JPH04141099A - 増幅捕捉アッセイ - Google Patents
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
［，０００１］
本発明は、サンプル中の特定の核酸を測定するハイブリ
ダイゼーションの分野に関する。更に詳しくは、これは
増幅手順およびマルチプローブハイブリダイゼーション
アッセイの組合せの改良に関する。 ［０００２］
ダイゼーションの分野に関する。更に詳しくは、これは
増幅手順およびマルチプローブハイブリダイゼーション
アッセイの組合せの改良に関する。 ［０００２］
特定の結合アッセイ技術の発展により、極めて低濃度で
種々の液体または固体（例えば組織）中に現れる診断、
医療、環境並びに工業的に重要な種々の物質を測定する
極めて有用な分析方法が提供された。特異的結合アッセ
イは、測定下で結合し得る分析物とその結合パートナ−
すなわち分析物特異的部分との特異的な相互作用に基く
。分析物特異的部分の結合および必要に応じていずれか
の付加的な試薬との相互作用により、結合および未結合
ラベル分析物の機械的分離が行われ、または検出し得る
シグナルを調節するようラベル作用される。前者の状態
は通常は異種的と呼ばれ、後者は分離工程を必要としな
い点で、後者は同種的と呼ばれる。 ［０００３］ 分析物またはその結合パートナ−のいずれが標的核酸配
列であり、他のものが相補的核酸配列である場合であっ
ても、このアッセイは、核酸ハイブリダイゼーションア
ッセイとして知られている。一般には、ファルコウら、
米国’Ｉｆ＝許１４゜３５８．５３５号、コウリルスキ
ーら、米国特許第４，５８１，３３３号、アルバレラら
、米国特許第４，５６３，４１７号、並びにパラら、米
国特許第４，５５６．６４３号を参照するとよい。 ［０００４］ 特開平４−ｘ４ｘｏ：＋ｃ）（３０） 従来のラベル共役特異的結合アッセイ技術においては、
アッセイに供する液体媒体からなるサンプルと種々の試
薬組成物とを組合せる。この種の組成物には、ラベルと
混和された結合成分からなるラベル共役物が包含される
。他の構成成分と共に参画する兵役物中の結合成分があ
る場合、これは試薬組成物およびアッセイ下における媒
体中のリガンドのものであり、２つの分子種を与える結
合反応系を形成するものであるか、または例えば結合分
子種（共役複合体）および遊離分子種のような共役物の
形態を形成するものである。結合分子種においては、共
役物の結合成分は結合パートナ−に対応することにより
結合されるが、これに対して遊離分子種では、結合成分
はこのように結合されない。遊離分子種に比較して結果
的に結合分子種を与える共役物の割合の量は、試験サン
プル中の検出されるべき分析物の存在（または量）の関
数である。 ［０００５］ 特異的結合アッセイについての他の形態は「サンドイッ
チ」アッセイ手順であるが、この場合は、標的分析物は
、第１特異的結合パートナー（これは直接または結合基
を介して固体マトリックスに固定される）と第２特異的
結合パートナー（これはシグナル生成またはラベル系と
会合する）との間に結合される。第１および第２特異的
結合パートナーの両者がオリゴまたはポリヌクレオチド
であり、標的が核酸である場合、このアッセイはサンド
イッチハイブリダイゼーションアッセイとして知られて
いる。一般には、ランキら、米国特許第４，４８６，５
３９号およびランキら、米国特許第４，５６３，４１９
号を参照することができる。また、ビルタネンら、「ウ
ィルス診断の新しい試験：核酸サンドイッチハイブリダ
イゼーションによる鼻咽頭粘液呼吸疾患のアデノウィル
スの検出」、Ｌａｎｃｅｔ、１ ：３８１−３８３ （
１９８３）およびランキら、「粗製サンプル中の核酸を
検出する便利な方法としてのサンドイッチハイブリダイ
ゼーション＋、Ｇｅｎｅ、２１ ニア７−８５ （１９
８３）を参照することができる。 ［０００６］ ウルデアら、「プロッティングまたは放射能活性を用い
ることなく粗製生物サンプル中の特定の核酸配列を迅速
に検出する新規な方法：ヒト血清中の肝炎Ｂウィルスの
分析への応用Ｊ、Ｇｅｎｅ、６１ ：２５３−２６４
（１９８７） には溶液ハイブリダイゼーションが記載
されているが、これは、可溶性オリゴヌクレオチドプロ
ーブの多重度を利用するものである。ここに開示された
方法では、溶液ハイブリダイゼーションにおいて、４８
の異なる肝炎ウィルス特異的配列からなる２つの組合せ
のプローブの使用が開示されている。１つの組合せのプ
ローブ（Ａプローブセット）は、標的特異的領域と非単
独重合捕捉特異的領域とからなる核酸配列を有する。こ
のプローブセットの非単独重合捕捉特異的領域は、ビオ
チンによりラベルされアビジン修飾ビーズにより結合さ
れ得る捕捉ヌクレオチド配列に相補的である。プローブ
の他の組合せ（Ｂプローブセット）は、標的特異的領域
と他の非単独重合非標的特異的領域とからなるヌクレオ
チド配列を有する。この非単独重合非標的特異的領域は
、ラベル捕捉ヌクレオチドマルチマー配列に特異的であ
る。このラベル捕捉ヌクレオチドマルチマー配列自体は
、非単独重合非標的特異的領域に相補的な領域、並びに
シグナル剤、西洋ワサビペルオキシダーゼによりラベル
されたシグナルオリゴヌクレオチドに相補的な領域を有
する。標的核酸とプローブセットＡおよびＢとのハイブ
リダイゼーションに続き、ハイブリダイズした複合体を
その後ビオチンラベル捕捉プローブにハイブリダイズさ
せ、これをその後人にアビジン修飾ビーズに結合させる
。マトリックス結合複合体をラベル捕捉ヌクレオチドマ
ルチマー配列とハイブリダイズさせ、その後シグナルオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。結合ハイブ
リダイズ複合体の量は、西洋ワサビペルオキシダーゼの
存在により測定される。この研究に開示された方法は、
５１の異なるオリゴヌクレオチド、その付着非単独重合
領域と共に４８の異なる標的特異的プローブ、捕捉プロ
ーブ、ラベル捕捉ヌクレオチドマルチマー、並びにシグ
ナルプローブの合成を必要とする。また、これは、それ
ぞれ架橋剤および西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる
ビオチンによる後者の３つのプローブの修飾を必要とす
る。この著者は、異なるプローブの数に比例した感受性
を記載している。 ［０００７］ １９８９年３月１日こ公告されたジビンとモナハン、Ｅ
ＰＯ公告第０３０５１４５号には溶液サンドイッチハイ
ブリダイゼーション法が開示されているが、これは２つ
の可溶性オリゴヌクレオチドプローブを利用するもので
ある。１つのプローブは、相補的ホモポリヌクレオチド
により被覆された固体支持体により捕捉されるホモポリ
ヌクレオチド尾部を有し、他のプローブは、標的の異な
る領域に相補的な検出し得るプローブである。標的核酸
配列は、溶液中で２つのプローブとハイブリダイズ可能
である。ハイブリダイゼーションが完了して始めて、ハ
イブリダイズした複合体を含有するサンプルを不溶性固
体支持体と接触させ捕捉させる。共に譲渡され１９８７
年１月１５日に出願された同時係属中の米国特許出願第
００５，３７７、号にもサンドイッチハイブリダイゼー
ションが開示されているが、これを参考としてここに取
り入れる。 ［０００８］ 核酸の増幅についての幾つかの初期の方法論が知られて
いる。例えば、オルソンら、「化学合成りＮＡ断片の酵
素的増幅Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ、２４３−６０ （１９７５） 、パネットと
コーラナ、「ポリヌクレオチドの研究。デオキシリボ核
酸とセルロースとの結合およびその複製におけるその使
用」、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２
４９：５２１３−５２２１ （１９７４）、ゲッター
ら、「無細胞抽出液におけるＤＮＡ合成、第３部：ＤＮ
ＡポリメラーゼＩＩの触媒特性」、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、 ２４７：３３２１−３３２６ （
１９７２）、並びにクレッペら、「ポリヌクレオチドの
研究、第９６部、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒された
ものとしての短い合成りＮＡの修復複製」、Ｊ、 Ｍ
ｏ１． Ｂｉｏｌ、 ５６：３４１−３６１ （
１９７１）を参照することができる。 ［０００９］ 更に最近の他の方法論は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ
）手順であり、これは天然に少量で存在する核酸の比較
的大量のものを利用可能とする種々の技術となった。端
的には、ＰＣＲ手順は次の通りである。コピーに供する
標的の分離した（一本鎖）相補的ストランドをそれぞれ
２つのストランドの対抗末端（すなわちそれぞれのプラ
イマーは５′−プライマーである）に相補的な過剰モル
のオリゴヌクレオチドプライマーにより処理する。元の
標的が二本鎖の場合、これは最初に一本鎖とする必要が
ある。個々のヌクレオチドおよび適当なポリメラーゼま
たは逆転写酵素を加えることによりプライマーを延長し
て相補的プライマー延長生成物を形成する。−旦プライ
マー延長生成物が形成されたならば、それぞれの重複す
る二本鎖中間体生成物をメルト（変性）させて一本鎖形
態とする。その相補体から分離され他のプライマーにハ
イブリダイズされた場合、１つのプライマーから合成さ
れた延長生成物は、他のプライマーの延長生成物の合成
のための鋳型となる。ムユリスら、米国特許第４，６８
３，１９５号および４，６８３，２０２号を参照すると
よい。 ［００１０１ ＰＣＲの大部分の応用において、増幅されたＤＮＡはサ
ザンまたはドツトプロットハイブリダイゼーションによ
り放射能ラベルまたはビオチンラベルされたプローブと
して分析される。例えば、オウら、「末梢血液単球細胞
のＤＮＡ中のＨＩＶ−１の直接検出のためのＤＮＡ増幅
」、５ｃｉｅｎｃｅ、２３９：２９２−２９５ （１９
８５） 、サイキら、［熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに
よるプライマー指向酵素的増幅Ｊ、５ｃｉｅｎｃｅ、２
３９ ：４８７−４９１ （１９８８）、ヒグチら、
［シングルへアーからのＤＮＡタイピングＪ、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３３２： ５４３−５４６ （１９８８） 、並
びにブガワンら、「胎児診断および法医学ＨＬＡタイピ
ングのための酵素的に増幅されたＤＮＡを分析する非放
射活性オリゴヌクレオチドプローブの使用Ｊ、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６ ：９４３−９４７ （１９８
８）を参照することができる。この種の手順は完遂する
のに２〜３日かかるため、これらは一般に大量の応用、
臨床試験状況での使用には不適切であり、自動化された
装置への応用に特に不適切である。 ［００１１］ 他の増幅系を記載すれば、リザルジら、「組換えＲＮＡ
ハイブリダイゼーションプローブの対数的増幅Ｊ、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６ ：１１９７−１２０２
（１９８８）には、ハイブリダイゼーションプローブ
およびＱβレプリカーゼによる対数増幅のための鋳型の
双方に機能する組換えＲＮＡ分子を合成したことが報告
されている。それぞれの組換え体は、ＭＤＶ−ＩＲＮＡ
の配列内に埋設されたプロトシア寄生体に特異的な配列
よりなり、これはＱβレプリカーゼの天然の鋳型である
。プローブ配列は、ＭＤＶ−ＩＲＮＡの外部に存在する
ヘアピンループ内に挿入される。相補的ＤＮＡに特異的
にハイブリダイズする組換えＲＮＡは、プローブドメイ
ン上のトポロジー的束縛にも拘らず、ＭＤＶ−ＩＲＮＡ
と同じ速度で複製され、その付加的な長さによらず、多
数のＲＮＡコピーの合成のための鋳型として働くことが
可能である。この結果は、バイオアッセイにおける対数
的複製可能なＲＮＡを用いることの実行可能性と言われ
、この場合これらは特異的プローブおよび増幅レセプタ
ーの二元的な役割を果たし得る。これらのアッセイでは
、非特異的にハイブリダイズした、またはトラップされ
た二元的役割のプローブ／増幅可能プローブの標的非特
異的増幅の影響を被り得る。 ［００１２］ ケンプら、「ポリメラーゼ鎖反応により増幅された特異
的ＤＮＡ断片の発色検出Ｊ 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．
Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ、８６：２４２３−２４２
７ （１９８９）には、増幅されたＤＮＡの発色検出の
ためのアッセイが記載されている。標的ＤＮＡは最初に
ＰＣＲによって増幅され、その後最初の２つの間に介在
する第２の組のオリゴヌクレオチドを、３以上のＰＣＲ
サイクルにより組み込む。これらのオリゴヌクレオチド
はリガンドを担持する。例えば、１つはビオチニル化さ
れ得、他は二本鎖ＤＮＡ結合蛋白質についての部位を含
有し得る。 固定化アフイニティ試薬（例えばクローン化ＤＮＡ結合
蛋白質）への結合、および西洋ワサビペルオキシダーゼ
に結合した第２アフイニテイ試薬（例えばアビジン）に
よりラベルの後、発色性物質を用いる反応により増幅さ
れたＤＮＡの検出を行う。 ［００１３］ ケーラーとカーノ、「核酸プローブを使用するＨＩＶ配
列の同定」、Ａｍ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｌａｂｓ、（
１９８８年１１月）では、ＨＩ Ｖ−１ウイルス核酸の
検出についての最近開発された方法が論じられている。 記載された１つの方法は、組み込まれた、またはエピ−
シームＤＮＡに存在するＨＩＶ−１プロウイルス上でポ
リメラーゼ鎖反応を使用することにより開始する。サイ
キら、前記文献を引用し、ウィルスＲＮＡも、幾つかの
付加的な工程により特異的に増幅され得ることが記載さ
れている。ＲＮＡ鋳型はウィルスｍＲＮＡまたはパック
されたウィルス粒子ＲＮＡである。ウィルスＲＮＡのｃ
ＤＮＡコピーは、ＰＣＲプライマーおよび逆転写酵素を
使用して合成される。この著者によれば、恐らく検出形
式を改変して、より単純であるがより信頼性の高い試験
を提供すべきことが示されいてる。サンドイッチハイブ
リダイゼーションは、他のものとして言及され、従来の
ハイブリダイゼーションの図式が示されているカミ詳細
は全く与えられていない。 ［００１４］ フォーら、「ビーズ基材サンドイッチハイブリダイゼー
ション形式を用いる転写に基く増幅系および増幅された
ヒト免疫疾患ウィルスタイプ１の検出」、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａ ｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ、８６：１１
７３−１１７７ （１９８９）には、転写に基く増幅系
（ＴＡＳ）が開示されている。それぞれのサイクルは２
つの工程からなる。第１はｃＤＮＡ合成工程であり、こ
れはＲＮＡまたはＤＮＡ標的核酸のそれぞれのコピーに
ついての二本鎖ＤＮＡ鋳型の１つのコピーを与える。こ
のｃＤＮＡ合成工程の過程で、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ
メラーゼによって認識される配列が、増幅される標的の
ｃＤＮＡコピー中に挿入される。第２の工程は、ｃＤＮ
Ａ鋳型を多数のコピーのＲＮＡに転写することによる標
的配列の増幅である。この手順は、ＨＩＶ−１の検出に
応用された。ＨＩＶ−１感染細胞に由来するＴＡＳ形成
ＲＮＡの検出は、ビーズ基材サンドイッチハイブリダイ
ゼーション手順によって達成することができる。オリゴ
ヌクレオチドを含有するセファクリルビーズは、ボッシ
ュとムッソ、［固体支持体へのオリゴヌクレオチドの共
有付着Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ、１５：５３５３−５３７２ （１９８７）に記
載されているように調製された。このビーズ結合オリゴ
ヌクレオチドを使用し、これらの標的が３２Ｐラベル検
出オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした後に、ＴＡ
Ｓ増幅ＨＩＶ−１配列が捕捉された。 ［００１５］
種々の液体または固体（例えば組織）中に現れる診断、
医療、環境並びに工業的に重要な種々の物質を測定する
極めて有用な分析方法が提供された。特異的結合アッセ
イは、測定下で結合し得る分析物とその結合パートナ−
すなわち分析物特異的部分との特異的な相互作用に基く
。分析物特異的部分の結合および必要に応じていずれか
の付加的な試薬との相互作用により、結合および未結合
ラベル分析物の機械的分離が行われ、または検出し得る
シグナルを調節するようラベル作用される。前者の状態
は通常は異種的と呼ばれ、後者は分離工程を必要としな
い点で、後者は同種的と呼ばれる。 ［０００３］ 分析物またはその結合パートナ−のいずれが標的核酸配
列であり、他のものが相補的核酸配列である場合であっ
ても、このアッセイは、核酸ハイブリダイゼーションア
ッセイとして知られている。一般には、ファルコウら、
米国’Ｉｆ＝許１４゜３５８．５３５号、コウリルスキ
ーら、米国特許第４，５８１，３３３号、アルバレラら
、米国特許第４，５６３，４１７号、並びにパラら、米
国特許第４，５５６．６４３号を参照するとよい。 ［０００４］ 特開平４−ｘ４ｘｏ：＋ｃ）（３０） 従来のラベル共役特異的結合アッセイ技術においては、
アッセイに供する液体媒体からなるサンプルと種々の試
薬組成物とを組合せる。この種の組成物には、ラベルと
混和された結合成分からなるラベル共役物が包含される
。他の構成成分と共に参画する兵役物中の結合成分があ
る場合、これは試薬組成物およびアッセイ下における媒
体中のリガンドのものであり、２つの分子種を与える結
合反応系を形成するものであるか、または例えば結合分
子種（共役複合体）および遊離分子種のような共役物の
形態を形成するものである。結合分子種においては、共
役物の結合成分は結合パートナ−に対応することにより
結合されるが、これに対して遊離分子種では、結合成分
はこのように結合されない。遊離分子種に比較して結果
的に結合分子種を与える共役物の割合の量は、試験サン
プル中の検出されるべき分析物の存在（または量）の関
数である。 ［０００５］ 特異的結合アッセイについての他の形態は「サンドイッ
チ」アッセイ手順であるが、この場合は、標的分析物は
、第１特異的結合パートナー（これは直接または結合基
を介して固体マトリックスに固定される）と第２特異的
結合パートナー（これはシグナル生成またはラベル系と
会合する）との間に結合される。第１および第２特異的
結合パートナーの両者がオリゴまたはポリヌクレオチド
であり、標的が核酸である場合、このアッセイはサンド
イッチハイブリダイゼーションアッセイとして知られて
いる。一般には、ランキら、米国特許第４，４８６，５
３９号およびランキら、米国特許第４，５６３，４１９
号を参照することができる。また、ビルタネンら、「ウ
ィルス診断の新しい試験：核酸サンドイッチハイブリダ
イゼーションによる鼻咽頭粘液呼吸疾患のアデノウィル
スの検出」、Ｌａｎｃｅｔ、１ ：３８１−３８３ （
１９８３）およびランキら、「粗製サンプル中の核酸を
検出する便利な方法としてのサンドイッチハイブリダイ
ゼーション＋、Ｇｅｎｅ、２１ ニア７−８５ （１９
８３）を参照することができる。 ［０００６］ ウルデアら、「プロッティングまたは放射能活性を用い
ることなく粗製生物サンプル中の特定の核酸配列を迅速
に検出する新規な方法：ヒト血清中の肝炎Ｂウィルスの
分析への応用Ｊ、Ｇｅｎｅ、６１ ：２５３−２６４
（１９８７） には溶液ハイブリダイゼーションが記載
されているが、これは、可溶性オリゴヌクレオチドプロ
ーブの多重度を利用するものである。ここに開示された
方法では、溶液ハイブリダイゼーションにおいて、４８
の異なる肝炎ウィルス特異的配列からなる２つの組合せ
のプローブの使用が開示されている。１つの組合せのプ
ローブ（Ａプローブセット）は、標的特異的領域と非単
独重合捕捉特異的領域とからなる核酸配列を有する。こ
のプローブセットの非単独重合捕捉特異的領域は、ビオ
チンによりラベルされアビジン修飾ビーズにより結合さ
れ得る捕捉ヌクレオチド配列に相補的である。プローブ
の他の組合せ（Ｂプローブセット）は、標的特異的領域
と他の非単独重合非標的特異的領域とからなるヌクレオ
チド配列を有する。この非単独重合非標的特異的領域は
、ラベル捕捉ヌクレオチドマルチマー配列に特異的であ
る。このラベル捕捉ヌクレオチドマルチマー配列自体は
、非単独重合非標的特異的領域に相補的な領域、並びに
シグナル剤、西洋ワサビペルオキシダーゼによりラベル
されたシグナルオリゴヌクレオチドに相補的な領域を有
する。標的核酸とプローブセットＡおよびＢとのハイブ
リダイゼーションに続き、ハイブリダイズした複合体を
その後ビオチンラベル捕捉プローブにハイブリダイズさ
せ、これをその後人にアビジン修飾ビーズに結合させる
。マトリックス結合複合体をラベル捕捉ヌクレオチドマ
ルチマー配列とハイブリダイズさせ、その後シグナルオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。結合ハイブ
リダイズ複合体の量は、西洋ワサビペルオキシダーゼの
存在により測定される。この研究に開示された方法は、
５１の異なるオリゴヌクレオチド、その付着非単独重合
領域と共に４８の異なる標的特異的プローブ、捕捉プロ
ーブ、ラベル捕捉ヌクレオチドマルチマー、並びにシグ
ナルプローブの合成を必要とする。また、これは、それ
ぞれ架橋剤および西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる
ビオチンによる後者の３つのプローブの修飾を必要とす
る。この著者は、異なるプローブの数に比例した感受性
を記載している。 ［０００７］ １９８９年３月１日こ公告されたジビンとモナハン、Ｅ
ＰＯ公告第０３０５１４５号には溶液サンドイッチハイ
ブリダイゼーション法が開示されているが、これは２つ
の可溶性オリゴヌクレオチドプローブを利用するもので
ある。１つのプローブは、相補的ホモポリヌクレオチド
により被覆された固体支持体により捕捉されるホモポリ
ヌクレオチド尾部を有し、他のプローブは、標的の異な
る領域に相補的な検出し得るプローブである。標的核酸
配列は、溶液中で２つのプローブとハイブリダイズ可能
である。ハイブリダイゼーションが完了して始めて、ハ
イブリダイズした複合体を含有するサンプルを不溶性固
体支持体と接触させ捕捉させる。共に譲渡され１９８７
年１月１５日に出願された同時係属中の米国特許出願第
００５，３７７、号にもサンドイッチハイブリダイゼー
ションが開示されているが、これを参考としてここに取
り入れる。 ［０００８］ 核酸の増幅についての幾つかの初期の方法論が知られて
いる。例えば、オルソンら、「化学合成りＮＡ断片の酵
素的増幅Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ、２４３−６０ （１９７５） 、パネットと
コーラナ、「ポリヌクレオチドの研究。デオキシリボ核
酸とセルロースとの結合およびその複製におけるその使
用」、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２
４９：５２１３−５２２１ （１９７４）、ゲッター
ら、「無細胞抽出液におけるＤＮＡ合成、第３部：ＤＮ
ＡポリメラーゼＩＩの触媒特性」、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、 ２４７：３３２１−３３２６ （
１９７２）、並びにクレッペら、「ポリヌクレオチドの
研究、第９６部、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒された
ものとしての短い合成りＮＡの修復複製」、Ｊ、 Ｍ
ｏ１． Ｂｉｏｌ、 ５６：３４１−３６１ （
１９７１）を参照することができる。 ［０００９］ 更に最近の他の方法論は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ
）手順であり、これは天然に少量で存在する核酸の比較
的大量のものを利用可能とする種々の技術となった。端
的には、ＰＣＲ手順は次の通りである。コピーに供する
標的の分離した（一本鎖）相補的ストランドをそれぞれ
２つのストランドの対抗末端（すなわちそれぞれのプラ
イマーは５′−プライマーである）に相補的な過剰モル
のオリゴヌクレオチドプライマーにより処理する。元の
標的が二本鎖の場合、これは最初に一本鎖とする必要が
ある。個々のヌクレオチドおよび適当なポリメラーゼま
たは逆転写酵素を加えることによりプライマーを延長し
て相補的プライマー延長生成物を形成する。−旦プライ
マー延長生成物が形成されたならば、それぞれの重複す
る二本鎖中間体生成物をメルト（変性）させて一本鎖形
態とする。その相補体から分離され他のプライマーにハ
イブリダイズされた場合、１つのプライマーから合成さ
れた延長生成物は、他のプライマーの延長生成物の合成
のための鋳型となる。ムユリスら、米国特許第４，６８
３，１９５号および４，６８３，２０２号を参照すると
よい。 ［００１０１ ＰＣＲの大部分の応用において、増幅されたＤＮＡはサ
ザンまたはドツトプロットハイブリダイゼーションによ
り放射能ラベルまたはビオチンラベルされたプローブと
して分析される。例えば、オウら、「末梢血液単球細胞
のＤＮＡ中のＨＩＶ−１の直接検出のためのＤＮＡ増幅
」、５ｃｉｅｎｃｅ、２３９：２９２−２９５ （１９
８５） 、サイキら、［熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに
よるプライマー指向酵素的増幅Ｊ、５ｃｉｅｎｃｅ、２
３９ ：４８７−４９１ （１９８８）、ヒグチら、
［シングルへアーからのＤＮＡタイピングＪ、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３３２： ５４３−５４６ （１９８８） 、並
びにブガワンら、「胎児診断および法医学ＨＬＡタイピ
ングのための酵素的に増幅されたＤＮＡを分析する非放
射活性オリゴヌクレオチドプローブの使用Ｊ、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６ ：９４３−９４７ （１９８
８）を参照することができる。この種の手順は完遂する
のに２〜３日かかるため、これらは一般に大量の応用、
臨床試験状況での使用には不適切であり、自動化された
装置への応用に特に不適切である。 ［００１１］ 他の増幅系を記載すれば、リザルジら、「組換えＲＮＡ
ハイブリダイゼーションプローブの対数的増幅Ｊ、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６ ：１１９７−１２０２
（１９８８）には、ハイブリダイゼーションプローブ
およびＱβレプリカーゼによる対数増幅のための鋳型の
双方に機能する組換えＲＮＡ分子を合成したことが報告
されている。それぞれの組換え体は、ＭＤＶ−ＩＲＮＡ
の配列内に埋設されたプロトシア寄生体に特異的な配列
よりなり、これはＱβレプリカーゼの天然の鋳型である
。プローブ配列は、ＭＤＶ−ＩＲＮＡの外部に存在する
ヘアピンループ内に挿入される。相補的ＤＮＡに特異的
にハイブリダイズする組換えＲＮＡは、プローブドメイ
ン上のトポロジー的束縛にも拘らず、ＭＤＶ−ＩＲＮＡ
と同じ速度で複製され、その付加的な長さによらず、多
数のＲＮＡコピーの合成のための鋳型として働くことが
可能である。この結果は、バイオアッセイにおける対数
的複製可能なＲＮＡを用いることの実行可能性と言われ
、この場合これらは特異的プローブおよび増幅レセプタ
ーの二元的な役割を果たし得る。これらのアッセイでは
、非特異的にハイブリダイズした、またはトラップされ
た二元的役割のプローブ／増幅可能プローブの標的非特
異的増幅の影響を被り得る。 ［００１２］ ケンプら、「ポリメラーゼ鎖反応により増幅された特異
的ＤＮＡ断片の発色検出Ｊ 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ １．
Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ、８６：２４２３−２４２
７ （１９８９）には、増幅されたＤＮＡの発色検出の
ためのアッセイが記載されている。標的ＤＮＡは最初に
ＰＣＲによって増幅され、その後最初の２つの間に介在
する第２の組のオリゴヌクレオチドを、３以上のＰＣＲ
サイクルにより組み込む。これらのオリゴヌクレオチド
はリガンドを担持する。例えば、１つはビオチニル化さ
れ得、他は二本鎖ＤＮＡ結合蛋白質についての部位を含
有し得る。 固定化アフイニティ試薬（例えばクローン化ＤＮＡ結合
蛋白質）への結合、および西洋ワサビペルオキシダーゼ
に結合した第２アフイニテイ試薬（例えばアビジン）に
よりラベルの後、発色性物質を用いる反応により増幅さ
れたＤＮＡの検出を行う。 ［００１３］ ケーラーとカーノ、「核酸プローブを使用するＨＩＶ配
列の同定」、Ａｍ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｌａｂｓ、（
１９８８年１１月）では、ＨＩ Ｖ−１ウイルス核酸の
検出についての最近開発された方法が論じられている。 記載された１つの方法は、組み込まれた、またはエピ−
シームＤＮＡに存在するＨＩＶ−１プロウイルス上でポ
リメラーゼ鎖反応を使用することにより開始する。サイ
キら、前記文献を引用し、ウィルスＲＮＡも、幾つかの
付加的な工程により特異的に増幅され得ることが記載さ
れている。ＲＮＡ鋳型はウィルスｍＲＮＡまたはパック
されたウィルス粒子ＲＮＡである。ウィルスＲＮＡのｃ
ＤＮＡコピーは、ＰＣＲプライマーおよび逆転写酵素を
使用して合成される。この著者によれば、恐らく検出形
式を改変して、より単純であるがより信頼性の高い試験
を提供すべきことが示されいてる。サンドイッチハイブ
リダイゼーションは、他のものとして言及され、従来の
ハイブリダイゼーションの図式が示されているカミ詳細
は全く与えられていない。 ［００１４］ フォーら、「ビーズ基材サンドイッチハイブリダイゼー
ション形式を用いる転写に基く増幅系および増幅された
ヒト免疫疾患ウィルスタイプ１の検出」、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａ ｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ、８６：１１
７３−１１７７ （１９８９）には、転写に基く増幅系
（ＴＡＳ）が開示されている。それぞれのサイクルは２
つの工程からなる。第１はｃＤＮＡ合成工程であり、こ
れはＲＮＡまたはＤＮＡ標的核酸のそれぞれのコピーに
ついての二本鎖ＤＮＡ鋳型の１つのコピーを与える。こ
のｃＤＮＡ合成工程の過程で、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ
メラーゼによって認識される配列が、増幅される標的の
ｃＤＮＡコピー中に挿入される。第２の工程は、ｃＤＮ
Ａ鋳型を多数のコピーのＲＮＡに転写することによる標
的配列の増幅である。この手順は、ＨＩＶ−１の検出に
応用された。ＨＩＶ−１感染細胞に由来するＴＡＳ形成
ＲＮＡの検出は、ビーズ基材サンドイッチハイブリダイ
ゼーション手順によって達成することができる。オリゴ
ヌクレオチドを含有するセファクリルビーズは、ボッシ
ュとムッソ、［固体支持体へのオリゴヌクレオチドの共
有付着Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ、１５：５３５３−５３７２ （１９８７）に記
載されているように調製された。このビーズ結合オリゴ
ヌクレオチドを使用し、これらの標的が３２Ｐラベル検
出オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした後に、ＴＡ
Ｓ増幅ＨＩＶ−１配列が捕捉された。 ［００１５］
これらの努力にも拘らず、これらのある種の方法論には
存在するが他には存在しない望ましい特性の組合せを達
成する点において、改良の余地は太いに残されている。 ［００１６］
存在するが他には存在しない望ましい特性の組合せを達
成する点において、改良の余地は太いに残されている。 ［００１６］
本発明によれば、増幅された核酸を検出する単純化され
た組成物および方法が、特異的なりＮＡ配列の増幅の記
載された有用性を十分に活用するのに必要であることが
認められた。本発明によれば、後記する評価基準が充足
された。これは十分に感度が高く、このため増幅の工程
は最小限に維持された。これは適切に特異的であり、こ
のため全ゆる非特異的増幅は誤りなく陽性でないと記録
される。 これは大量の臨床試験への応用が可能であり、更に好ま
しくは自動化に容易に適用することができる。 ［００１７］ 所定の態様の更なる利点は、これらは増幅の効率を見積
る方法論を提供するため、意図する配列についての陰性
の結果は、増加した確実性をもって陰性であると記録さ
れる点である。またこの種の系により、１つのサンプル
内で単一のアッセイ操作により複数の標的核酸配列を増
幅および検出する単純化された方法も可能となる。この
種の方法の付加的な利点は、これらが増幅サイクルの前
に意図する標的核酸配列を部分精製する単純で危険性の
ない方法論を提供することである［００１８］ 先に示したように、本発明によれば、サンプル中の核酸
分析物の存在または非存在を測定する組成物および方法
が提供される。 ［００１９］ 試験を行うサンプル液体には、生物的、生理的、工業的
、環境的並びに他の種類の液体が包含される。特に意図
するものは生物的液体であり、例えば血清、血漿、尿、
脳を髄液、唾液、ミルクブロスおよび他の培養媒体並び
に上澄、更にこれらのいずれかの混合物または分画があ
る。意図する生理的液体には、注射溶液、緩衝液、防腐
または抗微生物溶液等が包含される。工業的液体には、
発酵培地および使用される他の加工液体が包含され、例
えば薬剤の製造におけるもの、乳製品およびマルト飲料
がある。従来の方法によ−って試験されるサンプル液体
の他の供給源は、使用するこの用語によって企図され、
本発明に従ってアッセイすることができる。また、試験
を企図するものには組織サンプルがあり、例えば、髪バ
イオプシーまたは組織切片サンプルが包含され、新鮮、
凍結またはバラフインに包埋されたものであることを問
わない。 ［００２０１ 用語「分析物」または「標的」は、その存在がサンプル
液体中で定性的または定量的に測定される全ゆる核酸含
有物質を意図する。分析物は、通常はオリゴまたはポリ
ヌクレオチドであり、これに対して相補的な核酸配列が
存在するか、またはこれを調製することができるもので
ある。分析物または標的は通常はＲＮＡまたはＤＮＡで
ある。 ［００２１］ 用語「マトリックス」または「試験帯域」は、キャリヤ
または支持体を意図し、例えば、顕微鏡スライド、マイ
クロタイタ穴、粒子等であり、その試験で使用する試験
サンプル、水または生理的液体および試薬に露呈された
場合、これは不溶性でありその構造的一貫性を維持する
。適切な材料には、ガラスまたは有機プラスチック材料
が包含され、例えばポリスチレン、ポリプロピレン等が
ある。 ［００２２］ 用語「普遍的検出」、「普遍的ラベル捕捉部分」並びに
「普遍的ラベル」は、「ポリヌクレオチド配列を利用す
るアッセイ方法」と題し、米国出願番号第９２２．７５
７号を有し、１９８６年１０月２４日に出願され共に譲
渡されたベルゴリジらに対する同時係属中の出願に記載
されたラベル系を意図する。この出願の開示を参考とし
てここに取り入れる。 ［００２３］ 前記したコピー数の増幅は、例えばポリメラーゼ鎖反応
または核酸材料の遺伝型として特異的な蛋白質を再生す
ることにより行うことができる（例えば、転写に基く増
幅）。 ［００２４］ 後記するように、第１および第２実体の例には、１つの
実体がリガンドであり他の実体がそのレセプターである
もの、第１および第２実体が相補的ポリヌクレオチド単
独重合体であるもの、１つの実体が抗原またはハプテン
であり他の実体が抗原またはハプテンに対するその抗体
または特異的結合断片であるもの、１つの実体がホルモ
ンであり他の実体がそのレセプターであるもの、１つの
実体が酵［００２５］ ［００２６］ 特開平４−１４１０９？） （３９） ブリダイズし得る条件下で、かくして形成された全ゆる
ハイブリッドと、標的核酸の第２部分とハイブリダイズ
し得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなるマトリ
ックス固定第２ポリヌクレオチドプローブとを接触させ
て結合複合体を形成し、（ｄ）必要に応じて結合複合体
を全ゆる未結合核酸から分離し、（ｅ）普遍的ラベルの
存在または非存在を捕捉して観察することにより増幅さ
れた標的核酸の存在または非存在を測定することからな
る。 ［００２７］ 第２の観点では、この発明によれば、試験に供するサン
プル中の一本鎖標的核酸を測定する組成物が提供される
。この組成物は、（ｉ）それぞれの一本鎖標的核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマー
は、一本鎖の標的核酸の相補的部分に選択的にアニール
することができる）、（ｉ ｉ）４つの核酸塩基のそれ
ぞれについてのモノヌクレオチド、（ｉ ｉ ｉ）プラ
イマーおよびモノヌクレオチドから延長生成物を生成し
得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的核酸に相補
的であり、これに対してプライマーがアニールする）、
（ｉ ｖ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る
第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の
少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチドプ
ローブ、（ｖ）標的核酸の第２部分とハイブリダイズし
得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１実
体からなる第２ポリヌクレオチドプローブ、並びに（ｖ
ｉ）第１実体と特異的に結合し得る第２実体が付着した
マトリックスからなる。 ［００２８］ 更にこの観点に関し、この発明によれば、試験に供する
サンプル中の一本鎖標的核酸を測定する方法が提供され
る。この方法は、（ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、
（ｂ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー
数の標的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分にハイブリダ
イズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した
ラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１−ポリヌ
クレオチドプローブ、（ｉ ｉ）標的核酸の第２部分と
ハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片
に付着した第１実体からなる第２ポリヌク：・、オチド
プローブ、並びに（ｉ ｉ ｉ）第１実体と特異的に結
合し得る第２実体が付着したマトリックスとを接触させ
、（ｃ）第１および第２プローブと存在する全ゆる増幅
したコピー数の標的核酸とのハイブリダイゼーションお
よび第１実体と第２実体との結合を行って結合複合体を
生成し、 （ｄ）必要に応じて結合複合体を全ゆる未結
合核酸から分離し、（ｅ）増幅したコピー数の標的核酸
の存在または非存在を測定することからなる。 ［００２９］ この発明の他の観点によれば、一本鎖標的核酸およびそ
の試薬の増幅および検出の効率を改良する予備増幅捕捉
工程について提供される。１つの態様によれば組成物が
提供され、これは、（ａ）意図するそれぞれの一本鎖標
的核酸についてのマトリックス捕捉ポリヌクレオド（こ
のポリヌクレオチドは、その標的核酸の相補的部分に選
択的にアニールすることができると共にその標的核酸の
プライマーとして機能する）、（ｂ）４つの核酸塩基の
それぞれのモノヌクレオチド、（ｃ）プライマーおよび
モノヌクレオチドから延長生成物を生成し得る核酸ポリ
メラーゼ（これは一本鎖の標的核酸に相補的であり、こ
れにプライマーがアニールしてマトリックス結合増幅核
酸配列を与える）、 （ｄ）増幅、マトリックス固定標
的核酸の一部とハイブリダイズし得る一本鎖ポリヌクレ
オチド断片に付着したラベル系の少なくとも１つの成分
からなるポリヌクレオチドプローブからなる［００３０
１ この観点の他の態様によれば、（ａ）ハイブリッドを形
成すべく一本鎖標的核酸と意図するそれぞれの一本鎖標
的核酸についてのマトリックス固定捕捉ポリヌクレオチ
ドとを接触させ、（ｂ）ハイブリダイズした標的核酸を
サンプルから分離し、（ｃ）標的核酸のコピー数を増幅
してマトリックス結合増幅コピー数の標的核酸を生成し
、（ｄ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピ
ー数と増幅した標的核酸の一部にハイブリダイズし得る
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少な
くとも１つの成分からなるポリヌクレオチドプローブと
を接触させ、（ｅ）ハイブリダイズさせて増幅した標的
核酸とプローブとの複合体を形成し、 （ｆ）必要に応
じて結合プローブを全ゆる未結合核酸から分離し、（ｇ
）結合レベルを観察することにより結合した増幅標的の
存在または非存在を測定することからなる方法が提供さ
れる。 ［００３１］ この観点の他の態様は組成物であり、これは、（ａ）意
図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのマトリック
ス固定捕捉ポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは
、その標的核酸の相補的部分に選択的にアニールし得る
）、（ｂ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸について
のオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマーは、
その標的核酸の相補的部分に選択的にアニールし得る）
（ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチ
ド、（ｄ）プライマーおよびオリゴヌクレオチドから延
長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖
の標的核酸に相補的であり、これに対してプライマーが
アニールする）、（ｅ）標的核酸の第１部分にハイブリ
ダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着し
たラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌ
クレオチドプローブ、（ｆ）標的核酸の第２部分にハイ
ブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付
着した第１実体からなる第２ポリヌクレオチドプローブ
、並びに（ｇ）第１実体に特異的に結合し得る第２実体
が付着したマトリックスからなる。 ［００３２］ この観点の他の態様は方法であり、これは、（ａ゛）ハ
イブリダイズし得る条件下で、一本鎖標的核酸と意図す
るそれぞれの一本鎖標的核酸についての少なくとも１つ
のマトリックス付着捕捉ポリヌクレオチドとを接触させ
（このポリヌクレオチドは、その標的核酸の相補的部分
に選択的にアニールすることができる）、（ｂ）ハイブ
リダイズした標的核酸をサンプルから分離し、（ｃ）捕
捉配列と重複しないプライマーを添加することにより標
的核酸のコピー数を増幅して未結合増幅コピー数の標的
核酸を生成し、（ｄ）複合体を形成すべく未結合増幅標
的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし
得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル
系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチ
ドプローブ、（ｉｉ）標的核酸の第一２部分とハイブリ
ダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着し
た第１実体からなる第２ポリヌクレオチドプローブとを
接触させ、（ｅ）複合体と第１実体に特異的に結合し得
る第２実体が付着核酸から分離し、（ｇ）結合ラベルを
観察することにより結合増幅標的核酸の存在または非存
在を測定することからなる。 ［００３３］ 他の観点では、本発明によれば、マーカー核酸を含有し
標的核酸を含有する可能性のあるサンプル中で、一本鎖
標的核酸を測定しその増幅の効率を確証する組成物が提
供される。１つの態様では、この組成物は、（ａ）反応
帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌ
クレオチドプライマー（このプライマーは、一本鎖標的
核酸の相補的部分に選択的にアニールすることができる
）、（ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖マーカー核酸
についてのオリゴヌクレオチドプライマー（そのコピー
数は既知である）（このプライマーは、一本鎖マーカー
核酸の相補的部分に選択的にアニールすることができる
） （ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレ
オチド、（ｄ）プライマーおよびモノヌクレオチドから
反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ
（これはそれぞれ一本鎖の標的およびマーカー核酸に相
補的であり、これに対してプライマーがアニールする）
、（ｅ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る第
１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少
なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド標的
プローブ、（ｆ）反応帯域から離間した第１試験帯域に
結合し、標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第
２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第２ポリヌクレ
オチド標的プローブ、（ｇ）マーカー核酸の第１部分と
ハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片
に付着した第２ラベル系の少なくとも１つの成分からな
る第１ポリヌクレオチドマーカープローブ、並びに（ｈ
）反応帯域および第１試験帯域から離間した第２試験帯
域に結合し、マーカー核酸の第２部分にハイブリダイズ
し得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第２ポ
リヌクレオチドマーカープローブからなる。 ［００３４］ この観点の他の態様は方法であり、これは、（ａ）反応
帯域中でサンプルと一本鎖標的核酸の相補的部分に選択
的にアニールし得るオリゴヌクレオチドプライマーとを
接触させ、（ｂ）反応帯域中で既知のコピー数のマーカ
ー核酸を含有するサンプルと一本鎖マーカー核酸の相補
的部分に選択的にアニールし得るオリゴヌクレオチドプ
ライマーとを接触させ、（ｃ）核酸ポリメラーゼとの接
触により反応帯域中で標的およびマーカー核酸のコピー
数を増幅し、（ｄ）反応帯域中でハイブリダイズし得る
条件下で、増幅したコピー数の標的およびマーカー核酸
と（ｉ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る第
１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１ラベル系
の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド
標的プローブおよび（ｉ ｉ）マーカー核酸の第１部分
とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断
片に付着した第２ラベル系の少なくとも１つの成分から
なる第１ポリヌクレオチドマーカープローブとを接触さ
せ、（ｅ）第１マーカーおよび標的プローブと増幅した
コピー数のマーカー核酸および存在し得る全ゆる標的核
酸とをそれぞれハイブリダイズさせてマーカーおよび標
的ハイブリッドを形成し、（ｆ）反応帯域から離間した
第１試験帯域中でかくして処理したサンプルの第１分画
と第１試験帯域に結合した第２ポリヌクレオチド標的プ
ローブとを接触させて第２標的プローブと存在する全ゆ
る増幅したコピー数の標的核酸とをハイブリダイズさせ
、 （ｇ）反応帯域および第１試験帯域から離間した第
２試験帯域中でかくして処理されたサンプルの第２分画
と第２試験帯域に結合した第２ポリヌクレオチドマーカ
ープローブとを接触させて第２マーカープローブと増幅
したコピー数のマーカー核酸とをハイブリダイズさせ、
（ｈ）必要に応じて試験帯域から全ゆる未結合核酸を
分離し、（ｉ）第１試験帯域中に存在する全ゆる標的核
酸のコピー数および第２試験帯域中のマーカー核酸のコ
ピー数を測定することからなる。前記した態様では、第
１および第２ラベル系は同一または異なるものとするこ
とができる。 ［００３５］ この観点の他の態様は組成物であり、これは、（ａ）反
応帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴ
ヌクレオチドプライマー（このプライマーは、一本鎖標
的核酸の相補的部分に選択的にアニールすることができ
る） （ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖核酸につ
いてのオ史ゴヌクレオチドプライマ−（サンプル中のそ
のコピー数は既知である）（このプライマーは、一本鎖
マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニールすること
ができる） （ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノ
ヌクレオチド、 （ｄ）プライマーおよびモノヌクレオ
チドがら反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸ポリ
メラーゼ（これはそれぞれ一本鎖の標的およびマーカー
核酸に相補的であり、これにプライマーがアニールする
）（ｅ）標的核酸の第１部分にハイブリダイズし得る第
１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１ラベル系
の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド
標的プローブ、（ｆ）標的核酸の第２部分にハイブリダ
イズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した
第１実体からなる第２ポリヌクレオチド標的プローブ、
（ｇ）第１実体に特異的に結合し得る第２実体が結合し
た標的試験帯域、（ｈ）マーカー核酸の第１部分にハイ
ブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付
着した第２ラベル系の少なくとも１つの成分からなる第
１ポリヌクレオチドマーカープローブ、（ｉ）マーカー
核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリ
ヌクレオチド断片に付着した第３実体からなる第２ポリ
ヌクレオチドマーカープローブ、並びに（ｊ）第３実体
と特異的に結合し得る第４実体が結合した標的試験帯域
からなる。 ［００３６］ 前記した態様では、第１および第２ラベル系は同一とす
ることができ、この場合、第１および第２結合実体対は
第３および第４結合実体対と異なる。また、第１および
第２ラベル系が識別し得る程異なる場合、第１および第
２結合実体対は第２および第４結合実体対と同一とする
ことができる。 ［００３７］ この観点の他の態様は方法であり、これは、（ａ）反応
帯域中でサンプルとそれぞれの一本鎖標的核酸について
のオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させ（このプ
ライマーは、一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にア
ニールすることができる） （ｂ）反応帯域中でサン
プルとそれぞれの一本鎖マーカー核酸についてのオリゴ
ヌクレオチドプライマーとを接触させ（サンプル中のそ
のコピー数は既知であり、このプライマーは、一本鎖マ
ーカー核酸の相補的部分に選択的にアニールすることが
できる）、（ｃ）サンプルと核酸ポリメラー ゼとを接
触させることにより、反応帯域中でサンプル中の標的お
よびマーカー核酸のコピー数を増幅し、（ｄ）反応帯域
中で、ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー
分とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド
断片からなる第１ポリヌクレオチド標的プローブおよび
（ｉ ｉ）標的核酸の第２部分にハイブリダイズし得る
第２一本鎖ポリヌクレオチド断片および第２ポリヌクレ
オチド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌクレ
オチド標的プローブとを接触させ、（ｅ）反応帯域中で
、ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー数の
マーカー核酸と（ｉ）ラベル部分およびラベルに付着し
たマーカー核酸の第１部分にハイブリダイズし得る第１
一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第１ポリヌクレオ
チドマーカープローブおよび（ｉｉ）マーカー核酸の第
２部分とハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオ
チド断片および第２ポリヌクレオチド断片に付着した第
３実体からなる第２ポリヌクレオチドマーカープローブ
とを接触させ、（ｆ）（ｉ）第１および第２標的プロー
ブと存在する全ゆる増幅したコピー数の標的核酸との、
および（ｉ ｉ）第１および第２マーカープローブと存
在する増幅したコピー数のマーカー核酸とのハイブリダ
イゼーションを行い、（ｇ）工程（ａ）〜（ｆ）で処理
したサンプルの分画と第１試験帯域（これは反応帯域か
ら離間し、これに第２実体が結合する）中の第１実体と
特異的に結合し得る第２実体とを接触させ、（ｈ）かく
して工程（ａ）〜（ｆ）で処理したサンプルの他の分画
と第２試験帯域（これは反応帯域および第１試験帯域か
ら離間し、これに第４実体が結合する）中の第３実体と
特異的に結合し得る第４実体とを接触させ、（ｉ）試験
帯域に結合した核酸を全ゆる未結合核酸から分離し、（
Ｄ増幅されたマーカー核酸のコピー数および全ゆる標的
核酸の存在または非存在を測定することからなる。 ［００３８］ 更に他の観点では、本発明によれば、試験に供するサン
プル中の複数の一本鎖標的核酸を増幅し検出する組成物
が提供される。多数の組合せのポリヌクレオチドプライ
マーにより、単一の増幅反応混合物内での１以上の標的
核酸配列の特異的な増幅が可能となり、第１および第２
ポリヌクレオチドプローブの多数の組合せの使用により
、増幅された標的核酸配列の１以上の検出が可能となる
。これらの組成物は、陰性の結果の信頼性を確立するた
めに増幅反応の効率の測定を単純化するのに有用である
。またこれらは、試験に供する特定のサンプル上で１以
上の測定を同時に行うのに有用である。 ［００３９］ １つの態様では、この発明によればミ試験に供するサン
プル中の複数の一本鎖標的核酸を測定する組成物が提供
される。この組成物は、（ａ）意図するそれぞれの一本
