JPH0724595B2 - サイトカインを製造する方法 - Google Patents
サイトカインを製造する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、サイトカインを製造する方法に関する。より
詳細に述べれば、本発明は、誘導段階、及び産生段階を
各々異なる温度及びpH値の下で実施することを特徴とす
るサイトカインを製造する方法に関する。
詳細に述べれば、本発明は、誘導段階、及び産生段階を
各々異なる温度及びpH値の下で実施することを特徴とす
るサイトカインを製造する方法に関する。
（従来の技術） サイトカインは、細胞機能の調整と生体の組織との間の
相互関係において重要な役割を演じている。
相互関係において重要な役割を演じている。
「サイトカイン」なる用語は、生細胞によって産生さ
れ、かつそれらの周囲に分泌される生物学的活性を有す
るすべての分子または分子グループを意味する。その代
表的なものは、イントーロイキン、インターフェロン
（IFN−Ｓ）、リポコルチン、腫瘍壊死因子である。
れ、かつそれらの周囲に分泌される生物学的活性を有す
るすべての分子または分子グループを意味する。その代
表的なものは、イントーロイキン、インターフェロン
（IFN−Ｓ）、リポコルチン、腫瘍壊死因子である。
生細胞は、適当な誘導物質、例えばウイルス、レクチ
ン、マイトジェン、デキサメタゾン、ホルボールエステ
ル、イオノフォア、合成リボ核酸などの作用により、イ
ンビトロにおいても、サイトカインを産生することがで
きる。従って、適当な方法を用いることにより、生物学
的活性物質を、工業的規模で生産することができる。
ン、マイトジェン、デキサメタゾン、ホルボールエステ
ル、イオノフォア、合成リボ核酸などの作用により、イ
ンビトロにおいても、サイトカインを産生することがで
きる。従って、適当な方法を用いることにより、生物学
的活性物質を、工業的規模で生産することができる。
サイトカインはまた、いわゆる自然的方法、即ち遺伝子
操作を使ってもつくられる。この遺伝子操作において
は、誘導物質をヒトまたは動物の細胞に加えると、細胞
が、誘導物質の作用を受け、栄養溶液中にサイトカイン
を産生する。このサイトカインを、媒体から取り出す。
操作を使ってもつくられる。この遺伝子操作において
は、誘導物質をヒトまたは動物の細胞に加えると、細胞
が、誘導物質の作用を受け、栄養溶液中にサイトカイン
を産生する。このサイトカインを、媒体から取り出す。
この方法に関しては、次のような報告がある。
例えば、グルココルチコイド使用によるリポコルチン
〔ビー・ロスフート（B.Rothhut）ら：フェブス・レタ
ーズ（FEBS Lett.）219、169ページ（1987年）〕、PMA
使用によるＢ細胞刺激因子（IL−４）〔ジェイ・ヒュー
・リー（J.Hu−Li）ら：ジャーナル・オブ・エクスペリ
メンタル・メディシン（J.Exp.Med.）165、157ページ
（1987年）〕、コンカナバリンＡ使用によるインターロ
イキン−２〔ケイ・カトー（K.Kato）ら：バイオケミカ
ル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイション
ズ（Biochem.Biophys.Res.Commun.）127、182ページ（1
985）〕、センダイウイルス使用によるα−インターフ
ェロン〔ケイ・キャンテル（K.Cantell）ら：メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）72、29
ページ（1981）〕などである。
〔ビー・ロスフート（B.Rothhut）ら：フェブス・レタ
ーズ（FEBS Lett.）219、169ページ（1987年）〕、PMA
使用によるＢ細胞刺激因子（IL−４）〔ジェイ・ヒュー
・リー（J.Hu−Li）ら：ジャーナル・オブ・エクスペリ
メンタル・メディシン（J.Exp.Med.）165、157ページ
（1987年）〕、コンカナバリンＡ使用によるインターロ
イキン−２〔ケイ・カトー（K.Kato）ら：バイオケミカ
ル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイション
ズ（Biochem.Biophys.Res.Commun.）127、182ページ（1
985）〕、センダイウイルス使用によるα−インターフ
ェロン〔ケイ・キャンテル（K.Cantell）ら：メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）72、29
ページ（1981）〕などである。
上記各方法に共通する特徴は、サイトカインの誘導及び
生産が、同一の条件で行なわれていることである。
生産が、同一の条件で行なわれていることである。
（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、サイトカインの合成を阻害する因子の
影響を抑制して、サイトカインの収量を増加させること
である。
影響を抑制して、サイトカインの収量を増加させること
である。
（課題を解決するための手段） 本発明は、誘導に最適な条件の後で、生成物阻害作用が
早期に進むため、これを周囲条件の適切な制限によっ
て、回避させることができるという認識に基づいてい
る。
早期に進むため、これを周囲条件の適切な制限によっ
て、回避させることができるという認識に基づいてい
る。
上記認識に基づいて成された本発明は、動物細胞によっ
て産生され、かつそれらの周囲に分泌される生物学的活
