波長４４０ｎｍで測定
する。

【００３１】２．フェノール法：ｐＨ１０の５０ｍＭ
ＡＰＢＢ５００μｌに酵素溶液５０μｌを加え、３０℃
で１０分間プレインキュベートする。カゼインを２％含
む５０ｍＭ ＡＰＢＢ溶液５００μｌを該溶液に加え、
３０℃で１０分間インキュベートした後、0.3 Ｍトリク
ロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液２ｍｌを加えて反応を停止させ
る。３０℃で２０分間インキュベートした後、ろ過し、
ろ液0.5 ｍｌに0.4 Ｍ炭酸ナトリウム2.5ｍｌおよび６
倍希釈のフェノール試薬0.5 ｍｌを添加し、３０℃で３
０分間インキュベートして発色させた後、６６０ｎｍに
おける吸光度を測定する。なお、上記測定において１秒
間にチロシン１モル相当の酸可溶性分解物を生じる酵素
量を１カタール（kat ）と定義する。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明の酵素を具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００３３】実施例１：本発明酵素の培養 ５リットル容坂口フラスコにポリペプトン１％、ミート
エキス１％、炭酸ナトリウム１％およびカゼイン0.1 ％
を含む液体培地２リットル入れ、１２１℃で１５分間オ
ートクレーブで滅箘した。これにプレート培養さらに試
験管培養しておいたTS50093 株を接種し、３０℃、１２
５rpm で２日間坂口培養を行なった。培養液を回収後、
０℃で３０分間遠心分離（8000rpm ）を行ない、上清液
を採取した。上清液に２倍容の−２０℃のアセトンを加
え、再び０℃で３０分間遠心分離（8000rpm ）を行な
い、沈澱物を採取した後、減圧乾燥し粗酵素の粉末を得
た。

【００３４】得られた粗酵素約１０ｍｇを５０ｍＭ Ｍ
ＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）３０
μｌとグリセリン３μｌに溶解し、以下の条件でアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。同様にズブチリシンＡ、Ａ
ＰＩ−２１（特公昭６０−５５１１８号記載のＮＫＳ−
２１株が産生するプロテアーゼ）およびプロテアーゼＣ
３６０（米国特許第３７２３２５０号記載のＣ３６０株
が生産するプロテアーゼ）についてもアガロースゲル電
気泳動にかけた。

【００３５】条件；ゲル濃度：アガロース１％， ゲル面積：１５×１５ｃｍ， 緩衝液 ：５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ6.5 ）， 電圧 ：４０Ｖ， 温度 ：４℃， 泳動時間：４〜６時間。

【００３６】結果は図１に示す通りであり、TS50093 株
は等電点の異なる２〜３のプロテアーゼを生産するが、
このうち、ＮＫＳ−２１株の生産するアルカリプロテア
ーゼＡＰＩ−２１と挙動の似ている高等電点側の酵素の
精製を行なった。

【００３７】なお、酵素の活性は、電気泳動後、ゲルの
下面に0.5 Ｍ ＡＰＢＢ（ｐＨ１０）7.5 ｍｌおよび１
０ｍＭ Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA １５μｌを染み込ま
せたろ紙を張り付け、３７℃で３０分間インキュベート
した後、ゲルに紫外線を照射し、発光するスポットが生
じるのを観察することにより確認した。

【００３８】実施例２：酵素の精製 実施例１で得られた粗酵素を、１ｍＭの塩化カルシウム
を含有する１０ｍＭＭＥＳ緩衝液約２００ｍｌ（ｐＨ6.
5 ）に溶解し、同緩衝液５リットルで２回透析した。そ
の後、DEAE-Cellulofine A-500（生化学工業製）カラム
クロマトグラフィー（ゲル体積５０ｍｌ）にかけ（同緩
衝液）、素通り画分を回収し、次にCM-Cellulofine C-5
00（生化学工業製）カラムクロマトグラフィー（ゲル体
積５０ｍｌ）にかけた。吸着した活性画分を０〜１Ｍ塩
化ナトリウムによりグラジエント溶出し、比活性がイオ
ン交換クロマトグラフィー前の約１２倍に上昇した本発
明のアルカリプロテアーゼを回収した。該サンプルをＳ
ＤＳスラブ電気泳動にかけ、染色液にはクーマシーブリ
リアントブルー（ＣＢＢ）を用いたところ酵素純度は均
一であることが確認された。精製の終了した酵素は凍結
乾燥して冷凍保存した。