鎖標的核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマー（
このプライマーのそれぞれは、一本鎖の標的核酸の１つ
の相補的部分に選択的にアニールすることができる）、
（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、
（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから反応帯域
中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（この延
長生成物は、一本鎖の標的核酸に相補的であり、これに
特定のプライマーがアニールする）、（ｄ）ラベル部分
およびラベル部分に付着した第１一本鎖ポリヌクレオチ
ド断片からなるそれぞれの核酸標的についての第１ポリ
ヌクレオチドプローブ（第」一本鎖ポリヌクレオチド断
片のそれぞれは、そのそれぞれの標的核酸の第１部分に
ハイブリダイズし得る） （ｅ）その標的核酸の第２
部分にハイブリダイズし得てそれぞれの他の標的核酸試
験帯域から離間した試験帯域に結合した第２一本鎖ポリ
ヌクレオチド断片からなるそれぞれの核酸標的について
の第２ポリヌクレオチドプローブからなる。 ［００４０］ この観点の他の態様では、この発明によれば、試験に供
するサンプル中の複数の一本鎖標的核酸を測定する組成
物が提供される。この組成物は、 （ａ）意図するそれ
ぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌクレオチドプ
ライマー（このプライマーのそれぞれは、一本鎖の標的
核酸の１つの相補的部分に選択的にアニールすることが
できる）、（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌク
レオチド、（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドか
ら反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸ポリ、メラ
ーゼ（この延長生成物は、特定のプライマーがアニール
する一本鎖の標的核酸に相補的である）、（ｄ）その標
的核酸の第１部分にハイブリダイズし得る第１一本鎖ポ
リヌクレオチド断片に付着したラベルからなるそれぞれ
の核酸標的についての第１ポリヌクレオチドプローブ、
（ｅ）その標的核酸の第２部分にハイブリダイズし得
る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片および第２ポリヌク
レオチド断片に付着した特異的結合実体からなるそれぞ
れの核酸標的につぃての第２ポリヌクレオチドプローフ
、並びに（ｆ）それぞれ反応帯域およびそれぞれの他の
試験帯域から離間し、結合パートナ−（これは意図する
標的核酸についての第２プローブに付着した特異的結合
実体とのみ結合し得る）がそれぞれ付着した複数の試験
帯域からなる。 ［００４１］ 他の観点では、この発明によれば、増幅の特性とハイブ
リダイゼーション凝集のものとを組合せる組成物および
方法が提供される。ハイブリダイゼーション凝集は、１
９８７年１月１５日に米国出願第００５，３２７号とし
て出願されたエンゲルハードとラバ二の「遺伝物質の検
出のためのハイブリダイゼーション方法」と題する共に
譲渡され同時係属中の出願に詳述されている。この出願
の開示を参考としてここに取り入れる。この出願は、米
国出願番号第６５３，８１６号（１９８４年９月２４日
出願）から誘導され、これは米国出願番号第６０５，０
２２ （１９８４年４月２７日出願）から誘導される。 ［００４２］ この観点の１つの態様は組成物であり、これは、（ａ）
意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌ
クレオチドプライマー（このプライマーは、一本鎖標的
核酸の相補的部分に選択的にアニールすることができる
）、（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチ
ド、（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長
生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の
標的核酸に相補的であり、これにプライマーがアニール
して増幅した核酸配列を与える）（ｄ）標的核酸の第１
部分に相補的な複数の第１一本鎖ポリヌクレオチド断片
が付着した第１粒子からなる第１ポリヌクレオチドプロ
ーブ、並びに（ｅ）標的核酸の第２部分に相補的な複数
の第２一本鎖ポリヌクレオチド断片が付着した第２粒子
からなる第２ポリヌクレオチドプローブからなる。 ［００４３］ この観点の他の態様によれば、その方法が提供され、（
ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、（ｂ）ハイブリダイ
ズし得る条件下で、標的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部
分に相補的な複数の第１一本鎖ポリヌクレオチド断片が
付着した第１粒子からなる第１ポリヌクレオチドプロー
ブおよび（ｉ ｉ）標的核酸の第２部分に相補的な複数
の第２一本鎖ポリヌクレオチド断片が付着した第２粒子
からなる第２ポリヌクレオチドプローブとを接触させ、
（ｃ）第１ポリヌクレオチド断片と標的核酸の第１部
分および第２断片と標的核酸の第２部分とをノ＼イブリ
ダイズさせ、ハイブリダイゼーションにより結果的に凝
集を与え、 （ｄ）凝集を測定する工程からなる。 ［００４４］
た組成物および方法が、特異的なりＮＡ配列の増幅の記
載された有用性を十分に活用するのに必要であることが
認められた。本発明によれば、後記する評価基準が充足
された。これは十分に感度が高く、このため増幅の工程
は最小限に維持された。これは適切に特異的であり、こ
のため全ゆる非特異的増幅は誤りなく陽性でないと記録
される。 これは大量の臨床試験への応用が可能であり、更に好ま
しくは自動化に容易に適用することができる。 ［００１７］ 所定の態様の更なる利点は、これらは増幅の効率を見積
る方法論を提供するため、意図する配列についての陰性
の結果は、増加した確実性をもって陰性であると記録さ
れる点である。またこの種の系により、１つのサンプル
内で単一のアッセイ操作により複数の標的核酸配列を増
幅および検出する単純化された方法も可能となる。この
種の方法の付加的な利点は、これらが増幅サイクルの前
に意図する標的核酸配列を部分精製する単純で危険性の
ない方法論を提供することである［００１８］ 先に示したように、本発明によれば、サンプル中の核酸
分析物の存在または非存在を測定する組成物および方法
が提供される。 ［００１９］ 試験を行うサンプル液体には、生物的、生理的、工業的
、環境的並びに他の種類の液体が包含される。特に意図
するものは生物的液体であり、例えば血清、血漿、尿、
脳を髄液、唾液、ミルクブロスおよび他の培養媒体並び
に上澄、更にこれらのいずれかの混合物または分画があ
る。意図する生理的液体には、注射溶液、緩衝液、防腐
または抗微生物溶液等が包含される。工業的液体には、
発酵培地および使用される他の加工液体が包含され、例
えば薬剤の製造におけるもの、乳製品およびマルト飲料
がある。従来の方法によ−って試験されるサンプル液体
の他の供給源は、使用するこの用語によって企図され、
本発明に従ってアッセイすることができる。また、試験
を企図するものには組織サンプルがあり、例えば、髪バ
イオプシーまたは組織切片サンプルが包含され、新鮮、
凍結またはバラフインに包埋されたものであることを問
わない。 ［００２０１ 用語「分析物」または「標的」は、その存在がサンプル
液体中で定性的または定量的に測定される全ゆる核酸含
有物質を意図する。分析物は、通常はオリゴまたはポリ
ヌクレオチドであり、これに対して相補的な核酸配列が
存在するか、またはこれを調製することができるもので
ある。分析物または標的は通常はＲＮＡまたはＤＮＡで
ある。 ［００２１］ 用語「マトリックス」または「試験帯域」は、キャリヤ
または支持体を意図し、例えば、顕微鏡スライド、マイ
クロタイタ穴、粒子等であり、その試験で使用する試験
サンプル、水または生理的液体および試薬に露呈された
場合、これは不溶性でありその構造的一貫性を維持する
。適切な材料には、ガラスまたは有機プラスチック材料
が包含され、例えばポリスチレン、ポリプロピレン等が
ある。 ［００２２］ 用語「普遍的検出」、「普遍的ラベル捕捉部分」並びに
「普遍的ラベル」は、「ポリヌクレオチド配列を利用す
るアッセイ方法」と題し、米国出願番号第９２２．７５
７号を有し、１９８６年１０月２４日に出願され共に譲
渡されたベルゴリジらに対する同時係属中の出願に記載
されたラベル系を意図する。この出願の開示を参考とし
てここに取り入れる。 ［００２３］ 前記したコピー数の増幅は、例えばポリメラーゼ鎖反応
または核酸材料の遺伝型として特異的な蛋白質を再生す
ることにより行うことができる（例えば、転写に基く増
幅）。 ［００２４］ 後記するように、第１および第２実体の例には、１つの
実体がリガンドであり他の実体がそのレセプターである
もの、第１および第２実体が相補的ポリヌクレオチド単
独重合体であるもの、１つの実体が抗原またはハプテン
であり他の実体が抗原またはハプテンに対するその抗体
または特異的結合断片であるもの、１つの実体がホルモ
ンであり他の実体がそのレセプターであるもの、１つの
実体が酵［００２５］ ［００２６］ 特開平４−１４１０９？） （３９） ブリダイズし得る条件下で、かくして形成された全ゆる
ハイブリッドと、標的核酸の第２部分とハイブリダイズ
し得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなるマトリ
ックス固定第２ポリヌクレオチドプローブとを接触させ
て結合複合体を形成し、（ｄ）必要に応じて結合複合体
を全ゆる未結合核酸から分離し、（ｅ）普遍的ラベルの
存在または非存在を捕捉して観察することにより増幅さ
れた標的核酸の存在または非存在を測定することからな
る。 ［００２７］ 第２の観点では、この発明によれば、試験に供するサン
プル中の一本鎖標的核酸を測定する組成物が提供される
。この組成物は、（ｉ）それぞれの一本鎖標的核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマー
は、一本鎖の標的核酸の相補的部分に選択的にアニール
することができる）、（ｉ ｉ）４つの核酸塩基のそれ
ぞれについてのモノヌクレオチド、（ｉ ｉ ｉ）プラ
イマーおよびモノヌクレオチドから延長生成物を生成し
得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的核酸に相補
的であり、これに対してプライマーがアニールする）、
（ｉ ｖ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る
第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の
少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチドプ
ローブ、（ｖ）標的核酸の第２部分とハイブリダイズし
得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１実
体からなる第２ポリヌクレオチドプローブ、並びに（ｖ
ｉ）第１実体と特異的に結合し得る第２実体が付着した
マトリックスからなる。 ［００２８］ 更にこの観点に関し、この発明によれば、試験に供する
サンプル中の一本鎖標的核酸を測定する方法が提供され
る。この方法は、（ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、
（ｂ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー
数の標的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分にハイブリダ
イズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した
ラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１−ポリヌ
クレオチドプローブ、（ｉ ｉ）標的核酸の第２部分と
ハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片
に付着した第１実体からなる第２ポリヌク：・、オチド
プローブ、並びに（ｉ ｉ ｉ）第１実体と特異的に結
合し得る第２実体が付着したマトリックスとを接触させ
、（ｃ）第１および第２プローブと存在する全ゆる増幅
したコピー数の標的核酸とのハイブリダイゼーションお
よび第１実体と第２実体との結合を行って結合複合体を
生成し、 （ｄ）必要に応じて結合複合体を全ゆる未結
合核酸から分離し、（ｅ）増幅したコピー数の標的核酸
の存在または非存在を測定することからなる。 ［００２９］ この発明の他の観点によれば、一本鎖標的核酸およびそ
の試薬の増幅および検出の効率を改良する予備増幅捕捉
工程について提供される。１つの態様によれば組成物が
提供され、これは、（ａ）意図するそれぞれの一本鎖標
的核酸についてのマトリックス捕捉ポリヌクレオド（こ
のポリヌクレオチドは、その標的核酸の相補的部分に選
択的にアニールすることができると共にその標的核酸の
プライマーとして機能する）、（ｂ）４つの核酸塩基の
それぞれのモノヌクレオチド、（ｃ）プライマーおよび
モノヌクレオチドから延長生成物を生成し得る核酸ポリ
メラーゼ（これは一本鎖の標的核酸に相補的であり、こ
れにプライマーがアニールしてマトリックス結合増幅核
酸配列を与える）、 （ｄ）増幅、マトリックス固定標
的核酸の一部とハイブリダイズし得る一本鎖ポリヌクレ
オチド断片に付着したラベル系の少なくとも１つの成分
からなるポリヌクレオチドプローブからなる［００３０
１ この観点の他の態様によれば、（ａ）ハイブリッドを形
成すべく一本鎖標的核酸と意図するそれぞれの一本鎖標
的核酸についてのマトリックス固定捕捉ポリヌクレオチ
ドとを接触させ、（ｂ）ハイブリダイズした標的核酸を
サンプルから分離し、（ｃ）標的核酸のコピー数を増幅
してマトリックス結合増幅コピー数の標的核酸を生成し
、（ｄ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピ
ー数と増幅した標的核酸の一部にハイブリダイズし得る
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少な
くとも１つの成分からなるポリヌクレオチドプローブと
を接触させ、（ｅ）ハイブリダイズさせて増幅した標的
核酸とプローブとの複合体を形成し、 （ｆ）必要に応
じて結合プローブを全ゆる未結合核酸から分離し、（ｇ
）結合レベルを観察することにより結合した増幅標的の
存在または非存在を測定することからなる方法が提供さ
れる。 ［００３１］ この観点の他の態様は組成物であり、これは、（ａ）意
図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのマトリック
ス固定捕捉ポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは
、その標的核酸の相補的部分に選択的にアニールし得る
）、（ｂ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸について
のオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマーは、
その標的核酸の相補的部分に選択的にアニールし得る）
（ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチ
ド、（ｄ）プライマーおよびオリゴヌクレオチドから延
長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖
の標的核酸に相補的であり、これに対してプライマーが
アニールする）、（ｅ）標的核酸の第１部分にハイブリ
ダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着し
たラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌ
クレオチドプローブ、（ｆ）標的核酸の第２部分にハイ
ブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付
着した第１実体からなる第２ポリヌクレオチドプローブ
、並びに（ｇ）第１実体に特異的に結合し得る第２実体
が付着したマトリックスからなる。 ［００３２］ この観点の他の態様は方法であり、これは、（ａ゛）ハ
イブリダイズし得る条件下で、一本鎖標的核酸と意図す
るそれぞれの一本鎖標的核酸についての少なくとも１つ
のマトリックス付着捕捉ポリヌクレオチドとを接触させ
（このポリヌクレオチドは、その標的核酸の相補的部分
に選択的にアニールすることができる）、（ｂ）ハイブ
リダイズした標的核酸をサンプルから分離し、（ｃ）捕
捉配列と重複しないプライマーを添加することにより標
的核酸のコピー数を増幅して未結合増幅コピー数の標的
核酸を生成し、（ｄ）複合体を形成すべく未結合増幅標
的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし
得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル
系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチ
ドプローブ、（ｉｉ）標的核酸の第一２部分とハイブリ
ダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着し
た第１実体からなる第２ポリヌクレオチドプローブとを
接触させ、（ｅ）複合体と第１実体に特異的に結合し得
る第２実体が付着核酸から分離し、（ｇ）結合ラベルを
観察することにより結合増幅標的核酸の存在または非存
在を測定することからなる。 ［００３３］ 他の観点では、本発明によれば、マーカー核酸を含有し
標的核酸を含有する可能性のあるサンプル中で、一本鎖
標的核酸を測定しその増幅の効率を確証する組成物が提
供される。１つの態様では、この組成物は、（ａ）反応
帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌ
クレオチドプライマー（このプライマーは、一本鎖標的
核酸の相補的部分に選択的にアニールすることができる
）、（ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖マーカー核酸
についてのオリゴヌクレオチドプライマー（そのコピー
数は既知である）（このプライマーは、一本鎖マーカー
核酸の相補的部分に選択的にアニールすることができる
） （ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレ
オチド、（ｄ）プライマーおよびモノヌクレオチドから
反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ
（これはそれぞれ一本鎖の標的およびマーカー核酸に相
補的であり、これに対してプライマーがアニールする）
、（ｅ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る第
１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少
なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド標的
プローブ、（ｆ）反応帯域から離間した第１試験帯域に
結合し、標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第
２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第２ポリヌクレ
オチド標的プローブ、（ｇ）マーカー核酸の第１部分と
ハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片
に付着した第２ラベル系の少なくとも１つの成分からな
る第１ポリヌクレオチドマーカープローブ、並びに（ｈ
）反応帯域および第１試験帯域から離間した第２試験帯
域に結合し、マーカー核酸の第２部分にハイブリダイズ
し得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第２ポ
リヌクレオチドマーカープローブからなる。 ［００３４］ この観点の他の態様は方法であり、これは、（ａ）反応
帯域中でサンプルと一本鎖標的核酸の相補的部分に選択
的にアニールし得るオリゴヌクレオチドプライマーとを
接触させ、（ｂ）反応帯域中で既知のコピー数のマーカ
ー核酸を含有するサンプルと一本鎖マーカー核酸の相補
的部分に選択的にアニールし得るオリゴヌクレオチドプ
ライマーとを接触させ、（ｃ）核酸ポリメラーゼとの接
触により反応帯域中で標的およびマーカー核酸のコピー
数を増幅し、（ｄ）反応帯域中でハイブリダイズし得る
条件下で、増幅したコピー数の標的およびマーカー核酸
と（ｉ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る第
１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１ラベル系
の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド
標的プローブおよび（ｉ ｉ）マーカー核酸の第１部分
とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断
片に付着した第２ラベル系の少なくとも１つの成分から
なる第１ポリヌクレオチドマーカープローブとを接触さ
せ、（ｅ）第１マーカーおよび標的プローブと増幅した
コピー数のマーカー核酸および存在し得る全ゆる標的核
酸とをそれぞれハイブリダイズさせてマーカーおよび標
的ハイブリッドを形成し、（ｆ）反応帯域から離間した
第１試験帯域中でかくして処理したサンプルの第１分画
と第１試験帯域に結合した第２ポリヌクレオチド標的プ
ローブとを接触させて第２標的プローブと存在する全ゆ
る増幅したコピー数の標的核酸とをハイブリダイズさせ
、 （ｇ）反応帯域および第１試験帯域から離間した第
２試験帯域中でかくして処理されたサンプルの第２分画
と第２試験帯域に結合した第２ポリヌクレオチドマーカ
ープローブとを接触させて第２マーカープローブと増幅
したコピー数のマーカー核酸とをハイブリダイズさせ、
（ｈ）必要に応じて試験帯域から全ゆる未結合核酸を
分離し、（ｉ）第１試験帯域中に存在する全ゆる標的核
酸のコピー数および第２試験帯域中のマーカー核酸のコ
ピー数を測定することからなる。前記した態様では、第
１および第２ラベル系は同一または異なるものとするこ
とができる。 ［００３５］ この観点の他の態様は組成物であり、これは、（ａ）反
応帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴ
ヌクレオチドプライマー（このプライマーは、一本鎖標
的核酸の相補的部分に選択的にアニールすることができ
る） （ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖核酸につ
いてのオ史ゴヌクレオチドプライマ−（サンプル中のそ
のコピー数は既知である）（このプライマーは、一本鎖
マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニールすること
ができる） （ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノ
ヌクレオチド、 （ｄ）プライマーおよびモノヌクレオ
チドがら反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸ポリ
メラーゼ（これはそれぞれ一本鎖の標的およびマーカー
核酸に相補的であり、これにプライマーがアニールする
）（ｅ）標的核酸の第１部分にハイブリダイズし得る第
１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１ラベル系
の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド
標的プローブ、（ｆ）標的核酸の第２部分にハイブリダ
イズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した
第１実体からなる第２ポリヌクレオチド標的プローブ、
（ｇ）第１実体に特異的に結合し得る第２実体が結合し
た標的試験帯域、（ｈ）マーカー核酸の第１部分にハイ
ブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付
着した第２ラベル系の少なくとも１つの成分からなる第
１ポリヌクレオチドマーカープローブ、（ｉ）マーカー
核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリ
ヌクレオチド断片に付着した第３実体からなる第２ポリ
ヌクレオチドマーカープローブ、並びに（ｊ）第３実体
と特異的に結合し得る第４実体が結合した標的試験帯域
からなる。 ［００３６］ 前記した態様では、第１および第２ラベル系は同一とす
ることができ、この場合、第１および第２結合実体対は
第３および第４結合実体対と異なる。また、第１および
第２ラベル系が識別し得る程異なる場合、第１および第
２結合実体対は第２および第４結合実体対と同一とする
ことができる。 ［００３７］ この観点の他の態様は方法であり、これは、（ａ）反応
帯域中でサンプルとそれぞれの一本鎖標的核酸について
のオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させ（このプ
ライマーは、一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にア
ニールすることができる） （ｂ）反応帯域中でサン
プルとそれぞれの一本鎖マーカー核酸についてのオリゴ
ヌクレオチドプライマーとを接触させ（サンプル中のそ
のコピー数は既知であり、このプライマーは、一本鎖マ
ーカー核酸の相補的部分に選択的にアニールすることが
できる）、（ｃ）サンプルと核酸ポリメラー ゼとを接
触させることにより、反応帯域中でサンプル中の標的お
よびマーカー核酸のコピー数を増幅し、（ｄ）反応帯域
中で、ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー
分とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド
断片からなる第１ポリヌクレオチド標的プローブおよび
（ｉ ｉ）標的核酸の第２部分にハイブリダイズし得る
第２一本鎖ポリヌクレオチド断片および第２ポリヌクレ
オチド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌクレ
オチド標的プローブとを接触させ、（ｅ）反応帯域中で
、ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー数の
マーカー核酸と（ｉ）ラベル部分およびラベルに付着し
たマーカー核酸の第１部分にハイブリダイズし得る第１
一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第１ポリヌクレオ
チドマーカープローブおよび（ｉｉ）マーカー核酸の第
２部分とハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオ
チド断片および第２ポリヌクレオチド断片に付着した第
３実体からなる第２ポリヌクレオチドマーカープローブ
とを接触させ、（ｆ）（ｉ）第１および第２標的プロー
ブと存在する全ゆる増幅したコピー数の標的核酸との、
および（ｉ ｉ）第１および第２マーカープローブと存
在する増幅したコピー数のマーカー核酸とのハイブリダ
イゼーションを行い、（ｇ）工程（ａ）〜（ｆ）で処理