性を有するサイトカインを製造する方法であって、希望
するサイトカインに対応する動物細胞に一種以上の誘導
物質を添加して、サイトカインの産生を誘導する誘導段
階及び産生段階の主として２段階からなる方法におい
て、誘導段階における温度及びpH値と、産生段階におけ
る温度及びpH値が各々異なることを特徴とするサイトカ
インを製造する方法に関する。
て産生され、かつそれらの周囲に分泌される生物学的活
性を有するサイトカインを製造する方法であって、希望
するサイトカインに対応する動物細胞に一種以上の誘導
物質を添加して、サイトカインの産生を誘導する誘導段
階及び産生段階の主として２段階からなる方法におい
て、誘導段階における温度及びpH値と、産生段階におけ
る温度及びpH値が各々異なることを特徴とするサイトカ
インを製造する方法に関する。
本発明による方法を用いるこにより、インビトロでのさ
まざまな細胞からのサイトカインの収率を相当に上げる
ことができる。
まざまな細胞からのサイトカインの収率を相当に上げる
ことができる。
サイトカインは、通常、対応する細胞を１種類以上の誘
導物質をもって処理し、次に、それを一定時間培養する
ことによって調製される。その後、栄養溶液に分泌され
たサイトカインを、通常の方法で取り出す。
導物質をもって処理し、次に、それを一定時間培養する
ことによって調製される。その後、栄養溶液に分泌され
たサイトカインを、通常の方法で取り出す。
本発明によれば、適当な時間間隔で培養条件を変化させ
ることにより、阻害因子の作用を遅らせ、収量を相当に
上げることができる。
ることにより、阻害因子の作用を遅らせ、収量を相当に
上げることができる。
観察したところ、サイトカインの合成を遅延させる生化
学的作用は、サイトカイン合成の指数的間隔後に一層激
しくなる。指数的時間から開始すれば、サイトカインの
生産は、培養条件の変化に左右されにくくなり、かつ、
合成を緩やかに遅らせる場合よりも阻害されなくなる。
学的作用は、サイトカイン合成の指数的間隔後に一層激
しくなる。指数的時間から開始すれば、サイトカインの
生産は、培養条件の変化に左右されにくくなり、かつ、
合成を緩やかに遅らせる場合よりも阻害されなくなる。
生産の間隔は、適切な変化と、変化時点の選択とによっ
て延ばすことができる。
て延ばすことができる。
pH調整が行なわれていない場合、そのpH値を生理学的
値、即ち7.2〜7.4にする。
値、即ち7.2〜7.4にする。
本発明の方法を実施する場合、誘導段階における培養温
度及び培養pH値を、産生段階における培養温度及び培養
pH値より高くすることが好ましい。また、産生段階にお
ける培養pH7、及び培養温度を15乃至40℃の範囲に調節
することが好ましい。更に、サイトカイン産生開始後、
培養pHまたは培養温度を変化させること、及びサイトカ
イン産生の指数的関数が持続する間に、pH値または温度
を変化させることが好ましい。
度及び培養pH値を、産生段階における培養温度及び培養
pH値より高くすることが好ましい。また、産生段階にお
ける培養pH7、及び培養温度を15乃至40℃の範囲に調節
することが好ましい。更に、サイトカイン産生開始後、
培養pHまたは培養温度を変化させること、及びサイトカ
イン産生の指数的関数が持続する間に、pH値または温度
を変化させることが好ましい。
（実施例） 以下、好適実施例に基づき、本発明による方法を詳細に
説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を制約す
るものではない。
説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を制約す
るものではない。
実施例１ 培養基のpH値変化によるヒト白血球α−IFNの収率の向
上 0.83％塩化アンモニウム溶液による溶血を数回行ない、
不純物がまじっている赤血球から、軟膜（新鮮なヒト血
液から得られる白血球リッチな画分）を精製し、得られ
た白血球を、鉱酸塩、グルコース、および1mg/mlの無ガ
ンマグロブリンヒト血清を含有する適切な栄養溶液中
に、１×107細胞/mlの密度で懸濁させる。
上 0.83％塩化アンモニウム溶液による溶血を数回行ない、
不純物がまじっている赤血球から、軟膜（新鮮なヒト血
液から得られる白血球リッチな画分）を精製し、得られ
た白血球を、鉱酸塩、グルコース、および1mg/mlの無ガ
ンマグロブリンヒト血清を含有する適切な栄養溶液中
に、１×107細胞/mlの密度で懸濁させる。
得られた溶液に対し、200IU/mlのヒト白血球α−IFNを
加え、この混合物を、37℃にて２時間培養する。次に、
100HAユニット/mlのセンダイウイルスを細胞に加え、そ
の混合物を、37℃にて２時間培養する。
加え、この混合物を、37℃にて２時間培養する。次に、
100HAユニット/mlのセンダイウイルスを細胞に加え、そ
の混合物を、37℃にて２時間培養する。
２時間、pH値が７になるような量で細胞懸濁液が入って
いるビンに対し、トリス塩酸緩衝液を加えてから、20時
間培養を行なう。次に、白血球を取り出すために、栄養
溶液を遠心分離にかける。
いるビンに対し、トリス塩酸緩衝液を加えてから、20時
間培養を行なう。次に、白血球を取り出すために、栄養
溶液を遠心分離にかける。
このようにして得られた生のIFNの抗ウイルス力価は、2
00,000IU/mlである。この値は、緩衝液によるpH値調整
を行なわずに得られるIFNの力価よりも、２倍高いこと
になる。
00,000IU/mlである。この値は、緩衝液によるpH値調整