【００３９】実施例３：Ｎ末端アミノ酸配列の分析 本発明のアルカリプロテアーゼおよびＡＰＩ−２１の凍
結乾燥品を５０％アセトニトリル、0.1 ％トリフルオロ
酢酸に溶解し、ＨＰＬＣによってメインピークを回収し
たものをアミノ酸シークエンサーにかけＮ末端アミノ酸
配列を４９残基分析した。結果を配列番号１および配列
番号２に示す。

【００４０】本発明のアルカリプロテアーゼはＡＰＩ−
２１に対して約９０％の相同性が認められる。

【００４１】実施例４：精製酵素の性質の測定 （１）至適温度および温度安定性 本発明のアルカリプロテアーゼの至適温度と温度安定性
は以下のようにして測定した。

【００４２】（１−１）至適温度：基質として１％のカ
ゼイン、金属塩として0.05ｍＭの塩化カルシウムを含む
５０ｍＭ ＡＰＢＢ（ｐＨ１０）に本発明のアルカリプ
ロテアーゼを添加し１０分間各温度で反応させた。３０
℃での活性を１００％として各温度での相対活性を求め
た結果を図２に示す。図２より、本発明のアルカリプロ
テアーゼのｐＨ１０における至適温度は５５〜５７℃付
近である。

【００４３】（１−２）温度安定性及びカルシウムイオ
ンによる安定化効果：１０nkat／ｍｌの本発明のアルカ
リプロテアーゼと１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０ｍ
Ｍ ＡＰＢＢ（ｐＨ１０）２００μｌを各温度で１０分
間インキュベートし、氷冷した後、活性を測定した。ま
た、塩化カルシウムを含有しないものに対しても同様に
測定した。また、酵素としてＡＰＩ−２１についても同
様に活性を求めた。結果を図３に合わせて示す。図３よ
り、いずれの酵素も同じような温度安定性を示し、カル
シウムイオンの存在により温度に対する安定性が上昇す
る。ｐＨ１０で１０分間の熱処理において活性が半減す
る温度は、カルシウムイオンの存在下で５１〜５５℃で
あり、カルシウムイオンの非存在下で４６〜４９℃であ
る。また、５０℃における活性はカルシウムイオンの存
在下で７７％であり、カルシウムイオンの非存在下で３
２％である。

【００４４】（２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ域 本発明のアルカリプロテアーゼの至適ｐＨおよび安定ｐ
Ｈ域は以下のようにして測定した。

【００４５】（２−１）至適ｐＨ：基質として１％のカ
ゼインを含む５０ｍＭのBritton-Robinson広域緩衝液
（ｐＨ４〜１２）に実施例２で得た酵素を添加し、３０
℃で１０分間各ｐＨで反応させた。ｐＨ11.5での活性を
１００％として各ｐＨでの相対活性を求めた。図４に結
果を示す。図４より、至適ｐＨは１１〜11.5付近であっ
た。

【００４６】（２−２）安定ｐＨ域：５０ｍＭのBritto
n-Robinson広域緩衝液２５５μｌに２０ｍＭの塩化カル
シウム１５μｌと酵素溶液（１００nkat／ｍｌ，５０ｍ
Ｍ ＡＰＢＢ，ｐＨ１０）３０μｌを加え、３０℃で２
４時間インキュベートした後、氷冷し、活性を測定し
た。酵素としては、実施例２で得た酵素を用い、インキ
ュベート前の活性を１００％として、各ｐＨでの残存活
性を求めた結果を図５に示す。図５より、安定ｐＨ域は
３０℃で４〜8.5 付近（残存活性５０％以上）であるこ
とが分かる。

