JPH07250700A - 競合ｐｃｒ法による核酸の簡易定量法 - Google Patents
競合ｐｃｒ法による核酸の簡易定量法Info
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- JPH07250700A JPH07250700A JP6071701A JP7170194A JPH07250700A JP H07250700 A JPH07250700 A JP H07250700A JP 6071701 A JP6071701 A JP 6071701A JP 7170194 A JP7170194 A JP 7170194A JP H07250700 A JPH07250700 A JP H07250700A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 サンプル中のＤＮＡ又はＲＮＡを競合ＰＣＲ
法で定量する方法であり、サンプル中のＤＮＡ又はＲＮ
Ａと、配列内部に部分的に欠失、挿入又は変異を有する
競合体少なくとも２種と、そのＤＮＡ又はＲＮＡ及びい
ずれの競合体ともアニーリング可能な１種のセンス又は
アンチセンスプライマーと、互いに異なる競合体１種の
みとアニーリング可能であり競合体数と同数の対応のア
ンチセンス又はセンスプライマーとを同一容器内で遺伝
子増幅し、その産物を電気泳動分析にかけてＤＮＡ又は
ＲＮＡを定量する方法。 【効果】 １検体あたりＰＣＲ時のチューブ数を半減以
下に減らすことができ、これにより作業時間の短縮、作
業効率の向上、コスト削減などの利点をもつ。
法で定量する方法であり、サンプル中のＤＮＡ又はＲＮ
Ａと、配列内部に部分的に欠失、挿入又は変異を有する
競合体少なくとも２種と、そのＤＮＡ又はＲＮＡ及びい
ずれの競合体ともアニーリング可能な１種のセンス又は
アンチセンスプライマーと、互いに異なる競合体１種の
みとアニーリング可能であり競合体数と同数の対応のア
ンチセンス又はセンスプライマーとを同一容器内で遺伝
子増幅し、その産物を電気泳動分析にかけてＤＮＡ又は
ＲＮＡを定量する方法。 【効果】 １検体あたりＰＣＲ時のチューブ数を半減以
下に減らすことができ、これにより作業時間の短縮、作
業効率の向上、コスト削減などの利点をもつ。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、競合ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）法による核酸の定量法に関する。特に、
本発明は、微量核酸の定量に有効である。
反応（ＰＣＲ）法による核酸の定量法に関する。特に、
本発明は、微量核酸の定量に有効である。
【０００２】
【従来の技術】免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘル
ペスウイルス等の病原性ウイルスや、結核菌、ＭＲＳＡ
等の病原性細菌はヒトや他の動物に感染して重篤な疾病
を引き起こし、特に免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、
ＭＲＳＡ等にあっては直接的又は間接的に死に至らしめ
ることさえある。さらに、このような病原性ウイルスや
細菌類の中には、例えば免疫不全ウイルスのように特に
血液や性的接触を通して感染し長期間動物体内に潜伏し
たのち発病せしめるものや、肝炎ウイルス、特にＣ型肝
炎ウイルス（ＨＣＶ）のようにウイルス汚染された輸血
用血液を通して感染し慢性肝炎を経て肝硬変、肝癌へと
移行せしめるものや、ＭＲＳＡのように抵抗力の減退し
た患者に院内感染するものなど、すでに社会的問題へと
発展しているものさえある。
ペスウイルス等の病原性ウイルスや、結核菌、ＭＲＳＡ
等の病原性細菌はヒトや他の動物に感染して重篤な疾病
を引き起こし、特に免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、
ＭＲＳＡ等にあっては直接的又は間接的に死に至らしめ
ることさえある。さらに、このような病原性ウイルスや
細菌類の中には、例えば免疫不全ウイルスのように特に
血液や性的接触を通して感染し長期間動物体内に潜伏し
たのち発病せしめるものや、肝炎ウイルス、特にＣ型肝
炎ウイルス（ＨＣＶ）のようにウイルス汚染された輸血
用血液を通して感染し慢性肝炎を経て肝硬変、肝癌へと
移行せしめるものや、ＭＲＳＡのように抵抗力の減退し
た患者に院内感染するものなど、すでに社会的問題へと
発展しているものさえある。
【０００３】こうした状況下にあって、感染源を早期に
特定し、輸血用血液においては重大な輸血後感染を抑止
するために、また感染患者においては早期治療を可能に
するために種々の検査又は診断法が開発され又は開発途
上にある。そのために、簡易で且つ精確で且つ迅速な検
査、診断法が望まれている。特にＨＣＶの場合には、感
染初期の患者又はキャリヤーの体内、特に血中に存在す
るウイルス量が非常に少ないため、ウイルス自体を検出
することは困難である。そのため、感染初期の患者で血
中にウイルスは存在するが、抗体の上昇していない患者
や特定の抗原に対する抗体産生の悪い患者においては、
抗体検出法ではＨＣＶの感染は検出できず感染を見逃し
てしまう恐れがある。一般のウイルス感染や細菌感染で
はこのような場合、血中の病原体の抗原すなわちウイル
スや細菌を検出する抗原検出法が使用されるが、ＨＣＶ
の場合血中のウイルス量が非常に少ないために酵素抗体
法で検出することは困難である。また適当な培養法も確
立されておらず培養して検出することも難しい状態であ
る。
特定し、輸血用血液においては重大な輸血後感染を抑止
するために、また感染患者においては早期治療を可能に
するために種々の検査又は診断法が開発され又は開発途
上にある。そのために、簡易で且つ精確で且つ迅速な検
査、診断法が望まれている。特にＨＣＶの場合には、感
染初期の患者又はキャリヤーの体内、特に血中に存在す
るウイルス量が非常に少ないため、ウイルス自体を検出
することは困難である。そのため、感染初期の患者で血
中にウイルスは存在するが、抗体の上昇していない患者
や特定の抗原に対する抗体産生の悪い患者においては、
抗体検出法ではＨＣＶの感染は検出できず感染を見逃し
てしまう恐れがある。一般のウイルス感染や細菌感染で
はこのような場合、血中の病原体の抗原すなわちウイル
スや細菌を検出する抗原検出法が使用されるが、ＨＣＶ
の場合血中のウイルス量が非常に少ないために酵素抗体
法で検出することは困難である。また適当な培養法も確
立されておらず培養して検出することも難しい状態であ
る。
【０００４】このような場合、抗原検出法に代る方法と
してウイルス遺伝子を検出するＰＣＲ法を用いた遺伝子
増幅法が使用されている（須栗真，核医学技術第１２
巻，第１号，第４４〜５２頁（１９９２年））。ＰＣＲ
法はＤＮＡを増幅し検出する方法であるが、ＲＮＡの場
合にもＲＮＡより逆転写酵素（ＲＴ）によりｃＤＮＡを
合成し、これを鋳型にして増幅させるＲＴ−ＰＣＲ法が
用いられる。またＰＣＲ法は原理的には１分子の遺伝子
が存在すれば、検出可能なまでに増幅させることができ
るが、実際には１０００分子以下のＤＮＡ／ｃＤＮＡを
１回の増幅で視覚的に確認できるまで増幅することは困
難である。この視覚的に確認するとはアガロースやポリ
アクリルアミドのゲルでエチジュウムブロマイドの染色
で確認するということである。このため、非常に分子数
の少ない検体／遺伝子を増幅させる場合には、１回目の
ＰＣＲのあとに１回目のＰＣＲで得られた産物の一部を
さらに２回目のＰＣＲを行ない増幅させるｎｅｓｔｅｄ
−ＰＣＲが行なわれる。
してウイルス遺伝子を検出するＰＣＲ法を用いた遺伝子
増幅法が使用されている（須栗真，核医学技術第１２
巻，第１号，第４４〜５２頁（１９９２年））。ＰＣＲ
法はＤＮＡを増幅し検出する方法であるが、ＲＮＡの場
合にもＲＮＡより逆転写酵素（ＲＴ）によりｃＤＮＡを
合成し、これを鋳型にして増幅させるＲＴ−ＰＣＲ法が
用いられる。またＰＣＲ法は原理的には１分子の遺伝子
が存在すれば、検出可能なまでに増幅させることができ
るが、実際には１０００分子以下のＤＮＡ／ｃＤＮＡを
１回の増幅で視覚的に確認できるまで増幅することは困
難である。この視覚的に確認するとはアガロースやポリ
アクリルアミドのゲルでエチジュウムブロマイドの染色
で確認するということである。このため、非常に分子数
の少ない検体／遺伝子を増幅させる場合には、１回目の
ＰＣＲのあとに１回目のＰＣＲで得られた産物の一部を
さらに２回目のＰＣＲを行ない増幅させるｎｅｓｔｅｄ
−ＰＣＲが行なわれる。
【０００５】一方、ウイルス量の測定は抗原検出系が確
立されていないために、遺伝子の量を測定することによ
り行なわれている。その１つの方法はカイロン社が開発
したブランチドＤＮＡのプローブを用いウイルスのＲＮ
Ａとハイブリッドさせることによりウイルス遺伝子の量
を測定する方法である（飯野四郎と日野邦彦，Mebio,9
(11):44-49(1992)）。しかしながらこの検出系は遺伝子
の増幅を行なわないために感度が悪く、１０3 〜１０5
／ｍｌ以下のウイルス量の場合には検出できないと考え
られている。このため、より一般的にはＲＴ−ＰＣＲ法
を用い、同じチューブに鋳型ＲＮＡより短い欠失を導入
した競合用のＲＮＡやＤＮＡを加え最終的に同じ量のＤ
ＮＡが増幅されるものをその検体のＲＮＡ量とする競合
法が行なわれている（金子周一ら，日本臨床，第５０
巻，第１１１−１１６頁，１９９２年特別号）。
立されていないために、遺伝子の量を測定することによ
り行なわれている。その１つの方法はカイロン社が開発
したブランチドＤＮＡのプローブを用いウイルスのＲＮ
Ａとハイブリッドさせることによりウイルス遺伝子の量
を測定する方法である（飯野四郎と日野邦彦，Mebio,9
(11):44-49(1992)）。しかしながらこの検出系は遺伝子
の増幅を行なわないために感度が悪く、１０3 〜１０5
／ｍｌ以下のウイルス量の場合には検出できないと考え
られている。このため、より一般的にはＲＴ−ＰＣＲ法
を用い、同じチューブに鋳型ＲＮＡより短い欠失を導入
した競合用のＲＮＡやＤＮＡを加え最終的に同じ量のＤ
ＮＡが増幅されるものをその検体のＲＮＡ量とする競合
法が行なわれている（金子周一ら，日本臨床，第５０
巻，第１１１−１１６頁，１９９２年特別号）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この競
合法では１検体につき１つの競合体しか使用しないため
に、また、サンプルのＲＮＡと競合法のＲＮＡまたはＤ
ＮＡを同じチューブで競合させ最終的に増幅されたＤＮ
Ａ産物の量を比較し、サンプルから得られたＤＮＡとそ
の１種の競合体から得られたＤＮＡが同じ濃さのバンド
としてゲル中で確認できる濃度をウイルス量とするため
に、ウイルス量の分からない検体を測定する場合、多く
のチューブが必要となる。例えば、１〜１０8 程度のウ
イルスがいると推定される場合に、１０倍きざみで検出
する場合には８本のチューブが必要となる。検体を希釈
する場合にはチューブの数を減らすことが可能だが、そ
れでも最低４〜５本のチューブが必要となり、手間がか
かり分析に長時間を要すると共に操作も繁雑になる。
合法では１検体につき１つの競合体しか使用しないため
に、また、サンプルのＲＮＡと競合法のＲＮＡまたはＤ
ＮＡを同じチューブで競合させ最終的に増幅されたＤＮ
Ａ産物の量を比較し、サンプルから得られたＤＮＡとそ
の１種の競合体から得られたＤＮＡが同じ濃さのバンド
としてゲル中で確認できる濃度をウイルス量とするため
に、ウイルス量の分からない検体を測定する場合、多く
のチューブが必要となる。例えば、１〜１０8 程度のウ
イルスがいると推定される場合に、１０倍きざみで検出
する場合には８本のチューブが必要となる。検体を希釈
する場合にはチューブの数を減らすことが可能だが、そ
れでも最低４〜５本のチューブが必要となり、手間がか
かり分析に長時間を要すると共に操作も繁雑になる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来の競
合ＰＣＲ法の改良研究を行ない、１検体につき少なくと
も２種の競合体を使用することによって、またそれぞれ
の競合体が異なるプライマーで増幅されるように設計す
ることによって、従来法と比べてチューブの数を半減又
はそれ以下に減らせること、したがって分析時間の著し
い短縮を可能にすることを見出した。
合ＰＣＲ法の改良研究を行ない、１検体につき少なくと
も２種の競合体を使用することによって、またそれぞれ
の競合体が異なるプライマーで増幅されるように設計す
ることによって、従来法と比べてチューブの数を半減又
はそれ以下に減らせること、したがって分析時間の著し
い短縮を可能にすることを見出した。
【０００８】本発明は、まず第１に、サンプル中のＤＮ
Ａ又はＲＮＡを競合ＰＣＲ法で定量する方法であって、
（ｉ）サンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡと、少なくと
も２種の、予備決定されたコピー数の競合体であって、
前記ＤＮＡ又はＲＮＡと完全に又は部分的に相同性をも
ち且つ前記ＤＮＡ又はＲＮＡに対応する配列の内部に部
分的に欠失又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ及びいずれの競合体ともアニーリング可能
な１種のセンス又はアンチセンスプライマーと、このプ
ライマーに対応しこれと異なる配列を有し且つ前記競合
体の種類と同数のアンチセンス又はセンスプライマーで
あって、各々が互いに異なる競合体１種のみとアニーリ
ング可能である前記アンチセンス又はセンスプライマー
とを同一容器内で競合ＰＣＲ法にかけて、サンプル由来
の前記ＤＮＡ又はＲＮＡ及び前記競合体を鋳型とする互
いに異なるサイズの増幅産物を得、（ｉｉ）ステップ
（ｉ）の増幅産物を電気泳動分析にかけてサイズ分離
し、その分離したバンドの濃さと競合体の前記コピー数
とに基づいてサンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡのコピ
ー数を決定する、ことを包含する方法を提供する。
Ａ又はＲＮＡを競合ＰＣＲ法で定量する方法であって、
（ｉ）サンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡと、少なくと
も２種の、予備決定されたコピー数の競合体であって、
前記ＤＮＡ又はＲＮＡと完全に又は部分的に相同性をも
ち且つ前記ＤＮＡ又はＲＮＡに対応する配列の内部に部
分的に欠失又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ及びいずれの競合体ともアニーリング可能
な１種のセンス又はアンチセンスプライマーと、このプ
ライマーに対応しこれと異なる配列を有し且つ前記競合
体の種類と同数のアンチセンス又はセンスプライマーで
あって、各々が互いに異なる競合体１種のみとアニーリ
ング可能である前記アンチセンス又はセンスプライマー
とを同一容器内で競合ＰＣＲ法にかけて、サンプル由来
の前記ＤＮＡ又はＲＮＡ及び前記競合体を鋳型とする互
いに異なるサイズの増幅産物を得、（ｉｉ）ステップ
（ｉ）の増幅産物を電気泳動分析にかけてサイズ分離
し、その分離したバンドの濃さと競合体の前記コピー数
とに基づいてサンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡのコピ
ー数を決定する、ことを包含する方法を提供する。
【０００９】好ましい態様としては、サンプル中の前記
ＲＮＡが、ＰＣＲにかける前に予め逆転写酵素の作用に