したサンプルの分画と第１試験帯域（これは反応帯域か
ら離間し、これに第２実体が結合する）中の第１実体と
特異的に結合し得る第２実体とを接触させ、（ｈ）かく
して工程（ａ）〜（ｆ）で処理したサンプルの他の分画
と第２試験帯域（これは反応帯域および第１試験帯域か
ら離間し、これに第４実体が結合する）中の第３実体と
特異的に結合し得る第４実体とを接触させ、（ｉ）試験
帯域に結合した核酸を全ゆる未結合核酸から分離し、（
Ｄ増幅されたマーカー核酸のコピー数および全ゆる標的
核酸の存在または非存在を測定することからなる。 ［００３８］ 更に他の観点では、本発明によれば、試験に供するサン
プル中の複数の一本鎖標的核酸を増幅し検出する組成物
が提供される。多数の組合せのポリヌクレオチドプライ
マーにより、単一の増幅反応混合物内での１以上の標的
核酸配列の特異的な増幅が可能となり、第１および第２
ポリヌクレオチドプローブの多数の組合せの使用により
、増幅された標的核酸配列の１以上の検出が可能となる
。これらの組成物は、陰性の結果の信頼性を確立するた
めに増幅反応の効率の測定を単純化するのに有用である
。またこれらは、試験に供する特定のサンプル上で１以
上の測定を同時に行うのに有用である。 ［００３９］ １つの態様では、この発明によればミ試験に供するサン
プル中の複数の一本鎖標的核酸を測定する組成物が提供
される。この組成物は、（ａ）意図するそれぞれの一本
鎖標的核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマー（
このプライマーのそれぞれは、一本鎖の標的核酸の１つ
の相補的部分に選択的にアニールすることができる）、
（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、
（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから反応帯域
中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（この延
長生成物は、一本鎖の標的核酸に相補的であり、これに
特定のプライマーがアニールする）、（ｄ）ラベル部分
およびラベル部分に付着した第１一本鎖ポリヌクレオチ
ド断片からなるそれぞれの核酸標的についての第１ポリ
ヌクレオチドプローブ（第」一本鎖ポリヌクレオチド断
片のそれぞれは、そのそれぞれの標的核酸の第１部分に
ハイブリダイズし得る） （ｅ）その標的核酸の第２
部分にハイブリダイズし得てそれぞれの他の標的核酸試
験帯域から離間した試験帯域に結合した第２一本鎖ポリ
ヌクレオチド断片からなるそれぞれの核酸標的について
の第２ポリヌクレオチドプローブからなる。 ［００４０］ この観点の他の態様では、この発明によれば、試験に供
するサンプル中の複数の一本鎖標的核酸を測定する組成
物が提供される。この組成物は、 （ａ）意図するそれ
ぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌクレオチドプ
ライマー（このプライマーのそれぞれは、一本鎖の標的
核酸の１つの相補的部分に選択的にアニールすることが
できる）、（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌク
レオチド、（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドか
ら反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸ポリ、メラ
ーゼ（この延長生成物は、特定のプライマーがアニール
する一本鎖の標的核酸に相補的である）、（ｄ）その標
的核酸の第１部分にハイブリダイズし得る第１一本鎖ポ
リヌクレオチド断片に付着したラベルからなるそれぞれ
の核酸標的についての第１ポリヌクレオチドプローブ、
（ｅ）その標的核酸の第２部分にハイブリダイズし得
る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片および第２ポリヌク
レオチド断片に付着した特異的結合実体からなるそれぞ
れの核酸標的につぃての第２ポリヌクレオチドプローフ
、並びに（ｆ）それぞれ反応帯域およびそれぞれの他の
試験帯域から離間し、結合パートナ−（これは意図する
標的核酸についての第２プローブに付着した特異的結合
実体とのみ結合し得る）がそれぞれ付着した複数の試験
帯域からなる。 ［００４１］ 他の観点では、この発明によれば、増幅の特性とハイブ
リダイゼーション凝集のものとを組合せる組成物および
方法が提供される。ハイブリダイゼーション凝集は、１
９８７年１月１５日に米国出願第００５，３２７号とし
て出願されたエンゲルハードとラバ二の「遺伝物質の検
出のためのハイブリダイゼーション方法」と題する共に
譲渡され同時係属中の出願に詳述されている。この出願
の開示を参考としてここに取り入れる。この出願は、米
国出願番号第６５３，８１６号（１９８４年９月２４日
出願）から誘導され、これは米国出願番号第６０５，０
２２ （１９８４年４月２７日出願）から誘導される。 ［００４２］ この観点の１つの態様は組成物であり、これは、（ａ）
意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌ
クレオチドプライマー（このプライマーは、一本鎖標的
核酸の相補的部分に選択的にアニールすることができる
）、（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチ
ド、（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長
生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の
標的核酸に相補的であり、これにプライマーがアニール
して増幅した核酸配列を与える）（ｄ）標的核酸の第１
部分に相補的な複数の第１一本鎖ポリヌクレオチド断片
が付着した第１粒子からなる第１ポリヌクレオチドプロ
ーブ、並びに（ｅ）標的核酸の第２部分に相補的な複数
の第２一本鎖ポリヌクレオチド断片が付着した第２粒子
からなる第２ポリヌクレオチドプローブからなる。 ［００４３］ この観点の他の態様によれば、その方法が提供され、（
ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、（ｂ）ハイブリダイ
ズし得る条件下で、標的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部
分に相補的な複数の第１一本鎖ポリヌクレオチド断片が
付着した第１粒子からなる第１ポリヌクレオチドプロー
ブおよび（ｉ ｉ）標的核酸の第２部分に相補的な複数
の第２一本鎖ポリヌクレオチド断片が付着した第２粒子
からなる第２ポリヌクレオチドプローブとを接触させ、
（ｃ）第１ポリヌクレオチド断片と標的核酸の第１部
分および第２断片と標的核酸の第２部分とをノ＼イブリ
ダイズさせ、ハイブリダイゼーションにより結果的に凝
集を与え、 （ｄ）凝集を測定する工程からなる。 ［００４４］
実施例上
Ｅ−Ｂ （Ｅｐ ｓ ｔ ｅ １ｎ−Ｂａ ｒ ｒ）ウ
ィルス（ＥＢＶ）（プラスミドＤＮＡの精製調製物並び
にＥＢＶ感染リンパ球細胞の組成細胞溶解物中に含有さ
れる）を、ポリメラーゼ鎖反応技術により酵素的に増幅
し、ハイブリッド捕捉により検出した。 ［００４５］ 試薬 特に記載しない限り、化学試薬はアルドリッチ社から購
入した。デテク１−ｈｒｐ、デデクー１ａｌｋ、バイオ
ブリッジＡ、ターミナルデオキシヌクレオチドトランス
フェラーゼおよびビオチン−１１−ｄＵＴＰは、エンシ
ー・バイオケム社から、サーマス・アクアチカス（Ｔａ
ｑ）ポリメラーゼは、ペルキン−エルマー／シータスか
ら購入した。ｐＵｃ１８はインターナショナル・バイオ
テクノロジイス社から得た。デオキシヌクレオシドトリ
リン酸および硫酸デキストランはファルマシアから得た
。オルソフェニレンジアミンジヒドロクロリド（○ＰＤ
）、ポルシン皮膚ゼラチン、過酸化水素、セファデック
スＧ−２５並びにトリトンＸ−１００はシグマから得た
。イムロン２マイクロメータプレートは、ダイナチック
から購入した。ホルムアミドはフル力から得た。ＲＰＭ
１１６４０培養培地および熱失活ウシ胎児血清はギブコ
から購入した。バイオジンＢ膜はパール・コーポレーシ
ョンから購入した。ヌシーブアカ゛ロースおよびセアケ
ムアガロ＝スはＦＭＣから購入した。 ［００４６］ ハイブリダイゼーションおよび検出アッセイで使用した
緩衝液は、次の保存溶液から調製した： １）２０ｘＳ
ＳＣ含有３ＭＮａＣ１，０，３Ｍクエン酸ナトリウム、
２）２０ｘＳＳＰＥ含有３．６ＭＮａＣ１，０，２Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４、並びに０．０２Ｍエ
チレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、３）クエン酸
リン酸緩衝液ｐＨ５，３（０，０５Ｍクエン酸および０
．１ＭＮａ２ＨＰＯ４を含有して組合せ５．３のｐＨを
与える）、４）１０ｘＰＢＳ （１゜５ＭＮａＣ１，０
，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，２を含有する）
、並びに５）デンハードの溶液（１％フィコール、１％
ポリビニルピロリドン並びに１％ウシ血清アルブミンを
含有する）。 ［００４７］ オリゴヌクレオチド合成、精製並びにラベルホスホルア
ミダイト法により、フプライド・バイオシステムス社装
置、モデル３８０Ｂによりオリゴヌクレオチドを合成し
た。０．２μｍｏｌおよび１μｍ。 １合成サイクルの両者を用いた。シアノエチルホスホル
アミダイトおよび試薬を製造業者により推奨されたよう
にして使用した。鎖延長の際のホスホルアミダイト添加
は、トリチルカチオンの遊離により監視した。オリゴヌ
クレオチドを支持体から開裂させた後にジメトキシトリ
チルエーテルとして保護された５′ヒドロキシルを残す
手順を使用した。合成および支持体からの開裂の後に、
オリゴマーを、５５°Ｃで一夜アンモニアにより処理す
ることにより脱保護し、溶液を続いて蒸発させて乾燥し
た。 ［００４８］ ５′−〇−ジメトキシトリチルオリゴヌクレオチドを１
ｍｌの１０ｍＭ）リエチルアンモニウム・ビカーボネー
ト、ｐＨ７，５〜９．０に再溶解し、ワットマン・パラ
チシルＭ−２００ＤＳ−３（ｃ１８半調製用）ＨＰＬＣ
カラムを使用して精製した。１：９９でアセトニトリル
：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７，０（Ｔ
ＥＡＡ）中でカラムを平衡化した。７５吸収単位（２６
０ｎｍ）までカラムに注入した。オリゴヌクレオチドを
、流速４ｍ１７分にて、１：９９アセトニトリル：ＴＥ
ＡＡを使用して１分間溶出させた後、２０分間かけて１
〜３０％アセトニトリル直線グラジェントを行った。ト
リチル化オリゴマーは、リチル化し、その後凍結乾燥し
た。最終精製は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム中でセファ
デックスＧ−２５クロマトグラフイにより行った。オリ
コ゛マーを含有する画分を凍結乾燥し、滅菌水に再懸濁
した。 ［００４９］ ７〜４０９５ （１９８８）に先に記載されたようにし
て、モル当り約３〜４ビオチン−１１−ｄＵＴＰ残基を
用いてオリゴヌクレオチドを３′末端ラベルした。 ハイブリッド捕捉アッセイについてのシグナルオリゴヌ
クレオチドは、０．２Ｍカコジル酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７，２，１ｍＭ２−メルカプトエタノール、ターミナ
ルトランスフェラーゼ（２０〜５０単位／μｇオリゴマ
ー） 、０．４ｍＭＴＴＰ並びに２０ ｐ ｇ ／ ｍ
ｌオリゴヌクレオチドを含有する反応混合物中で、Ｔ
ＭＰの重合体により３′末端ラベルした。反応を完了ま
で行わせ（３７°Ｃで９０分〜２時間）、最終濃度２５
ｍＭでＥＤＴＡを添加することにより終了させた。ビオ
チンラベルおよびポリエラベルしたオリゴヌクレオチド
を、更に精製することなく使用した。 ［００５０１ 郡雅Ａ堕社灰グ肌袈 Ｂ９５−８、ラジ、ナマルワとラモス細胞を、１０％熱
失活ウシつ児血清を含有するＲＰＭ１１６４０培地で維
持した。低速遠心により細胞を補集し、培地を除去し、
細胞を１０μｌのＰＢＳに再懸濁した。滅菌水によりサ
ンプル容積を４５μｍに増加させ、酵素的増幅に供した
。 ［００５１］ 増幅反応 ４５μｌ容量の精製したプラスミドＤ’Ｎ、Ａまたはリ
ンパ球細胞を９２°Ｃに１０分間加熱し、速やかに冷却
した。煮沸したサンプルを５５μｍ１の１．８Ｘ保存反
応緩衝液と混合し、最終反応混合物カミ ５０ｍＭＫＣ
ｌ、１０ｍＭ）リス−ＨのそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、並びに１μＭのそれぞれ
のオリゴヌクレオチドプライマーを含有するものとした
。２．５単位のＴａｑポリメラーゼを添加することによ
り反応を開始した。９２°Ｃでの１分間の変性工程、３
７°Ｃでの２分間のアニール工程、並びに７０’Ｃでの
３分間の延長工程により、サンプルを繰返し循環させた
。最後のサイクルの後、サンプルを１分間９２°Ｃに加
熱し、速やかに冷却した。 ［００５２］ ハイブリッドす捉および７出 ９６穴の独立した穴のイムロン２プレートを１Ｍ酢酸ア
ンモニウムにより２回リンスした。５０ｎｇの捕捉オリ
ゴヌクレオチドを、１Ｍ酢酸アンモニウム中にてプレー
トの穴に添加した。プレートを３７°Ｃで一夜インキユ
ベートして乾燥し、その後直ちに使用するか、使用の前
に４°Ｃで保存した。結合した捕捉オリゴヌクレオチド
を有するプレートを、調製物中で０．５ｘＳＳＣ１０，
１％トリトンＸ−１００により予備洗浄し、ハイブリッ
ド捕捉アッセイにおける使用を図った。 ［００５３］ 分析に供するサンプルを９２°Ｃで１０分間熱変性させ
、速やかに冷却し、滅菌水中で希釈した。希釈したサン
プルを、終濃度で２０％ホルムアミド、１ｘＳＳＰＥ、
２％硫酸デキストラン、１％トリトンＸ−１００並びに
５０ｎｇ／ｍｌのシグナルオリゴヌクレオチド（３′−
ポリＴ尾部を含有する）を含有するハイブリダイゼーシ
ョン溶液に添加した。それぞれのサンプルの１００μｍ
を三速でオリゴヌクレオチド被覆穴に添加し、（振盪し
つつ）１時間室温でハイブリダイズさせた。ハイブリダ
イゼーションの後、０．０５ｘＳＳＣ１０゜１％トリト
ンＸ−１００を用いて４回穴を洗浄し、バイオブリッジ
Ａ （２ｘＳＳＣ，０，１％トリトンＸ−１００中でエ
ンシーの仕様書により希釈）をそれぞれの穴に添加し、
室温で２．５分間インキュベートした。０ｙ５ｘＳＳＣ
１０，１％トリトンＸ−１００、並びにデテク１ｈｒｐ
ブランドのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ複合体により穴を３回洗浄し、０．５ＭＮａＣ１
，５ｍＭＥＤＴＡ、０．３％ゼラチン、０．２５％トリ
トンＸ−１００を含有するリン酸緩衝塩類溶液中で希釈
し、０．０１％チメロゾルをそれぞれの穴に添加し、室
温で１５分間（振盪しつつ）インキュベートした。０．
５ｘＳＳＣ，０，１％トリトンＸ−１００により穴を３
回洗浄し、その後５ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳによ
り３回洗浄した。クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５，３）
中に０．０１２５％過酸化水素および１．６ｍｇ／ｍｌ
オルソフェニレンジアミンを含有する１５０／、ｔｌの
反応混合物を添加することによりシグナルを生成させた
。５０ｐｌの４ＮＨ２Ｓ３’、５．５’−テトラメチル
ベンジデンのような他の発色性指示薬も使用することが
できる。 ［００５４］ 増幅した生成物を、０．０４Ｍ）リス−酢酸、０．００
２ＭＥＤＴＡ （ｐＨ８０）並びに０． ２μｇ／ｍ１
臭化エチジウム中に３％ヌシーブアガロース、１％セア
ケムアガロースを含有するアガロースゲル中で電気泳動
に供した。電気泳動の後、０．４ＮＮａＯＨ，０，６Ｎ
ＮａＣ１中でＤＮＡを変性させ、バイオジンＢ膜に対し
て一夜移行させた。６ｘＳＳＣ１５Ｘデンハードの溶液
、０． １％ＳＤＳ並びに１００１−ｔ ｇ ／ ｍ
１熱変性サケ精子ＤＮＡを含有する緩衝液中で、５５℃
にて６０分間膜を予備ハイブリダイズさせた。５５°Ｃ
で１０％硫酸デキストランを用い、予備ハイブリダイゼ
ーション緩衝液中に３′−ビオチン−１１−ｄＵＭＰ尾
部を含有するオリゴヌクレオチドＥＢＶ５ （１００ｎ
ｇ／ｍ１）（図１参照）にＤＮＡをハイブリダイズさせ
た。ハイブリダイゼーションの後、室温で３ｘＳＳＣ，
０，１％ＳＤＳにより１０分間膜を洗浄し、同じ緩衝液
中で５５０にて３回（洗浄当り１０分間）行った。膜を
、１００ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０） 、１００
ｍＭＮａＣＬ ３ｍＭＭｇＣ１２並びに０．５％ツイ
ーン２０（溶液Ａ）中でリンスし１、その後０．５％カ
ゼインを含有するＰＢＳにより。 １５分間予備ブロックした。デテク１−ａｌｋ中で室温
にて１５分間膜をインキュベートし、１００ｍＭ）リス
−ＨＣｌ （ｐＨ９，５）、１００ｍＭＮａＣ１、浄
した後、１００ｍＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ９，５）
、１０ ｒｎＭＭ ｇ Ｃ１２，１００ｍＭＮａＣ１，
７５ｍｇ ７ｍ ｌ 、：＝−トロブルー・テトラゾリ
ウム並びに５０ｍｇ／ｍ１５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルリン酸を含有する検出緩衝液を添加した。 フィルタを検出緩衝液から除去し、これを水でリンスす
ることにより、約５分後に発色の進行を停止した。 ［００５５］ ハイブリッド によるＥ−ＢウィルスＤＮＡ配置の
出精製プラスミドＤＮＡ調製物およびＥＢＶ感染リンパ
球細胞培養の粗製細胞溶解物中に含有されるＥ−Ｂウィ
ルス（ＥＢＶ）を、増幅および検出のための標的として
選択した。ＥＢＶのＩＲ１リピートは、ＥＢＶゲノム当
り約１０回繰り返されている。これは、チエラングとキ
ーフ、「Ｅ−ＢウィルスＤＮＡ中の長い内部直接リピー
ト」、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４４：２８６−２９４
（１９８２）に報告されている。ＩＲＩリピートの２４
６塩基対配列に延在する６のオリゴヌクレオチドを、共
役増幅／ハイブリッド捕捉アッセイでの使用のために選
択した。これらを図１の下部に示す。ＩＲＩ標的配列の
ハイブリダイゼーションおよび検出を至適にするため、
幾つかのオリゴヌクレオチド対を、プラスミドｐｃＦ１
（これはｐＵｃ１８ベクタ中にＩＲＩリピートのＢａｍ
Ｈ１開裂断片を含有する）を捕捉しシグナルするその能
力について、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて
試験した。それぞれの場合、１（または２）のオリゴヌ
クレオチドがイムロン２プレートの穴に結合し、標的配
列を捕捉するよう作用した。第２のオリゴヌクレオチド
（または２つのオリゴヌクレオチド）（ポリＴによる３
′末端ラベル）は、標的配列およびビオチン修飾ポリｄ
Ａ （バイオブリッジハブランド試薬）と協奏的にハイ
ブリダイズすることにより、シグナル反応において架橋
として作用した。過酸化水素およびＯＰＤの存在下で、
ストレプトアビジンおよびビオチニル化西洋ワサビペル
オキシダーゼの複合体を使用してビオチンを検出した。 ネガティブコントロールとして、ｐＵｃ１８中に１３ｋ
ｂサイトメガロウイルス（ｃＭＶ）ＤＮＡ挿入物を含有
するｐＡＫ８を、ＥＢＶ特異的オリゴヌクレオチドを使
用してアッセイした。図１に示す種々の組合せのオリゴ
ヌクレオチドとハイブリダイズした既知量のｐｃＦｌに
ついて標準曲線を作成した。 ［００５６］ 図２は、２つの異なる組合せのオリゴヌクレオチド対を
用いるハイブリダイゼーションの後に０．７８ｎｇ〜５
０ｎｇのｐｃＦｌを用いて作成した標準曲線を示す。増
幅されていないｐｃＦｌについてのハイブリダイゼーシ
ョンの検出限界含有するプラスミド、ｐＡＫ８はシグナ
ルを生成することができず、したがってアッセイの特異
性が示された。 ［００５７］ オリゴヌクレオチドＥＢＶ１およびＥＢＶ６を境界とす
る２４６ｂｐ配列（図１）を２５回のＰＣＲによる１ｐ
ｇのｐｃＦｌに供することにより酵素的に増幅した。増
幅の後、出発プラスミドＤＮＡの７８アトグラム〜２．
５フエムトグラムと等量の増幅反応混合物の一部を、Ｅ
ＢＶ５を捕捉オリゴヌクレオチドとしてポリ１尾部ＥＢ
Ｖ４をシグナルオリゴクレオチドとして使用してハイブ
リッド捕捉によりアッセイした。図３に、既知量の増幅
していないｐｃＦｌにより作成した標準曲線と比較し、
増幅した材料の４９０ｎｍの吸光度を示す。２５回の増
幅の後、共役ＰＣＲ／ハイブリッド捕捉アッセイでは、
１２．５〜４００モルの９２％の効率が示唆された（効
率は、ｎ＝増幅の回数、Ｘ＝それぞれのサイクルの平均
効率、並びにＹをｎサイクル後の収率として、Ｙ＝ （
１＋Ｘ） により計算した。ムリスとファローナ、「
ポリメラーゼ触媒鏡反応を介する試験管内でのＤＮＡの
特異的合成ｊ、Ｍｅｔｈｏ′ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、
１５５：３３５−３５０ （１９８７）を参照するとよ
い）。対照として、ｉｐｇのｐＡＫ８ＤＮＡを、ＥＢＶ
ｌおよびＥＢＶ６の存在下でＰＣＲにより２５回増幅し
、同様のハイブリッド補足手順によりアッセイした。元
のサンプルの５％（５０ｆ ｇ）に至るまでアッセイし
た場合でも、シグナルは全く与えられなかった。同様の
検討では、前記同様増幅しハイブリダイズさせた１０ｎ
ｇに及ぶ対照プラスミドＤＮＡにをＴａｑポリメラーゼ
の非存在下にＰＣＲを介してサイクルさせた場合、ハイ
ブリダイゼーションアッセイにおいてシグナルは全く与
えられなかった。 ［００５８］ 更に図１に示した配列を参照し、それぞれのシグナル／
捕捉オリゴヌクレオチド対について良好に機能する種々
のプライマーの組合せは、シグナル／捕捉オリゴヌクレ
オチド対４および５および／または２および３について
プライマー１および６、シグナル／捕捉オリゴヌクレオ
チド対４および５についてプライマー２および６、シグ
ナル／捕捉オリゴヌクレオチド対４および５についてプ
ライマー３および６、シグナル／捕捉オリゴヌクレオチ
ド対２および３についてプライマー１および５、並びに
シグナル／捕捉オリゴヌクレオチド対２および３につい
てプライマー１および４であった。 ［００５９］ 増幅手順に渡って標的ＤＮＡの量の相対的増加を測定す
るため、プライマーＥＢＶ１ およびＥＢＶ６（７）存
在下に０〜３５回のＰＣＲを介ｔ、てｌＯｐｇのｐｃＦ
ｌおよびｐＡＫ８をサイクルさせた。５回の時点で増幅
反応を停止し、０．０３％の反応混合物をアッセイした
。図４に示すように、２０回の増幅の後にシグナルが最
初に検出された。このシグナルは標的ＤＮＡの１．７Ｘ
１０５倍の増加に対応し、８０％の増幅の効率を示唆す
る。一連の増幅の回で標的ＤＮＡの量が増加し、３５回
で僅か０．０３％の反応混合物により生成したシグナル
がアッセイの直線的吸光度範囲および増幅の絶対レベル
を越え、増幅の絶対レベルは正確に測定され得なかった
。同様に処理したネガティブコントロール、ｐＡＫ８Ｄ
ＮＡは、増幅工程の如何なる段階においてもハイブリダ
イゼーションアッセイでシグナルを与えなかった。 ［００６０］ 制細 のＥＢＶ配Ｉの増−と 出感染細胞の溶
解物に含有される標的ＤＮＡの検出の例として、粗製細
胞溶解物中のＥＢＶ特異的配列の増幅および検出を検討
した。これらの検討のため、４つのリンパセルラインを
使用した。Ｂ９５−８はＥＢＶ感染セルラインであり、
その９５％の細胞が約５０コピーのＥＢＶを含有し、５
％の細胞が１０００コピー特開平４−１４１０９９ （
５ｇ） を越えるＥＢＶＤＮＡを含有する。これを使用したが、
更にはミラーとりツブマン、「形質転換キヌザル白血球
による感染性ＥＢＶの放出Ｊ 、Ｐｒ ｏ’ｃ、 Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ、７０ ：１９０
−１９４ （１９７３） に記載されている。ラジ（全
ての細胞が約５０コピーのＥＢＶＤＮＡを有するセルラ
イン）を使用したカミ更にはニブスティンら、［培養プ
ルキット腫瘍リンホブラスト（ラジ種）による形態的お
よびウィルス的検討Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ。 ３７ ： ５４７−５５９ （１９６６）に記載されて
いる。ナマルワ（全ての細胞が１〜２コピーのＥＢＶＤ
ＮＡを含有するセルライン）を使用したが、更にはり−
ドマンとフレイン、「処理および未処理リンホブラスト
イドセルラインにおけるＥＢＶ関連相補的固定抗原の細
胞的局在性」、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、１１：４４
９−５２０ （１９７３）に記載されている。また、ラ
モス（未感染リンパ球セルライン）も使用したが、更に
はフレインら、「アメリカン・プルキットリンパ球から
確立されたＥＢＶゲノム陰性セルライン：レセプター特
性、ＥＢＶ感染性、並びに試験管内感染によるＥＢＶ陽
性サプラインへの永久的変換」、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ、５ ：３１９−３３４ （１９７５）に記載さ
れている。 それぞれの培養物の１０４〜１０６細胞を煮沸により溶
解し、その後ＥＢＶ１およびＥＢＶ６の存在下で１５回
の増幅に供した。それぞれの反応混合物の一部をその後
ハイブリッド捕捉によりアッセイした。標的ＤＮＡを用
いることなくハイブリダイズ（および検出）した捕捉穴
を、吸光度の読みのゼロ（ブランク）対照として使用し
た。結果を表１に示す。 ［００６１］
ィルス（ＥＢＶ）（プラスミドＤＮＡの精製調製物並び
にＥＢＶ感染リンパ球細胞の組成細胞溶解物中に含有さ
れる）を、ポリメラーゼ鎖反応技術により酵素的に増幅
し、ハイブリッド捕捉により検出した。 ［００４５］ 試薬 特に記載しない限り、化学試薬はアルドリッチ社から購
入した。デテク１−ｈｒｐ、デデクー１ａｌｋ、バイオ
ブリッジＡ、ターミナルデオキシヌクレオチドトランス
フェラーゼおよびビオチン−１１−ｄＵＴＰは、エンシ
ー・バイオケム社から、サーマス・アクアチカス（Ｔａ
ｑ）ポリメラーゼは、ペルキン−エルマー／シータスか
ら購入した。ｐＵｃ１８はインターナショナル・バイオ
テクノロジイス社から得た。デオキシヌクレオシドトリ
リン酸および硫酸デキストランはファルマシアから得た
。オルソフェニレンジアミンジヒドロクロリド（○ＰＤ
）、ポルシン皮膚ゼラチン、過酸化水素、セファデック
スＧ−２５並びにトリトンＸ−１００はシグマから得た
。イムロン２マイクロメータプレートは、ダイナチック
から購入した。ホルムアミドはフル力から得た。ＲＰＭ
１１６４０培養培地および熱失活ウシ胎児血清はギブコ
から購入した。バイオジンＢ膜はパール・コーポレーシ
ョンから購入した。ヌシーブアカ゛ロースおよびセアケ
ムアガロ＝スはＦＭＣから購入した。 ［００４６］ ハイブリダイゼーションおよび検出アッセイで使用した
緩衝液は、次の保存溶液から調製した： １）２０ｘＳ
ＳＣ含有３ＭＮａＣ１，０，３Ｍクエン酸ナトリウム、
２）２０ｘＳＳＰＥ含有３．６ＭＮａＣ１，０，２Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４、並びに０．０２Ｍエ
チレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、３）クエン酸
リン酸緩衝液ｐＨ５，３（０，０５Ｍクエン酸および０
．１ＭＮａ２ＨＰＯ４を含有して組合せ５．３のｐＨを
与える）、４）１０ｘＰＢＳ （１゜５ＭＮａＣ１，０
，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，２を含有する）
、並びに５）デンハードの溶液（１％フィコール、１％
ポリビニルピロリドン並びに１％ウシ血清アルブミンを
含有する）。 ［００４７］ オリゴヌクレオチド合成、精製並びにラベルホスホルア
ミダイト法により、フプライド・バイオシステムス社装