【００４７】（３）免疫特性 オクタロニー法に従い、ＡＰＩ−２１抗血清およびプロ
テアーゼＣ３６０抗血清に対する本発明のアルカリプロ
テアーゼの免疫特性を調べたところ、本発明のアルカリ
プロテアーゼはＡＰＩ−２１抗血清に対して沈降線を形
成したが、プロテアーゼＣ３６０抗血清には沈降線を形
成しなかった。すなわち、本発明のアルカリプロテアー
ゼはＡＰＩ−２１と同じ免疫特性を有するが、プロテア
ーゼＣ３６０とは免疫特性が異なることがわかる。

【００４８】（４）等電点の測定 実施例２で得た乾燥粉体の酵素１ｍｇを用い、ショ糖密
度勾配等電点電気泳動法（堀尾武一、山下仁平、蛋白質
・酵素の基礎実験法(1981)）に従い、酵素の等電点を測
定した。その結果、本発明のアルカリプロテアーゼの等
電点は 9.4〜9.5 であった。

【００４９】（５）分子量の測定 本発明のアルカリプロテアーゼを、分子量マーカーとし
てチトクロームを用いて１５％ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法により分子量を測定したところ、2
9,100±1,000 であった。

【００５０】（６）基質特異性 本発明のアルカリプロテアーゼの各種ＭＣＡ合成基質お
よび各種タンパク質に対する分解活性を以下のようにし
て調べた。

【００５１】（６−１）ＭＣＡ合成基質に対する分解活
性：本発明のアルカリプロテアーゼおよびＡＰＩ−２１
を用い、基質として表に示す各種ＭＣＡ合成基質を用
い、ｐＨ１０にて分解活性を比較した（蛍光法）。な
お、表中、Ｓｕｃはスクシニル基、Ｂｏｃはt-ブトキシ
カルボニル基、Ｂｚｌはベンジル基、Ｂｚはベンゾイル
基、Ｐｙｒはピログルタミル基、ｚはカルボベンゾキシ
基を示す。また、活性はSuc-AlaAlaProPhe-MCAの分解活
性を１００としたときの相対活性で示す。

【００５２】

【表５】

【００５３】（６−２）各種タンパク質に対する分解活
性：１％の各種タンパク質を添加した５０ｍＭ ＡＰＢ
Ｂ（ｐＨ１０）１ｍｌを３０℃で１０分間放置した後、
表６に示す酵素の５０ｍＭ ＡＰＢＢ（ｐＨ１０）溶液
５０μｌを加え、３０℃で１０分間反応させた後、0.3
Ｍ トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液２ｍｌで反応を停止
し、活性を測定した。活性はフェノール法により測定
し、カゼインの分解活性を１００としたときの相対活性
を表６に示す。

【００５４】

【表６】 基 質 本発明 API-21 フ゜ロテア-セ゛C360 カゼイン 100 100 100 ヘモグロビン（未変性） 58 40 32 ヘモグロビン（変性） 165 130 60 ＢＳＡ 21 15 15 卵白アルブミン 20 26 20 ケラチン（変性） 68 50 39

【００５５】本発明のアルカリプロテアーゼは、各種タ
ンパク質に対する分解活性において、プロテアーゼＣ３
６０とは大きく異なり、ＡＰＩ−２１とも異なるパター
ンを示す。なお、本出願人の先願に係る特開平5-252949
号に記載のアルカリプロテアーゼは基質特異性がプロテ
アーゼＣ３６０に酷似しており、従って、本発明のアル
カリプロテアーゼは基質特異性の点で特開平5-252949号
に記載のアルカリプロテアーゼと大きく異なっている。