よってｃＤＮＡに変換されることを特徴とする上記記載
の方法に関する。
ＲＮＡが、ＰＣＲにかける前に予め逆転写酵素の作用に
よってｃＤＮＡに変換されることを特徴とする上記記載
の方法に関する。
【００１０】本発明は第２に、サンプル中の微量のＤＮ
Ａ又はＲＮＡを競合ＰＣＲ法で定量する方法であって、
（ｉ）サンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡと、少なくと
も２種の、予備決定されたコピー数の競合体であって、
前記ＤＮＡ又はＲＮＡと完全に又は部分的に相同性をも
ち且つ前記ＤＮＡ又はＲＮＡに対応する配列の内部に部
分的に欠失又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ＤＮ
Ａもしくは前記ＲＮＡ及び前記競合体とアニーリング可
能な第１のセンス及びアンチセンスプライマーとを同一
容器内で第１ＰＣＲにかけて前記ＤＮＡ又はＲＮＡを増
幅し、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物に、前記ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ及びいずれの競合体ともアニーリング可能
な１種の第２のセンス又はアンチセンスプライマーと、
このプライマーに対応しこれと異なる配列を有し且つ前
記競合体の種類と同数の第２のアンチセンス又はセンス
プライマーであって、各々が互いに異なる競合体１種の
みとアニーリング可能である前記第２のアンチセンス又
はセンスプライマーとを添加して競合ＰＣＲ法にかけ、
サンプル由来の前記ＤＮＡ又はＲＮＡ及び前記競合体を
鋳型とする互いに異なるサイズの増幅産物を得、（ｉｉ
ｉ）ステップ（ｉｉ）の増幅産物を電気泳動分析にかけ
てサイズ分離し、その分離したバンドの濃さと競合体の
前記コピー数とに基づいてサンプル中の前記ＤＮＡ又は
ＲＮＡのコピー数を決定する、ことを包含する前記方法
を提供する。
Ａ又はＲＮＡを競合ＰＣＲ法で定量する方法であって、
（ｉ）サンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡと、少なくと
も２種の、予備決定されたコピー数の競合体であって、
前記ＤＮＡ又はＲＮＡと完全に又は部分的に相同性をも
ち且つ前記ＤＮＡ又はＲＮＡに対応する配列の内部に部
分的に欠失又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ＤＮ
Ａもしくは前記ＲＮＡ及び前記競合体とアニーリング可
能な第１のセンス及びアンチセンスプライマーとを同一
容器内で第１ＰＣＲにかけて前記ＤＮＡ又はＲＮＡを増
幅し、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物に、前記ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ及びいずれの競合体ともアニーリング可能
な１種の第２のセンス又はアンチセンスプライマーと、
このプライマーに対応しこれと異なる配列を有し且つ前
記競合体の種類と同数の第２のアンチセンス又はセンス
プライマーであって、各々が互いに異なる競合体１種の
みとアニーリング可能である前記第２のアンチセンス又
はセンスプライマーとを添加して競合ＰＣＲ法にかけ、
サンプル由来の前記ＤＮＡ又はＲＮＡ及び前記競合体を
鋳型とする互いに異なるサイズの増幅産物を得、（ｉｉ
ｉ）ステップ（ｉｉ）の増幅産物を電気泳動分析にかけ
てサイズ分離し、その分離したバンドの濃さと競合体の
前記コピー数とに基づいてサンプル中の前記ＤＮＡ又は
ＲＮＡのコピー数を決定する、ことを包含する前記方法
を提供する。
【００１１】また、サンプル中の前記ＲＮＡが、ＰＣＲ
にかける前に予め逆転写酵素の作用によってｃＤＮＡに
変換されることを特徴とする上記記載の方法に関する。
にかける前に予め逆転写酵素の作用によってｃＤＮＡに
変換されることを特徴とする上記記載の方法に関する。
【００１２】本発明は第３に、サンプル中の微量のＤＮ
Ａ又はＲＮＡを競合ＰＣＲ法で定量する方法であって、
（ｉ）サンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡと、２種の、
予備決定されたコピー数の競合体であって、前記ＤＮＡ
又はＲＮＡと完全に又は部分的に相同性をもち且つ前記
ＤＮＡ又はＲＮＡに対応する配列の内部に部分的に欠失
又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ＤＮＡもしくは
前記ＲＮＡ及び前記競合体とアニーリング可能な第１の
センス及びアンチセンスプライマーとを同一容器内で第
１ＰＣＲにかけて前記ＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し、（ｉ
ｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物に、前記ＤＮＡ又はＲＮ
Ａ及びいずれの競合体ともアニーリング可能な１種の第
２のセンス又はアンチセンスプライマーと、このプライ
マーに対応しこれと異なる配列を有する２種の第２のア
ンチセンス又はセンスプライマーであって、各々が互い
に異なる競合体のみとアニーリング可能である前記第２
のアンチセンス又はセンスプライマーとを添加して競合
ＰＣＲ法にかけ、サンプル由来の前記ＤＮＡ又はＲＮＡ
及び前記競合体を鋳型とする互いに異なるサイズの増幅
産物を得、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の増幅産物を電
気泳動分析にかけてサイズ分離し、その分離したバンド
の濃さと競合体の前記コピー数とに基づいてサンプル中
の前記ＤＮＡ又はＲＮＡのコピー数を決定する、ことを
包含する前記方法を提供する。
Ａ又はＲＮＡを競合ＰＣＲ法で定量する方法であって、
（ｉ）サンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡと、２種の、
予備決定されたコピー数の競合体であって、前記ＤＮＡ
又はＲＮＡと完全に又は部分的に相同性をもち且つ前記
ＤＮＡ又はＲＮＡに対応する配列の内部に部分的に欠失
又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ＤＮＡもしくは
前記ＲＮＡ及び前記競合体とアニーリング可能な第１の
センス及びアンチセンスプライマーとを同一容器内で第
１ＰＣＲにかけて前記ＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し、（ｉ
ｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物に、前記ＤＮＡ又はＲＮ
Ａ及びいずれの競合体ともアニーリング可能な１種の第
２のセンス又はアンチセンスプライマーと、このプライ
マーに対応しこれと異なる配列を有する２種の第２のア
ンチセンス又はセンスプライマーであって、各々が互い
に異なる競合体のみとアニーリング可能である前記第２
のアンチセンス又はセンスプライマーとを添加して競合
ＰＣＲ法にかけ、サンプル由来の前記ＤＮＡ又はＲＮＡ
及び前記競合体を鋳型とする互いに異なるサイズの増幅
産物を得、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の増幅産物を電
気泳動分析にかけてサイズ分離し、その分離したバンド
の濃さと競合体の前記コピー数とに基づいてサンプル中
の前記ＤＮＡ又はＲＮＡのコピー数を決定する、ことを
包含する前記方法を提供する。
【００１３】また、サンプル中の前記ＲＮＡが、ＰＣＲ
にかける前に予め逆転写酵素の作用によってｃＤＮＡに
変換されることを特徴とする上記記載の方法に関する。
にかける前に予め逆転写酵素の作用によってｃＤＮＡに
変換されることを特徴とする上記記載の方法に関する。
【００１４】本発明は第４に、サンプル中の微量のＣ型
肝炎ウイルスＲＮＡを競合ＰＣＲ法で定量する方法であ
って、（ｉ）サンプル中の前記ＲＮＡを予め逆転写酵素
により変換して得たｃＤＮＡと、２種の、予備決定され
たコピー数の競合体であって、前記ｃＤＮＡと完全に又
は部分的に相同性をもち且つ前記ＲＮＡに対応する配列
の内部に部分的に欠失又は挿入又は変異をもつ競合体
と、前記ｃＤＮＡ及び前記競合体とアニーリング可能な
第１のセンス及びアンチセンスプライマーとを同一容器
内で第１ＰＣＲにかけて前記ｃＤＮＡを増幅し、（ｉ
ｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物に、前記ｃＤＮＡ及びい
ずれの競合体ともアニーリング可能な１種の第２のアン
チセンスプライマーと、このプライマーと異なる配列を
有する２種の第２のセンスプライマーであって、各々が
互いに異なる競合体のみとアニーリング可能である前記
第２のセンスプライマーとを添加して競合ＰＣＲ法にか
け、サンプル由来の前記ｃＤＮＡ及び前記競合体を鋳型
とする互いに異なるサイズの増幅産物を得、（ｉｉｉ）
ステップ（ｉｉ）の増幅産物を電気泳動分析にかけてサ
イズ分離し、その分離したバンドの濃さと競合体の前記
コピー数とに基づいてサンプル中の前記ＲＮＡのコピー
数を決定する、ことを包含する前記方法を提供する。
肝炎ウイルスＲＮＡを競合ＰＣＲ法で定量する方法であ
って、（ｉ）サンプル中の前記ＲＮＡを予め逆転写酵素
により変換して得たｃＤＮＡと、２種の、予備決定され
たコピー数の競合体であって、前記ｃＤＮＡと完全に又
は部分的に相同性をもち且つ前記ＲＮＡに対応する配列
の内部に部分的に欠失又は挿入又は変異をもつ競合体
と、前記ｃＤＮＡ及び前記競合体とアニーリング可能な
第１のセンス及びアンチセンスプライマーとを同一容器
内で第１ＰＣＲにかけて前記ｃＤＮＡを増幅し、（ｉ
ｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物に、前記ｃＤＮＡ及びい
ずれの競合体ともアニーリング可能な１種の第２のアン
チセンスプライマーと、このプライマーと異なる配列を
有する２種の第２のセンスプライマーであって、各々が
互いに異なる競合体のみとアニーリング可能である前記
第２のセンスプライマーとを添加して競合ＰＣＲ法にか
け、サンプル由来の前記ｃＤＮＡ及び前記競合体を鋳型
とする互いに異なるサイズの増幅産物を得、（ｉｉｉ）
ステップ（ｉｉ）の増幅産物を電気泳動分析にかけてサ
イズ分離し、その分離したバンドの濃さと競合体の前記
コピー数とに基づいてサンプル中の前記ＲＮＡのコピー
数を決定する、ことを包含する前記方法を提供する。
【００１５】また、前記２種の競合体がそれぞれ配列番
号１及び配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有
し、前記第１のセンスプライマーが５’−ＣＣＴＧＴＧ
ＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣ−３’であり、前記第１の
アンチセンスプライマーが５’−ＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧ
ＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ−３’であり、前記第２のアンチ
センスプライマーが５’−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣ
ＴＡＧＣＡＧＴ−３’であり、並びに前記第２のセンス
プライマーが５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴ
ＣＴＡＧ−３’及び５’−ＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣ
ＴＧＣＧＧＡＡＣＣ−３’であることを特徴とする上記
記載の方法に関する。
号１及び配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有
し、前記第１のセンスプライマーが５’−ＣＣＴＧＴＧ
ＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣ−３’であり、前記第１の
アンチセンスプライマーが５’−ＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧ
ＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ−３’であり、前記第２のアンチ
センスプライマーが５’−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣ
ＴＡＧＣＡＧＴ−３’であり、並びに前記第２のセンス
プライマーが５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴ
ＣＴＡＧ−３’及び５’−ＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣ
ＴＧＣＧＧＡＡＣＣ−３’であることを特徴とする上記
記載の方法に関する。
【００１６】本発明の競合ＰＣＲ法は、少なくとも２種
類の競合体と、いずれの競合体ともアニーリング可能な
１種類のセンス又はアンチセンスプライマー及び、競合
体の種類と同数で互いに異なる競合体１種類のみとアニ
ーリング可能である対応のアンチセンス又はセンスプラ
イマーとを用いて増幅反応を行なうことを特徴としてい
る。
類の競合体と、いずれの競合体ともアニーリング可能な
１種類のセンス又はアンチセンスプライマー及び、競合
体の種類と同数で互いに異なる競合体１種類のみとアニ
ーリング可能である対応のアンチセンス又はセンスプラ
イマーとを用いて増幅反応を行なうことを特徴としてい
る。
【００１７】本明細書中、「競合体」なる用語は、測定
しようとするサンプルすなわち検体（例えば全血液、血
漿、血清、脳脊髄液、組織、臓器など）中に含有すると
推定されるウイルス、細菌等に由来するＤＮＡ又はＲＮ
Ａと完全に又は部分的に相同性をもち且つそのＤＮＡ又
はＲＮＡに対応する配列の内部に任意の部位に部分的に
欠失又は挿入又は変異を有している、予めコピー数の分
かっている標準物質を指す。また競合体に用いるもの
は、合成ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡでもＤＮＡ断片でも
可能である。さらに競合体のＤＮＡ、ＲＮＡは、プライ
マー結合部分さえ本来の遺伝子と相同性があればその他
の部分に別の遺伝子が入っていてもかまわない。競合体
には欠失や変異又は挿入を入れなければならないが、あ
るいは欠失部分をプライマーとハイブリダイズしない配
列に置き換えてＰＣＲで増幅されないようにすることも
可能である。
しようとするサンプルすなわち検体（例えば全血液、血
漿、血清、脳脊髄液、組織、臓器など）中に含有すると
推定されるウイルス、細菌等に由来するＤＮＡ又はＲＮ
Ａと完全に又は部分的に相同性をもち且つそのＤＮＡ又
はＲＮＡに対応する配列の内部に任意の部位に部分的に
欠失又は挿入又は変異を有している、予めコピー数の分
かっている標準物質を指す。また競合体に用いるもの
は、合成ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡでもＤＮＡ断片でも
可能である。さらに競合体のＤＮＡ、ＲＮＡは、プライ
マー結合部分さえ本来の遺伝子と相同性があればその他
の部分に別の遺伝子が入っていてもかまわない。競合体
には欠失や変異又は挿入を入れなければならないが、あ
るいは欠失部分をプライマーとハイブリダイズしない配
