JPS6158594A - インタ−フエロン−αの製造方法 - Google Patents
インタ−フエロン−αの製造方法Info
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- JPS6158594A JPS6158594A JP18010284A JP18010284A JPS6158594A JP S6158594 A JPS6158594 A JP S6158594A JP 18010284 A JP18010284 A JP 18010284A JP 18010284 A JP18010284 A JP 18010284A JP S6158594 A JPS6158594 A JP S6158594A
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- Japan
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- ifn
- alpha
- medium
- interferon
- cells
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、インターフェロン−α（以下、ＩＦＮ−α）
産生細胞から効率的にＩＦＮ−αを製造産生せしめるこ
とによるｒＦＮ−αの製造方法に関する。
産生細胞から効率的にＩＦＮ−αを製造産生せしめるこ
とによるｒＦＮ−αの製造方法に関する。
長野ら（Ｃｏｍｐｔ、 Ｒｅｎｄ、 Ｓｏｃ、 Ｂｉｏ
ｌ、 、 １４８巻。
ｌ、 、 １４８巻。
ｌ７００頁、 １９５４年）および１ｓａａｃｓら（Ｉ
’ｒｏｃ、 ＲＯＭ。
’ｒｏｃ、 ＲＯＭ。
Ｓｏｃ、 Ｓｅｒ、 Ｂ、 ＋ １４７巻、２５８頁、
１９５７年）によって発明されたインターフェロンは
、抗ウイルス作用以外に、近年抗腫瘍効果を含む多岐に
わたる生物学的作用を有する事が報告され（Ｇｒｅｓｓ
ｏｒ、 ＩらＢ、Ｂ、Ａ、、 ５１６巻、２３１頁、
１９７８年）、医薬としての可能性が注目を集めている
。現在、インターフェロンは大きく３種に分類され、そ
れぞれインターフェロン−α、インターフェロン−β、
インターフェロン−γと命名されている（Ｎａｔｕｒｅ
、 ２８６Ｓ、 １／ＯＬ １９８０年）。インターフ
ェロン−αは培養した白血球またはリンパ芽球を、各種
のウィルス、例えばセンダイウィルス（ＨＶＪ）、ニュ
ーキャスルデイジーズウイルス（ＮＤＶ）、インフルエ
ンザウィルスなどで刺激することによって誘起される
（八ｎｔｉｍｉｃｒｏｂｏａｌ 八ｇｅｎｔ ａｎｄ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅ−ｒａｐｙ ２０ （１／５，１９８
１）。
１９５７年）によって発明されたインターフェロンは
、抗ウイルス作用以外に、近年抗腫瘍効果を含む多岐に
わたる生物学的作用を有する事が報告され（Ｇｒｅｓｓ
ｏｒ、 ＩらＢ、Ｂ、Ａ、、 ５１６巻、２３１頁、
１９７８年）、医薬としての可能性が注目を集めている
。現在、インターフェロンは大きく３種に分類され、そ
れぞれインターフェロン−α、インターフェロン−β、
インターフェロン−γと命名されている（Ｎａｔｕｒｅ
、 ２８６Ｓ、 １／ＯＬ １９８０年）。インターフ
ェロン−αは培養した白血球またはリンパ芽球を、各種
のウィルス、例えばセンダイウィルス（ＨＶＪ）、ニュ
ーキャスルデイジーズウイルス（ＮＤＶ）、インフルエ
ンザウィルスなどで刺激することによって誘起される
（八ｎｔｉｍｉｃｒｏｂｏａｌ 八ｇｅｎｔ ａｎｄ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅ−ｒａｐｙ ２０ （１／５，１９８
１）。
これら従来技術において、誘発剤の濃度は仕較的高く、
細胞濃度０．５〜７Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌにおいて
、センダイウィルスは１００−１０００ ＩＩＡＬＩ／