置、モデル３８０Ｂによりオリゴヌクレオチドを合成し
た。０．２μｍｏｌおよび１μｍ。 １合成サイクルの両者を用いた。シアノエチルホスホル
アミダイトおよび試薬を製造業者により推奨されたよう
にして使用した。鎖延長の際のホスホルアミダイト添加
は、トリチルカチオンの遊離により監視した。オリゴヌ
クレオチドを支持体から開裂させた後にジメトキシトリ
チルエーテルとして保護された５′ヒドロキシルを残す
手順を使用した。合成および支持体からの開裂の後に、
オリゴマーを、５５°Ｃで一夜アンモニアにより処理す
ることにより脱保護し、溶液を続いて蒸発させて乾燥し
た。 ［００４８］ ５′−〇−ジメトキシトリチルオリゴヌクレオチドを１
ｍｌの１０ｍＭ）リエチルアンモニウム・ビカーボネー
ト、ｐＨ７，５〜９．０に再溶解し、ワットマン・パラ
チシルＭ−２００ＤＳ−３（ｃ１８半調製用）ＨＰＬＣ
カラムを使用して精製した。１：９９でアセトニトリル
：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７，０（Ｔ
ＥＡＡ）中でカラムを平衡化した。７５吸収単位（２６
０ｎｍ）までカラムに注入した。オリゴヌクレオチドを
、流速４ｍ１７分にて、１：９９アセトニトリル：ＴＥ
ＡＡを使用して１分間溶出させた後、２０分間かけて１
〜３０％アセトニトリル直線グラジェントを行った。ト
リチル化オリゴマーは、リチル化し、その後凍結乾燥し
た。最終精製は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム中でセファ
デックスＧ−２５クロマトグラフイにより行った。オリ
コ゛マーを含有する画分を凍結乾燥し、滅菌水に再懸濁
した。 ［００４９］ ７〜４０９５ （１９８８）に先に記載されたようにし
て、モル当り約３〜４ビオチン−１１−ｄＵＴＰ残基を
用いてオリゴヌクレオチドを３′末端ラベルした。 ハイブリッド捕捉アッセイについてのシグナルオリゴヌ
クレオチドは、０．２Ｍカコジル酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７，２，１ｍＭ２−メルカプトエタノール、ターミナ
ルトランスフェラーゼ（２０〜５０単位／μｇオリゴマ
ー） 、０．４ｍＭＴＴＰ並びに２０ ｐ ｇ ／ ｍ
ｌオリゴヌクレオチドを含有する反応混合物中で、Ｔ
ＭＰの重合体により３′末端ラベルした。反応を完了ま
で行わせ（３７°Ｃで９０分〜２時間）、最終濃度２５
ｍＭでＥＤＴＡを添加することにより終了させた。ビオ
チンラベルおよびポリエラベルしたオリゴヌクレオチド
を、更に精製することなく使用した。 ［００５０１ 郡雅Ａ堕社灰グ肌袈 Ｂ９５−８、ラジ、ナマルワとラモス細胞を、１０％熱
失活ウシつ児血清を含有するＲＰＭ１１６４０培地で維
持した。低速遠心により細胞を補集し、培地を除去し、
細胞を１０μｌのＰＢＳに再懸濁した。滅菌水によりサ
ンプル容積を４５μｍに増加させ、酵素的増幅に供した
。 ［００５１］ 増幅反応 ４５μｌ容量の精製したプラスミドＤ’Ｎ、Ａまたはリ
ンパ球細胞を９２°Ｃに１０分間加熱し、速やかに冷却
した。煮沸したサンプルを５５μｍ１の１．８Ｘ保存反
応緩衝液と混合し、最終反応混合物カミ ５０ｍＭＫＣ
ｌ、１０ｍＭ）リス−ＨのそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、並びに１μＭのそれぞれ
のオリゴヌクレオチドプライマーを含有するものとした
。２．５単位のＴａｑポリメラーゼを添加することによ
り反応を開始した。９２°Ｃでの１分間の変性工程、３
７°Ｃでの２分間のアニール工程、並びに７０’Ｃでの
３分間の延長工程により、サンプルを繰返し循環させた
。最後のサイクルの後、サンプルを１分間９２°Ｃに加
熱し、速やかに冷却した。 ［００５２］ ハイブリッドす捉および７出 ９６穴の独立した穴のイムロン２プレートを１Ｍ酢酸ア
ンモニウムにより２回リンスした。５０ｎｇの捕捉オリ
ゴヌクレオチドを、１Ｍ酢酸アンモニウム中にてプレー
トの穴に添加した。プレートを３７°Ｃで一夜インキユ
ベートして乾燥し、その後直ちに使用するか、使用の前
に４°Ｃで保存した。結合した捕捉オリゴヌクレオチド
を有するプレートを、調製物中で０．５ｘＳＳＣ１０，
１％トリトンＸ−１００により予備洗浄し、ハイブリッ
ド捕捉アッセイにおける使用を図った。 ［００５３］ 分析に供するサンプルを９２°Ｃで１０分間熱変性させ
、速やかに冷却し、滅菌水中で希釈した。希釈したサン
プルを、終濃度で２０％ホルムアミド、１ｘＳＳＰＥ、
２％硫酸デキストラン、１％トリトンＸ−１００並びに
５０ｎｇ／ｍｌのシグナルオリゴヌクレオチド（３′−
ポリＴ尾部を含有する）を含有するハイブリダイゼーシ
ョン溶液に添加した。それぞれのサンプルの１００μｍ
を三速でオリゴヌクレオチド被覆穴に添加し、（振盪し
つつ）１時間室温でハイブリダイズさせた。ハイブリダ
イゼーションの後、０．０５ｘＳＳＣ１０゜１％トリト
ンＸ−１００を用いて４回穴を洗浄し、バイオブリッジ
Ａ （２ｘＳＳＣ，０，１％トリトンＸ−１００中でエ
ンシーの仕様書により希釈）をそれぞれの穴に添加し、
室温で２．５分間インキュベートした。０ｙ５ｘＳＳＣ
１０，１％トリトンＸ−１００、並びにデテク１ｈｒｐ
ブランドのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ複合体により穴を３回洗浄し、０．５ＭＮａＣ１
，５ｍＭＥＤＴＡ、０．３％ゼラチン、０．２５％トリ
トンＸ−１００を含有するリン酸緩衝塩類溶液中で希釈
し、０．０１％チメロゾルをそれぞれの穴に添加し、室
温で１５分間（振盪しつつ）インキュベートした。０．
５ｘＳＳＣ，０，１％トリトンＸ−１００により穴を３
回洗浄し、その後５ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳによ
り３回洗浄した。クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５，３）
中に０．０１２５％過酸化水素および１．６ｍｇ／ｍｌ
オルソフェニレンジアミンを含有する１５０／、ｔｌの
反応混合物を添加することによりシグナルを生成させた
。５０ｐｌの４ＮＨ２Ｓ３’、５．５’−テトラメチル
ベンジデンのような他の発色性指示薬も使用することが
できる。 ［００５４］ 増幅した生成物を、０．０４Ｍ）リス−酢酸、０．００
２ＭＥＤＴＡ （ｐＨ８０）並びに０． ２μｇ／ｍ１
臭化エチジウム中に３％ヌシーブアガロース、１％セア
ケムアガロースを含有するアガロースゲル中で電気泳動
に供した。電気泳動の後、０．４ＮＮａＯＨ，０，６Ｎ
ＮａＣ１中でＤＮＡを変性させ、バイオジンＢ膜に対し
て一夜移行させた。６ｘＳＳＣ１５Ｘデンハードの溶液
、０． １％ＳＤＳ並びに１００１−ｔ ｇ ／ ｍ
１熱変性サケ精子ＤＮＡを含有する緩衝液中で、５５℃
にて６０分間膜を予備ハイブリダイズさせた。５５°Ｃ
で１０％硫酸デキストランを用い、予備ハイブリダイゼ
ーション緩衝液中に３′−ビオチン−１１−ｄＵＭＰ尾
部を含有するオリゴヌクレオチドＥＢＶ５ （１００ｎ
ｇ／ｍ１）（図１参照）にＤＮＡをハイブリダイズさせ
た。ハイブリダイゼーションの後、室温で３ｘＳＳＣ，
０，１％ＳＤＳにより１０分間膜を洗浄し、同じ緩衝液
中で５５０にて３回（洗浄当り１０分間）行った。膜を
、１００ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０） 、１００
ｍＭＮａＣＬ ３ｍＭＭｇＣ１２並びに０．５％ツイ
ーン２０（溶液Ａ）中でリンスし１、その後０．５％カ
ゼインを含有するＰＢＳにより。 １５分間予備ブロックした。デテク１−ａｌｋ中で室温
にて１５分間膜をインキュベートし、１００ｍＭ）リス
−ＨＣｌ （ｐＨ９，５）、１００ｍＭＮａＣ１、浄
した後、１００ｍＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ９，５）
、１０ ｒｎＭＭ ｇ Ｃ１２，１００ｍＭＮａＣ１，
７５ｍｇ ７ｍ ｌ 、：＝−トロブルー・テトラゾリ
ウム並びに５０ｍｇ／ｍ１５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルリン酸を含有する検出緩衝液を添加した。 フィルタを検出緩衝液から除去し、これを水でリンスす
ることにより、約５分後に発色の進行を停止した。 ［００５５］ ハイブリッド によるＥ−ＢウィルスＤＮＡ配置の
出精製プラスミドＤＮＡ調製物およびＥＢＶ感染リンパ
球細胞培養の粗製細胞溶解物中に含有されるＥ−Ｂウィ
ルス（ＥＢＶ）を、増幅および検出のための標的として
選択した。ＥＢＶのＩＲ１リピートは、ＥＢＶゲノム当
り約１０回繰り返されている。これは、チエラングとキ
ーフ、「Ｅ−ＢウィルスＤＮＡ中の長い内部直接リピー
ト」、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４４：２８６−２９４
（１９８２）に報告されている。ＩＲＩリピートの２４
６塩基対配列に延在する６のオリゴヌクレオチドを、共
役増幅／ハイブリッド捕捉アッセイでの使用のために選
択した。これらを図１の下部に示す。ＩＲＩ標的配列の
ハイブリダイゼーションおよび検出を至適にするため、
幾つかのオリゴヌクレオチド対を、プラスミドｐｃＦ１
（これはｐＵｃ１８ベクタ中にＩＲＩリピートのＢａｍ
Ｈ１開裂断片を含有する）を捕捉しシグナルするその能
力について、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて
試験した。それぞれの場合、１（または２）のオリゴヌ
クレオチドがイムロン２プレートの穴に結合し、標的配
列を捕捉するよう作用した。第２のオリゴヌクレオチド
（または２つのオリゴヌクレオチド）（ポリＴによる３
′末端ラベル）は、標的配列およびビオチン修飾ポリｄ
Ａ （バイオブリッジハブランド試薬）と協奏的にハイ
ブリダイズすることにより、シグナル反応において架橋
として作用した。過酸化水素およびＯＰＤの存在下で、
ストレプトアビジンおよびビオチニル化西洋ワサビペル
オキシダーゼの複合体を使用してビオチンを検出した。 ネガティブコントロールとして、ｐＵｃ１８中に１３ｋ
ｂサイトメガロウイルス（ｃＭＶ）ＤＮＡ挿入物を含有
するｐＡＫ８を、ＥＢＶ特異的オリゴヌクレオチドを使
用してアッセイした。図１に示す種々の組合せのオリゴ
ヌクレオチドとハイブリダイズした既知量のｐｃＦｌに
ついて標準曲線を作成した。 ［００５６］ 図２は、２つの異なる組合せのオリゴヌクレオチド対を
用いるハイブリダイゼーションの後に０．７８ｎｇ〜５
０ｎｇのｐｃＦｌを用いて作成した標準曲線を示す。増
幅されていないｐｃＦｌについてのハイブリダイゼーシ
ョンの検出限界含有するプラスミド、ｐＡＫ８はシグナ
ルを生成することができず、したがってアッセイの特異
性が示された。 ［００５７］ オリゴヌクレオチドＥＢＶ１およびＥＢＶ６を境界とす
る２４６ｂｐ配列（図１）を２５回のＰＣＲによる１ｐ
ｇのｐｃＦｌに供することにより酵素的に増幅した。増
幅の後、出発プラスミドＤＮＡの７８アトグラム〜２．
５フエムトグラムと等量の増幅反応混合物の一部を、Ｅ
ＢＶ５を捕捉オリゴヌクレオチドとしてポリ１尾部ＥＢ
Ｖ４をシグナルオリゴクレオチドとして使用してハイブ
リッド捕捉によりアッセイした。図３に、既知量の増幅
していないｐｃＦｌにより作成した標準曲線と比較し、
増幅した材料の４９０ｎｍの吸光度を示す。２５回の増
幅の後、共役ＰＣＲ／ハイブリッド捕捉アッセイでは、
１２．５〜４００モルの９２％の効率が示唆された（効
率は、ｎ＝増幅の回数、Ｘ＝それぞれのサイクルの平均
効率、並びにＹをｎサイクル後の収率として、Ｙ＝ （
１＋Ｘ） により計算した。ムリスとファローナ、「
ポリメラーゼ触媒鏡反応を介する試験管内でのＤＮＡの
特異的合成ｊ、Ｍｅｔｈｏ′ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、
１５５：３３５−３５０ （１９８７）を参照するとよ
い）。対照として、ｉｐｇのｐＡＫ８ＤＮＡを、ＥＢＶ
ｌおよびＥＢＶ６の存在下でＰＣＲにより２５回増幅し
、同様のハイブリッド補足手順によりアッセイした。元
のサンプルの５％（５０ｆ ｇ）に至るまでアッセイし
た場合でも、シグナルは全く与えられなかった。同様の
検討では、前記同様増幅しハイブリダイズさせた１０ｎ
ｇに及ぶ対照プラスミドＤＮＡにをＴａｑポリメラーゼ
の非存在下にＰＣＲを介してサイクルさせた場合、ハイ
ブリダイゼーションアッセイにおいてシグナルは全く与
えられなかった。 ［００５８］ 更に図１に示した配列を参照し、それぞれのシグナル／
捕捉オリゴヌクレオチド対について良好に機能する種々
のプライマーの組合せは、シグナル／捕捉オリゴヌクレ
オチド対４および５および／または２および３について
プライマー１および６、シグナル／捕捉オリゴヌクレオ
チド対４および５についてプライマー２および６、シグ
ナル／捕捉オリゴヌクレオチド対４および５についてプ
ライマー３および６、シグナル／捕捉オリゴヌクレオチ
ド対２および３についてプライマー１および５、並びに
シグナル／捕捉オリゴヌクレオチド対２および３につい
てプライマー１および４であった。 ［００５９］ 増幅手順に渡って標的ＤＮＡの量の相対的増加を測定す
るため、プライマーＥＢＶ１ およびＥＢＶ６（７）存
在下に０〜３５回のＰＣＲを介ｔ、てｌＯｐｇのｐｃＦ
ｌおよびｐＡＫ８をサイクルさせた。５回の時点で増幅
反応を停止し、０．０３％の反応混合物をアッセイした
。図４に示すように、２０回の増幅の後にシグナルが最
初に検出された。このシグナルは標的ＤＮＡの１．７Ｘ
１０５倍の増加に対応し、８０％の増幅の効率を示唆す
る。一連の増幅の回で標的ＤＮＡの量が増加し、３５回
で僅か０．０３％の反応混合物により生成したシグナル
がアッセイの直線的吸光度範囲および増幅の絶対レベル
を越え、増幅の絶対レベルは正確に測定され得なかった
。同様に処理したネガティブコントロール、ｐＡＫ８Ｄ
ＮＡは、増幅工程の如何なる段階においてもハイブリダ
イゼーションアッセイでシグナルを与えなかった。 ［００６０］ 制細 のＥＢＶ配Ｉの増−と 出感染細胞の溶
解物に含有される標的ＤＮＡの検出の例として、粗製細
胞溶解物中のＥＢＶ特異的配列の増幅および検出を検討
した。これらの検討のため、４つのリンパセルラインを
使用した。Ｂ９５−８はＥＢＶ感染セルラインであり、
その９５％の細胞が約５０コピーのＥＢＶを含有し、５
％の細胞が１０００コピー特開平４−１４１０９９ （
５ｇ） を越えるＥＢＶＤＮＡを含有する。これを使用したが、
更にはミラーとりツブマン、「形質転換キヌザル白血球
による感染性ＥＢＶの放出Ｊ 、Ｐｒ ｏ’ｃ、 Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ、７０ ：１９０
−１９４ （１９７３） に記載されている。ラジ（全
ての細胞が約５０コピーのＥＢＶＤＮＡを有するセルラ
イン）を使用したカミ更にはニブスティンら、［培養プ
ルキット腫瘍リンホブラスト（ラジ種）による形態的お
よびウィルス的検討Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ。 ３７ ： ５４７−５５９ （１９６６）に記載されて
いる。ナマルワ（全ての細胞が１〜２コピーのＥＢＶＤ
ＮＡを含有するセルライン）を使用したが、更にはり−
ドマンとフレイン、「処理および未処理リンホブラスト
イドセルラインにおけるＥＢＶ関連相補的固定抗原の細
胞的局在性」、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、１１：４４
９−５２０ （１９７３）に記載されている。また、ラ
モス（未感染リンパ球セルライン）も使用したが、更に
はフレインら、「アメリカン・プルキットリンパ球から
確立されたＥＢＶゲノム陰性セルライン：レセプター特
性、ＥＢＶ感染性、並びに試験管内感染によるＥＢＶ陽
性サプラインへの永久的変換」、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ、５ ：３１９−３３４ （１９７５）に記載さ
れている。 それぞれの培養物の１０４〜１０６細胞を煮沸により溶
解し、その後ＥＢＶ１およびＥＢＶ６の存在下で１５回
の増幅に供した。それぞれの反応混合物の一部をその後
ハイブリッド捕捉によりアッセイした。標的ＤＮＡを用
いることなくハイブリダイズ（および検出）した捕捉穴
を、吸光度の読みのゼロ（ブランク）対照として使用し
た。結果を表１に示す。 ［００６１］
【表１】
秀ヱ
２．５３６
１．８６５
フシ
０．４２４
０．５６３
プマル７
０ 、２０４
＜０ 、００
ｊｒ・ら
＜（１，００ゾ４ ７ｖ” ＩＥ’
１５２
＜０．００［００６２］ 表１に示すように、Ｂ９５−８、ラジ並びにナマルヮ細
胞によりシグナルが得られたが、ロマス細胞では得られ
なかった。これらのデータは、共役した増幅／ハイブリ
ッド捕捉アッセイの特異性は、標的が精製ＤＮＡでない
場合であっても維持されることを示す。 ［００６３］ ナマルワ細胞は１〜２コピーのＥＢＶＤＮＡを含有する
ため、これらの細胞を選択して共役アッセイの感度を検
討した。結果を表２に示す。 ［００６４］
＜（１，００ゾ４ ７ｖ” ＩＥ’
１５２
＜０．００［００６２］ 表１に示すように、Ｂ９５−８、ラジ並びにナマルヮ細
胞によりシグナルが得られたが、ロマス細胞では得られ
なかった。これらのデータは、共役した増幅／ハイブリ
ッド捕捉アッセイの特異性は、標的が精製ＤＮＡでない
場合であっても維持されることを示す。 ［００６３］ ナマルワ細胞は１〜２コピーのＥＢＶＤＮＡを含有する
ため、これらの細胞を選択して共役アッセイの感度を検
討した。結果を表２に示す。 ［００６４］
【表２】
蓑２
［００６５］
表２に示すように、僅か１０ナマルワ細胞の２４６ｂｐ
ＩＲ１配列の増幅により、２０％（２つの細胞に相当す
る）の反応混合物をアッセイした場合、弱いシグナルが
生成した。シグナルの強度は、初発増幅反応に１００細
胞を投入した場合に顕著に増加した。等置数のロマス細
胞の増幅によっては、バックグラウンドの読みを越える
シグナルは生成しなかった。 ［００６６］ 感染および未感染細胞の異種存在における感染性試薬の
核酸の検出の例とじてによりアッセイした。ナマルワ細
胞（１０２）とラモス細胞（１０４）とを混合し、３５
回のＰＣＲを介してサイクルした。反応混合物の一部（
２０％）をその後アッセイした。結果を表３に示す。 ［００６７］ −６６２＝
ＩＲ１配列の増幅により、２０％（２つの細胞に相当す
る）の反応混合物をアッセイした場合、弱いシグナルが
生成した。シグナルの強度は、初発増幅反応に１００細
胞を投入した場合に顕著に増加した。等置数のロマス細
胞の増幅によっては、バックグラウンドの読みを越える
シグナルは生成しなかった。 ［００６６］ 感染および未感染細胞の異種存在における感染性試薬の
核酸の検出の例とじてによりアッセイした。ナマルワ細
胞（１０２）とラモス細胞（１０４）とを混合し、３５
回のＰＣＲを介してサイクルした。反応混合物の一部（
２０％）をその後アッセイした。結果を表３に示す。 ［００６７］ −６６２＝
【表３】
−ｆ７１し７
１ζ
０．８８
うτ又
２υＯ０
０，０１
うＣス
［００６８］
表３に示すように、混合細胞溶解物の場合でも、標的配
列は増幅され検出された。細胞混合物中の増幅のレベル
は、純粋種の細胞存在と比較すると約４倍低減された。 ラモス細胞の増幅は単独ではイブリダイゼーションアツ
セイにおいてシグナルを生成しないため、混合した溶解
物により生成されたシグナルは、ナマルワ細胞における
特異的標的配列の生成物であったと考えることができる
。 ［００６９］ 共役した増幅ハイブリッド捕捉検出アッセイの特異性を
確認するため、増幅反応生成物をアガロースゲル中で電
気泳動により分析し、その後サザンブロットハイプリダ
イゼーションを行った。Ｅ Ｂ Ｖ−１およびＥＢＶ６
をプライマーとして使用してｐｃＦｌ中のＩＲＩ配列の
一部を増幅した場合に得られた生成物のエチジウムプロ
ミド染色アガロースは、約２５０ｂｐの断片を示した。 この断片は、ｐＡＫ８ＤＮＡまたはラモス細胞溶解物か
らの増幅生成物中には認められなかった。電気泳動的に
分析したＤＮＡをバイオジンＢナイロン膜に移し、ビオ
チン−１１−ｄＵＴＰの３′末端添加によりラベルした
ＥＢＶ５オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。 ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルリン酸の存在下に、ストレプトア
ビジンおよびビオチニル化したアルカリ性ホスファター
ゼの複合体を使用して発色アッセイを行うことによりビ
オチン部分を検出した。２５０ｂｐ断片がハイブリダイ
ゼーションの主要なバンドであり、したがってハイブリ
ッド捕捉アッセイで得られた結果が確認された。 ［００７０］ 実施例蓋 サンプル中のヒト免疫疾患ウィルス（ＨＩＶ Ｉ）（
またはＨＴＬＶ ＩＩＩ）核酸配列の存在を測定する
方法論の有用性を検討するため、減少する量の精製ＨＩ
Ｖ ｌＤＮＡを用い、ヒト末梢血液細胞を接種した（
または接種しなかった）。更に処理または精製を行わな
いサンプルをその後、表４に示すプライマーを使用する
ポリメラーゼ鎖反応による２５回の増幅に供した。増幅
反応の後、表４に示すプローブを使用してハイブリッド
捕捉につき主として前記したようにサンプルを試験した
。結果を表５に示す。 ［００７１］
列は増幅され検出された。細胞混合物中の増幅のレベル
は、純粋種の細胞存在と比較すると約４倍低減された。 ラモス細胞の増幅は単独ではイブリダイゼーションアツ
セイにおいてシグナルを生成しないため、混合した溶解
物により生成されたシグナルは、ナマルワ細胞における
特異的標的配列の生成物であったと考えることができる
。 ［００６９］ 共役した増幅ハイブリッド捕捉検出アッセイの特異性を
確認するため、増幅反応生成物をアガロースゲル中で電
気泳動により分析し、その後サザンブロットハイプリダ
イゼーションを行った。Ｅ Ｂ Ｖ−１およびＥＢＶ６
をプライマーとして使用してｐｃＦｌ中のＩＲＩ配列の
一部を増幅した場合に得られた生成物のエチジウムプロ
ミド染色アガロースは、約２５０ｂｐの断片を示した。 この断片は、ｐＡＫ８ＤＮＡまたはラモス細胞溶解物か
らの増幅生成物中には認められなかった。電気泳動的に
分析したＤＮＡをバイオジンＢナイロン膜に移し、ビオ
チン−１１−ｄＵＴＰの３′末端添加によりラベルした
ＥＢＶ５オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。 ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルリン酸の存在下に、ストレプトア
ビジンおよびビオチニル化したアルカリ性ホスファター
ゼの複合体を使用して発色アッセイを行うことによりビ
オチン部分を検出した。２５０ｂｐ断片がハイブリダイ
ゼーションの主要なバンドであり、したがってハイブリ
ッド捕捉アッセイで得られた結果が確認された。 ［００７０］ 実施例蓋 サンプル中のヒト免疫疾患ウィルス（ＨＩＶ Ｉ）（
またはＨＴＬＶ ＩＩＩ）核酸配列の存在を測定する
方法論の有用性を検討するため、減少する量の精製ＨＩ
Ｖ ｌＤＮＡを用い、ヒト末梢血液細胞を接種した（
または接種しなかった）。更に処理または精製を行わな
いサンプルをその後、表４に示すプライマーを使用する
ポリメラーゼ鎖反応による２５回の増幅に供した。増幅
反応の後、表４に示すプローブを使用してハイブリッド
捕捉につき主として前記したようにサンプルを試験した
。結果を表５に示す。 ［００７１］
【表４１
ｔ−ＨＶｌ、１ ｉルＶ々ト０チの吟びソ ：フ０ライ
マー ＴＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴＣＴＡＣＴＳＴＭ
３’Ｔ（］−７ ネ荀゛むヒ才・Ｉり （マｋｌ−ｔｎｍ宜７０９１−
７２２４ （メ１［弊十四 ）シフ°゛すｌしオリ
ゴ （七プリＴん殆７’）７１８３−７２ｉ９ （句
桂吻） 〉 ：ｌ ’ ＧＴ！：ＣＡＣＴＧＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧ
ＣＡＴＡ：ＡＴτＧＣττＴＴＣＣＴ ３’ＣＣ］ＣＣ
Ｔ口Ｃ，（ｔｊ；ＧＴＣＴＧＡＡＧＡゴＣＴＣＧＧＡＣ
τＣＡＴＴＧＴ丁 ３′七肋Ｓ ＣＩ’？諒）笥仰文紀
今て、 ［００７２］ ７１開平４−１４１０９９ （６２） 【表５】 壊よ ｉ、糾果 ゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーショ
ンによる検出、電気泳動並びにオートラジオグラフィに
供した場合、検出の限界は実質的に同一だった。 ［００７４］ これらのデータは、組合せた増幅およびハイブリッド捕
捉アッセイの特異性および感度を示す。僅かに変動する
長さおよび／または少しの配列の変動を有するプライマ
ーおよびプローブは、ここで使用した特定の配列と互換
性があると考えられる。 ［００７５］ 実施倒立 検出ハイブリダイゼーション反応の効率を増加させ、ハ
イブリダイゼーションを完了するのに必要な時間を減少
させるために、増幅した標的核酸配列の溶液ハイブリダ
イゼーションを行う。 ［００７６］ オリゴヌクレオチドプローブのラベル タックら（１９８８）、前記文献に先に記載されたよう
にしてシグナルオリゴヌクレオチドを３′−末端ラベル
する。またこれらを、１００ ｒｎＭ Ｋ Ｐ Ｏ４緩
衝液ｐＨ７，２，１０ｍＭＭｇＣ１１ｍＭ２−、Ｉルカ
プトエタノール、ターミ２・ ナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ、ｄＡＴ
Ｐ並びにビオチン−１１−ｄＵＴＰ （その量は、ｄＡ
ＴＰおよびビオチン−１１−ｄＵＴＰが、５：１〜９：
１のモル比で最初に存在し、ｄＡＴＰ濃度プラスビオチ
ン−１１−ｄＵＴＰ濃度の和がオリゴヌクレオチドの濃
度の２００倍であるものとする）を含有する溶液中での
インキュベーションによりラベルする。反応は、３７°
Ｃで２〜２０分間、または全ての単量体が組み込まれる
まで行わせる。 ［００７７］ 前記したように、捕捉オリゴヌクレオチドは、ポリｄＴ
の３′末端付加によりラベルする。連結技術も使用する
ことができるが、この種の方法論はそれ程複雑ではない
。また、捕捉オリゴヌクレオチドは、ＤＮＰ−ｄＵＴＰ
Ｏ形でジニトロフェニル残基を組み込むことによりラベ
ルすることができる。また、捕捉オリゴヌクレオチドは
、化学的にラベルした後、アリルアミンｄＵＭＰホスホ
ロアミダイト（タックら（１９８８）、前記文献参照）
の存在下で自動的に合成することができる。合成および
仕上げの後、アリルアミン残基を２，４−ジニトロフル
オロベンゼンとの反応によりラベルする。 ［００７８］ 足マトリックスおよび 出 １Ｍ酢酸アンモニウムによりイムロン２マイクロタイタ
ブレートの穴を２回リンスすることにより、ポリｄＡ捕
捉穴を調製する。２００ｎｇのポリｄＡ （ファ１）開
平４−１４１０９９ （６４） ルマシア・ファイン・ケミカルス、ビス力タウェイ、Ｎ
Ｊ）を、５０μｌの容量の１Ｍ酢酸アンモニウム中にて
穴に添加する。穴が乾燥するまで（１２時間以上）ドラ
イインキュベータ中でプレートを３７°Ｃでインキュベ
ートする。プレートを封止し、使用するまで２〜８°Ｃ
で保存する。使用の直前に、固定ポリＡを含むプレート
を２ｘＳＳＣにより２回リンスし、その後０．１％トリ
トンＸ−１００を含有するＺｘＳＳＣ中で５〜６０分間
定置する。 ［００７９］ ウサギ抗ＤＮＰＩｇＧのような抗体を含有する捕捉穴を
、３７°Ｃで２〜４時間イムロン２プレートの穴中で５
０μｍの５０ｍＭ重炭酸緩衝液中で希釈された適当な量
の抗体をインキュベートすることにより調製する。使用
するまで２〜８Ｃでカバーしてプレートを保存する。使
用の直前に、固定抗体を含むプレートを、０．１％トリ
トンＸ−１００を含有する０、５ｘＳＳＣにより２回リ
ンスする。 ［００８０１ 分析に供する増幅したコピー数の標的核酸を含有するサ
ンプルを９２°Ｃで１０分間熱変性させ、速やかに冷却
し、滅菌水に−より希釈する。２０％ホルムアミド、１
ｘＳＳＰＥ、２％硫酸デキストラン、１％トリトンＸ−
１００並びに５０ｎ ｇ ／ ｍ １のシグナルオリゴ
デオキシヌクレオチド並びに適当量の捕捉オリゴヌクレ
オチドのようなハイブリダイゼーション溶液に希釈した
サンプルを添加する。例えば、ｄＡＴＰ−ビオチン−１
１−ｄＵＴＰ尾部シグナルプローブを、ポリｄＴ尾部捕