列に置き換えてＰＣＲで増幅されないようにすることも
可能である。
【００１８】「部分的に相同性をもち」とは、センス又
はアンチセンスプライマーが少なくとも結合可能な程度
に相同性を有していればよいことを意味している。
はアンチセンスプライマーが少なくとも結合可能な程度
に相同性を有していればよいことを意味している。
【００１９】「欠失又は挿入又は変異」については、セ
ンス又はアンチセンスプライマーが競合体１種類とのみ
アニールし、他の競合体とアニールしないように競合体
の配列内部に適切に欠失、挿入または変異が導入される
必要がある。ここで、「欠失」とはヌクレオチド配列の
部分的欠損を意味し、「挿入」とは外来配列の付加を意
味し、また「変異」とはヌクレオチドの置換、付加、欠
失、修飾等の部分的変性を意味する。これらの欠失、挿
入又は変異部位には、したがってプライマーによるアニ
ーリングが不可能である。このように人為的変異を導入
することによって、各競合体間で結果的に増幅領域が異
なることとなり、したがって電気泳動上検出されるバン
ドのサイズが異なるために各競合体の識別が容易とな
る。
ンス又はアンチセンスプライマーが競合体１種類とのみ
アニールし、他の競合体とアニールしないように競合体
の配列内部に適切に欠失、挿入または変異が導入される
必要がある。ここで、「欠失」とはヌクレオチド配列の
部分的欠損を意味し、「挿入」とは外来配列の付加を意
味し、また「変異」とはヌクレオチドの置換、付加、欠
失、修飾等の部分的変性を意味する。これらの欠失、挿
入又は変異部位には、したがってプライマーによるアニ
ーリングが不可能である。このように人為的変異を導入
することによって、各競合体間で結果的に増幅領域が異
なることとなり、したがって電気泳動上検出されるバン
ドのサイズが異なるために各競合体の識別が容易とな
る。
【００２０】定量の対象となる核酸の種類としては、こ
れらに限定されないが、例えばＨＩＶ（ヒト免疫不全ウ
イルス）ＲＮＡ（Gonda,M.A., M.J.Braun, J.E.Clement
s, J.M.Pyper, F.Wong-Staal, R.C.Gallo, and R.V.Gil
den. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83:4007-401
1; Wain-Hobson,S., P.Sonigo, O.Danos, S.Cole, and
M.Alizon. Cell, 1985, 40:9-17.）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎
ウイルス）ＤＮＡ（Kaneko,S., R.H.Miller, S.M.Feins
tone, M.Unoura, K.Kobayashi, N.Hattori, and R.H.Pu
rcell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:312-31
6 ）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）ＲＮＡ（Takamizaw
a,A.C. Mori,I. Fuke,S. Manabe,S. Murakami,J. Fujit
a.E. Onishi,T. Andoh,I. Yoshida, and H.Okayama,
J.Virol.,1991, 65:1105-1113. ）、ＨＤＶ（Ｄ型肝炎
ウイルス）ＤＮＡ、ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞白血病ウイル
ス）ＲＮＡ（Bhagavati,S., et al. N.Engl. J. Med 19
88,318:1141-1147.）、単純ヘルペスウイルスＤＮＡ、
サイトメガロウイルスＤＮＡ（Demmler,G.J., G.J.Buff
one, C.M.Schimmbor, and R.A May. J. Infect. Dis.19
88. 158:1177-1184. ）、パルボウイルスＤＮＡ、ヒト
パピローマウイルスＨＰＶ ＤＮＡ（Cole,S.T., and
O.Danos. J. Mol. Biol. 1987, 193:599-603.）、ロタ
ウイルスＤＮＡ、日本脳炎ウイルスＲＮＡ、コクサッキ
ーＡ、Ｂウイルス核酸（N.Iizuka, S. Kuga, and A.Nom
oto. Virology, 1987. 156:64-73. ）、ポリオウイルス
ＲＮＡ、アデノウイルスＤＮＡ、水痘ウイルス核酸、帯
状ヘルペスウイルス核酸、結核菌ＤＮＡ、クラミジアト
ラコマチィスＤＮＡ、淋菌ＤＮＡ、ＭＲＳＡ ＤＮＡな
どが挙げられる。
れらに限定されないが、例えばＨＩＶ（ヒト免疫不全ウ
イルス）ＲＮＡ（Gonda,M.A., M.J.Braun, J.E.Clement
s, J.M.Pyper, F.Wong-Staal, R.C.Gallo, and R.V.Gil
den. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83:4007-401
1; Wain-Hobson,S., P.Sonigo, O.Danos, S.Cole, and
M.Alizon. Cell, 1985, 40:9-17.）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎
ウイルス）ＤＮＡ（Kaneko,S., R.H.Miller, S.M.Feins
tone, M.Unoura, K.Kobayashi, N.Hattori, and R.H.Pu
rcell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:312-31
6 ）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）ＲＮＡ（Takamizaw
a,A.C. Mori,I. Fuke,S. Manabe,S. Murakami,J. Fujit
a.E. Onishi,T. Andoh,I. Yoshida, and H.Okayama,
J.Virol.,1991, 65:1105-1113. ）、ＨＤＶ（Ｄ型肝炎
ウイルス）ＤＮＡ、ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞白血病ウイル
ス）ＲＮＡ（Bhagavati,S., et al. N.Engl. J. Med 19
88,318:1141-1147.）、単純ヘルペスウイルスＤＮＡ、
サイトメガロウイルスＤＮＡ（Demmler,G.J., G.J.Buff
one, C.M.Schimmbor, and R.A May. J. Infect. Dis.19
88. 158:1177-1184. ）、パルボウイルスＤＮＡ、ヒト
パピローマウイルスＨＰＶ ＤＮＡ（Cole,S.T., and
O.Danos. J. Mol. Biol. 1987, 193:599-603.）、ロタ
ウイルスＤＮＡ、日本脳炎ウイルスＲＮＡ、コクサッキ
ーＡ、Ｂウイルス核酸（N.Iizuka, S. Kuga, and A.Nom
oto. Virology, 1987. 156:64-73. ）、ポリオウイルス
ＲＮＡ、アデノウイルスＤＮＡ、水痘ウイルス核酸、帯
状ヘルペスウイルス核酸、結核菌ＤＮＡ、クラミジアト
ラコマチィスＤＮＡ、淋菌ＤＮＡ、ＭＲＳＡ ＤＮＡな
どが挙げられる。
【００２１】競合体の調製に際しては、ＤＮＡを競合体
として用いる場合は、直鎖状のＤＮＡ断片でも環状のプ
ラスミドやコスミドのようなものでも可能である。ＤＮ
Ａ断片は一般的なＤＮＡ合成でも作製可能である。また
ＰＣＲにより容易に増幅、調製可能である（詳しくは、
Michael A. Innisら、「PCR Protocols 」、AcademicPr
ess, Inc., （1990年）； Henry A. Erlich，「ＰＣＲ
テクノロジー」、宝酒造（1990年）に記載されてい
る）。また、これらのＤＮＡに欠失、挿入、変異を導入
する方法はＰＣＲによるものが容易である（前記の「PC
R protocols 」，「ＰＣＲテクノロジー」参照）。その
他の方法については、例えば「Molecular Cloning 」Co
ld Spring Harbor Laboratory Press （1989年）に詳し
く記載されている。当業者はここに示された文献類を参
照するならば公知の核酸配列又は、遺伝子工学分野で一
般的なＤＮＡ配列決定手順（前記「Malecular Cloning
」Section 13: DNA Sequencing参照）に従って決定さ
れた核酸配列をベースとして容易に目的の競合体を作製
することが可能であろう。さらに、ＲＮＡを競合体とし
て用いる場合には、ＤＮＡの場合と同様に合成機を用い
てＲＮＡを直接合成してもよいし、あるいはＤＮＡより
プロモーターによっても合成可能である。化学合成の詳
しいプロトコールは後藤俊夫ら、「有機化学実験のてび
き［３］、［４］」化学同人（1990年）に、またＤＮＡ
よりの合成方法は前掲の「Molecular Cloning 」等に詳
しく示されており、これらの文献を参照するならば容易
に実施可能である。
として用いる場合は、直鎖状のＤＮＡ断片でも環状のプ
ラスミドやコスミドのようなものでも可能である。ＤＮ
Ａ断片は一般的なＤＮＡ合成でも作製可能である。また
ＰＣＲにより容易に増幅、調製可能である（詳しくは、
Michael A. Innisら、「PCR Protocols 」、AcademicPr
ess, Inc., （1990年）； Henry A. Erlich，「ＰＣＲ
テクノロジー」、宝酒造（1990年）に記載されてい
る）。また、これらのＤＮＡに欠失、挿入、変異を導入
する方法はＰＣＲによるものが容易である（前記の「PC
R protocols 」，「ＰＣＲテクノロジー」参照）。その
他の方法については、例えば「Molecular Cloning 」Co
ld Spring Harbor Laboratory Press （1989年）に詳し
く記載されている。当業者はここに示された文献類を参
照するならば公知の核酸配列又は、遺伝子工学分野で一
般的なＤＮＡ配列決定手順（前記「Malecular Cloning
」Section 13: DNA Sequencing参照）に従って決定さ
れた核酸配列をベースとして容易に目的の競合体を作製
することが可能であろう。さらに、ＲＮＡを競合体とし
て用いる場合には、ＤＮＡの場合と同様に合成機を用い
てＲＮＡを直接合成してもよいし、あるいはＤＮＡより
プロモーターによっても合成可能である。化学合成の詳
しいプロトコールは後藤俊夫ら、「有機化学実験のてび
き［３］、［４］」化学同人（1990年）に、またＤＮＡ
よりの合成方法は前掲の「Molecular Cloning 」等に詳
しく示されており、これらの文献を参照するならば容易
に実施可能である。
【００２２】ＰＣＲに用いるプライマーの長さは増幅さ
せるＤＮＡ又はＲＮＡと結合可能な長さであればよい
が、一般に１５〜４０塩基のもの、好ましくは２０〜３
０塩基のものが使用される。またプライマーの合成はマ
ニュアルでも合成機を用いる方法でも可能であるが、合
成方法は前述の「有機化学実験のてびき［３］、
［４］」に詳しく示されている。プライマーは、サンプ
ルのＲＮＡ又はＤＮＡと配列が同じ方が望ましいが、全
く同一でなくても使用可能である。
せるＤＮＡ又はＲＮＡと結合可能な長さであればよい
が、一般に１５〜４０塩基のもの、好ましくは２０〜３
０塩基のものが使用される。またプライマーの合成はマ
ニュアルでも合成機を用いる方法でも可能であるが、合
成方法は前述の「有機化学実験のてびき［３］、
［４］」に詳しく示されている。プライマーは、サンプ
ルのＲＮＡ又はＤＮＡと配列が同じ方が望ましいが、全
く同一でなくても使用可能である。
【００２３】ＰＣＲの手法については、前掲の「ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」や「ＰＣＲテクノロジー」に詳
細に記載されており、それらを参照して実施可能であ
る。一般に、ＰＣＲサイクルは約９４℃で変性（ｄｅｎ
ａｔｕｒａｔｉｏｎ）すなわち２本鎖を１本鎖に解離す
る段階と、約５５℃でアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎ
ｇ）すなわち鋳型核酸にプライマーを結合する段階と、
約７２℃で伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）すなわち鋳型に
沿ってプライマーを伸長し相補鎖を合成する段階とから
成り、これを１サイクルとして数サイクル以上、通常２
０サイクル以上繰り返し、必要に応じてその後約７２℃
で追加反応する。
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」や「ＰＣＲテクノロジー」に詳
細に記載されており、それらを参照して実施可能であ
る。一般に、ＰＣＲサイクルは約９４℃で変性（ｄｅｎ
ａｔｕｒａｔｉｏｎ）すなわち２本鎖を１本鎖に解離す
る段階と、約５５℃でアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎ
ｇ）すなわち鋳型核酸にプライマーを結合する段階と、
約７２℃で伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）すなわち鋳型に
沿ってプライマーを伸長し相補鎖を合成する段階とから
成り、これを１サイクルとして数サイクル以上、通常２
０サイクル以上繰り返し、必要に応じてその後約７２℃
で追加反応する。
【００２４】検出すべき核酸がＲＮＡの場合には、ＰＣ
Ｒに先立って逆転写酵素の作用下にｃＤＮＡに変換して
もよい（前掲の「Molecular Cloning 」参照のこと）。
逆転写酵素としては、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（Ａ
ＭＶ）由来ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、マウスレ
トロウイルス由来（ＭＭＬＶ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メラーゼなどを例示することができる。
Ｒに先立って逆転写酵素の作用下にｃＤＮＡに変換して
もよい（前掲の「Molecular Cloning 」参照のこと）。
逆転写酵素としては、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（Ａ
ＭＶ）由来ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、マウスレ
トロウイルス由来（ＭＭＬＶ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メラーゼなどを例示することができる。
【００２５】サンプル中の核酸が（極）微量の場合に
は、第１ＰＣＲにかけて該核酸を一旦増幅するのが望ま
しく、また、この第１ＰＣＲ時に競合体を共存させても
よく、あるいは増幅終了時に競合体を第２プライマーと
共に後添加してもよい。好ましくは、第１ＰＣＲ時に競
合体を共存させておくのがよい。
は、第１ＰＣＲにかけて該核酸を一旦増幅するのが望ま
しく、また、この第１ＰＣＲ時に競合体を共存させても
よく、あるいは増幅終了時に競合体を第２プライマーと
共に後添加してもよい。好ましくは、第１ＰＣＲ時に競