ｍｌ添加されている。しかし、そのＩＦＮ−αの生産量
は比較的少なく、誘発後１日の培養上清よりＩＦＮ−α
が回収されるのみで、ＩＦＮ−αの持続性がなく、十分
量のＩＦＮ−αは回収できない。
細胞濃度０．５〜７Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌにおいて
、センダイウィルスは１００−１０００ ＩＩＡＬＩ／
ｍｌ添加されている。しかし、そのＩＦＮ−αの生産量
は比較的少なく、誘発後１日の培養上清よりＩＦＮ−α
が回収されるのみで、ＩＦＮ−αの持続性がなく、十分
量のＩＦＮ−αは回収できない。
本発明は、ＩＦＮ−α産生細胞よりＩＦＮ−αを効率的
に産生せしめる方法を提供することを目的とする。即ち
、本発明は、同一細胞で数回ＩＦＮ−αを産生させるこ
とを目的とする。
に産生せしめる方法を提供することを目的とする。即ち
、本発明は、同一細胞で数回ＩＦＮ−αを産生させるこ
とを目的とする。
かかる目的を達成するために種々研究を重ねてきたとこ
ろ、本発明者らはＴＦＮ−α産生細胞を誘発せしめてＩ
ＦＮ−αを産生させる際に、培地中への誘発剤の添加濃
度を従来法における添加濃度の１／１０〜１／５０とす
れば、ＩＦＮ−α産生量が増大すること、即ち、かかる
誘発剤濃度とすることによって［ＦＮ−α産生細胞を数
回培地に再浮遊させても、ＩＦＮ−αの産生が持続する
ことを見出して本発明を完成した。
ろ、本発明者らはＴＦＮ−α産生細胞を誘発せしめてＩ
ＦＮ−αを産生させる際に、培地中への誘発剤の添加濃
度を従来法における添加濃度の１／１０〜１／５０とす
れば、ＩＦＮ−α産生量が増大すること、即ち、かかる
誘発剤濃度とすることによって［ＦＮ−α産生細胞を数
回培地に再浮遊させても、ＩＦＮ−αの産生が持続する
ことを見出して本発明を完成した。
即ち、本発明は、インターフェロン−α産生細胞に誘発
剤を接種してインターフェロン−αを生産するに際して
、誘発剤の濃度を従来使用濃度の１／ＩＯ〜ｌ１５０と
することを特徴とするインターフェロン−αの製造方法
である。
剤を接種してインターフェロン−αを生産するに際して
、誘発剤の濃度を従来使用濃度の１／ＩＯ〜ｌ１５０と
することを特徴とするインターフェロン−αの製造方法
である。
本発明にて使用されるＩＦＮ−α産生細胞は、誘発する
ことによってＩＦＮ−αを産生しうるものであれば特に
制限はない。好ましいＩＦＮ−α産生細胞としては、産
生能の観点から、培養リンパ芽球様細胞（特にヒト由来
のもの）が挙げられる。培養リンパ芽球様細胞としては
、特にナマルバ株が好ましい。ナマルバ株は２０種のバ
ーキットリンパ腫、および白血病患者の株化リンパ球の
中から選択された株化細胞であり、現在この細胞はＩＦ
Ｎ−αを最もよく産出するとされている。
ことによってＩＦＮ−αを産生しうるものであれば特に
制限はない。好ましいＩＦＮ−α産生細胞としては、産
生能の観点から、培養リンパ芽球様細胞（特にヒト由来
のもの）が挙げられる。培養リンパ芽球様細胞としては
、特にナマルバ株が好ましい。ナマルバ株は２０種のバ
ーキットリンパ腫、および白血病患者の株化リンパ球の
中から選択された株化細胞であり、現在この細胞はＩＦ
Ｎ−αを最もよく産出するとされている。
（Ｉｎｔｅｒ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ、 ＩＬ ３２７
（１９７３） 、Ｊ、 Ｃ１ｉ−ｎｉｃａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、 ］、 ］ （１９７５） ）。
（１９７３） 、Ｊ、 Ｃ１ｉ−ｎｉｃａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、 ］、 ］ （１９７５） ）。
当該細胞の誘発に用いられる誘発剤としては、ＩＦＮ−
αの誘発剤として公知のものがいずれも好適に使用しう
る。かかる誘発剤としては、例えばＨ■、ｙ、、ＮＤ■
、インフルエンザウィルスなどが例示される。