を行なわずに得られるIFNの力価よりも、２倍高いこと
になる。
実施例２ 培養温度及びpH値変化によるヒト白血球ガンマIFN及び
インターロイキン−２の収率の向上 ガンマIFN及びインターロイキン−２を、同じ細胞培養
で同時に調製する。
インターロイキン−２の収率の向上 ガンマIFN及びインターロイキン−２を、同じ細胞培養
で同時に調製する。
新鮮な軟膜から得られた白血球、あるいはIFNの調製時
に使用された白血球を、この生産のために用いる。白血
球懸濁液を、実施例１に記載の要領で調製する。
に使用された白血球を、この生産のために用いる。白血
球懸濁液を、実施例１に記載の要領で調製する。
1mg/mlの無ガンマグロブリンヒト血清を含む通常の栄養
溶液中に、１×107〜２×107細胞/mlの濃度範囲で白血
球を懸濁させる。
溶液中に、１×107〜２×107細胞/mlの濃度範囲で白血
球を懸濁させる。
10〜20μg/mlのコンカナバリンＡか、１〜10μg/mlの植
物凝集素か、20〜10ng/mlのメセレイン（mesereine）
か、0.5〜２μg/mlのA23187イオノフォアか、または５
〜30ng/mlのホルボールミリステートアセテートを加
え、37℃で誘導を行なう。
物凝集素か、20〜10ng/mlのメセレイン（mesereine）
か、0.5〜２μg/mlのA23187イオノフォアか、または５
〜30ng/mlのホルボールミリステートアセテートを加
え、37℃で誘導を行なう。
誘導物質を加えてから３時間後、白血球の入っているビ
ンを、30℃に保たれている恒温槽に移し、pH値を７に調
整してから、混合物を培養する。
ンを、30℃に保たれている恒温槽に移し、pH値を７に調
整してから、混合物を培養する。
培養後、ガンマ−IFNおよびインターロイキン−２（IL
−２）を含む栄養溶液から、遠心分離によって細胞を取
り除く。
−２）を含む栄養溶液から、遠心分離によって細胞を取
り除く。
ガンマ−IFNの抗ウイルス力価は15,000IU/ml、IL−２の
抗ウイルス力価は1300IU/mlである。これらの値は、緩
衝液によるpH調整をせずに37℃の一定温度で得られる生
成物の力価よりも、２〜2.5倍高くなっている。
抗ウイルス力価は1300IU/mlである。これらの値は、緩
衝液によるpH調整をせずに37℃の一定温度で得られる生
成物の力価よりも、２〜2.5倍高くなっている。
ガンマ−IFNとIL−２とは、別の精製操作で分離され
る。
る。
実施例３ 培養温度を変化させることによるリポコルチン収率の向
上 新鮮なヒト血液から得られた軟膜を、0.83％塩化アンモ
ニウム溶液による数回にわたる溶血により、不純物がま
じっている赤血球から精製する。
上 新鮮なヒト血液から得られた軟膜を、0.83％塩化アンモ
ニウム溶液による数回にわたる溶血により、不純物がま
じっている赤血球から精製する。
次に、得られた純粋な白血球画分を血清の含まれていな
い栄養溶液中に懸濁させ、1ml当りの細胞数を１×107個
とし、更に、１μＭのデキサメタゾンによる処理を行な
ってから、37℃で２時間培養する。それから、培養温度
を30〜32℃の範囲に調節し、その温度で更に15〜20時間
培養を続ける。その後、栄養溶液から白血球を取り出す
ために、遠心分離にかける。
い栄養溶液中に懸濁させ、1ml当りの細胞数を１×107個
とし、更に、１μＭのデキサメタゾンによる処理を行な
ってから、37℃で２時間培養する。それから、培養温度
を30〜32℃の範囲に調節し、その温度で更に15〜20時間
培養を続ける。その後、栄養溶液から白血球を取り出す
ために、遠心分離にかける。
このようにして得られた上澄み液は、粗調製のリポコル
チンであるが、カラゲニン誘発炎症に対して強力な抑制
作用を発揮する。
チンであるが、カラゲニン誘発炎症に対して強力な抑制
作用を発揮する。
温度を一定に保つことなく生成された粗リポコルチンの
炎症抑制作用は、一定温度で生成されるリポコルチンよ
りも、２〜2.5倍強力である。
炎症抑制作用は、一定温度で生成されるリポコルチンよ
りも、２〜2.5倍強力である。
ウインター（Winter）らが、プロシーディングス・オブ
・ソサイエティ・フォア・エクスペリメンタル・バイオ
ロジー・アンド・メディシン（Proc.Soc.Exp.Biol.Me
d.）、111、644ページ（1962年）に報告しているカラゲ
ニン試験法により、ラットに対する炎症抑制作用の測定
を行なった。
・ソサイエティ・フォア・エクスペリメンタル・バイオ
ロジー・アンド・メディシン（Proc.Soc.Exp.Biol.Me
d.）、111、644ページ（1962年）に報告しているカラゲ
ニン試験法により、ラットに対する炎症抑制作用の測定
を行なった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−96083（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−105195（ＪＰ，Ａ) 特表 昭57−501265（ＪＰ，Ａ)
Claims (5)
- 【請求項１】動物細胞によって産生され、かつそれらの
周囲に分泌される生物学的活性を有するサイトカインを
製造する方法であって、希望するサイトカインに対応す
る動物細胞に一種以上の誘導物質を添加して、サイトカ
インの産生を誘導する誘導段階及び産生段階の主として
２段階からなる方法において、誘導段階における温度及
びpH値と、産生段階における温度及びpH値が各々異なる