合体を共存させておくのがよい。
【００２６】サンプル中の微量のＤＮＡ又はＲＮＡを競
合ＰＣＲ法で定量する場合には、本発明方法は、（ｉ）
サンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡと、少なくとも２種
の、予備決定されたコピー数の競合体であって、前記Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡと完全に又は部分的に相同性をもち且つ
前記ＤＮＡ又はＲＮＡに対応する配列の内部に部分的に
欠失又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ＤＮＡもし
くは前記ＲＮＡ及び前記競合体とアニーリング可能な第
１のセンス及びアンチセンスプライマーとを同一容器内
で第１ＰＣＲにかけて前記ＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物に、前記ＤＮＡ又は
ＲＮＡ及びいずれの競合体ともアニーリング可能な１種
の第２のセンス又はアンチセンスプライマーと、このプ
ライマーに対応しこれと異なる配列を有し且つ前記競合
体と同数の第２のアンチセンス又はセンスプライマーで
あって、各々が互いに異なる競合体１種のみとアニーリ
ング可能である前記第２のアンチセンス又はセンスプラ
イマーとを添加して競合ＰＣＲ法にかけ、サンプル由来
の前記ＤＮＡ又はＲＮＡ及び前記競合体を鋳型とする互
いに異なるサイズの増幅産物を得、（ｉｉｉ）ステップ
（ｉｉ）の増幅産物を電気泳動分析にかけてサイズ分離
し、その分離したバンドの濃さと競合体の前記コピー数
とに基づいてサンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡのコピ
ー数を決定する、ことを包含する。
合ＰＣＲ法で定量する場合には、本発明方法は、（ｉ）
サンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡと、少なくとも２種
の、予備決定されたコピー数の競合体であって、前記Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡと完全に又は部分的に相同性をもち且つ
前記ＤＮＡ又はＲＮＡに対応する配列の内部に部分的に
欠失又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ＤＮＡもし
くは前記ＲＮＡ及び前記競合体とアニーリング可能な第
１のセンス及びアンチセンスプライマーとを同一容器内
で第１ＰＣＲにかけて前記ＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物に、前記ＤＮＡ又は
ＲＮＡ及びいずれの競合体ともアニーリング可能な１種
の第２のセンス又はアンチセンスプライマーと、このプ
ライマーに対応しこれと異なる配列を有し且つ前記競合
体と同数の第２のアンチセンス又はセンスプライマーで
あって、各々が互いに異なる競合体１種のみとアニーリ
ング可能である前記第２のアンチセンス又はセンスプラ
イマーとを添加して競合ＰＣＲ法にかけ、サンプル由来
の前記ＤＮＡ又はＲＮＡ及び前記競合体を鋳型とする互
いに異なるサイズの増幅産物を得、（ｉｉｉ）ステップ
（ｉｉ）の増幅産物を電気泳動分析にかけてサイズ分離
し、その分離したバンドの濃さと競合体の前記コピー数
とに基づいてサンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡのコピ
ー数を決定する、ことを包含する。
【００２７】この方法の最も簡便な例として、２種類の
競合体を使用する方法を挙げることができ、これもまた
本願発明の範囲に包含される。その具体例として、後述
の実施例に示されるとおりのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）ＲＮＡの定量法が挙げられる。すなわち、その実施
態様により、サンプル中の微量のＣ型肝炎ウイルスＲＮ
Ａを競合ＰＣＲ法で定量する方法は、（ｉ）サンプル中
の前記ＲＮＡを予め逆転写酵素により変換して得たｃＤ
ＮＡと、２種の、予備決定されたコピー数の競合体であ
って、前記ｃＤＮＡと完全に又は部分的に相同性をもち
且つ前記ＲＮＡに対応する配列の内部に部分的に欠失又
は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ｃＤＮＡ及び前記
競合体とアニーリング可能な第１のセンス及びアンチセ
ンスプライマーとを同一容器内で第１ＰＣＲにかけて前
記ｃＤＮＡを増幅し、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の増幅産
物に、前記ｃＤＮＡ及びいずれの競合体ともアニーリン
グ可能な１種の第２のアンチセンスプライマーと、この
プライマーと異なる配列を有する２種の第２のセンスプ
ライマーであって、各々が互いに異なる競合体のみとア
ニーリング可能である前記第２のセンスプライマーとを
添加して競合ＰＣＲ法にかけ、サンプル由来の前記ｃＤ
ＮＡ及び前記競合体を鋳型とする互いに異なるサイズの
増幅産物を得、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の増幅産物
を電気泳動分析にかけてサイズ分離し、その分離したバ
ンドの濃さと競合体の前記コピー数とに基づいてサンプ
ル中の前記ＲＮＡのコピー数を決定する、ことを包含す
る。
競合体を使用する方法を挙げることができ、これもまた
本願発明の範囲に包含される。その具体例として、後述
の実施例に示されるとおりのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）ＲＮＡの定量法が挙げられる。すなわち、その実施
態様により、サンプル中の微量のＣ型肝炎ウイルスＲＮ
Ａを競合ＰＣＲ法で定量する方法は、（ｉ）サンプル中
の前記ＲＮＡを予め逆転写酵素により変換して得たｃＤ
ＮＡと、２種の、予備決定されたコピー数の競合体であ
って、前記ｃＤＮＡと完全に又は部分的に相同性をもち
且つ前記ＲＮＡに対応する配列の内部に部分的に欠失又
は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ｃＤＮＡ及び前記
競合体とアニーリング可能な第１のセンス及びアンチセ
ンスプライマーとを同一容器内で第１ＰＣＲにかけて前
記ｃＤＮＡを増幅し、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の増幅産
物に、前記ｃＤＮＡ及びいずれの競合体ともアニーリン
グ可能な１種の第２のアンチセンスプライマーと、この
プライマーと異なる配列を有する２種の第２のセンスプ
ライマーであって、各々が互いに異なる競合体のみとア
ニーリング可能である前記第２のセンスプライマーとを
添加して競合ＰＣＲ法にかけ、サンプル由来の前記ｃＤ
ＮＡ及び前記競合体を鋳型とする互いに異なるサイズの
増幅産物を得、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の増幅産物
を電気泳動分析にかけてサイズ分離し、その分離したバ
ンドの濃さと競合体の前記コピー数とに基づいてサンプ
ル中の前記ＲＮＡのコピー数を決定する、ことを包含す
る。
【００２８】ここで、使用可能な２種の競合体の具体例
は配列番号１（ＰＫ９）及び配列番号２（ＰＫ１１）に
示されるヌクレオチド配列を有し、また第１のセンスプ
ライマーが５’−ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧ
ＴＣ−３’（ＴＭ１）であり、第１のアンチセンスプラ
イマーが５’−ＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ
ＣＡ−３’（ＫＭ３）であり、第２のアンチセンスプラ
イマーが５’−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡ
ＧＴ−３’（ＭＵ８）であり、第２のセンスプライマー
が５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−
３’（ＭＵ９）及び５’−ＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣ
ＴＧＣＧＧＡＡＣＣ−３’（ＭＵ１１ａ）である。
は配列番号１（ＰＫ９）及び配列番号２（ＰＫ１１）に
示されるヌクレオチド配列を有し、また第１のセンスプ
ライマーが５’−ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧ
ＴＣ−３’（ＴＭ１）であり、第１のアンチセンスプラ
イマーが５’−ＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ
ＣＡ−３’（ＫＭ３）であり、第２のアンチセンスプラ
イマーが５’−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡ
ＧＴ−３’（ＭＵ８）であり、第２のセンスプライマー
が５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−
３’（ＭＵ９）及び５’−ＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣ
ＴＧＣＧＧＡＡＣＣ−３’（ＭＵ１１ａ）である。
【００２９】図１がこれらの競合体とプライマーとの関
係を模式的に示し、且つＰＣＲ結果を得られた増幅産物
のサイズで示したものである。
係を模式的に示し、且つＰＣＲ結果を得られた増幅産物
のサイズで示したものである。
【００３０】ｎａｔｉｖｅ ＲＮＡは２ｎｄ ＰＣＲ
で、ＭＵ９−ＭＵ８の組合せで２０３ｂｐのバンドが、
ＭＵ１１ａ−ＭＵ８の組合せで１３０ｂｐのバンドが増
幅される。一方競合体ＰＫ９はＭＵ１１ａ−ＭＵ８で１
１５ｂｐのバンドが増幅されるが、ＭＵ９部分を欠失し
ているためにＭＵ９−ＭＵ８では増幅されない。競合体
ＰＫ１１は逆にＭＵ９−ＭＵ８で１４７ｂｐのバンドが
増幅されるが、ＭＵ１１ａ−ＭＵ８ではＭＵ１１ａ部分
を欠失しているために増幅されない。このため競合体Ｐ
Ｋ９とｎａｔｉｖｅ ＲＮＡはＭＵ１１ａ−ＭＵ８で競
合し、ＰＫ１１とｎａｔｉｖｅ ＲＮＡはＭＵ９−ＭＵ
８で競合するため、１本のチューブ内で従来法の場合の
２本分の競合反応が行なえることになる。
で、ＭＵ９−ＭＵ８の組合せで２０３ｂｐのバンドが、
ＭＵ１１ａ−ＭＵ８の組合せで１３０ｂｐのバンドが増
幅される。一方競合体ＰＫ９はＭＵ１１ａ−ＭＵ８で１
１５ｂｐのバンドが増幅されるが、ＭＵ９部分を欠失し
ているためにＭＵ９−ＭＵ８では増幅されない。競合体
ＰＫ１１は逆にＭＵ９−ＭＵ８で１４７ｂｐのバンドが
増幅されるが、ＭＵ１１ａ−ＭＵ８ではＭＵ１１ａ部分
を欠失しているために増幅されない。このため競合体Ｐ
Ｋ９とｎａｔｉｖｅ ＲＮＡはＭＵ１１ａ−ＭＵ８で競
合し、ＰＫ１１とｎａｔｉｖｅ ＲＮＡはＭＵ９−ＭＵ
８で競合するため、１本のチューブ内で従来法の場合の
２本分の競合反応が行なえることになる。
【００３１】さらに本発明の方法は競合体の数を増や
し、プライマーの数を増やすことにより１本のチューブ
ですべての反応を行なうことが可能であるし、理論的に
は、すべての範囲の定量が可能である。競合体は通常１
〜１０7 コピー添加されるが、これに限定されない。ま
た、反応後のサンプルは希釈しても又は非希釈でもよ
く、希釈する場合には蒸留水や緩衝液等の溶媒で任意の
希釈系列に調製することができる。
し、プライマーの数を増やすことにより１本のチューブ
ですべての反応を行なうことが可能であるし、理論的に
は、すべての範囲の定量が可能である。競合体は通常１
〜１０7 コピー添加されるが、これに限定されない。ま
た、反応後のサンプルは希釈しても又は非希釈でもよ
く、希釈する場合には蒸留水や緩衝液等の溶媒で任意の
希釈系列に調製することができる。
【００３２】図２にＨＣＶの場合の１〜１０7 コピーま
で検出可能な競合体とプライマーの組合せの１例を示し
ている。図２において、サンプルの１０0 とは非希釈状
態を、また１０-1とは１０倍に希釈したことを示し、競
合体（ＰＫ９、ＰＫ１１）の１，１０2 ，１０3 ，１０
5 はともにコピー数を示す。チューブ１にはサンプルを
希釈せずに加え、ＰＫ９を１コピー（実施例では加え
ず）とＰＫ１１を１０2コピー加え、チューブ２にはサ
ンプルを１０倍希釈しＰＫ９を１０3 コピーとＰＫ１１
を１０5 コピー加えた。図の下はチューブ１とチューブ
２の増幅産物を電気泳動したときの模式図である。各泳
動像の左側のコピー数はサンプルのコピー数を示し、こ
のコピー数の場合の泳動像を模式化した。黒い泳動物が
競合体からの増幅産物、白い泳動物がサンプルからの泳
動物を示している。例えば１コピーの場合はチューブ１
のＰＫ９（ＭＵ１１ａ−ＭＵ８）１コピーとサンプル
（ＭＵ１１ａ−ＭＵ８）の増幅産物の量が同じためサン
プル中のコピー数は約１コピーと判定される。また１０
4 コピーの場合はチューブ２中のＰＫ９（ＭＵ１１ａ−
ＭＵ８）１０3 コピーと１０倍希釈されたサンプル（Ｍ
Ｕ１１ａ−ＭＵ８）の増幅産物の濃度が同じため１０3
×１０＝１０4 コピーと判定される。
で検出可能な競合体とプライマーの組合せの１例を示し
ている。図２において、サンプルの１０0 とは非希釈状
態を、また１０-1とは１０倍に希釈したことを示し、競
合体（ＰＫ９、ＰＫ１１）の１，１０2 ，１０3 ，１０
5 はともにコピー数を示す。チューブ１にはサンプルを
希釈せずに加え、ＰＫ９を１コピー（実施例では加え
ず）とＰＫ１１を１０2コピー加え、チューブ２にはサ
ンプルを１０倍希釈しＰＫ９を１０3 コピーとＰＫ１１
を１０5 コピー加えた。図の下はチューブ１とチューブ
２の増幅産物を電気泳動したときの模式図である。各泳
動像の左側のコピー数はサンプルのコピー数を示し、こ
のコピー数の場合の泳動像を模式化した。黒い泳動物が
競合体からの増幅産物、白い泳動物がサンプルからの泳
動物を示している。例えば１コピーの場合はチューブ１
のＰＫ９（ＭＵ１１ａ−ＭＵ８）１コピーとサンプル
（ＭＵ１１ａ−ＭＵ８）の増幅産物の量が同じためサン
プル中のコピー数は約１コピーと判定される。また１０
4 コピーの場合はチューブ２中のＰＫ９（ＭＵ１１ａ−
ＭＵ８）１０3 コピーと１０倍希釈されたサンプル（Ｍ
Ｕ１１ａ−ＭＵ８）の増幅産物の濃度が同じため１０3
×１０＝１０4 コピーと判定される。
【００３３】増幅産物の検出は、一般に電気泳動、特に
アガロースゲル電気泳動によって行なうのが望ましく、
例えば臭化エチジウム染色または、32Ｐ等で放射性標識
したプローブによるハイブリダイゼーション後オートラ
ジオグラフィーによってバンドを識別することができ
る。
アガロースゲル電気泳動によって行なうのが望ましく、
例えば臭化エチジウム染色または、32Ｐ等で放射性標識
したプローブによるハイブリダイゼーション後オートラ
ジオグラフィーによってバンドを識別することができ
る。
【００３４】下記の実施例により本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３５】
【実施例】実施例１ 競合体用遺伝子のクローニング 慢性期のＨＣＶ肝炎患者血漿よりＲＴ−ＰＣＲ法によ
り、ＨＣＶ遺伝子のクローニングを行なった。
り、ＨＣＶ遺伝子のクローニングを行なった。
【００３６】先ず、Ｃ型肝炎患者血漿１００μｌに６Ｍ
のＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオシアネート、３７．５
ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７５％ザルコシル、０．
２Ｍメルカプトエタノール）２００μｌと酵母のｔ−Ｒ
ＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）１μｌを加え撹拌する。更に３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μｌ、ＴＥ緩衝液
［１０mM Tris-HCl （pH 8.0）、１mM EDTA ］飽和フェ
ノール（ｐＨ７．５〜８．０）３０μｌ、クロロホルム
／イソアミルアルコール（４９：１）７０μｌを加え素
早く混合し、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分間静置
する。遠心機で１５０００rpm 、２０分間４℃で遠心す
る。水層を採り、等量のイソプロピルアルコールと混合
し−２０℃に１時間以上置く。これを１５０００rpm 、
２０分間４℃で遠心し、沈澱させる。沈殿物を４ＭのＧ
ＴＣ（６Ｍ ＧＴＣを滅菌水で希釈したもの）１００μ
ｌに溶解し、等量のイソプロピルアルコールと混合し、
−２０℃に１時間以上静置する。１５０００rpm 、２０
分間、４℃で遠心し沈殿物を得る。７０％エタノール１
ｍｌで洗浄後、室温で風乾し、１０μｌの滅菌水に溶解
しＲＮＡとして使用した。
のＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオシアネート、３７．５
ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７５％ザルコシル、０．
２Ｍメルカプトエタノール）２００μｌと酵母のｔ−Ｒ
ＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）１μｌを加え撹拌する。更に３
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μｌ、ＴＥ緩衝液
［１０mM Tris-HCl （pH 8.0）、１mM EDTA ］飽和フェ
ノール（ｐＨ７．５〜８．０）３０μｌ、クロロホルム
／イソアミルアルコール（４９：１）７０μｌを加え素
早く混合し、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分間静置
する。遠心機で１５０００rpm 、２０分間４℃で遠心す
る。水層を採り、等量のイソプロピルアルコールと混合
し−２０℃に１時間以上置く。これを１５０００rpm 、
２０分間４℃で遠心し、沈澱させる。沈殿物を４ＭのＧ
ＴＣ（６Ｍ ＧＴＣを滅菌水で希釈したもの）１００μ
ｌに溶解し、等量のイソプロピルアルコールと混合し、
−２０℃に１時間以上静置する。１５０００rpm 、２０
分間、４℃で遠心し沈殿物を得る。７０％エタノール１
ｍｌで洗浄後、室温で風乾し、１０μｌの滅菌水に溶解
しＲＮＡとして使用した。
【００３７】ｃＤＮＡ合成はＲＮＡ１０μｌをシリコン
処理チューブ（０．５ｍｌ）に分注した後、７０℃、３
分間加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅインヒビ
ター（宝酒造）１μｌ（５０単位／μｌ）、ｄＮＴＰｓ
（各２０ｍＭ）１μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ、５×ＲＴ
緩衝液（250mM Tris−HCl(pH8.5)、 375mM KCl、15mMMg
Cl2 ）４μｌ、ランダムオリゴヘキサマープライマー
（１００pmol／μｌ）１μｌ、逆転写酵素（ＢＲＬ）
（２００単位／μｌ）１μｌを加え、滅菌水で合計２０
μｌに合わせる。４２℃で２時間反応後、９４℃で５分
間加熱し酵素を失活させた。このｃＤＮＡを用いてＰＣ
Ｒを行なった。ＰＣＲは検出ＤＮＡの増幅感度と特異性
を上げる為に２ステップ法を用いた。即ち、先ず２種の
プライマーで１回目のＰＣＲをかける（１ｓｔ ｓｔｅ
ｐ ＰＣＲ）。次にそのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列の内側
に存在する２種のプライマーを用いて２回目のＰＣＲに
かける（ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）方法である。
処理チューブ（０．５ｍｌ）に分注した後、７０℃、３
分間加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅインヒビ
ター（宝酒造）１μｌ（５０単位／μｌ）、ｄＮＴＰｓ
（各２０ｍＭ）１μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ、５×ＲＴ
緩衝液（250mM Tris−HCl(pH8.5)、 375mM KCl、15mMMg
Cl2 ）４μｌ、ランダムオリゴヘキサマープライマー
（１００pmol／μｌ）１μｌ、逆転写酵素（ＢＲＬ）
（２００単位／μｌ）１μｌを加え、滅菌水で合計２０
μｌに合わせる。４２℃で２時間反応後、９４℃で５分
間加熱し酵素を失活させた。このｃＤＮＡを用いてＰＣ
Ｒを行なった。ＰＣＲは検出ＤＮＡの増幅感度と特異性
を上げる為に２ステップ法を用いた。即ち、先ず２種の
プライマーで１回目のＰＣＲをかける（１ｓｔ ｓｔｅ
ｐ ＰＣＲ）。次にそのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列の内側
に存在する２種のプライマーを用いて２回目のＰＣＲに
かける（ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）方法である。
【００３８】５’ＵＴＲ領域からＣＯＲＥの領域のＤＮ
Ａ産物を増幅させるために既報の配列（TAKAMIZAWA,A.,
et al, J. Virol., 1991, 65:1105-1113 ）を参考にし
てプライマーを合成した。１ｓｔ ＰＣＲに用いたプラ
イマーはＫＫ２８ ５’−ＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣ
ＡＴＡＧＡＴＣ−３’，ＫＫ２９ ５’−ＡＡＣＴＣＣ
ＡＣＣＡＡＣＧＡＴＣＴＧＡＣ−３’であり、２ｎｄ
ＰＣＲにはＫＫ２８５’−ＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣ
ＡＴＡＧＡＴＣ−３’，ＫＫ３１ ５’−ＣＣＧＧＧＡ
ＡＣＴＴＧＡＣＧＴＣＣＴＧＴ−３’を用いた。
Ａ産物を増幅させるために既報の配列（TAKAMIZAWA,A.,
et al, J. Virol., 1991, 65:1105-1113 ）を参考にし
てプライマーを合成した。１ｓｔ ＰＣＲに用いたプラ
イマーはＫＫ２８ ５’−ＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣ
ＡＴＡＧＡＴＣ−３’，ＫＫ２９ ５’−ＡＡＣＴＣＣ
ＡＣＣＡＡＣＧＡＴＣＴＧＡＣ−３’であり、２ｎｄ
ＰＣＲにはＫＫ２８５’−ＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣ
ＡＴＡＧＡＴＣ−３’，ＫＫ３１ ５’−ＣＣＧＧＧＡ
ＡＣＴＴＧＡＣＧＴＣＣＴＧＴ−３’を用いた。
【００３９】ＰＣＲの条件は、０．５ｍｌチューブ中に
上記ｃＤＮＡ合成反応液を２０μｌと１０×ＰＣＲ緩衝
液（100mM Tris-HCl (pH8.3)、500mM KCl 、15mM MgCl
2 、0.1% gelatine ）８μｌ、１st step プライマー２
種（各７５ pmole）、２mMｄＮＴＰｓ ８μｌを加え、
滅菌水で１００μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、
Ampli Taq(Perkin-Elmer-Cetus) １μｌ（５単位）を加
え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心する。ＰＣ
Ｒ反応は、変性９４℃１分間、アニーリング５５℃１分
間、伸長７２℃２分間の条件で３０サイクル行なった。
次に新しい０．５ｍｌチューブに１ｓｔ ＰＣＲ反応終
了液１０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液９μｌを加え、２nd
step プライマー２種（各７５ pmole）、１mM ｄＮＴ
Ｐｓ９μｌ、滅菌水で１００μｌとする。９４℃で１０
分間加熱し、Ampli Taq １μｌ（５単位）を加え撹拌
後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心し、先の条件で２
ｎｄ ＰＣＲを行なう。反応後、反応液１０μｌをアガ
ロースゲル電気泳動し、特異的に増幅されたＤＮＡ断片
を検出した。
上記ｃＤＮＡ合成反応液を２０μｌと１０×ＰＣＲ緩衝
液（100mM Tris-HCl (pH8.3)、500mM KCl 、15mM MgCl
2 、0.1% gelatine ）８μｌ、１st step プライマー２
種（各７５ pmole）、２mMｄＮＴＰｓ ８μｌを加え、
滅菌水で１００μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、
Ampli Taq(Perkin-Elmer-Cetus) １μｌ（５単位）を加
え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心する。ＰＣ
Ｒ反応は、変性９４℃１分間、アニーリング５５℃１分
間、伸長７２℃２分間の条件で３０サイクル行なった。
次に新しい０．５ｍｌチューブに１ｓｔ ＰＣＲ反応終
了液１０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液９μｌを加え、２nd
step プライマー２種（各７５ pmole）、１mM ｄＮＴ
Ｐｓ９μｌ、滅菌水で１００μｌとする。９４℃で１０
分間加熱し、Ampli Taq １μｌ（５単位）を加え撹拌
後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心し、先の条件で２
ｎｄ ＰＣＲを行なう。反応後、反応液１０μｌをアガ
ロースゲル電気泳動し、特異的に増幅されたＤＮＡ断片
を検出した。
【００４０】ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片ＰＫＩ５（約
４００ｂｐ）を低融点アガロース電気泳動により単離
し、滅菌水２００μｌを加え、６８℃１５分間ゲルを溶
解させた。ＴＥ緩衝液［10mM Tris-HCl (pH8.0) 、1mM
EDTA］飽和フェノールで２回抽出操作を行ない、ＤＮＡ
断片が溶解している水層をエタノール沈澱した。沈殿物
に１０×キナーゼ緩衝液（0.5M Tris-HCl pH7.6 、0.1M
MgCl2 、50mM DTT、１mMスペルミジン、1mM EDTA pH
8.0）２μｌ、 10mM ATP １μｌ、Ｔ４キナーゼ（宝酒
造）１μｌ（１０単位／μｌ）を加え滅菌水で２０μｌ
とし、３７℃１時間反応し、５’末端のリン酸化を行な
う。６８℃で１０分間加熱し、キナーゼを失活させた後
ｐＵＣ１８との連結反応を行なう。ｐＵＣ１８（１μ
ｇ）は制限酵素反応液２０μｌ［10mM Tris-HCl pH8.0
、7mM MgCl2 、20mM KCl、１０単位のＳｍａＩ酵素
（宝酒造）］中で３７℃で１時間反応し、６８℃で１０
分間加熱した後、滅菌水８０μｌを加え、ＳｍａＩクロ
ーニングベクターとする。リン酸化されたＤＮＡ断片１
０μｌとＳｍａＩベクター２μｌを１０×緩衝液（0.66
M Tris-HCl pH7.6、50mM MgCl2 、50mM DTT）２μｌ、
１０ｍＭ ＡＴＴ １μｌ、Ｔ４リガーゼ（宝酒造）１
μｌ（３５０単位／μｌ）、滅菌水４μｌを加え、２０
μｌとし、１６℃で一晩連結反応を行なった。
４００ｂｐ）を低融点アガロース電気泳動により単離
し、滅菌水２００μｌを加え、６８℃１５分間ゲルを溶
解させた。ＴＥ緩衝液［10mM Tris-HCl (pH8.0) 、1mM
EDTA］飽和フェノールで２回抽出操作を行ない、ＤＮＡ
断片が溶解している水層をエタノール沈澱した。沈殿物
に１０×キナーゼ緩衝液（0.5M Tris-HCl pH7.6 、0.1M
MgCl2 、50mM DTT、１mMスペルミジン、1mM EDTA pH
8.0）２μｌ、 10mM ATP １μｌ、Ｔ４キナーゼ（宝酒
造）１μｌ（１０単位／μｌ）を加え滅菌水で２０μｌ
とし、３７℃１時間反応し、５’末端のリン酸化を行な
う。６８℃で１０分間加熱し、キナーゼを失活させた後
ｐＵＣ１８との連結反応を行なう。ｐＵＣ１８（１μ
ｇ）は制限酵素反応液２０μｌ［10mM Tris-HCl pH8.0
、7mM MgCl2 、20mM KCl、１０単位のＳｍａＩ酵素
（宝酒造）］中で３７℃で１時間反応し、６８℃で１０
分間加熱した後、滅菌水８０μｌを加え、ＳｍａＩクロ
ーニングベクターとする。リン酸化されたＤＮＡ断片１
０μｌとＳｍａＩベクター２μｌを１０×緩衝液（0.66
M Tris-HCl pH7.6、50mM MgCl2 、50mM DTT）２μｌ、
１０ｍＭ ＡＴＴ １μｌ、Ｔ４リガーゼ（宝酒造）１
μｌ（３５０単位／μｌ）、滅菌水４μｌを加え、２０
μｌとし、１６℃で一晩連結反応を行なった。
【００４１】この反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ
１０９株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸
菌株は、Ｈａｎａｈａｎの方法［DNA cloning : A prac
tical approach, IRC Press (1985)］により作られる。
１０９株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸
菌株は、Ｈａｎａｈａｎの方法［DNA cloning : A prac
tical approach, IRC Press (1985)］により作られる。
【００４２】形質転換大腸菌２％ Ｘ−Ｇａｌ（５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド）５０μｌと１００ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｌが
塗布されたＬＢ−Ａｍｐプレート［１％トリプシン、
０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、１．５％寒
天、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）］上で３７℃一晩
培養した。プレート上に生じたコロニーの中で白色を呈
するコロニーを一白金耳取り、５０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エ
キス、０．５％ＮａＣｌ）に移し、一晩３７℃で振盪培
養した。１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、プラ
スミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、Molecular Cloning : A Laboratory
Manual, 1982 ）により行なった。得られたプラスミド
ＤＮＡ１μｇを反応液３０μｌ（100mM Tris-HCl pH7.