αの誘発剤として公知のものがいずれも好適に使用しう
る。かかる誘発剤としては、例えばＨ■、ｙ、、ＮＤ■
、インフルエンザウィルスなどが例示される。
本発明における誘発は、誘発剤を添加した培地中にて行
われ、その際の誘発剤の濃度を従来濃度の１／１０〜１
／５０量とするところに本発明の特徴がある。従って、
その他の培養条件は、従来方法に準ずればよい。
われ、その際の誘発剤の濃度を従来濃度の１／１０〜１
／５０量とするところに本発明の特徴がある。従って、
その他の培養条件は、従来方法に準ずればよい。
培地としては、通常、Ｒ１’Ｍｌ １６４０ 、Ｅａｇ
ｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、ＤＩＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ
−１２培地、ＲＩＴＣ５６−２培地などが好適なものと
して例示される。さらに好ましくは牛新生児血清を、好
ましくは ０．１〜１５（Ｖ／Ｖ）％、さらに好ましく
は１０（ｖ／ｖ）％程度添加したＩＩＰ旧１６４０、Ｅ
ａｇｌｅｓ ＭＵＭ培地、Ｄ［７Ｍ培地、Ｉｌａｍ’ｓ
Ｆ−１２培地、ヒト・アルブミンを０．１〜１ （
Ｗ／Ｖ）％程度添加したＲＩＴＣ５６−２培地などが例
示される。
ｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、ＤＩＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ
−１２培地、ＲＩＴＣ５６−２培地などが好適なものと
して例示される。さらに好ましくは牛新生児血清を、好
ましくは ０．１〜１５（Ｖ／Ｖ）％、さらに好ましく
は１０（ｖ／ｖ）％程度添加したＩＩＰ旧１６４０、Ｅ
ａｇｌｅｓ ＭＵＭ培地、Ｄ［７Ｍ培地、Ｉｌａｍ’ｓ
Ｆ−１２培地、ヒト・アルブミンを０．１〜１ （
Ｗ／Ｖ）％程度添加したＲＩＴＣ５６−２培地などが例
示される。
細胞１度は、通常１．ＯＸ １０”〜１．ＯＸ’ＩＯ？
である。
である。
誘発剤の濃度は、個々の誘発剤によって異なるが、従来
濃度の１／１０〜１／５０量であり、例えばＨＶ Ｊは
０．１−１０１／八〇 ／ ｍ Ｉである。
濃度の１／１０〜１／５０量であり、例えばＨＶ Ｊは
０．１−１０１／八〇 ／ ｍ Ｉである。
培養時間は２０〜２４時間程度、培養温度は２５〜３７
℃程度が好ましい。また、誘発にはデキサメサゾン、酪
酸、ＤＭＳＯ等の処理剤を存在さセることが好ましい。
℃程度が好ましい。また、誘発にはデキサメサゾン、酪
酸、ＤＭＳＯ等の処理剤を存在さセることが好ましい。
第１回目のＴＦＮ−α産生後、細胞を回収して上記と同
様の新鮮培地に再浮遊させることによって、ＴＦＮ−α
の産生が持続される。当該Ｙｑ−Ｐｌ遊は２〜１０回、
繰り返される。再浮遊においては誘発剤は不要である。
様の新鮮培地に再浮遊させることによって、ＴＦＮ−α
の産生が持続される。当該Ｙｑ−Ｐｌ遊は２〜１０回、
繰り返される。再浮遊においては誘発剤は不要である。
しかし再浮遊を何度も繰り返し、ｒＦＮ−αを産生しつ
くした細胞は、さらに免疫増強剤（例えば、ＢＣＧ、０
Ｋ−４３２など）、処理剤（例えば、デキサメサゾン、
酪酸、ＤＭＳＯ等”） 、ＤＥＡＥ−デキストランの存
在下に誘発剤と処理することによって、再び多量の１Ｆ
Ｎ−αの産生が可能である。その際の誘発剤の濃度も、
前述と同様の低濃度である。
くした細胞は、さらに免疫増強剤（例えば、ＢＣＧ、０
Ｋ−４３２など）、処理剤（例えば、デキサメサゾン、
酪酸、ＤＭＳＯ等”） 、ＤＥＡＥ−デキストランの存
在下に誘発剤と処理することによって、再び多量の１Ｆ
Ｎ−αの産生が可能である。その際の誘発剤の濃度も、
前述と同様の低濃度である。
実施例１
ナマルバ細胞株を１０（Ｖ／Ｖ）％牛新生児血清加ＲＰ
Ｍ１／６４０培地を用い、２５０＋ｎ Ｉ のスピンナ
ーフラスコで培養する。培養開始３日後にデキサメサゾ
ンを最終濃度１０−７Ｍとなるように添加し、さらに４
８時間培養する。この後、細胞を１５０゜ｒｐｍ、 ５