ことを特徴とするサイトカインを製造する方法。 - 【請求項２】誘導段階における培養温度及び培養pH値
が、産生段階における培養温度及び培養pH値より高いこ
とを特徴とするサイトカインを製造する方法。 - 【請求項３】産生段階における培養pHを７、及び培養温
度を15乃至40℃の範囲に調節する請求項（１）または
（２）記載のサイトカインを製造する方法。 - 【請求項４】サイトカイン産生開始後、培養pHまたは培
養温度を変化させる請求項（１）乃至（３）のいずれか
に記載のサイトカインを製造する方法。 - 【請求項５】サイトカイン産生の指数的関数が持続する
間に、pH値または温度を変化させる請求項（１）乃至
（４）のいずれかに記載のサイトカインを製造する方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU881049A HU202594B (en) | 1988-03-04 | 1988-03-04 | Process for increasing yield of leucoquines |
| HU2251-1049/88 | 1988-03-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01281095A JPH01281095A (ja) | 1989-11-13 |
| JPH0724595B2 true JPH0724595B2 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=10952631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1050209A Expired - Lifetime JPH0724595B2 (ja) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | サイトカインを製造する方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0724595B2 (ja) |
| CN (1) | CN1036794A (ja) |
| AT (1) | AT392800B (ja) |
| DE (1) | DE3907114A1 (ja) |
| HU (1) | HU202594B (ja) |
| IT (1) | IT1229193B (ja) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2906160A1 (de) * | 1979-02-17 | 1980-09-04 | Thomae Gmbh Dr K | Verbessertes verfahren zur herstellung von humaninterferon |
| US4357422A (en) * | 1980-08-14 | 1982-11-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Method of enhancing interferon production |
| JPS57105195A (en) * | 1980-10-24 | 1982-06-30 | Nat Res Dev | Production of interferon |
| JPS6296083A (ja) * | 1985-10-21 | 1987-05-02 | Toray Ind Inc | 動物細胞の培養方法 |
-
1988
- 1988-03-04 HU HU881049A patent/HU202594B/hu not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-03-03 JP JP1050209A patent/JPH0724595B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-03 AT AT481/89A patent/AT392800B/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-03 CN CN89102021.7A patent/CN1036794A/zh active Pending
- 1989-03-03 IT IT8919632A patent/IT1229193B/it active
- 1989-03-06 DE DE3907114A patent/DE3907114A1/de active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU202594B (en) | 1991-03-28 |
| HUT50218A (en) | 1989-12-28 |
| IT1229193B (it) | 1991-07-25 |
| JPH01281095A (ja) | 1989-11-13 |
| DE3907114C2 (ja) | 1991-12-19 |
| AT392800B (de) | 1991-06-10 |
| CN1036794A (zh) | 1989-11-01 |
| IT8919632A0 (it) | 1989-03-03 |
| DE3907114A1 (de) | 1989-09-14 |
| ATA48189A (de) | 1990-11-15 |
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