5、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、１０単位のＥcoＲＩ（宝
酒造）およびＨinｄIII （宝酒造）酵素）中で３７℃１
時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行なって挿入Ｄ
ＮＡ断片の大きさを計算する。約４００ｂｐの挿入ＤＮ
Ａ断片が検出されるクローンをＰＫＩ５と命名した。得
られたクローンをＳａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖終止法
［Sanger, F. Science, 214, 1205〜1210 (1981) ］を
用いて、挿入ＮＳ３ ＤＮＡ断片の塩基配列及びアミノ
酸配列を決定した。
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド）５０μｌと１００ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｌが
塗布されたＬＢ−Ａｍｐプレート［１％トリプシン、
０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、１．５％寒
天、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）］上で３７℃一晩
培養した。プレート上に生じたコロニーの中で白色を呈
するコロニーを一白金耳取り、５０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エ
キス、０．５％ＮａＣｌ）に移し、一晩３７℃で振盪培
養した。１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、プラ
スミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、Molecular Cloning : A Laboratory
Manual, 1982 ）により行なった。得られたプラスミド
ＤＮＡ１μｇを反応液３０μｌ（100mM Tris-HCl pH7.
5、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、１０単位のＥcoＲＩ（宝
酒造）およびＨinｄIII （宝酒造）酵素）中で３７℃１
時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行なって挿入Ｄ
ＮＡ断片の大きさを計算する。約４００ｂｐの挿入ＤＮ
Ａ断片が検出されるクローンをＰＫＩ５と命名した。得
られたクローンをＳａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖終止法
［Sanger, F. Science, 214, 1205〜1210 (1981) ］を
用いて、挿入ＮＳ３ ＤＮＡ断片の塩基配列及びアミノ
酸配列を決定した。
【００４３】また、得られたプラスミドＤＮＡをＰＫＩ
５と名付けた。
５と名付けた。
【００４４】実施例２ 競合体ＤＮＡ ＰＫＩ５／Ｄの構築 得られたプラスミドＰＫＩ５の５’ＵＴＲ領域に１５ｂ
ｐの欠失を導入するためＰＣＲ法を行なった。２本のプ
ライマー、ＢＡ２ ５’−ＡＣＣＧＧＴＴＣＣＧＣＡＧ
ＡＣＣＡＣＴＡ−３’とＢＡ３ ５’−ＧＣＣＡＧＧＡ
ＣＧＡＣＣＧＧＧＴＣＣＴＴ−３’を用いて、１００ｐ
ｇのＰＫＩ５のＤＮＡを鋳型に５０pmolの上記プライマ
ー、１０×ＰＣＲ反応液（100mM Tris-HCl (pH8.3)、50
0mM KCl、 15mM MgCl2 、0.1% gelatine ）５μｌ、２m
M ｄＮＴＰｓ ５μｌを加え、滅菌水で５０μｌと
し、１．２５単位（０．２５μｌ）のTaq DNA polymera
se（宝酒造）を加え、ミネラルオイルを重層し、軽く遠
心した。ＰＣＲのサイクルは、９４℃１分、５５℃１．
５分、７２℃３分の条件で３０サイクル反応を行ない、
最後に７２℃７分間反応させた。反応液１０μｌをアガ
ロース電気泳動にかけ、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離
した。分離したＤＮＡをガラスパウダー法（Gene Clean
II 、BIO101社）により５０μｌのＴＥ溶液［10mM Tri
s-HCl(pH7.5)、1mM EDTA］に回収した。このＤＮＡ１０
μｌとｌｉｇａｔｉｏｎ Ａ液２５μｌとｌｉｇａｔｉ
ｏｎ Ｂ液５μｌ（ＤＮＡライゲーションキット、宝酒
造）を加え、良く混合した後１６℃、３時間反応を行な
わせた。得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いて、大腸菌
ＸＬＩ−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＨａｎ
ａｈａｎの方法（前掲）に従って形質転換させた。
ｐの欠失を導入するためＰＣＲ法を行なった。２本のプ
ライマー、ＢＡ２ ５’−ＡＣＣＧＧＴＴＣＣＧＣＡＧ
ＡＣＣＡＣＴＡ−３’とＢＡ３ ５’−ＧＣＣＡＧＧＡ
ＣＧＡＣＣＧＧＧＴＣＣＴＴ−３’を用いて、１００ｐ
ｇのＰＫＩ５のＤＮＡを鋳型に５０pmolの上記プライマ
ー、１０×ＰＣＲ反応液（100mM Tris-HCl (pH8.3)、50
0mM KCl、 15mM MgCl2 、0.1% gelatine ）５μｌ、２m
M ｄＮＴＰｓ ５μｌを加え、滅菌水で５０μｌと
し、１．２５単位（０．２５μｌ）のTaq DNA polymera
se（宝酒造）を加え、ミネラルオイルを重層し、軽く遠
心した。ＰＣＲのサイクルは、９４℃１分、５５℃１．
５分、７２℃３分の条件で３０サイクル反応を行ない、
最後に７２℃７分間反応させた。反応液１０μｌをアガ
ロース電気泳動にかけ、約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離
した。分離したＤＮＡをガラスパウダー法（Gene Clean
II 、BIO101社）により５０μｌのＴＥ溶液［10mM Tri
s-HCl(pH7.5)、1mM EDTA］に回収した。このＤＮＡ１０
μｌとｌｉｇａｔｉｏｎ Ａ液２５μｌとｌｉｇａｔｉ
ｏｎ Ｂ液５μｌ（ＤＮＡライゲーションキット、宝酒
造）を加え、良く混合した後１６℃、３時間反応を行な
わせた。得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いて、大腸菌
ＸＬＩ−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＨａｎ
ａｈａｎの方法（前掲）に従って形質転換させた。
【００４５】得られたクローンから、アルカリ−ＳＤＳ
法によりＤＮＡをミニプレパレーションし、このＤＮＡ
約１ngを用いＰＣＲを行なった。以下のプライマーＭＵ
９５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−
３’，ＭＵ１０ ５’−ＧＴＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡ
ＧＧＡＣＣＣ−３’を用い、１０×ＰＣＲ反応液５μ
ｌ、２mM ｄＮＴＰ ５μｌ、Taq DNA ポリメラーゼ
０．２５μｌ（１．２５単位）、ＭＵ９、ＭＵ１０のプ
ライマー各５０pmolに滅菌蒸留水を加え５０μｌとし反
応させた。ＰＣＲのサイクルは９４℃１分、５５℃１
分、７２℃１分で３０サイクル行なった。対照としてＰ
ＫＩ５のＤＮＡ１ngを用い、同じ反応を行なったとこ
ろ、ＰＫＩ５では１４４ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されて
きた。得られたクローンの中に約１２９ｂｐのＤＮＡ断
片が増幅されてくるものがあった。これをＰＫＩ５／Ｄ
と名付けた。
法によりＤＮＡをミニプレパレーションし、このＤＮＡ
約１ngを用いＰＣＲを行なった。以下のプライマーＭＵ
９５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−
３’，ＭＵ１０ ５’−ＧＴＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡ
ＧＧＡＣＣＣ−３’を用い、１０×ＰＣＲ反応液５μ
ｌ、２mM ｄＮＴＰ ５μｌ、Taq DNA ポリメラーゼ
０．２５μｌ（１．２５単位）、ＭＵ９、ＭＵ１０のプ
ライマー各５０pmolに滅菌蒸留水を加え５０μｌとし反
応させた。ＰＣＲのサイクルは９４℃１分、５５℃１
分、７２℃１分で３０サイクル行なった。対照としてＰ
ＫＩ５のＤＮＡ１ngを用い、同じ反応を行なったとこ
ろ、ＰＫＩ５では１４４ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されて
きた。得られたクローンの中に約１２９ｂｐのＤＮＡ断
片が増幅されてくるものがあった。これをＰＫＩ５／Ｄ
と名付けた。
【００４６】実施例３ 競合体ＤＮＡ ＰＫ９，ＰＫ１１の構築 さらに図１に示すような競合体ＤＮＡ ＰＫ９，ＰＫ１
１を得るためさらにＰＣＲを行なった。ＰＫ９の構築用
のプライマーはＢＡ５ ５’−ＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ
ＧＴＡＴＧＡＧＴＧ−３’とＢＡ４ ５’−ＧＡＣＡＧ
ＴＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＧＧＧ−３’である。ＰＫ１
１用のプライマーはＢＡ３ ５’−ＧＣＣＧＧＧＡＡＧ
ＡＣＴＧＧＧＴＣＣＴＴ−３’とＢＡ６ ５’−ＧＣＣ
ＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＡＣＧＡＣＡＣ−３’を用いた。
詳しいプロトコールはプライマー以外は実施例２と同様
である。形質転換後、プラークより大腸菌を培養し、プ
ラスミドＤＮＡをミニプレパレーションした。競合体Ｄ
ＮＡ ＰＫ９とＰＫ１１を得るため、プライマーＭＵ９
５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−
３’とＭＵ８ ５’−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡ
ＧＣＡＧＴ−３’の組合せとＭＵ１１ａ ５’−ＡＣＧ
ＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣ−３’とＭＵ
８の組合せでＰＣＲを行なった。ＰＫ９用は、ＭＵ１１
ａ−ＭＵ８の組合せで１１５ｂｐのＤＮＡ断片が増幅
し、ＭＵ９−ＭＵ８の組合せで増幅がかからないクロー
ンを選択し、ＰＫ９と名付けた（図１参照）。ＰＫ１１
用はＭＵ１１ａ−ＭＵ８の組合せで１４７ｂｐの増幅が
かからず、ＭＵ９−ＭＵ８で１４７ｂｐのＤＮＡ断片が
増幅されるクローンを選びＰＫ１１と名付けた（図１参
照）。
１を得るためさらにＰＣＲを行なった。ＰＫ９の構築用
のプライマーはＢＡ５ ５’−ＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ
ＧＴＡＴＧＡＧＴＧ−３’とＢＡ４ ５’−ＧＡＣＡＧ
ＴＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＧＧＧ−３’である。ＰＫ１
１用のプライマーはＢＡ３ ５’−ＧＣＣＧＧＧＡＡＧ
ＡＣＴＧＧＧＴＣＣＴＴ−３’とＢＡ６ ５’−ＧＣＣ
ＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＡＣＧＡＣＡＣ−３’を用いた。
詳しいプロトコールはプライマー以外は実施例２と同様
である。形質転換後、プラークより大腸菌を培養し、プ
ラスミドＤＮＡをミニプレパレーションした。競合体Ｄ
ＮＡ ＰＫ９とＰＫ１１を得るため、プライマーＭＵ９
５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−
３’とＭＵ８ ５’−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡ
ＧＣＡＧＴ−３’の組合せとＭＵ１１ａ ５’−ＡＣＧ
ＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣ−３’とＭＵ
８の組合せでＰＣＲを行なった。ＰＫ９用は、ＭＵ１１
ａ−ＭＵ８の組合せで１１５ｂｐのＤＮＡ断片が増幅
し、ＭＵ９−ＭＵ８の組合せで増幅がかからないクロー
ンを選択し、ＰＫ９と名付けた（図１参照）。ＰＫ１１
用はＭＵ１１ａ−ＭＵ８の組合せで１４７ｂｐの増幅が
かからず、ＭＵ９−ＭＵ８で１４７ｂｐのＤＮＡ断片が
増幅されるクローンを選びＰＫ１１と名付けた（図１参
照）。
【００４７】実施例４ ＰＫ９，ＰＫ１１を用いた競合法によるサンプルの測定 まず、得られたクローンＰＫ９，ＰＫ１１のＤＮＡの精
製を行なった。ＰＫ９およびＰＫ１１によって形質転換
されたＸＬ−１ｂｌｕｅをＬＢ培地５０ｍｌで１昼夜培
養し、菌体を得た。この菌体より、アルカリ−ＳＤＳ法
によるＤＮＡ抽出の変法であるＱＩＡＧＥＮ（フナコ
シ）のキットを用い、プロトコールに従い、ＤＮＡの精
製を行なった。
製を行なった。ＰＫ９およびＰＫ１１によって形質転換
されたＸＬ−１ｂｌｕｅをＬＢ培地５０ｍｌで１昼夜培
養し、菌体を得た。この菌体より、アルカリ−ＳＤＳ法
によるＤＮＡ抽出の変法であるＱＩＡＧＥＮ（フナコ
シ）のキットを用い、プロトコールに従い、ＤＮＡの精
製を行なった。
【００４８】得られた環状ＤＮＡ ＰＫ９およびＰＫ１
１ １０μｇをそれぞれ制限酵素ＥcoＲＩで消化した。
１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）５μｌ、ＤＮＡ １
０μｇ、ＥcoＲＩ（宝酒造）１００単位に滅菌水を加え
５０μｌとし、３７℃１時間加温した。この溶液をフェ
ノール／クロロホルム処理３回、クロロホルム処理１回
により蛋白を除去した。エタノール沈殿後滅菌蒸留水１
０μｌに溶解した。このＤＮＡ溶液濃度を分光光度計で