捉プローブと組合せて、またはＤＮＰラベル捕捉プロー
ブと組合せて使用する。捕捉プローブ量は、予め滴定し
たものである。全ての捕捉プローブが、標的配列にハイ
ブリダイズするが否かに拘らず、マイクロタイタブレー
トの単一捕捉穴中で捕捉試薬により結合され得るものと
する。ハイブリダイゼーション反応（１００μｌ）を室
温で５〜３０分間行わせた後、０．１％トリトンＸ−１
００を含有する４００μｍの０．０５ｘ〜Ｏ５−、、，
１ｘ Ｓ Ｓ Ｃによりサンプルを希釈する。希釈ハイ
ブリダイゼーション反応物の分画をマイクロタイタブレ
ートの穴に添加する。ポリｄＡ捕捉穴を使用し、ポリ１
尾部捕捉プローブを使用する場合、サンプルを大中で２
〜５分間インキュベートした後、０．１％トリトンＸ−
１００を含有する０、０５ｘ〜０．１ｘＳＳＣにより洗
浄する。ＤＮＰラベル捕捉プローブと共に抗ＤＮＰ抗体
を使用する場合、穴を１０〜６０分間インキュベートし
た後、０．１％トリトンＸ−１００を含有する０、０５
ｘ 〜０．１ｘＳＳＣにより洗浄する。前記したように
、デテク１−ｈｒｐを使用してハイブリッ、ドの量を測
定することができる。 ［００８１］ 抗体またはポリヌクレオチド修飾ラテックスまたはポリ
スチレンビーズのようなマトリックスを、同様の増幅／
サンドイッチ捕捉アッセイの捕捉マトリックスとして使
用することができる。 ［００８２］ 実施例↓ ＡＩＤＳの蔓延および特定の種類のＨＩＶの蔓延に関す
る疫学的研究は、世界の人口に対するウィルスの範囲お
よび分布を確立するのに極めて重要である。この疾患の
蔓延を監視すると共に特定の患者における疾患の進行を
監視するため、そして恐らくより重要なことは、世界の
血液供給を保護するために、ＨＩＶ核酸配列の存在また
は非存在を測定することは非常に重要である。ＰＣＲの
ような増幅方法論はこの種の検討を行う能力を相当改良
されているが、これらのアッセイのネガティブな結果の
正確性を決定するのは困難である。 ［００８３］ 核酸増幅および検出の陰性結果の確認の推定は、Ｈｌｌ
［Ｖに露呈された個々人の範囲においてＨＩＶＤＮＡの
量を正確に測定することによってのみ行うことができる
。最近の研究によれば、ＣＤ４ （＋）細胞は、潜伏Ｈ
ＩＶプロウィルスＤＮＡの保存体として作用し、プロウ
ィルスＤＮＡを有するこれらの細胞の数は、無症候性血
清陽性個人で１／４０，０００〜１／１００．−ＡＩＤ
Ｓ患者で１／１００と見積もられている。プサリドポウ
ロスら、「組み込まれたプロウィルスヒト免疫不全ウィ
ルスタイプ■は、健康な血清陽性個人のＣＤ４＋末梢血
液リンパ球中に存在する」、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６
３：４６２６−４６３１ （１９８９）、およびシュ
ニットマンら、「ヒト末梢血液のＨＩＶ−１の保存体は
、ＣＤ４の発現を維持するＴ細胞である」、Ｓｃ １ｅ
ｎｃｅ、２４５ ： ３０５−３０８ （１９８９）を
参照することができる。 ［００８４］ これらの研究において、ＡＣＨ２細胞は、１の組み込ま
れたコピーのＨＩＶ−１を細胞当り含有し、増幅／検出
手順の標準として使用された。したがって、この標準体
においては、反応毎の増幅効率の変動を考慮に入れるこ
とができなり）。 患者試料中細胞当りのＨＩＶゲノムの範囲を正確に確立
するためには、それぞれの反応における増幅の効率を測
定する必要がある。意図する配列と同一の反応混合物中
のβ−グロビンまたはグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼのような既知の標準配列の同時増幅により、こ
の種の情報が提供される。 ［００８５］ 実施例２では、増幅されたＨＩＶ核酸の検出の限界は、
１５０，０ＯＯＰＢＬ中のＨＩＶＤＮＡの２コピーであ
ると認められ、これは検出が、ここに開示した方法によ
るか、標準的な Ｐ方法論によるかを問わなかった。 この感度の限界のため、少なくとも７０〜８０％の増幅
の効率が必要である。臨床サンプルについて同様の試験
を行うに際し、１〜３コピー／１５０，０ＯＯＰＢＬの
バックグラウンドの範囲の読みは、結論を出せないと判
断しなければならない。低くかつ／または陰性の読みは
、ＨＩＶＤＮＡの非存在または存在するＨＩＶＤＮＡの
不充分な増幅の結果である。それぞれの増幅反応の効率
が既知の場合、低くかつ／または陰性の読みは、結論を
出し得るものとして解釈できる。例えば、臨床サンプル
についての増幅反応の効率が８５％であると知られ、Ｈ
ＩＶ検出の結果、くく２コピーのＨＩＶＤＮＡが示され
る場合（すなわち、バックグラウンドを越えるには不充
分である）、ＨＩＶＤＮＡの不存在（１５０，０ＯＯＰ
ＢＬ中）の結論を出すことができる。一方、増幅反応の
効率が５０％であると知られ、ＨＩＶ配列検出によりＯ
〜３コピーのＨＩＶが示された場合、結果は結論を出し
得ないものと考えられ、手順を繰り返すことにより必要
な増幅効率か達成され得る。 ［００８６］ 増幅反応に既知の標準を取り入れて使用し、それぞれの
増幅反応の効率を見積もることができるのは自明である
が、これを達成するための簡単な手段は全く記載されて
いない。ここに開示した方法は、この種の手順に容易に
受は入れられるものである。実施例２では、患者試料を
サンプル材料として破壊した未精製末梢血液リンパ球（
ＰＢＬ）細胞を使用しポリメラーゼ鎖反応により増幅に
供する場合、２つの組合せのプライマー（ＨＩＶ配列に
ついての１つの組合せ、およびマーカー配列についての
第２の組合せ）をＰＣＲ反応に包めることができる。第
２の組合せのプライマーは、細胞当り１コピーでＰＢＬ
の正常なゲノム中に存在することが知られた遺伝子配列
から選択される。この種の遺伝子配列の例はβ−グロビ
ン遺伝子である。他の例は、中間代謝の酵素の遺伝子で
あり、例えばグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
遺伝子である。β−グロビンについての遺伝子を使用す
る場合、サイキら、「カマ細胞貧血症の診断のためのＢ
−グロビンゲノム配列の酵素的増幅および制限部位分析
Ｊ、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３５０−１３５４ （
１９８５）に記載されたようなプライマーの配列が適切
である。 重複しない一本鎖ポリヌクレオチドプローブの対を、こ
れらのプライマーの間に位置する配列から選択する。こ
れらは、１本のストランドまたは他のものに相補的であ
るよう選択し、増幅したコピー数のβ−グロビン配列を
検出するのに使用する。検出は、標的核酸の検出で使用
した手順により行う。 ［００８７］ ＨＩＶＩ配列およびβ−グロビン配列の検出のための増
幅反応は、ＨＩＶＩについて表４に示したプライマーの
存在下、サイキら、（１９８５）、前記文献に示された
β−グロビン配列についてのプライマーの存在下で、Ｐ
ＢＬの懸濁物により行う。増幅の後、主として前記した
ようにしてプローブに対するハイブリダイゼーションを
行う。２つのポリＴ尾部プローブをハイブリダイゼーシ
ョン溶液に添加する。表５のＨＩＶについての１尾部プ
ローブを、前記したように選択したβ−グロビンについ
ての１尾部プローブと同様に使用する。ハイブリダイゼ
ーション反応の一部をマイクロタイタブレートの個々の
穴に添加する。１つの組合せの穴は、表５に示されるよ
うにＨＩＶＩについてのプローブを含有し、他の組合せ
の穴は前記したように選択されたβ−グロビンについて
のプローブを有する。増幅した核酸の特異的な希釈物を
ハイブリダイゼーション混合物に添加し、その後希釈物
をマイクロタイタブレートの穴に添加する。増幅した核
酸配列を測定する。結果が現れる場合に得られる吸光度
の読みから、増幅反応の効率が確定され、意図する標的
配列についての陰性の結果の確認が行われる。 ［００８８］ またこれらの手順は、意図する第２標的核酸配列の存在
を検出するのに使用することができる。例えば、ＥＢＶ
およびＨＩＶについて前記したプライマーを単一増幅反
応で使用することができ、マイクロタイタブレートの穴
は、ＥＢＶ特異的またはＨＩＶ特異的オリゴヌクレオチ
ドを含有することができ、更にＨＩＶまたはＥＢＶまた
は両者の存在は、単一の増幅反応および単一の検出操作
により確立することができる。 ［００８９］ 実施倒立 実施例４において、感染個体中のＨＩＶＤＮＡの量を測
定する検討により、感染の段階によって、１０，０００
〜１，０００，０ＯＯＰＢＬ中の１ゲノムコピーの範囲
を確認することができる。単に増幅反応の効率を改良す
ることが可能ならば、それぞれの増幅反応で１０６以上
の細胞を一貫して使用してこの種の検討を行うことも可
能であろう。また、２５〜３５（以上）から増幅の回数
（ラウンド）を増加させてこの種の検討を行うことが可
能である。しかしながら、増幅の効率は、増幅反応に投
入される粗製材料の量が増加すると共に減少する傾向が
ある。更に増幅の回数が２５〜３５を越えて増加すると
、しばしば標的非特異的配列の生成が起こる。 ［００９０］ これらの困難を回避する方法は、サンプルから核酸を精
製することである。残念なことに、多くの場合サンプル
から核酸を精製することは困難で単調なものであり、サ
ンプルが互いに夾雑するに至る場合もある。更に、試験
に供するサンプルからの核酸の精製は、例えばフェノー
ルのような危険性のある材料の使用を必要とする。その
他の場合、サンプルからの核酸の精製が必要とされ得る
が、これはサンプルの破壊および核酸の放出に必要な条
件および材料が、核酸の酵素的増幅に和合しないためで
ある。例えば、フェノール、界面活性剤並びに還元剤を
使用して、唾液サンプル中のマイコバクテリウム・チュ
ーベルキュロシスまたはエム・アビウム核酸の存在につ
いての試験のためにサンプルが破壊される。このような
場合、増幅反応を開始する前に、核酸がこれらの破壊剤
を含有しないものとしなければならない。 ［００９１］ これらの困難を回避する簡単な方法は、意図する配列の
予備捕捉または予備選択である。この種の手順により、
殆ど全ゆる量のサンプルを使用する可能性、および通常
は酵素的増幅反応に和合しないサンプルを破壊する条件
および材料を使用する可能性が与えられる。 ［００９２］ 破壊されたサンプルから予期された標的核酸を予備捕捉
することにより、増幅の効率をより一貫したものとし、
幾つかのサンプルを破壊するのに使用する材料を酵素的
増幅反応を開始する前に容易に除去することができる。 標的核酸が非常に低い濃度であるためハイブリダイゼー
ション反応に非常に長い時間がかかることは考えなくて
もよい。増幅反応を行うに際し、最初の回の増幅にはプ
ライマーと標的核酸のハイブリダイゼーション（アニー
ル）を必要とする。現在使用されている手順では、これ
には通常は５分未満が必要である。破壊されたサンプル
中の核酸とマトリックス結合または捕捉し得る予備捕捉
プローブとの最初のアニール反応を行うことにより、標
的核酸がサンプルの残余およびサンプル破壊試薬を含有
しないものとすることが可能である。 ［００９３］ 実施例１におけるように、６〜８の異なる、重複しない
プローブ／プライマーオリゴヌクレオチドが選択され、
特定の標的核酸配列について合成が行われる。 これらは、図５のオリゴヌクレオチドＡ−Ｈとして示さ
れる。標的がＤＮＡである場合に予備捕捉プローブを形
成するためには、ボッシュとムッソ（１９８７）前記文
献に記載されたように、これらの２つのオリゴヌクレオ
チド（図５のオリゴヌクレオチドＡおよびＨ）（標的が
元来一本鎖の場合は１つのオリゴヌクレオチド、すなわ
ちＲＮＡ）を、その後５−′末端を介してセファクリル
または調節されたボアガラスまたは他の支持体に架橋さ
せる。１つの手順では、破壊したサンプルとビーズ架橋
オリゴヌクレオチド予備捕捉プローブとをハイブリダイ
ズさせる。このハイブリダイゼーションに続いて、沈降
またはろ過によりビーズを集め特開平４−ｚ４ｘｏｒ）
ｃ＋ （７０）−旦ビーズがこれらの材料を含有しない
ものとなったならば、ビーズを増幅反応 ［００９４］ リボヌクレオチドが存在するにも拘らず、ビーズに架橋
しない。増幅の後、 プロ ［００９５］ ができる。 この種の予備捕捉プローブは、 第１予備捕捉部分により修飾される。 的に相互作用する） とを接触させる。例えば、 図５の予備捕捉オリゴヌクレオチ ドＡおよびＨを、前記したようにポリＴによりその３′
末端において、または合 −ブの３′末端を前記したようにブロックする。破壊サ
ンプル中における核酸に対するアニールの後、ハイブリ
ッド（および全ての予備捕捉プローブＡおよびＨ）とポ
リＡまたはセファクリル、ラテックス、ポリスチレン、
ＣＰＧまたは他の固体マトリックスに架橋したポリｄＡ
とを接触させる。前記したようにハイブリッドを洗浄し
、これらがサンプルの残部およびサンプル破壊剤を含有
しないものとする。ハイブリッドを含有するマトリック
スをその後回７に示すようにプライマーＢおよびＧを含
有する増幅反応混合物に懸濁する。通常と同様に増幅を
行い図７の増幅された材料として増幅された核酸を検出
する。
マー ＴＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴＣＴＡＣＴＳＴＭ
３’Ｔ（］−７ ネ荀゛むヒ才・Ｉり （マｋｌ−ｔｎｍ宜７０９１−
７２２４ （メ１［弊十四 ）シフ°゛すｌしオリ
ゴ （七プリＴん殆７’）７１８３−７２ｉ９ （句
桂吻） 〉 ：ｌ ’ ＧＴ！：ＣＡＣＴＧＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧ
ＣＡＴＡ：ＡＴτＧＣττＴＴＣＣＴ ３’ＣＣ］ＣＣ
Ｔ口Ｃ，（ｔｊ；ＧＴＣＴＧＡＡＧＡゴＣＴＣＧＧＡＣ
τＣＡＴＴＧＴ丁 ３′七肋Ｓ ＣＩ’？諒）笥仰文紀
今て、 ［００７２］ ７１開平４−１４１０９９ （６２） 【表５】 壊よ ｉ、糾果 ゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーショ
ンによる検出、電気泳動並びにオートラジオグラフィに
供した場合、検出の限界は実質的に同一だった。 ［００７４］ これらのデータは、組合せた増幅およびハイブリッド捕
捉アッセイの特異性および感度を示す。僅かに変動する
長さおよび／または少しの配列の変動を有するプライマ
ーおよびプローブは、ここで使用した特定の配列と互換
性があると考えられる。 ［００７５］ 実施倒立 検出ハイブリダイゼーション反応の効率を増加させ、ハ
イブリダイゼーションを完了するのに必要な時間を減少
させるために、増幅した標的核酸配列の溶液ハイブリダ
イゼーションを行う。 ［００７６］ オリゴヌクレオチドプローブのラベル タックら（１９８８）、前記文献に先に記載されたよう
にしてシグナルオリゴヌクレオチドを３′−末端ラベル
する。またこれらを、１００ ｒｎＭ Ｋ Ｐ Ｏ４緩
衝液ｐＨ７，２，１０ｍＭＭｇＣ１１ｍＭ２−、Ｉルカ
プトエタノール、ターミ２・ ナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ、ｄＡＴ
Ｐ並びにビオチン−１１−ｄＵＴＰ （その量は、ｄＡ
ＴＰおよびビオチン−１１−ｄＵＴＰが、５：１〜９：
１のモル比で最初に存在し、ｄＡＴＰ濃度プラスビオチ
ン−１１−ｄＵＴＰ濃度の和がオリゴヌクレオチドの濃
度の２００倍であるものとする）を含有する溶液中での
インキュベーションによりラベルする。反応は、３７°
Ｃで２〜２０分間、または全ての単量体が組み込まれる
まで行わせる。 ［００７７］ 前記したように、捕捉オリゴヌクレオチドは、ポリｄＴ
の３′末端付加によりラベルする。連結技術も使用する
ことができるが、この種の方法論はそれ程複雑ではない
。また、捕捉オリゴヌクレオチドは、ＤＮＰ−ｄＵＴＰ
Ｏ形でジニトロフェニル残基を組み込むことによりラベ
ルすることができる。また、捕捉オリゴヌクレオチドは
、化学的にラベルした後、アリルアミンｄＵＭＰホスホ
ロアミダイト（タックら（１９８８）、前記文献参照）
の存在下で自動的に合成することができる。合成および
仕上げの後、アリルアミン残基を２，４−ジニトロフル
オロベンゼンとの反応によりラベルする。 ［００７８］ 足マトリックスおよび 出 １Ｍ酢酸アンモニウムによりイムロン２マイクロタイタ
ブレートの穴を２回リンスすることにより、ポリｄＡ捕
捉穴を調製する。２００ｎｇのポリｄＡ （ファ１）開
平４−１４１０９９ （６４） ルマシア・ファイン・ケミカルス、ビス力タウェイ、Ｎ
Ｊ）を、５０μｌの容量の１Ｍ酢酸アンモニウム中にて
穴に添加する。穴が乾燥するまで（１２時間以上）ドラ
イインキュベータ中でプレートを３７°Ｃでインキュベ
ートする。プレートを封止し、使用するまで２〜８°Ｃ
で保存する。使用の直前に、固定ポリＡを含むプレート
を２ｘＳＳＣにより２回リンスし、その後０．１％トリ
トンＸ−１００を含有するＺｘＳＳＣ中で５〜６０分間
定置する。 ［００７９］ ウサギ抗ＤＮＰＩｇＧのような抗体を含有する捕捉穴を
、３７°Ｃで２〜４時間イムロン２プレートの穴中で５
０μｍの５０ｍＭ重炭酸緩衝液中で希釈された適当な量
の抗体をインキュベートすることにより調製する。使用
するまで２〜８Ｃでカバーしてプレートを保存する。使
用の直前に、固定抗体を含むプレートを、０．１％トリ
トンＸ−１００を含有する０、５ｘＳＳＣにより２回リ
ンスする。 ［００８０１ 分析に供する増幅したコピー数の標的核酸を含有するサ
ンプルを９２°Ｃで１０分間熱変性させ、速やかに冷却
し、滅菌水に−より希釈する。２０％ホルムアミド、１
ｘＳＳＰＥ、２％硫酸デキストラン、１％トリトンＸ−
１００並びに５０ｎ ｇ ／ ｍ １のシグナルオリゴ
デオキシヌクレオチド並びに適当量の捕捉オリゴヌクレ
オチドのようなハイブリダイゼーション溶液に希釈した
サンプルを添加する。例えば、ｄＡＴＰ−ビオチン−１
１−ｄＵＴＰ尾部シグナルプローブを、ポリｄＴ尾部捕
捉プローブと組合せて、またはＤＮＰラベル捕捉プロー
ブと組合せて使用する。捕捉プローブ量は、予め滴定し
たものである。全ての捕捉プローブが、標的配列にハイ
ブリダイズするが否かに拘らず、マイクロタイタブレー
トの単一捕捉穴中で捕捉試薬により結合され得るものと
する。ハイブリダイゼーション反応（１００μｌ）を室
温で５〜３０分間行わせた後、０．１％トリトンＸ−１
００を含有する４００μｍの０．０５ｘ〜Ｏ５−、、，
１ｘ Ｓ Ｓ Ｃによりサンプルを希釈する。希釈ハイ
ブリダイゼーション反応物の分画をマイクロタイタブレ
ートの穴に添加する。ポリｄＡ捕捉穴を使用し、ポリ１
尾部捕捉プローブを使用する場合、サンプルを大中で２
〜５分間インキュベートした後、０．１％トリトンＸ−
１００を含有する０、０５ｘ〜０．１ｘＳＳＣにより洗
浄する。ＤＮＰラベル捕捉プローブと共に抗ＤＮＰ抗体
を使用する場合、穴を１０〜６０分間インキュベートし
た後、０．１％トリトンＸ−１００を含有する０、０５
ｘ 〜０．１ｘＳＳＣにより洗浄する。前記したように
、デテク１−ｈｒｐを使用してハイブリッ、ドの量を測
定することができる。 ［００８１］ 抗体またはポリヌクレオチド修飾ラテックスまたはポリ
スチレンビーズのようなマトリックスを、同様の増幅／
サンドイッチ捕捉アッセイの捕捉マトリックスとして使
用することができる。 ［００８２］ 実施例↓ ＡＩＤＳの蔓延および特定の種類のＨＩＶの蔓延に関す
る疫学的研究は、世界の人口に対するウィルスの範囲お
よび分布を確立するのに極めて重要である。この疾患の
蔓延を監視すると共に特定の患者における疾患の進行を
監視するため、そして恐らくより重要なことは、世界の
血液供給を保護するために、ＨＩＶ核酸配列の存在また
は非存在を測定することは非常に重要である。ＰＣＲの
ような増幅方法論はこの種の検討を行う能力を相当改良
されているが、これらのアッセイのネガティブな結果の
正確性を決定するのは困難である。 ［００８３］ 核酸増幅および検出の陰性結果の確認の推定は、Ｈｌｌ
［Ｖに露呈された個々人の範囲においてＨＩＶＤＮＡの
量を正確に測定することによってのみ行うことができる
。最近の研究によれば、ＣＤ４ （＋）細胞は、潜伏Ｈ
ＩＶプロウィルスＤＮＡの保存体として作用し、プロウ
ィルスＤＮＡを有するこれらの細胞の数は、無症候性血
清陽性個人で１／４０，０００〜１／１００．−ＡＩＤ
Ｓ患者で１／１００と見積もられている。プサリドポウ
ロスら、「組み込まれたプロウィルスヒト免疫不全ウィ
ルスタイプ■は、健康な血清陽性個人のＣＤ４＋末梢血
液リンパ球中に存在する」、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６
３：４６２６−４６３１ （１９８９）、およびシュ
ニットマンら、「ヒト末梢血液のＨＩＶ−１の保存体は
、ＣＤ４の発現を維持するＴ細胞である」、Ｓｃ １ｅ
ｎｃｅ、２４５ ： ３０５−３０８ （１９８９）を
参照することができる。 ［００８４］ これらの研究において、ＡＣＨ２細胞は、１の組み込ま
れたコピーのＨＩＶ−１を細胞当り含有し、増幅／検出
手順の標準として使用された。したがって、この標準体
においては、反応毎の増幅効率の変動を考慮に入れるこ
とができなり）。 患者試料中細胞当りのＨＩＶゲノムの範囲を正確に確立
するためには、それぞれの反応における増幅の効率を測
定する必要がある。意図する配列と同一の反応混合物中
のβ−グロビンまたはグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼのような既知の標準配列の同時増幅により、こ
の種の情報が提供される。 ［００８５］ 実施例２では、増幅されたＨＩＶ核酸の検出の限界は、
１５０，０ＯＯＰＢＬ中のＨＩＶＤＮＡの２コピーであ
ると認められ、これは検出が、ここに開示した方法によ
るか、標準的な Ｐ方法論によるかを問わなかった。 この感度の限界のため、少なくとも７０〜８０％の増幅
の効率が必要である。臨床サンプルについて同様の試験
を行うに際し、１〜３コピー／１５０，０ＯＯＰＢＬの
バックグラウンドの範囲の読みは、結論を出せないと判
断しなければならない。低くかつ／または陰性の読みは
、ＨＩＶＤＮＡの非存在または存在するＨＩＶＤＮＡの
不充分な増幅の結果である。それぞれの増幅反応の効率
が既知の場合、低くかつ／または陰性の読みは、結論を
出し得るものとして解釈できる。例えば、臨床サンプル
についての増幅反応の効率が８５％であると知られ、Ｈ
ＩＶ検出の結果、くく２コピーのＨＩＶＤＮＡが示され
る場合（すなわち、バックグラウンドを越えるには不充
分である）、ＨＩＶＤＮＡの不存在（１５０，０ＯＯＰ
ＢＬ中）の結論を出すことができる。一方、増幅反応の
効率が５０％であると知られ、ＨＩＶ配列検出によりＯ
〜３コピーのＨＩＶが示された場合、結果は結論を出し
得ないものと考えられ、手順を繰り返すことにより必要
な増幅効率か達成され得る。 ［００８６］ 増幅反応に既知の標準を取り入れて使用し、それぞれの
増幅反応の効率を見積もることができるのは自明である
が、これを達成するための簡単な手段は全く記載されて
いない。ここに開示した方法は、この種の手順に容易に
受は入れられるものである。実施例２では、患者試料を
サンプル材料として破壊した未精製末梢血液リンパ球（
ＰＢＬ）細胞を使用しポリメラーゼ鎖反応により増幅に
供する場合、２つの組合せのプライマー（ＨＩＶ配列に
ついての１つの組合せ、およびマーカー配列についての
第２の組合せ）をＰＣＲ反応に包めることができる。第
２の組合せのプライマーは、細胞当り１コピーでＰＢＬ
の正常なゲノム中に存在することが知られた遺伝子配列
から選択される。この種の遺伝子配列の例はβ−グロビ
ン遺伝子である。他の例は、中間代謝の酵素の遺伝子で
あり、例えばグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
遺伝子である。β−グロビンについての遺伝子を使用す
る場合、サイキら、「カマ細胞貧血症の診断のためのＢ
−グロビンゲノム配列の酵素的増幅および制限部位分析
Ｊ、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３５０−１３５４ （
１９８５）に記載されたようなプライマーの配列が適切
である。 重複しない一本鎖ポリヌクレオチドプローブの対を、こ
れらのプライマーの間に位置する配列から選択する。こ
れらは、１本のストランドまたは他のものに相補的であ
るよう選択し、増幅したコピー数のβ−グロビン配列を
検出するのに使用する。検出は、標的核酸の検出で使用
した手順により行う。 ［００８７］ ＨＩＶＩ配列およびβ−グロビン配列の検出のための増
幅反応は、ＨＩＶＩについて表４に示したプライマーの
存在下、サイキら、（１９８５）、前記文献に示された
β−グロビン配列についてのプライマーの存在下で、Ｐ
ＢＬの懸濁物により行う。増幅の後、主として前記した
ようにしてプローブに対するハイブリダイゼーションを
行う。２つのポリＴ尾部プローブをハイブリダイゼーシ
ョン溶液に添加する。表５のＨＩＶについての１尾部プ
ローブを、前記したように選択したβ−グロビンについ
ての１尾部プローブと同様に使用する。ハイブリダイゼ
ーション反応の一部をマイクロタイタブレートの個々の
穴に添加する。１つの組合せの穴は、表５に示されるよ
うにＨＩＶＩについてのプローブを含有し、他の組合せ
の穴は前記したように選択されたβ−グロビンについて
のプローブを有する。増幅した核酸の特異的な希釈物を
ハイブリダイゼーション混合物に添加し、その後希釈物
をマイクロタイタブレートの穴に添加する。増幅した核
酸配列を測定する。結果が現れる場合に得られる吸光度
の読みから、増幅反応の効率が確定され、意図する標的
配列についての陰性の結果の確認が行われる。 ［００８８］ またこれらの手順は、意図する第２標的核酸配列の存在
を検出するのに使用することができる。例えば、ＥＢＶ
およびＨＩＶについて前記したプライマーを単一増幅反
応で使用することができ、マイクロタイタブレートの穴
は、ＥＢＶ特異的またはＨＩＶ特異的オリゴヌクレオチ
ドを含有することができ、更にＨＩＶまたはＥＢＶまた
は両者の存在は、単一の増幅反応および単一の検出操作
により確立することができる。 ［００８９］ 実施倒立 実施例４において、感染個体中のＨＩＶＤＮＡの量を測
定する検討により、感染の段階によって、１０，０００
〜１，０００，０ＯＯＰＢＬ中の１ゲノムコピーの範囲
を確認することができる。単に増幅反応の効率を改良す
ることが可能ならば、それぞれの増幅反応で１０６以上
の細胞を一貫して使用してこの種の検討を行うことも可
能であろう。また、２５〜３５（以上）から増幅の回数
（ラウンド）を増加させてこの種の検討を行うことが可
能である。しかしながら、増幅の効率は、増幅反応に投
入される粗製材料の量が増加すると共に減少する傾向が
ある。更に増幅の回数が２５〜３５を越えて増加すると
、しばしば標的非特異的配列の生成が起こる。 ［００９０］ これらの困難を回避する方法は、サンプルから核酸を精
製することである。残念なことに、多くの場合サンプル
から核酸を精製することは困難で単調なものであり、サ
ンプルが互いに夾雑するに至る場合もある。更に、試験
に供するサンプルからの核酸の精製は、例えばフェノー
ルのような危険性のある材料の使用を必要とする。その
他の場合、サンプルからの核酸の精製が必要とされ得る
が、これはサンプルの破壊および核酸の放出に必要な条
件および材料が、核酸の酵素的増幅に和合しないためで
ある。例えば、フェノール、界面活性剤並びに還元剤を
使用して、唾液サンプル中のマイコバクテリウム・チュ
ーベルキュロシスまたはエム・アビウム核酸の存在につ
いての試験のためにサンプルが破壊される。このような
場合、増幅反応を開始する前に、核酸がこれらの破壊剤
を含有しないものとしなければならない。 ［００９１］ これらの困難を回避する簡単な方法は、意図する配列の
予備捕捉または予備選択である。この種の手順により、
殆ど全ゆる量のサンプルを使用する可能性、および通常
は酵素的増幅反応に和合しないサンプルを破壊する条件
および材料を使用する可能性が与えられる。 ［００９２］ 破壊されたサンプルから予期された標的核酸を予備捕捉
することにより、増幅の効率をより一貫したものとし、
幾つかのサンプルを破壊するのに使用する材料を酵素的
増幅反応を開始する前に容易に除去することができる。 標的核酸が非常に低い濃度であるためハイブリダイゼー
ション反応に非常に長い時間がかかることは考えなくて
もよい。増幅反応を行うに際し、最初の回の増幅にはプ
ライマーと標的核酸のハイブリダイゼーション（アニー
ル）を必要とする。現在使用されている手順では、これ
には通常は５分未満が必要である。破壊されたサンプル
中の核酸とマトリックス結合または捕捉し得る予備捕捉