【００５６】（７）界面活性剤に対する安定性 本発明のアルカリプロテアーゼの各種界面活性剤に対す
る安定性を以下のようにして調べた。

【００５７】（７−１）ｎ−ドデシルベンゼンスルホン
酸ナトリウム（ＬＡＳ）に対する安定性 洗剤成分中で配合酵素の失活に最も関係の深い陰イオン
界面活性剤の中でとりわけ酵素に強いダメージを与える
ＬＡＳ溶液中での安定性を比較した。酵素（本発明のア
ルカリプロテアーゼおよびＡＰＩ−２１）および１ｍＭ
の塩化カルシウムを含有する１００ｍＭ ＡＰＢＢ（ｐ
Ｈ１０）２５μｌと、２％ＬＡＳ水溶液２５μｌを５０
ｍＭ ＡＰＢＢ（ｐＨ１０）２００μｌに加えたもの
（酵素の最終濃度：２００nkat／ml，ＬＡＳの最終濃
度：0.2 ％）を４０℃で６０分間インキュベートし、１
５分毎にサンプリング（５０μｌ）したものを５０ｍＭ
ＡＰＢＢ（ｐＨ１０）５００μｌに加え、酵素添加直
後のカゼイン分解活性を１００として、その残存活性を
求めた。結果を図６に示す。ＡＰＩ−２１では６０分後
の残存活性は４０％程度であるのに対して本発明のアル
カリプロテアーゼでは６０分後に残存活性はおよそ６０
％を示し、他の酵素に比べＬＡＳ中での安定性が著しく
優れていることがわかる。

【００５８】（７−２）他の界面活性剤に対する安定性 界面活性剤として、トデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、ブリッジ３５（Brigi 35）およびトリトンＸ−１
００（Triton X-100）を用い、各界面活性剤１％に対す
る本発明のアルカリプロテアーゼの耐性を以下のように
して調べた。

【００５９】２５nkatの酵素（本発明のアルカリプロテ
アーゼ，ＡＰＩ−２１）および１０ｍＭの塩化カルシウ
ムを含有する１００ｍＭ ＡＰＢＢ（ｐＨ１０）２５μ
ｌと、１０％界面活性剤水溶液２５μｌを５０ｍＭ Ａ
ＰＢＢ（ｐＨ１０）２００μｌに溶かしたものを４０℃
で６０分間インキュベートし、１５分毎にサンプリング
（５０μｌ）したものをを５０ｍＭ ＡＰＢＢ（ｐＨ１
０）５００μｌに加え、酵素添加直後のカゼイン分解活
性を１００として、その残存活性を求めた。結果を図
７、８および９に示す。本発明のアルカリプロテアーゼ
の６０分後の残存活性は、１％ＳＤＳ溶液中で約４０
％、１％ブリッジ３５溶液中で約７５％、１％トリトン
Ｘ−１００溶液中で約７０％であり、公知のＡＰＩ−２
１の残存活性（ＳＤＳ溶液：１０％、ブリッジ３５溶
液：５５％、トリトンＸ−１００溶液：６０％）に比べ
て安定性に優れていることがわかる。

【００６０】

【発明の効果】以上説明したように、本発明のアルカリ
プロテアーゼは、既知のアルカリプロテアーゼＡＰＩ−
２１とＮ端アミノ酸配列が９０％の相同性があり、基質
特異性も類似しているが、各種界面活性剤に対する安定
性が高い点で既知のアルカリプロテアーゼと明確に相違
する。本発明のアルカリプロテアーゼは、皮革加工用、
食品工業用、繊維工業用、医薬用などのほか、その高い
界面活性剤に対する安定性を生かして洗剤、特に液体洗
剤用の補助添加剤として有効に利用することができる。

【００６１】

【配列表】

【００６２】配列番号：１ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Pro Tyr Ile Tyr Ser Asp Val Val Gln 1 5 10 15 His Gln Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr 20 25 30 Gly Val Ala Pro Gln Pro Asp Leu Leu Ile His His Gly Val Ser Phe 35 40 45 Ile 49