測定し、分子量とＯＤ値より分子数（又はコピー数）を
計算した。また、公知の配列決定法によりＰＫ９、ＰＫ
１１の配列を確定し、ＰＫ９及びＰＫ１１のヌクレオチ
ド配列をそれぞれ配列番号１、２として示した。各ヌク
レオチド配列中の星印（＊）は欠失を示す。
１ １０μｇをそれぞれ制限酵素ＥcoＲＩで消化した。
１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）５μｌ、ＤＮＡ １
０μｇ、ＥcoＲＩ（宝酒造）１００単位に滅菌水を加え
５０μｌとし、３７℃１時間加温した。この溶液をフェ
ノール／クロロホルム処理３回、クロロホルム処理１回
により蛋白を除去した。エタノール沈殿後滅菌蒸留水１
０μｌに溶解した。このＤＮＡ溶液濃度を分光光度計で
測定し、分子量とＯＤ値より分子数（又はコピー数）を
計算した。また、公知の配列決定法によりＰＫ９、ＰＫ
１１の配列を確定し、ＰＫ９及びＰＫ１１のヌクレオチ
ド配列をそれぞれ配列番号１、２として示した。各ヌク
レオチド配列中の星印（＊）は欠失を示す。
【００４９】このＰＫ９、ＰＫ１１のＤＮＡ溶液をキャ
リアとして１００μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ（ベーリンガー
マンハイム）が入った滅菌蒸留水で１０倍段階希釈し、
１コピー／１０μｌから１０倍ずつの希釈系列を得た。
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行なうことにより、この５’Ｕ
ＴＲ領域は１コピーまで検出可能なので、１ｓｔ ＰＣ
ＲにＭＵ７−ＭＵ８のプライマー、２ｎｄ ＰＣＲにＭ
Ｕ９−ＭＵ１０のプライマーを用い常法に従いＰＣＲを
行ない、１コピー／１０μｌ（０．５コピー／５μｌ）
のＤＮＡ（ＰＫ９，ＰＫ１１）が存在することを確認し
た。
リアとして１００μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ（ベーリンガー
マンハイム）が入った滅菌蒸留水で１０倍段階希釈し、
１コピー／１０μｌから１０倍ずつの希釈系列を得た。
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行なうことにより、この５’Ｕ
ＴＲ領域は１コピーまで検出可能なので、１ｓｔ ＰＣ
ＲにＭＵ７−ＭＵ８のプライマー、２ｎｄ ＰＣＲにＭ
Ｕ９−ＭＵ１０のプライマーを用い常法に従いＰＣＲを
行ない、１コピー／１０μｌ（０．５コピー／５μｌ）
のＤＮＡ（ＰＫ９，ＰＫ１１）が存在することを確認し
た。
【００５０】この希釈した競合体ＤＮＡを用いて、２チ
ューブでの定量を行なった。
ューブでの定量を行なった。
【００５１】ＨＣＶ患者血清１００μｌよりＲＮＡ抽出
用溶液ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いてＲＮＡ
を抽出するＩＳＯＧＥＮ ４００μｌにｔＲＮＡ（１０
ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ、２−メルカプトエタノール４μ
ｌ、クロロホルム８０μｌを加え、プロトコールに従い
ＲＮＡ抽出を行なう。イソプロパノールによる沈殿後、
７０％エタノールで４回洗浄し、室温風乾し、１０μｌ
の滅菌水に溶解し、ＲＮＡとして用いた。
用溶液ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いてＲＮＡ
を抽出するＩＳＯＧＥＮ ４００μｌにｔＲＮＡ（１０
ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ、２−メルカプトエタノール４μ
ｌ、クロロホルム８０μｌを加え、プロトコールに従い
ＲＮＡ抽出を行なう。イソプロパノールによる沈殿後、
７０％エタノールで４回洗浄し、室温風乾し、１０μｌ
の滅菌水に溶解し、ＲＮＡとして用いた。
【００５２】ｃＤＮＡ合成はＲＮＡ１０μｌをシリコン
処理したチューブに分注し、７０℃、３分間加熱し、氷
上で急冷する。次にＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造）
５０単位、２０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、５×ＲＴ緩衝
液（ＢＭＬ．ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅに添付）４μｌ、１
００ｍＭ ＤＴＴ ２μｌ、アンチセンスプライマーＫ
Ｍ３ １０pmol、ＭＭＬＶ逆転写酵素２００単位を加え
滅菌水で２０μｌにする。４２℃で３０分間保持する。
処理したチューブに分注し、７０℃、３分間加熱し、氷
上で急冷する。次にＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造）
５０単位、２０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、５×ＲＴ緩衝
液（ＢＭＬ．ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅに添付）４μｌ、１
００ｍＭ ＤＴＴ ２μｌ、アンチセンスプライマーＫ
Ｍ３ １０pmol、ＭＭＬＶ逆転写酵素２００単位を加え
滅菌水で２０μｌにする。４２℃で３０分間保持する。
【００５３】このｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行なう。図
２に示すように、１本目のチューブにｃＤＮＡを希釈せ
ずに１０μｌ加える。これにＰＫ９を１コピー、ＰＫ１
１を１０2 コピーとなるように加える。２本目のチュー
ブにはｃＤＮＡを１０倍希釈し１０μｌ加え、ＰＫ９を
１０3 コピー、ＰＫ１１を１０5 コピー加える。これに
１０×ＰＣＲ緩衝液４μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μ
ｌ、Taq DNA ポリメラーゼ 0.25μｌ（1.25単位）さら
にプライマーＴＭ１ １０pmol、ＫＭ３ １０pmolを加
え、滅菌水で５０μｌにする。ＰＣＲサイクルは９４℃
４分加熱後、９４℃１分、５１℃１分３０秒、７２℃１
分３０秒で２０サイクル行ない、最後に７２℃６分保温
する。
２に示すように、１本目のチューブにｃＤＮＡを希釈せ
ずに１０μｌ加える。これにＰＫ９を１コピー、ＰＫ１
１を１０2 コピーとなるように加える。２本目のチュー
ブにはｃＤＮＡを１０倍希釈し１０μｌ加え、ＰＫ９を
１０3 コピー、ＰＫ１１を１０5 コピー加える。これに
１０×ＰＣＲ緩衝液４μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μ
ｌ、Taq DNA ポリメラーゼ 0.25μｌ（1.25単位）さら
にプライマーＴＭ１ １０pmol、ＫＭ３ １０pmolを加
え、滅菌水で５０μｌにする。ＰＣＲサイクルは９４℃
４分加熱後、９４℃１分、５１℃１分３０秒、７２℃１
分３０秒で２０サイクル行ない、最後に７２℃６分保温
する。
【００５４】この１ｓｔ ＰＣＲ産物３μｌを用い２ｎ
ｄ ＰＣＲを行なう。１０×ＰＣＲ緩衝液３μｌ、２ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ ３μｌ、Taq DNA ポリメラーゼ 0.25μ
ｌ（2.5 単位）プライマーＭＵ９，ＭＵ１１ａ，ＭＵ８
をそれぞれ５０pmolずつ加える。さらに滅菌水を加え３
０μｌにする。ＰＣＲサイクルは９４℃４分加熱後、９
４℃５０秒、５５℃１分、７２℃１分１０秒で５３サイ
クル行なった。
ｄ ＰＣＲを行なう。１０×ＰＣＲ緩衝液３μｌ、２ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ ３μｌ、Taq DNA ポリメラーゼ 0.25μ
ｌ（2.5 単位）プライマーＭＵ９，ＭＵ１１ａ，ＭＵ８
をそれぞれ５０pmolずつ加える。さらに滅菌水を加え３
０μｌにする。ＰＣＲサイクルは９４℃４分加熱後、９
４℃５０秒、５５℃１分、７２℃１分１０秒で５３サイ
クル行なった。
【００５５】従来の競合法で１０4 〜１０5 コピーと判
定された検体をｃＤＮＡ合成後に１０倍段階希釈し、１
０0 希釈、１０-1希釈、１０-2希釈、１０-3希釈、１０
-4希釈、１０-5希釈し、上記のプロトコールを若干変更
して定量を行なった。変更点は１本目のチューブにＰＫ
９ １コピーを加えず、ＰＫ１１ １０2 コピーのみを
加えた点である。
定された検体をｃＤＮＡ合成後に１０倍段階希釈し、１
０0 希釈、１０-1希釈、１０-2希釈、１０-3希釈、１０
-4希釈、１０-5希釈し、上記のプロトコールを若干変更
して定量を行なった。変更点は１本目のチューブにＰＫ
９ １コピーを加えず、ＰＫ１１ １０2 コピーのみを
加えた点である。
【００５６】図３に写真を示すが、この写真で×１００
０００が０コピー、×１００００が１コピー、×１００
０が１０コピー、×１００が１０2 コピー、×１０が１
０3コピー、×１が１０4 コピーとなり良好な希釈直線
性が得られている。泳動像とコピー数の関係は図２に示
した通りである。
０００が０コピー、×１００００が１コピー、×１００
０が１０コピー、×１００が１０2 コピー、×１０が１
０3コピー、×１が１０4 コピーとなり良好な希釈直線
性が得られている。泳動像とコピー数の関係は図２に示
した通りである。
【００５７】
【発明の効果】本発明の特徴は、競合法とプライマーを
複数使用する点にある。このためにＰＣＲのチューブを
格別に減らすことが可能となった。例えば１０0 〜１０
7 コピー／ｍｌの範囲を測定する場合、１つの競合体と
２種のプライマー（センスとアンチセンスプライマー）
では基本的に８本のチューブが必要であった。これが２
つの競合体と３種のプライマー（１本のセンスと２本の
アンチセンスプライマーあるいは２本のセンスと１本の
アンチセンスプライマー）を用い、検体を希釈すること
によって２本のチューブに減らすことが可能である。さ
らに４つの競合体と５本のプライマーを用いることによ
り、１本のチューブに減らすことが可能である。
複数使用する点にある。このためにＰＣＲのチューブを
格別に減らすことが可能となった。例えば１０0 〜１０
7 コピー／ｍｌの範囲を測定する場合、１つの競合体と
２種のプライマー（センスとアンチセンスプライマー）
では基本的に８本のチューブが必要であった。これが２
つの競合体と３種のプライマー（１本のセンスと２本の
アンチセンスプライマーあるいは２本のセンスと１本の
アンチセンスプライマー）を用い、検体を希釈すること
によって２本のチューブに減らすことが可能である。さ
らに４つの競合体と５本のプライマーを用いることによ
り、１本のチューブに減らすことが可能である。
【００５８】このように、ＰＣＲ時のチューブ数が減ら
せることによって以下のような作用効果が得られる。
せることによって以下のような作用効果が得られる。
【００５９】（ａ）作業時間の短縮 ＰＣＲを行なう前のスタンダードの希釈、分注、検体の
希釈、分注等に掛かる時間が現在の方法の約１／２（チ
ューブ２本の場合）からほとんどなし（チューブ１本の
場合）まで短縮可能である。従来法では１２検体行なっ
た場合、準備も含めて約２時間程度かかる。
希釈、分注等に掛かる時間が現在の方法の約１／２（チ
ューブ２本の場合）からほとんどなし（チューブ１本の
場合）まで短縮可能である。従来法では１２検体行なっ
た場合、準備も含めて約２時間程度かかる。
【００６０】（ｂ）作業効率の向上 シータス社のＰＣＲの機械を使用した場合、一度に４８
本のチューブのＰＣＲができるので、従来法では１回の
ＰＣＲで、６検体（８本／１検体）の処理が可能である
のに対し、本発明の方法では、２本／１検体で定量する
と２４検体の処理が可能であり、また１本／１検体では
４８検体の処理が可能である。
本のチューブのＰＣＲができるので、従来法では１回の
ＰＣＲで、６検体（８本／１検体）の処理が可能である
のに対し、本発明の方法では、２本／１検体で定量する
と２４検体の処理が可能であり、また１本／１検体では
４８検体の処理が可能である。
【００６１】（ｃ）コストの削減 ＰＣＲでの費用で最もかかるものは耐熱性の酵素である
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼであるがチューブ８本を２
本に減らすことによりその費用は１／４、さらに１本に
減らすことにより１／８になる。さらにチューブが減る
ことによりそれに付随してチップ等の経費も減らすこと
ができる。労賃も含めて全体的に経費節減を可能にす
る。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼであるがチューブ８本を２
本に減らすことによりその費用は１／４、さらに１本に
減らすことにより１／８になる。さらにチューブが減る
ことによりそれに付随してチップ等の経費も減らすこと
ができる。労賃も含めて全体的に経費節減を可能にす
る。
【００６２】