プローブとの最初のアニール反応を行うことにより、標
的核酸がサンプルの残余およびサンプル破壊試薬を含有
しないものとすることが可能である。 ［００９３］ 実施例１におけるように、６〜８の異なる、重複しない
プローブ／プライマーオリゴヌクレオチドが選択され、
特定の標的核酸配列について合成が行われる。 これらは、図５のオリゴヌクレオチドＡ−Ｈとして示さ
れる。標的がＤＮＡである場合に予備捕捉プローブを形
成するためには、ボッシュとムッソ（１９８７）前記文
献に記載されたように、これらの２つのオリゴヌクレオ
チド（図５のオリゴヌクレオチドＡおよびＨ）（標的が
元来一本鎖の場合は１つのオリゴヌクレオチド、すなわ
ちＲＮＡ）を、その後５−′末端を介してセファクリル
または調節されたボアガラスまたは他の支持体に架橋さ
せる。１つの手順では、破壊したサンプルとビーズ架橋
オリゴヌクレオチド予備捕捉プローブとをハイブリダイ
ズさせる。このハイブリダイゼーションに続いて、沈降
またはろ過によりビーズを集め特開平４−ｚ４ｘｏｒ）
ｃ＋ （７０）−旦ビーズがこれらの材料を含有しない
ものとなったならば、ビーズを増幅反応 ［００９４］ リボヌクレオチドが存在するにも拘らず、ビーズに架橋
しない。増幅の後、 プロ ［００９５］ ができる。 この種の予備捕捉プローブは、 第１予備捕捉部分により修飾される。 的に相互作用する） とを接触させる。例えば、 図５の予備捕捉オリゴヌクレオチ ドＡおよびＨを、前記したようにポリＴによりその３′
末端において、または合 −ブの３′末端を前記したようにブロックする。破壊サ
ンプル中における核酸に対するアニールの後、ハイブリ
ッド（および全ての予備捕捉プローブＡおよびＨ）とポ
リＡまたはセファクリル、ラテックス、ポリスチレン、
ＣＰＧまたは他の固体マトリックスに架橋したポリｄＡ
とを接触させる。前記したようにハイブリッドを洗浄し
、これらがサンプルの残部およびサンプル破壊剤を含有
しないものとする。ハイブリッドを含有するマトリック
スをその後回７に示すようにプライマーＢおよびＧを含
有する増幅反応混合物に懸濁する。通常と同様に増幅を
行い図７の増幅された材料として増幅された核酸を検出
する。
【図１】
Ｅ−ＢウィルスＤＮＡ構造および増幅／ハイブリッド捕
捉アッセイに使用するオリゴヌクレオチド配列を示す図
。ＩＲＩリピートを拡大してオリゴヌクレオチドプライ
マーおよびプローブの位置を示す。記載した図の下部は
オリゴヌクレオチド１〜６の配列である。
捉アッセイに使用するオリゴヌクレオチド配列を示す図
。ＩＲＩリピートを拡大してオリゴヌクレオチドプライ
マーおよびプローブの位置を示す。記載した図の下部は
オリゴヌクレオチド１〜６の配列である。
【図２】
未増幅核酸標的配列を使用するハイブリッド捕捉アッセ
イの感度および特異性を示すグラフ。０．７８ｎｇ〜５
０ｎｇの標的プラスミドＤＮＡから、ｐｃＦｌを、オリ
ゴヌクレオチド対、ＥＢＶ２およびポリ下部部ＥＢＶ３
（白四角）またはＥＢＶ４およびポリ下部部ＥＢＶ５
（黒四角）を用いてハイブリッド捕捉によりアッセイ
した。等量のｐＡＫ８ＤＮＡといずれかのオリゴヌクレ
オチド対とのハイブリダイゼーションにより、バックグ
ラウンド吸光度の読み（白丸）が与えられた。
イの感度および特異性を示すグラフ。０．７８ｎｇ〜５
０ｎｇの標的プラスミドＤＮＡから、ｐｃＦｌを、オリ
ゴヌクレオチド対、ＥＢＶ２およびポリ下部部ＥＢＶ３
（白四角）またはＥＢＶ４およびポリ下部部ＥＢＶ５
（黒四角）を用いてハイブリッド捕捉によりアッセイ
した。等量のｐＡＫ８ＤＮＡといずれかのオリゴヌクレ
オチド対とのハイブリダイゼーションにより、バックグ
ラウンド吸光度の読み（白丸）が与えられた。
【図３】
ハイブリッド捕捉による増幅ＥＢＶ配列の検出を示すグ
ラフ。１ｐｇのｐ′ＣＦ１およびｐＡＫ８ＤＮＡを２５
回の増幅に供した。出発プラスミドＤＮＡの７８アトグ
ラム〜２．５フエムトグラムに和音する増幅反応混合物
の一部を、ＥＢＶ５を捕捉オリゴヌクレオチドとして、
ポリ下部部ＥＢＶ４をシグナルオリゴヌク〜レオチドと
して使用するハイブリッド捕捉によりアッセイした。増
幅されたｐＣツセイし標準の作成を図った。
ラフ。１ｐｇのｐ′ＣＦ１およびｐＡＫ８ＤＮＡを２５
回の増幅に供した。出発プラスミドＤＮＡの７８アトグ
ラム〜２．５フエムトグラムに和音する増幅反応混合物
の一部を、ＥＢＶ５を捕捉オリゴヌクレオチドとして、
ポリ下部部ＥＢＶ４をシグナルオリゴヌク〜レオチドと
して使用するハイブリッド捕捉によりアッセイした。増
幅されたｐＣツセイし標準の作成を図った。
【図４】
核酸配列の酵素的増幅の際の標的ＤＮＡの量の相対的増
加を示すグラフ。１０ｐｇのｐＤＦｌおよびｐＡＫ８Ｄ
ＮＡを０〜３５回の増幅に供した。５回の時点で増幅反
応を停止し、ＥＢＶ５およびポリＴ尾部ＥＢＶ４を使用
するハイブリッド捕捉によりアッセイした。１．２５ｎ
ｇ〜４０ｎｇの未増幅ｐｃＦ１もハイブリッド捕捉によ
りアッセイして標準曲線（これにより増幅の効率を見積
もる）を作成した。
加を示すグラフ。１０ｐｇのｐＤＦｌおよびｐＡＫ８Ｄ
ＮＡを０〜３５回の増幅に供した。５回の時点で増幅反
応を停止し、ＥＢＶ５およびポリＴ尾部ＥＢＶ４を使用
するハイブリッド捕捉によりアッセイした。１．２５ｎ
ｇ〜４０ｎｇの未増幅ｐｃＦ１もハイブリッド捕捉によ
りアッセイして標準曲線（これにより増幅の効率を見積
もる）を作成した。
【図５】
標的核酸配列の予備捕捉および増幅を示す図。これはＤ
ＮＡ標的中の標的核酸の領域を示す。予備捕捉、プライ
マーおよびプローブオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡデユ
ープレックスの上下の線により示す。Ａ−Ｄは、実線に
より示されるＤＮＡのストランド中に含まれるものと同
じ配列である代表的配列を含む。Ｅ−Ｈは、破線により
示されるＤＮＡのストランド中に含まれるものと同じ配
列である代表的配列を含む。
ＮＡ標的中の標的核酸の領域を示す。予備捕捉、プライ
マーおよびプローブオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡデユ
ープレックスの上下の線により示す。Ａ−Ｄは、実線に
より示されるＤＮＡのストランド中に含まれるものと同
じ配列である代表的配列を含む。Ｅ−Ｈは、破線により
示されるＤＮＡのストランド中に含まれるものと同じ配
列である代表的配列を含む。
【図６】
標的核酸配列の予備捕捉および増幅を示す図。この図で
は、予備捕捉プローブＡ−Ｈは、明細書中に記載したよ
うにビーズに架橋して示されている。これらは標的ＤＮ
Ａストランドにハイブリダイズする。ビーズ結合ハイブ
リッドの洗浄の後、予備捕捉プローブＡおよびＨを使用
しく３つのラウンドを示す）増幅を行い、結果的にビー
ズ結合、予備捕捉配列ＡおよびＨに架橋した増幅ＤＮＡ
配列を与える。増幅した核酸配列の検出は、結合シグナ
ルビーズＢ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのハイブリダイゼ
ーションおよび検出により行う。
は、予備捕捉プローブＡ−Ｈは、明細書中に記載したよ
うにビーズに架橋して示されている。これらは標的ＤＮ
Ａストランドにハイブリダイズする。ビーズ結合ハイブ
リッドの洗浄の後、予備捕捉プローブＡおよびＨを使用
しく３つのラウンドを示す）増幅を行い、結果的にビー
ズ結合、予備捕捉配列ＡおよびＨに架橋した増幅ＤＮＡ
配列を与える。増幅した核酸配列の検出は、結合シグナ
ルビーズＢ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのハイブリダイゼ
ーションおよび検出により行う。
【図７】
標的核酸配列の予備捕捉および増幅を示す図。この図で
は、ビーズ結合予備捕捉プローブＡおよびＨを３′末端
で修飾する（オリゴヌクレオチドの末端の黒丸により示
す）。標的核酸のビーズ結合ハイブリッドおよび予備捕
捉プローブを洗−浄した後、プライマーＢおよびＧの存
在下に増幅を行う。増幅の後（３ラウンドが示されてい
る） プローブ対ＣおよびＤおよび／またはＥおよびＦ
を、ビーズに架橋していない増幅核酸配列の検出に使用
する。図６および図７では、増幅ラウンドの重合工程の
際に合成されたＤＮＡは濃い実線または破線で示す。
は、ビーズ結合予備捕捉プローブＡおよびＨを３′末端
で修飾する（オリゴヌクレオチドの末端の黒丸により示
す）。標的核酸のビーズ結合ハイブリッドおよび予備捕
捉プローブを洗−浄した後、プライマーＢおよびＧの存
在下に増幅を行う。増幅の後（３ラウンドが示されてい
る） プローブ対ＣおよびＤおよび／またはＥおよびＦ
を、ビーズに架橋していない増幅核酸配列の検出に使用
する。図６および図７では、増幅ラウンドの重合工程の
際に合成されたＤＮＡは濃い実線または破線で示す。
【図１】
図面
【図２】
くＯ
５・３
【図３】
シむ形／ｌ初ント。
（ＰＣＴ ：Ｌ。
３−口、ｚ−ｐ＜／Ｐ雇ａ、 ０−０）２０・
３０ ４Ｃ二Ｊ くっ ４％ ｂ抄ｄ４竹塘 入 ａ （ｐ−一−・−−〜
−−−−−−−−−−−−−−−・−−・−ｍ−−−−
・−−−・−−−−−一−−〜−〜・−−−一・−・−
−−−−−−−−−−−−−−一一−−−−・−ｍ−−
−−・−−−一−−−−・ ５′−＋＋＋＋＋＋＋＋
−−−−−＋＋−１１−＋＋＋＋＋−−＋−１１−−−
−−ｍ−７″ ＬＪＨ
３０ ４Ｃ二Ｊ くっ ４％ ｂ抄ｄ４竹塘 入 ａ （ｐ−一−・−−〜
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−−ｍ−７″ ＬＪＨ
【図６】
巧＜廂祷τ炙７’ｏ−７’悄ｒ佑ビ゛−プ“士−！４す
、了・−「し工 ○＝エニー−，−１−−−−ｏ−０−１，１１，２−１
１，−１，−１
、了・−「し工 ○＝エニー−，−１−−−−ｏ−０−１，１１，２−１
１，−１，−１
【図７】
Ｇ
Claims (84)
- 【請求項１】試験に供するサンプル中の一本鎖標的核酸
を測定する組成物であって、 （ｉ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（このプライマーは、標的
核酸の一本鎖の相補的部分に選択的にアニールすること
ができる）、 （ｉｉ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド
、（ｉｉｉ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延
長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖
標的核酸に相補的であり、これに対してプライマーがア
ニールして増幅された核酸配列を与える）、（ｉｖ）第
１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した普遍的ラベル
捕捉部分からなる第１ポリヌクレオチドプローブ（これ
は標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る）、 （ｖ）標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第２
一本鎖ポリヌクレオチドからなる第２ポリヌクレオチド
プローブ、（ｖｉ）第２ポリヌクレオチドプローブが固
定されるマトリックス、並びに（ｖｉｉ）第１ポリヌク
レオチドプローブが、マトリックス固定第２ヌクレオチ
ドプローブとのハイブリダイズにより捕捉される増幅さ
れた標的核酸配列とのハイブリダイズにより捕捉される
場合、第１普遍的ラベル捕捉部分によって捕捉され得る
普遍的ラベル からなる組成物。 - 【請求項２】それぞれのオリゴヌクレオチドプライマー
が少なくともデカヌクレオチドである請求項１記載の組
成物。 - 【請求項３】核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼで
ある請求項１記載の組成物。 - 【請求項４】核酸ポリメラーゼが逆転写酵素である請求
項１記載の組成物。 - 【請求項５】核酸ポリメラーゼが逆転写酵素であり、更
にＤＮＡポリメラーゼを含む請求項１記載の組成物。 - 【請求項６】第１および第２プローブがそれぞれ少なく
ともデカヌクレオチドである請求項１記載の組成物。 - 【請求項７】普遍的ラベル捕捉部分が特異的結合対のパ
ートナーであり、組成物がこれに対して検出し得る部分
に結合した結合パートナーを更に含む請求項１記載の組
成物。 - 【請求項８】普遍的ラベル捕捉部分がリガンドであり、
その結合パートナーがそのレセプターである請求項７記
載の組成物。 - 【請求項９】普遍的ラベル捕捉部分がポリヌクレオチド
であり、その結合パートナーが相補的ポリヌクレオチド
である請求項７記載の組成物。 - 【請求項１０】普遍的ラベル部分が抗原またはハプテン
であり、その結合パートナーがその抗原またはハプテン
に対する抗体または特異的結合断片である請求項７記載
の組成物。 - 【請求項１１】普遍的ラベル捕捉部分がホルモンであり
、その結合パートナーがそのレセプターである請求項７
記載の組成物。 - 【請求項１２】普遍的ラベル捕捉部分がアポ酵素であり
、その結合パートナーがその補欠因子である請求項７記
載の組成物。 - 【請求項１３】普遍的ラベル捕捉部分が糖であり、その
結合パートナーがこれに特異的に結合し得るレクチンで
ある請求項７記載の組成物。 - 【請求項１４】普遍的ラベル捕捉部分がアビジンまたは
ストレプトアビジンであり、その結合パートナーがビオ
チンまたはその結合アナログである請求項７記載の組成
物。 - 【請求項１５】試験に供するサンプル中の一本鎖標的核
酸を測定する方法であって、 （ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、 （ｂ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー
数の標的核酸と第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着
した第１普遍的ラベル捕捉部分からなる第１ポリヌクレ
オチドプローブとを接触させ（第１一本鎖ポリヌクレオ
チド断片は、ハイブリッドを形成するよう標的核酸の第
１部分とハイブリダイズし得る）、（ｃ）ハイブリダイ
ズし得る条件下で、かくして形成されたいずれかのハイ
ブリッドとマトリックス固定第２ポリヌクレオチドプロ
ーブ（標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第２
一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる）とを接触させて
結合複合体を形成させ、 （ｄ）必要に応じて結合複合体を全ゆる未結合核酸から
分離し、（ｅ）普遍的ラベルの存在または非存在を捕捉
し観察することにより増幅された標的核酸の存在または
非存在を測定する ことからなる方法。 - 【請求項１６】標的核酸のコピー数の増幅をポリメラー
ゼ鎖反応により行う請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】標的核酸のコピー数を、Ｑβレプリカー
ゼを使用することにより増幅する請求項１５記載の方法
。 - 【請求項１８】工程（ｂ）が、増幅したコピー数の標的
ヌクメオチドと第１プローブとを接触させる（ここで普
遍的ラベル捕捉部分は特異的結合対の１つのパートナー
である）ことからなり、更にその後その反応生成物と普
遍的ラベル捕捉部分についての検出的にラベルした結合
パートナーとを接触させることからなる請求項１５記載
の方法。 - 【請求項１９】増幅したコピー数の標的核酸を同時に第
１プローブ（ここで普遍的ラベル捕捉部分は特異的結合
対の１つのパートナーである）および第２プローブと接
触させ、更にその後その反応生成物と普遍的ラベル捕捉
部分についての検出的にラベルした結合パートナーとを
接触させることからなる請求項１５記載の方法。 - 【請求項２０】第１および第２プローブをそれぞれ少な
くともデカヌクレオチドとする請求項１５記載の方法。 - 【請求項２１】普遍的ラベル捕捉部分をリガンドとし、
その結合パートナーをそのレセプターとする請求項１８
記載の方法。 - 【請求項２２】普遍的ラベル捕捉部分をポリヌクレオチ
ドとし、その結合パートナーを相補的ポリヌクレオチド
とする請求項１８記載の方法。 - 【請求項２３】普遍的ラベル捕捉部分を抗原またはハプ
テンとし、その結合パートナーを抗原またはハプテンに
対するその抗体または特異的結合断片とする請求項１８
記載の方法。 - 【請求項２４】普遍的ラベル捕捉部分をホルモンとし、
その結合パートナーをそのレセプターとする請求項１８
記載の方法。 - 【請求項２５】普遍的ラベル捕捉部分をアポ酵素とし、
その結合パートナーをその補欠因子とする請求項１８記
載の方法。 - 【請求項２６】普遍的ラベル捕捉部分を糖とし、その結
合パートナーをこれに特異的に結合し得るレクチンとす
る請求項１８記載の方法。 - 【請求項２７】普遍的ラベル捕捉部分をアビジンまたは
ストレプトアビジンとし、その結合パートナーをビオチ
ンまたはその結合アナログとする請求項１８記載の方法
。 - 【請求項２８】試験に供するサンプル中の一本鎖標的核
酸を測定する組成物であって、 （ｉ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（このプライマーは、標的
核酸の一本鎖の相補的部分に選択的にアニールすること
ができる）、 （ｉｉ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド
、（ｉｉｉ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延
長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖
標的核酸に相補的であり、これに対してプライマーがア
ニールする）、 （ｉｖ）第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラ
ベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレ
オチドプローブ（これは標的核酸の第１部分とハイブリ
ダイズし得る）、並びに （ｖ）標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第２
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１実体からな
る第２ポリヌクレオチドプローブ、（ｖｉ）第２実体が
付着したマトリックス（これは第１実体と特異的に結合
し得る） からなる組成物。 - 【請求項２９】それぞれのオリゴヌクレオチドプライマ
ーが少なくともデカヌクレオチドである請求項２８記載
の組成物。 - 【請求項３０】核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼ
である請求項２８記載の組成物。 - 【請求項３１】核酸ポリメラーゼが逆転写酵素である請
求項２８記載の組成物。 - 【請求項３２】核酸ポリメラーゼが逆転写酵素であり、
更にＤＮＡポリメラーゼを含む請求項２８記載の組成物
。 - 【請求項３３】ラベル系成分が特異的結合対の１つのパ
ートナーであり、組成物が検出し得る部分に結合したそ
の結合パートナーを更に含む請求項２８記載の組成物。 - 【請求項３４】１つの実体がリガンドであり、他の実体
がそのレセプターである請求項２８記載の組成物。 - 【請求項３５】第１および第２実体が相補的ポリヌクレ
オチドである請求項２８記載の組成物。 - 【請求項３６】１つの実体が抗原またはハプテンであり
、他の実体が抗原またはハプテンに対する抗体または特
異的結合断片である請求項２８記載の組成物。 - 【請求項３７】１つの実体がホルモンであり、他の実体
がそれに対するレセプターである請求項２８記載の組成
物。 - 【請求項３８】１つの実体が酵素であり、他の実体がそ
の阻害剤である請求項２８記載の組成物。 - 【請求項３９】１つの実体がアポ酵素であり、他の実体
がその補欠因子である請求項２８記載の組成物。 - 【請求項４０】１つの実体が糖であり、他の実体がこれ
に特異的に結合し得るレクチンである請求項２８記載の
組成物。 - 【請求項４１】１つの実体がアビジンまたはストレプト
アビジンであり、他の実体がビオチンまたはその結合ア
ナログである請求項２８記載の組成物。 - 【請求項４２】試験に供するサンプル中の一本鎖標的核
酸を測定する方法であって、 （ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、 （ｂ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー
数の標的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分にハイブリダ
イズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した
少なくとも１つのラベル系の成分からなる第１ポリヌク
レオチドプローブ、 （ｉｉ）標的核酸の第２部分にハイブリダイズし得る第
２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１実体から
なる第２ポリヌクレオチドプローブ、並びに（ｉｉｉ）
第１実体と特異的に結合し得る第２実体が付着したマト
リックスとを接触させ （ｃ）第１および第２プローブと存在する全ゆる増幅さ
れたコピー数の標的核酸とをハイブリダイズさせ、第１
実体と第２実体とを結合させて結合複合体を生成し、 （ｄ）必要に応じて結合複合体を全ゆる未結合核酸から
分離し、（ｅ）増幅された標的核酸の存在または非存在
を測定することからなる方法。 - 【請求項４３】標的核酸のコピー数の増幅をポリメラー
ゼ鎖反応により行う請求項４２記載の方法。 - 【請求項４４】標的核酸のコピー数をＱβレプリカーゼ
を使用することにより増幅する請求項４２記載の方法。 - 【請求項４５】増幅したコピー数の標的核酸を第１およ
び第２プローブと同時に接触させて複合体を形成させ、
その後第２実体と複合体とを接触させる請求項４２記載
の方法。 - 【請求項４６】第１プローブおよび増幅したコピー数の
標的核酸を、第１および第２実体により第２プローブが
既に結合したマトリックスと接触させる請求項４２記載
の方法。 - 【請求項４７】１つの実体をリガンドとし、他の実体を
そのレセプターとする請求項４２記載の方法。 - 【請求項４８】第１および耐２実体を相補的ポリヌクレ
オチドとする請求項４２記載の方法。 - 【請求項４９】１つの実体を抗原またはハプテンとし、
他の実体を抗原またはハプテンに対するその抗体または
特異的結合断片とする請求項４２記載の方法。 - 【請求項５０】１つの実体をホルモンとし、他の実体を
そのレセプターとする請求項４２記載の方法。 - 【請求項５１】１つの実体を酵素とし、他の実体をその
阻害剤とする請求項４２記載の方法。 - 【請求項５２】１つの実体をアポ酵素とし、他の実体を
その補欠因子とする請求項４２記載の方法。 - 【請求項５３】１つの実体を糖とし、他の実体をこれに
特異的に結合し得るレクチンとする請求項４２記載の方
法。 - 【請求項５４】１つの実体をアビシンまたはストレプト
アビジンとし、他の実体をビオチンまたはその結合アナ
ログとする請求項４２記載の方法。 - 【請求項５５】試験に供するサンプル中の一本鎖ＨＩＶ
核酸を測定する組成物であって、 （ａ）次の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
、【化１】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、
（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖ＨＩＶ
核酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニー
ルする）、 （ｄ）第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した普遍
的ラベル捕捉部分からなる第１ポリヌクレオチドプロー
ブ（これは次よりなる群から選択される配列を有する）
、 【化２】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｅ）この配列の他のものを有する第２ポリヌクレオチ
ドプローブ、（ｆ）第２ポリヌクレオチドプローブが固
定されるマトリックス、並びに（ｇ）第１ポリヌクレオ
チドプローブが、増幅された標的核酸配列に対するハイ
ブリダイズにより捕捉される場合（これは次にマトリッ
クス固定第２ポリヌクレオチドプローブとのハイブリダ
イズにより捕捉される）、第１ポリヌクレオチドプロー
ブに含有される第１普遍的ラベル捕捉部分によって捕捉
され得る普遍的ラベル からなる組成物。 - 【請求項５６】普遍的ラベル捕捉部分がポリーＴ配列で
ある請求項５５記載の組成物。 - 【請求項５７】普遍的ラベル捕捉部分がアビジンまたは
ストレプトアビジンであり、その結合パートナーがビオ
チンまたはその結合アナログである請求項５５記載の組
成物。 - 【請求項５８】試験に供するサンプル中の一本鎖ＨＩＶ
核酸を測定する方法であって、 （ａ）次の配列を有するＨＩＶ核酸のコピー数を増幅し
、【化３】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）ハイブリッド形成を可能とすべく増幅したコピー
数のＨＩＶ核酸と、次よりなる群から選択される配列を
有する第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１
普遍的ラベル捕捉部分からなる第１ポリヌクレオチドプ
ローブとを接触させ、 【化４】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｃ）ハイブリダイズし得る条件下で、かくして形成さ
れたハイブリッドと、この配列の他のものを有する第２
一本鎖ポリヌクレオチド断片からなるマトリックス固定
第２ポリヌクレオチドプローブとを接触させ、（ｄ）ハ
イブリッドとマトリックス固定第２プローブとのハイブ
リダイズを可能とし、 （ｅ）必要に応じて結合ハイブリッドを全ゆる未結合核
酸から分離し、（ｆ）増幅されたＨＩＶ核酸の存在また
は非存在を測定することからなる方法。 - 【請求項５９】試験に供するサンプル中の一本鎖ＨＩＶ
核酸を測定する組成物であって、 （ａ）次の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
、【化５】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、
（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖ＨＩＶ
核酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニー
ルする）、 （ｄ）次よりなる群から選択される配列を有する第１一
本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少なく
とも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチドプローブ
、 【化６】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｅ）この配列の他のものを有する第２一本鎖ポリヌク
レオチド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌク
レオチドプローブ、並びに（ｆ）第１実体に特異的に結
合し得る第２実体が固定されたマトリックスからなる組
成物。 - 【請求項６０】試験に供するサンプル中の一本鎖ＨＩＶ
核酸を測定する方法であって、 （ａ）次の配列を有するプライマーを使用し、標的核酸
のコピー数を増幅し、【化７】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）ハイブリッド形成を可能とすべく増幅したコピー
数のＨＩＶ核酸と、（ｉ）次よりなる群から選択される
配列を有する第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着し
たラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ヌクレ