分間遠心分離し、ＲＰ旧１６４０培地で細胞沈渣を懸濁
し、細胞濃度が２００Ｘ１０’ ｃｅｌｌｓ／ｍｌと
なるようにｆｌ製する。次に、ＴＦＮ−α誘発にセンダ
イウィルス（以下、ＨＶＪと略す）を最終濃度０．１〜
２００ ＨＡＤ ／ｍｌとなるように各々のスピンナー
フラスコに接種した。これを３７℃、２０時間処理した
。次に、培養液を１５０Ｏｒｐｍ 、５分間遠心分離し
、細胞とＩＦＮ−αを回収し、同量のＲＰＭＩ １６４
０培地により懸濁後２４時間培養し、再度、新鮮培地へ
の再浮遊を同様に繰り返した。下記に、誘発後毎日の培
養上清のＩＦＮ−α力価を測定し、毎日のＴＦＮ−α産
生量を第１表に示した。但し、培地交換を行わなかった
日の産生量は、（その日の上清のＴＦＮ−α力価−前日
の上清のＴＦＮ−α力価）で計算した。
Ｍ１／６４０培地を用い、２５０＋ｎ Ｉ のスピンナ
ーフラスコで培養する。培養開始３日後にデキサメサゾ
ンを最終濃度１０−７Ｍとなるように添加し、さらに４
８時間培養する。この後、細胞を１５０゜ｒｐｍ、 ５
分間遠心分離し、ＲＰ旧１６４０培地で細胞沈渣を懸濁
し、細胞濃度が２００Ｘ１０’ ｃｅｌｌｓ／ｍｌと
なるようにｆｌ製する。次に、ＴＦＮ−α誘発にセンダ
イウィルス（以下、ＨＶＪと略す）を最終濃度０．１〜
２００ ＨＡＤ ／ｍｌとなるように各々のスピンナー
フラスコに接種した。これを３７℃、２０時間処理した
。次に、培養液を１５０Ｏｒｐｍ 、５分間遠心分離し
、細胞とＩＦＮ−αを回収し、同量のＲＰＭＩ １６４
０培地により懸濁後２４時間培養し、再度、新鮮培地へ
の再浮遊を同様に繰り返した。下記に、誘発後毎日の培
養上清のＩＦＮ−α力価を測定し、毎日のＴＦＮ−α産
生量を第１表に示した。但し、培地交換を行わなかった
日の産生量は、（その日の上清のＴＦＮ−α力価−前日
の上清のＴＦＮ−α力価）で計算した。
第１表
ウィルス ウィルスｆｉ度（ｕへＵ ／ ｍ Ｉ
）接種後の □□−− 日数 ０．１ １．０ ５．０ ５０
２００１ ＊ １２，０００ １９．０００ １
９，４００ ２０．０００ ２＋、０００２ １３
．０００ １５，０００ ＋２．０００ ４．２００
３，２００３＊ ８，０００ １／，０００ ８
，５００ ２，９００ ２，２００４ ７．８００
１／，５００ ６，１００ ２．１００ １，９００
５ ３．１００ ３．０００ ６００ ６００
５００（注）表中、＊印をイリシたものは培地交換
を行ったものである。
）接種後の □□−− 日数 ０．１ １．０ ５．０ ５０
２００１ ＊ １２，０００ １９．０００ １
９，４００ ２０．０００ ２＋、０００２ １３
．０００ １５，０００ ＋２．０００ ４．２００
３，２００３＊ ８，０００ １／，０００ ８
，５００ ２，９００ ２，２００４ ７．８００
１／，５００ ６，１００ ２．１００ １，９００
５ ３．１００ ３．０００ ６００ ６００
５００（注）表中、＊印をイリシたものは培地交換
を行ったものである。
従来は、培養して得られた全細胞よりＩＦＮ−αを最大
限で得るには、細胞数を１００ＸＩＯ”−３００Ｘ］Ｏ
’ ｃｅｌｌｓ／ｍ＋となるように調製し、ＩＩＶＪ
を細胞１００ＸＩＯ’ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ当り最終濃
度が５０１／ＡＵ／ｍｌとなるような接種方法がとられ
てきた。ところが、これらの操作により、細胞数２００
ＸＩＯ’ ｃｅｌｌｓ／ｍｌのとき、最終濃度１．０
１／ＡＵ／ｍｌのＨＶＪの接種を行ったとき、従来のウ
ィルス量で１バツチで行う約３倍のＩＦＮ−αを得た。
限で得るには、細胞数を１００ＸＩＯ”−３００Ｘ］Ｏ
’ ｃｅｌｌｓ／ｍ＋となるように調製し、ＩＩＶＪ
を細胞１００ＸＩＯ’ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ当り最終濃
度が５０１／ＡＵ／ｍｌとなるような接種方法がとられ
てきた。ところが、これらの操作により、細胞数２００
ＸＩＯ’ ｃｅｌｌｓ／ｍｌのとき、最終濃度１．０