配列番号：１ 配列の長さ：３６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 配列 GCGACACTCC ACCATAGATC ACTCCCCTGT GAGGAACTAC TGTC****** ********** 44 ****CCATGG CGTTAGTATG AGTGTCGTAC AGCCTCCAGG CCCCCCCCTC CCGGGAGAGC 100 CATAGTGGTC TGCGGAACCG GT******** *******GCC AGGACGACCG GGTCCTTTCT 145 TGGATTAACC CGCTCAATGC CTGGAGATTT GGGCGTGCCC CCGCGAGACT GCTAGCCGAG 205 TAGTGTTGGG TCGCAAAGGC CTTGTGGTAC TGCCTGATAG GGTGCTTGCG AGTGCCCCGG 265 GAGGTCTCGT AGACCGTGCA CCATGAGCAC GAATCCTAAA CCTCAAAGAA AAACCAAACG 325 TAACACCAAC CGCCGCCCAC AGGACGTCAA GTTCCCGG 363 配列番号：２ 配列の長さ：３４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 配列 GCGACACTCC ACCATAGATC ACTCCCCTGT GAGGAACTAC TGTCTTCACG CAGAAAGCGT 60 CTAGCCATGG CGTTAGTATG AGTGTCGTAC AGCCTCCAGG C********* ********** 101 ********** ********** ********** *******GCC AGGACGACCG GGTCCTTTCT 124 TGGATTAACC CGCTCAATGC CTGGAGATTT GGGCGTGCCC CCGCGAGACT GCTAGCCGAG 184 TAGTGTTGGG TCGCAAAGGC CTTGTGGTAC TGCCTGATAG GGTGCTTGCG AGTGCCCCGG 244 GAGGTCTCGT AGACCGTGCA CCATGAGCAC GAATCCTAAA CCTCAAAGAA AAACCAAACG 304 TAACACCAAC CGCCGCCCAC AGGACGTCAA GTTCCCGG 342
【図１】この図は、競合ＰＣＲ法によるＨＣＶ ＲＮＡ
の定量法に使用される２つの競合体と、１つのアンチセ
ンスプライマー及び２つのセンスプライマーとの関係、
並びにサンプルＲＮＡ及び各競合体の増幅産物のサイズ
を示す。
の定量法に使用される２つの競合体と、１つのアンチセ
ンスプライマー及び２つのセンスプライマーとの関係、
並びにサンプルＲＮＡ及び各競合体の増幅産物のサイズ
を示す。
【図２】この図は、サンプル中のＨＣＶ ＲＮＡを本発
明の方法で定量化したときの、ＲＮＡコピー数の判定の
仕方を電気泳動像を用いて説明したものである。
明の方法で定量化したときの、ＲＮＡコピー数の判定の
仕方を電気泳動像を用いて説明したものである。
【図３】この図は、従来法による測定で１０4 −１０5
コピー／ｍｌのＨＣＶ−ＲＮＡを含む検体をｃＤＮＡ合
成後、１０倍階段希釈し、２チューブで定量を行なった
結果を示した写真である。１が１本目のチューブの泳動
像を、２が２本目のチューブの泳動像を示しており、１
と２の組みで１つの検体を示している。×１が１０4 コ
ピー／チューブ、×１００００が１コピー／チューブと
判定され、良好な希釈直線性を示している。
コピー／ｍｌのＨＣＶ−ＲＮＡを含む検体をｃＤＮＡ合
成後、１０倍階段希釈し、２チューブで定量を行なった
結果を示した写真である。１が１本目のチューブの泳動
像を、２が２本目のチューブの泳動像を示しており、１
と２の組みで１つの検体を示している。×１が１０4 コ
ピー／チューブ、×１００００が１コピー／チューブと
判定され、良好な希釈直線性を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (74)上記２名の代理人 弁理士 川口 義雄 （外２名 ） (72)発明者 田中 栄司 長野県松本市岡田松岡73−５ (72)発明者 松本 晶博 長野県松本市桐２−３−26 ＦＹコーポ 203号室 (72)発明者 山口 健次郎 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 サンプル中のＤＮＡ又はＲＮＡを競合Ｐ
ＣＲ法で定量する方法であって、 （ｉ）サンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡと、少なくと
も２種の、予備決定されたコピー数の競合体であって、
前記ＤＮＡ又はＲＮＡと完全に又は部分的に相同性をも
ち且つ前記ＤＮＡ又はＲＮＡに対応する配列の内部に部
分的に欠失又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ及びいずれの競合体ともアニーリング可能
な１種のセンス又はアンチセンスプライマーと、このプ
ライマーに対応しこれと異なる配列を有し且つ前記競合
体の種類と同数のアンチセンス又はセンスプライマーで
あって、各々が互いに異なる競合体１種のみとアニーリ
ング可能である前記アンチセンス又はセンスプライマー
とを同一容器内で競合ＰＣＲ法にかけて、サンプル由来
の前記ＤＮＡ又はＲＮＡ及び前記競合体を鋳型とする互
いに異なるサイズの増幅産物を得、 （ｉｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物を電気泳動分析にか
けてサイズ分離し、その分離したバンドの濃さと競合体
の前記コピー数とに基づいてサンプル中の前記ＤＮＡ又
はＲＮＡのコピー数を決定する、ことを包含する前記方
法。 - 【請求項２】 サンプル中の微量のＤＮＡ又はＲＮＡを
競合ＰＣＲ法で定量する方法であって、 （ｉ）サンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡと、少なくと
も２種の、予備決定されたコピー数の競合体であって、
前記ＤＮＡ又はＲＮＡと完全に又は部分的に相同性をも
ち且つ前記ＤＮＡ又はＲＮＡに対応する配列の内部に部
分的に欠失又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ＤＮ
Ａもしくは前記ＲＮＡ及び前記競合体とアニーリング可
能な第１のセンス及びアンチセンスプライマーとを同一
容器内で第１ＰＣＲにかけて前記ＤＮＡ又はＲＮＡを増
幅し、 （ｉｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物に、前記ＤＮＡ又は
ＲＮＡ及びいずれの競合体ともアニーリング可能な１種
の第２のセンス又はアンチセンスプライマーと、このプ
ライマーに対応しこれと異なる配列を有し且つ前記競合
体の種類と同数の第２のアンチセンス又はセンスプライ
マーであって、各々が互いに異なる競合体１種のみとア
ニーリング可能である前記第２のアンチセンス又はセン
スプライマーとを添加して競合ＰＣＲ法にかけ、サンプ
ル由来の前記ＤＮＡ又はＲＮＡ及び前記競合体を鋳型と
する互いに異なるサイズの増幅産物を得、 （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の増幅産物を電気泳動分析
にかけてサイズ分離し、その分離したバンドの濃さと競
合体の前記コピー数とに基づいてサンプル中の前記ＤＮ
Ａ又はＲＮＡのコピー数を決定する、ことを包含する前
記方法。 - 【請求項３】 サンプル中の微量のＤＮＡ又はＲＮＡを
競合ＰＣＲ法で定量する方法であって、 （ｉ）サンプル中の前記ＤＮＡ又はＲＮＡと、２種の、
予備決定されたコピー数の競合体であって、前記ＤＮＡ
又はＲＮＡと完全に又は部分的に相同性をもち且つ前記
ＤＮＡ又はＲＮＡに対応する配列の内部に部分的に欠失
又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記ＤＮＡもしくは
前記ＲＮＡ及び前記競合体とアニーリング可能な第１の
センス及びアンチセンスプライマーとを同一容器内で第
１ＰＣＲにかけて前記ＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し、 （ｉｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物に、前記ＤＮＡ又は
ＲＮＡ及びいずれの競合体ともアニーリング可能な１種
の第２のセンス又はアンチセンスプライマーと、このプ
ライマーに対応しこれと異なる配列を有する２種の第２
のアンチセンス又はセンスプライマーであって、各々が
互いに異なる競合体のみとアニーリング可能である前記
第２のアンチセンス又はセンスプライマーとを添加して
競合ＰＣＲ法にかけ、サンプル由来の前記ＤＮＡ又はＲ
ＮＡ及び前記競合体を鋳型とする互いに異なるサイズの
増幅産物を得、 （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の増幅産物を電気泳動分析
にかけてサイズ分離し、その分離したバンドの濃さと競
合体の前記コピー数とに基づいてサンプル中の前記ＤＮ
Ａ又はＲＮＡのコピー数を決定する、ことを包含する前
記方法。 - 【請求項４】 サンプル中の微量のＣ型肝炎ウイルスＲ
ＮＡを競合ＰＣＲ法で定量する方法であって、 （ｉ）サンプル中の前記ＲＮＡを予め逆転写酵素により
変換して得たｃＤＮＡと、２種の、予備決定されたコピ
ー数の競合体であって、前記ｃＤＮＡと完全に又は部分
的に相同性をもち且つ前記ＲＮＡに対応する配列の内部
に部分的に欠失又は挿入又は変異をもつ競合体と、前記
ｃＤＮＡ及び前記競合体とアニーリング可能な第１のセ
ンス及びアンチセンスプライマーとを同一容器内で第１
ＰＣＲにかけて前記ｃＤＮＡを増幅し、 （ｉｉ）ステップ（ｉ）の増幅産物に、前記ｃＤＮＡ及
びいずれの競合体ともアニーリング可能な１種の第２の
アンチセンスプライマーと、このプライマーと異なる配
列を有する２種の第２のセンスプライマーであって、各
々が互いに異なる競合体のみとアニーリング可能である
前記第２のセンスプライマーとを添加して競合ＰＣＲ法
にかけ、サンプル由来の前記ｃＤＮＡ及び前記競合体を
鋳型とする互いに異なるサイズの増幅産物を得、 （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の増幅産物を電気泳動分析
にかけてサイズ分離し、その分離したバンドの濃さと競
合体の前記コピー数とに基づいてサンプル中の前記ＲＮ
Ａのコピー数を決定する、ことを包含する前記方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6071701A JPH07250700A (ja) | 1994-03-15 | 1994-03-15 | 競合ｐｃｒ法による核酸の簡易定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6071701A JPH07250700A (ja) | 1994-03-15 | 1994-03-15 | 競合ｐｃｒ法による核酸の簡易定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07250700A true JPH07250700A (ja) | 1995-10-03 |
Family
ID=13468114
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6071701A Pending JPH07250700A (ja) | 1994-03-15 | 1994-03-15 | 競合ｐｃｒ法による核酸の簡易定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07250700A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997046716A1 (en) * | 1996-06-07 | 1997-12-11 | Wabco B.V. | Method to detect hcv specific nucleic acids |
| WO1999030167A1 (en) * | 1997-12-06 | 1999-06-17 | Genox Research, Inc. | Sample data managing system |
| WO2005059548A1 (ja) * | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Kankyo Engineering Co., Ltd. | 核酸測定用新規混合物、及びそれを用いる核酸の新規測定方法並びにそれらに用いる核酸プローブ |
-
1994
- 1994-03-15 JP JP6071701A patent/JPH07250700A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997046716A1 (en) * | 1996-06-07 | 1997-12-11 | Wabco B.V. | Method to detect hcv specific nucleic acids |
| WO1999030167A1 (en) * | 1997-12-06 | 1999-06-17 | Genox Research, Inc. | Sample data managing system |
| WO2005059548A1 (ja) * | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Kankyo Engineering Co., Ltd. | 核酸測定用新規混合物、及びそれを用いる核酸の新規測定方法並びにそれらに用いる核酸プローブ |
| US7951604B2 (en) | 2003-12-19 | 2011-05-31 | Kankyo Engineering Co., Ltd. | Mixtures for assaying nucleic acid, novel method of assaying nucleic acid with the use of the same and nucleic acid probe to be used therefor |
| US9587271B2 (en) | 2003-12-19 | 2017-03-07 | Nippon Steel & Sumikin Eco-Tech Corporation | Mixtures for assaying nucleic acid, novel method of assaying nucleic acid with the use of the same and nucleic acid probe to be used therefor |
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