【００６３】配列番号：２ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Pro Tyr Ile Tyr Ser Asp Val Val His 1 5 10 15 Arg Gln Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr 20 25 30 Gly Val Ala Pro His Pro Asp Leu His Ile Arg Gly Gly Val Ser Phe 35 40 45 Ile 49

【図面の簡単な説明】

【図１】 微生物の生産する酵素に対するアガロースゲ
ル電気泳動の結果である。

【図２】 本発明のアルカリプロテアーゼの至適温度範
囲を示すグラフである。

【図３】 本発明のアルカリプロテアーゼおよび公知酵
素（ＡＰＩ−２１）の温度安定性を示すグラフである。

【図４】 本発明のアルカリプロテアーゼの至適ｐＨ範
囲を示すグラフである。

【図５】 本発明のアルカリプロテアーゼのｐＨ安定性
を示すグラフである。

【図６】 本発明のアルカリプロテアーゼおよび公知酵
素（ＡＰＩ−２１）のＬＡＳ溶液中での安定性を示すグ
ラフである。

【図７】 本発明のアルカリプロテアーゼおよび公知酵
素（ＡＰＩ−２１）のＳＤＳ溶液中での安定性を示すグ
ラフである。

【図８】 本発明のアルカリプロテアーゼおよび公知酵
素（ＡＰＩ−２１）のブリッジ３５溶液中での安定性を
示すグラフである。

【図９】 本発明のアルカリプロテアーゼおよび公知酵
素（ＡＰＩ−２１）のトリトンＸ−１００溶液中での安
定性を示すグラフである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１１Ｄ 3/386 Ｃ１２Ｎ 15/09 15/01 (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の性質を有するアルカリプロテアー
   ゼ。 （１）作用：タンパク質を加水分解する。 （２）至適ｐＨ：カゼインを基質として３０℃で、１０
   分間反応させた場合、至適作用ｐＨは１１〜11.5付近に
   ある。 （３）至適温度：カゼインを基質としてｐＨ１０で反応
   させた場合、至適作用温度は５５℃付近にある。 （４）耐熱性：ｐＨ１０で１０分間処理した場合、活性
   が半減する温度はおよそ４６〜４９℃である。 （５）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法に
   より測定した分子量は、29,100±1,000 である。 （６）等電点：ショ糖密度勾配等電点電気泳動により測
   定した等電点は、 9.4〜9.5 である。 （７）界面活性剤に対する安定性 ２００nkat／mlの濃度で0.2 ％ｎ−ドデシルベンゼンス
   ルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）水溶液（４０℃）中で６
   ０分間インキュベートした場合、残存活性はおよそ６０
   ％である。
2. 【請求項２】 Ｎ末端アミノ酸配列の４９残基が配列番
   号１で示される請求項１に記載のアルカリプロテアー
   ゼ。
3. 【請求項３】 バチルス属に属し請求項１または２に記
   載するアルカリプロテアーゼの生産能を有する微生物ま
   たはその突然変異株もしくは遺伝子操作株を培養し、前
   記培養液から該アルカリプロテアーゼを採取することを
   特徴とする請求項１または２に記載のアルカリプロテア
   ーゼの製造方法。
4. 【請求項４】 アルカリプロテアーゼの生産能を有する
   微生物またはその突然変異株もしくは遺伝子操作株がバ
   チルスｓｐ. TS50093 株（工業技術院生命工学工業技術
   研究所受託番号FERM P-14104）またはその突然変異株も
   しくは遺伝子操作株である請求項３に記載の製造方法。
5. 【請求項５】 請求項１または２に記載するアルカリプ
   ロテアーゼの生産能を有するバチルス属に属する微生物
   またはその突然変異株もしくは遺伝子操作株。
6. 【請求項６】 微生物がバチルスｓｐ. TS50093 株（工
   業技術院生命工学工業技術研究所受託番号FERM P-1410
   4）である請求項５記載の微生物またはその突然変異株
   もしくは遺伝子操作株。