１／ＡＵ／ｍｌのＨＶＪの接種を行ったとき、従来のウ
ィルス量で１バツチで行う約３倍のＩＦＮ−αを得た。
実施例２
実施例１に示した方法で細胞を培養し、デキサメサゾン
処理を行った。そして実施例１にならい、２００ Ｘ
１０’ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで調製した細胞に対し、最
終濃度が１．ＯＨＡＤ／ｍｌとなるようにウィルスを接
種後、実施例Ｉとは異なり、この場合は１，３゜５日後
に１５０Ｏｒｐｍ 、 ５分間の遠心分離により培地交
換を行った。ここでは、誘発後４日目にデキサメサゾン
１０−７Ｍで処理を行った。誘発後５日目、培地交換後
、細胞数２８０Ｘ１０’ ｃｅｌｌｓ／ｍＱこ対し、
ＨＶＪを最終濃度１４８ＡＤ／ｍｌとなるように接種し
、１度の誘発と同様に誘発後１日、３日と新鮮培地で再
浮遊を行い、毎日の上清のＩＦＮ−α力価を測定し、毎
日のＩＦＮ−α産生量を第２表に示した。但し、培地交
換を行わなかった日の産生量は以下の計算式により求め
られた。
処理を行った。そして実施例１にならい、２００ Ｘ
１０’ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで調製した細胞に対し、最
終濃度が１．ＯＨＡＤ／ｍｌとなるようにウィルスを接
種後、実施例Ｉとは異なり、この場合は１，３゜５日後
に１５０Ｏｒｐｍ 、 ５分間の遠心分離により培地交
換を行った。ここでは、誘発後４日目にデキサメサゾン
１０−７Ｍで処理を行った。誘発後５日目、培地交換後
、細胞数２８０Ｘ１０’ ｃｅｌｌｓ／ｍＱこ対し、
ＨＶＪを最終濃度１４８ＡＤ／ｍｌとなるように接種し
、１度の誘発と同様に誘発後１日、３日と新鮮培地で再
浮遊を行い、毎日の上清のＩＦＮ−α力価を測定し、毎
日のＩＦＮ−α産生量を第２表に示した。但し、培地交
換を行わなかった日の産生量は以下の計算式により求め
られた。
（余白）
１０２．１００
Claims (2)
- （１）インターフェロン−α産生細胞に誘発剤を接種培
養してインターフェロン−αを生産するに際して、培地
中の誘発剤の濃度を従来使用濃度の１／１０〜１／５０
とすることを特徴とするインターフェロン−αの製造方
法。 - （２）特許請求の範囲第（１）項記載の方法によってイ
ンターフェロン−αの誘発・生産が終了した細胞を培養
液から単離し、これを新鮮培地に懸濁し、複数回インタ
ーフェロン−αの産生又は懸濁後再度誘発産生を行うこ
とを特徴とするインターフェロン−αの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18010284A JPS6158594A (ja) | 1984-08-28 | 1984-08-28 | インタ−フエロン−αの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18010284A JPS6158594A (ja) | 1984-08-28 | 1984-08-28 | インタ−フエロン−αの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6158594A true JPS6158594A (ja) | 1986-03-25 |
Family
ID=16077461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18010284A Pending JPS6158594A (ja) | 1984-08-28 | 1984-08-28 | インタ−フエロン−αの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6158594A (ja) |
-
1984
- 1984-08-28 JP JP18010284A patent/JPS6158594A/ja active Pending
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