オチドプローブ、 【化８】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｉｉ）この配列の他のものを有する第２一本鎖ポリヌ
クレオチド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌ
クレオチドプローブ、（ｉｉｉ）第１実体と特異的に結
合し得る第２実体が結合したマトリックス、（ｃ）第１
および第２プローブと存在する全ゆる増幅されたコピー
数のＨＩＶ核酸とをハイブリダイズさせ、第１実体と第
２実体とを結合させて結合複合体を形成させ、 （ｄ）必要に応じて結合複合体を全ゆる未結合核酸から
分離し、（ｅ）増幅されたＨＩＶ核酸の存在または非存
在を測定することからなる方法。 - 【請求項６１】試験に供するサンプル中の一本鎖Ｅ−Ｂ
ウィルス核酸を測定する組成物であって、 （ａ）次の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
、【化９】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、
（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖Ｅ−Ｂ
ウィルス核酸に相補的であり、これに対してプライマー
がアニールする）、 （ｄ）次よりなる群から選択される配列を有する第１一
本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した普遍的ラベル捕捉
部分からなる第１ポリヌクレオチドプローブ、【化１０
】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｅ）この配列の他のものを有する第２ポリヌクレオチ
ドプローブ、（ｆ）第２ポリヌクレオチドプローブが固
定されるマトリックス並びに（ｇ）第１ポリヌクレオチ
ドプローブがハイブリダイズにより増幅されたＥ−Ｂ核
酸配列に捕捉された場合（これはハイブリダイズにより
マトリックス固定第２ポリヌクレオチドプローブに捕捉
される）、第１普遍的ラベル捕捉部分により捕捉され得
る普遍的ラベル からなる組成物。 - 【請求項６２】普遍的ラベル捕捉部分がポリーＴ配列で
ある請求項６１記載の組成物。 - 【請求項６３】普遍的ラベル捕捉部分がアビジンまたは
ストレプトアビジンであり、その結合パートナーがビオ
チンまたはその結合アナログである請求項６１記載の組
成物。 - 【請求項６４】試験に供するサンプル中の一本鎖Ｅ−Ｂ
ウィルス核酸を測定する方法であって、 （ａ）次の配列を有するプライマーを使用し、Ｅ−Ｂウ
ィルス核酸のコピー数を増幅し、 【化１１】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）ハイブリッド形成を可能とすべく増幅したコピー
数のＥ−Ｂウィルス核酸と、次よりなる群から選択され
る配列を有する第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着
した第１普遍的ラベル捕捉部分からなる第１ポリヌクレ
オチドプローブとを接触させ、 【化１２】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｃ）ハイブリダイズし得る条件下で、ハイブリッドと
この配列の他のものを有する第２一本鎖ポリヌクレオチ
ド断片からなるマトリックス固定第２ポリヌクレオチド
プローブとを接触させ、 （ｄ）ハイブリッドとマトリックス固定第２プローブと
のハイブリダイズを行い、 （ｅ）必要に応じて結合ハイブリッドを全ゆる未結合核
酸から分離し、（ｆ）Ｅ−Ｂウィルス核酸の存在または
非存在を測定することからなる方法。 - 【請求項６５】試験に供するサンプル中の一本鎖Ｅ−Ｂ
ウィルス核酸を測定する組成物であって、 （ａ）次の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
、【化１３】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、
（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖Ｅ−Ｂ
ウィルス核酸に相補的であり、これに対してプライマー
がアニールする）、 （ｄ）次よりなる群から選択される配列を有する第１一
本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少なく
とも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチドプローブ
、 【化１４】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｅ）この配列の他のものを有する第２一本鎖ポリヌク
レオチド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌク
レオチドプローブ、並びに（ｆ）第１実体と特異的に結
合し得る第２実体が固定されたマトリックスからなる組
成物。 - 【請求項６６】試験に供するサンプル中の一本鎖Ｅ−Ｂ
ウィルス核酸を測定する方法であって、 （ａ）次の配列を有するプライマーを使用し、Ｅ−Ｂウ
ィルス核酸のコピー数を増幅し、 【化１５】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）ハイブリッド形成を可能とすべく増幅したコピー
数の標的核酸と、（ｉ）次よりなる群から選択される配
列を有する第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した
ラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌク
レオチドプローブ、 【化１６】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｉｉ）この配列の他のものを有する第２一本鎖ポリヌ
クレオチド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌ
クレオチドプローブ、並びに（ｉｉｉ）第１実体に特異
的に結合し得る第２実体が付着したマトリックスとを接
触させ、 （ｃ）第１および第２プローブと存在する全ゆる増幅し
たコピー数のＥ−Ｂウィルス核酸とをハイブリダイズさ
せ、第１実体と第２実体とを結合させて結合複合体を生
成し、 （ｄ）必要に応じて結合複合体を全ゆる未結合核酸から
分離し、（ｅ）増幅されたＥ−Ｂウィルス核酸の存在ま
たは非存在を測定することからなる方法。 - 【請求項６７】サンプル中の一本鎖標的核酸を測定する
組成物であって、（ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的
核酸についてのマトリックス付着捕捉ポリヌクレオチド
（このヌクレオチドは、その標的核酸の相補的部分に選
択的にアニールすることができ、その標的核酸のプライ
マーとして働くことができる）（ｂ）４つの核酸塩基の
それぞれのモノヌクレオチド、（ｃ）捕捉ポリヌクレオ
チド／プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖標的核
酸に相補的であり、これに対して捕捉ポリヌクレオチド
／プライマーがアニールしてマトリックス結合増幅核酸
配列を与える）、並びに （ｄ）増幅、マトリックス結合標的核酸とハイブリダイ
ズし得る一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル
系の少なくとも１つの成分からなるポリヌクレオチドプ
ローブ からなる組成物。 - 【請求項６８】試験に供するサンプル中の一本鎖標的核
酸を測定する方法であって、 （ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸について一本
鎖標的核酸とマトリックス固定捕捉ポリヌクレオチドと
の間のハイブリッド形成を行うべく接触させ、（ｂ）ハ
イブリダイズした標的核酸をサンプルから分離し、（ｃ
）標的核酸のコピー数を増幅してマトリックス結合増幅
コピー数の標的核酸を生成し、 （ｄ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー
数と、増幅した標的核酸の一部とハイブリダイズし得る
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少な
くとも１つの成分からなるポリヌクレオチドプローブと
を接触させ、（ｅ）ハイブリダイズさせて増幅標的核酸
とプローブとの複合体を形成し、（ｆ）必要に応じて結
合したプローブを全ゆる未結合核酸から分離し、（ｇ）
結合ラベルを観察することにより結合した増幅標的の存
在または非存在を測定する ことからなる方法。 - 【請求項６９】試験に供するサンプル中の一本鎖標的核
酸を測定する組成物であって、 （ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのマ
トリックス付着捕捉ポリヌクレオチド（このポリヌクレ
オチドは、その標的核酸の相補的部分に選択的にアニー
ルし得る）、 （ｂ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（このプライマーは、その
標的核酸の相補的部分に選択的にアニールし得る）、 （ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、
（ｄ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖標的核
酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニール
する）、 （ｅ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る第１
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少な
くとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチドプロー
ブ、 （ｆ）標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第２
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１実体からな
る第２ポリヌクレオチドプローブ、並びに（ｇ）第１実
体と特異的に結合し得る第２実体が付着したマトリック
スからなる組成物。 - 【請求項７０】試験に供するサンプル中の一本鎖標的核
酸を測定する方法であって、 （ａ）ハイブリダイズし得る条件下で、一本鎖標的核酸
と、意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてに少な
くとも１つのマトリックス付着捕捉ポリヌクレオチドと
を接触させ（このポリヌクレオチドは、その標的核酸の
相補的部分に選択的にアニールし得る）、 （ｂ）ハイブリダイズした標的核酸をサンプルから分離
し、（ｃ）捕捉配列と重複しないプライマーを添加する
ことにより標的核酸のコピー数を増幅して未結合増幅コ
ピー数の標的核酸を生成し、（ｄ）複合体を形成すべく
未結合増幅標的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分とハイ
ブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付
着したラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポ
リヌクレオチドプローブ、 （ｉｉ）標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第
２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１実体から
なる第２ポリヌクレオチドプローブとを接触させ、 （ｅ）複合体と、第１実体に特異的に結合し得る第２実
体が付着したマトリックスとを接触させ、 （ｆ）必要に応じて結合プローブを全ゆる未結合核酸か
ら分離し、（ｇ）結合ラベルの存在を観察することによ
り結合増幅標的核酸の存在または非存在を測定する ことからなる方法。 - 【請求項７１】試験に供するサンプル中の一本鎖ＨＩＶ
核酸を測定する組成物であって、 （ａ）次の配列を有するマトリックス付着捕捉ポリヌク
レオチド、【化１７】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、
（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖ＨＩＶ
核酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニー
ルする）、 （ｄ）次の群から選択される配列を有する一本鎖ポリヌ
クレオチド断片に付着したラベル系の少なくとも１つの
成分からなる第１ポリヌクレオチドプローブ、【化１８
】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｅ）この配列の他のものを有する第２ポリヌクレオチ
ドプローブからなる組成物。 - 【請求項７２】試験に供するサンプル中の一本鎖ＨＩＶ
核酸を測定する方法であって、 （ａ）ハイブリッドを形成すべく一本鎖ＨＩＶ核酸と次
の配列を有するマトリックス固定捕捉ポリヌクレオチド
／プライマーとを接触させ、【化１９】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）かくしてハイブリダイズしたＨＩＶ核酸をサンプ
ルから分離し、（ｃ）ＨＩＶ核酸のコピー数を増幅して
マトリックス結合増幅コピー数のＨＩＶ核酸を生成し、 （ｄ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅コピー数の
ＨＩＶ核酸と次よりなる群から選択される一本鎖ポリヌ
クレオチド断片に付着したラベル系の少なくとも１つの
成分からなるポリヌクレオチドプローブとを接触させ、
【化２０】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｆ）プローブとマトリックス固定ＨＩＶ核酸とをハイ
ブリダイズさせ、（ｇ）必要に応じて結合ハイブリッド
を全ゆる未結合核酸から分離し、（ｈ）結合ラベルの存
在または非存在を観察することにより増幅されたＨＩＶ
核酸の存在または非存在を測定する ことからなる方法。 - 【請求項７３】マーカー核酸を含有し標的核酸を含有す
る可能性のあるサンプル中で、一本鎖標的核酸を測定し
その増幅の効率を確認する組成物であって、（ａ）反応
帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌ
クレオチドプライマー（このプライマーは、一本鎖標的
核酸の相補的部分に選択的にアニールし得る）、 （ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖マーカー核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマー（サンプル中のそ
のコピー数は既知である）（このプライマーは、一本鎖
マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニールし得る）
、（ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド
、（ｄ）プライマーおよびモノヌクレオチドから反応帯
域中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これ
はそれぞれ一本鎖の標的およびマーカー核酸に対して相
補的であり、これにプライマーがアニールする）、（ｅ
）標的核酸の第１部分にハイブリダイズし得る第１一本
鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１ラベル系の少な
くとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド標的プ
ローブ、 （ｆ）反応帯域から離間した第１試験帯域に結合し、標
的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第２一本鎖ポ
リヌクレオチド断片からなる第２ポリヌクレオチド標的
プローブ、 （ｇ）マーカー核酸の第１部分とハイブリダイズし得る
第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の
少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチドマ
ーカープローブ、並びに （ｈ）反応帯域および第１試験帯域から離間した第２試
験帯域に結合し、マーカー核酸の第２部分とハイブリダ
イズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第
２ポリヌクレオチドマーカープローブからなる組成物。 - 【請求項７４】マーカー核酸を含有し標的核酸を含有す
る可能性のあるサンプル中で、一本鎖標的核酸を測定し
その増幅の効率を確認する方法であって、（ａ）反応帯
域中のサンプルと一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的
にアニールし得るオリゴヌクレオチドプライマーとを接
触させ、（ｂ）既知のコピー数のマーカー核酸を含有す
る反応帯域中のサンプルと一本鎖マーカー核酸の相補的
部分に選択的にアニールし得るオリゴヌクレオチドプラ
イマーとを接触させ、 （ｃ）核酸ポリメラーゼとの接触により反応帯域中の標
的およびマーカー核酸のコピー数を増幅し、 （ｄ）反応帯域中で、ハイブリダイズし得る条件下で、
増幅されたコピー数の標的およびマーカー核酸と （ｉ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る第１
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１ラベル系の
少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド標
的プローブ、および （ｉｉ）マーカー核酸の第１部分とハイブリダイズし得
る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第２ラベ
ル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオ
チドマーカープローブ とを接触させ、 （ｅ）第１マーカーおよび標的プローブと増幅したコピ
ー数のマーカー核酸および存在し得る全ゆる標的核酸と
をそれぞれハイブリダイズさせてマーカーおよび標的ハ
イブリッドを形成し、 （ｆ）反応帯域から離間した第１試験帯域中でかくして
処理したサンプルの第１分画と第１試験帯域に結合した
第２ポリヌクレオチド標的プローブとを接触させ、第２
標的プローブと存在する全ゆる増幅したコピー数の標的
核酸とをハイブリダイズさせ、 （ｇ）反応帯域および第１試験帯域から離間した第２試
験帯域中でかくして処理したサンプルの第２分画と第２
試験帯域に結合した第２ポリヌクレオチドマーカープロ
ーブとを接触させ、第２マーカープローブと増幅したコ
ピー数のマーカー核酸とをハイブリダイズさせ、 （ｈ）必要に応じて試験帯域から全ゆる未結合核酸を分
離し、（ｉ）第１試験帯域中に存在する全ゆる標的核酸
のコピー数および第２試験帯域中のマーカー核酸のコピ
ー数を測定する ことからなる方法。 - 【請求項７５】マーカー核酸を含有し標的核酸を含有す
る可能性のあるサンプル中で、一本鎖標的核酸を測定し
その増幅の効率を確認する組成物であって、（ａ）反応
帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌ
クレオチドプライマー（このプライマーは、一本鎖標的
核酸の相補的部分に選択的にアニールすることができる
）、 （ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（サンプル中のそのコピー
数は既知である）（このプライマーは、一本鎖マーカー
核酸の相補的部分に選択的にアニールすることができる
）（ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド
、（ｄ）プライマーおよびモノヌクレオチドから反応帯
域中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これ
はそれぞれ一本鎖の標的およびマーカー核酸に相補的で
あり、これに対してプライマーがアニールする）、（ｅ
）標的核酸の第１部分にハイブリダイズし得る第１一本
鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１ラベル系の少な
くとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド標的プ
ローブ、 （ｆ）標的核酸の第２部分にハイブリダイズし得る第２
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１実体からな
る第２ポリヌクレオチド標的プローブ、（ｇ）第１実体
に特異的に結合し得る第２実体が結合した標的試験帯域
、（ｈ）マーカー核酸の第１部分にハイブリダイズし得
る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第２ラベ
ル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオ
チドマーカープローブ、 （ｉ）マーカー核酸の第２部分にハイブリダイズし得る
第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第３実体か
らなる第２ポリヌクレオチドマーカープローブ、並びに （ｊ）第３実体に特異的に結合し得る第４実体が結合し
た標的試験帯域からなる組成物。 - 【請求項７６】第１および第２ラベル系が同一であり、
第１および第２結合実体対が第３および第４結合実体対
と異なる請求項７５記載の組成物。 - 【請求項７７】第１および第２ラベル系が識別し得る程
異なり、第１および第２結合実体対が第３および第４結
合実体対と同一である請求項７５記載の組成物。 - 【請求項７８】マーカー核酸を含有し、標的核酸を含有
する可能性のあるサンプル中で、一本鎖標的核酸を測定
しその増幅の効率を確認する方法であって、（ａ）反応
帯域中でサンプルと一本鎖標的核酸についてのオリゴヌ
クレオチドプライマーとを接触させ（このプライマーは
、一本鎖標的核酸の相補的部分と選択的にアニールする
ことができる）、 （ｂ）反応帯域中でサンプルと一本鎖マーカー核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させ（サ
ンプル中のそのコピー数は既知であり、このプライマー
は、一本鎖マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニー
ルすることができる）、 （ｃ）サンプルと核酸ポリメラーゼとを接触させること
により、反応帯域中でサンプル中の標的およびマーカー
核酸のコピー数を増幅し、（ｄ）反応帯域中でハイブリ
ダイズし得る条件下で増幅したコピー数の標的核酸と （ｉ）ラベル部分とラベル部分に付着した標的核酸の第
１部分とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオ
チド断片とからなる第１ポリヌクレオチド標的プローブ
、 （ｉｉ）標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第
２一本鎖ポリヌクレオチド断片および第２ポリヌクレオ
チド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌクレオ
チド標的プローブ とを接触させ、 （ｅ）反応帯域中で、ハイブリダイズし得る条件下で、
増幅されたコピー数のマーカー核酸と （ｉ）ラベル部分とラベルに付着したマーカー核酸の第
１部分とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオ
チド断片とからなる第１ポリヌクレオチドマーカープロ
ーブ、および （ｉｉ）マーカー核酸の第２部分とハイブリダイズし得
る第２一本祖ポリヌクレオチド断片と第２ポリヌクレオ
チド断片に付着した第３実体とからなる第２ポリヌクレ
オチドマーカープローブ とを接触させ、 （ｆ）（ｉ）第１および第２標的プローブと存在する全
ゆる増幅したコピー数の標的核酸との、および（ｉｉ）
第１および第２マーカープローブと存在する増幅したコ
ピー数のマーカー核酸とのハイブリダイゼーションを行
い、（ｇ）工程（ａ）〜（ｆ）で処理したサンプルの分
画と第１試験帯域（これは反応帯域から離間し、これに
第２実体が結合する）中の第１実体と特異的に結合し得
る第２実体とを接触させ、 （ｈ）工程（ａ）〜（ｆ）で処理したサンプルの他の分
画と第２試験帯域（これは反応帯域および第１試験帯域
から離間し、これに第４実体が結合する）中で第３実体
と特異的に結合し得る第４実体とを接触させ、（ｉ）必
要に応じて試験帯域に結合した核酸を全ゆる未結合核酸
から分離し、（ｊ）増幅されたマーカー核酸のコピー数
および全ゆる標的核酸の存在または非存在を測定する ことからなる方法。 - 【請求項７９】マーカー核酸を含有するサンプル中で一
本鎖ＨＩＶ核酸を測定しその増幅の効率を確認する組成
物であって、（ａ）次の配列を有する反応帯域中で有用
なＨＩＶオリゴヌクレオチドプライマー 【化２１】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）それぞれの一本鎖マーカー核酸についてのオリゴ
ヌクレオチドプライマー（そのコピー数は既知であり、
このプライマーは、その一本鎖マーカー核酸の相補的部
分に選択的にアニールすることができる）（ｃ）４つの
核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド（ｄ）プライマ
ーおよびモノヌクレオチドから延長生成物を生成し得る
核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的およびマーカー
核酸にそれぞれ相補的であり、これにプライマーがアニ
ールする）、 （ｅ）ラベル部分とラベル部分に付着した第１一本鎖ポ
リヌクレオチド断片とからなる第１ポリヌクレオチドＨ
ＩＶプローブ（この第１一本鎖ポリヌクレオチド断片は
次よりなる群から選択される配列を有する）【化２２】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｆ）この配列の他のものを有し、反応帯域から離間し
た第１試験帯域に結合した第２ポリヌクレオチドＨＩＶ
プローブ （ｇ）標的ラベル部分から識別し得る第２ラベル部分と
、標的核酸の第１部分にハイブリダイズし得てラベル部
分に付着した第１一本鎖ポリヌクレオチド断片とからな
る第１ポリヌクレオチドマーカープローブ、並びに（ｈ
）マーカー核酸の第２部分とハイブリダイズし得て反応
帯域および第１試験帯域から離間した第２試験帯域に結
合した第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第２ポ
リヌクレオチドマーカープローブからなる組成物。 - 【請求項８０】マーカー核酸を含有しＨＩＶ核酸を含有
する可能性のあるサンプル中で一本鎖ＨＩＶ核酸を測定
しその増幅の効率を確認する方法であって、（ａ）反応
帯域中でサンプルと次の配列を有するＨＩＶオリゴヌク
レオチドプライマーとを接触させ、 【化２３】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｂ）反応帯域中でサンプルとそれぞれの一本鎖マーカ
ー核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマーとを接
触させ（サンプル中のそのコピー数は既知であり、この
プライマーは、一本鎖マーカー核酸の相補的部分と選択
的にアニールすることができる）、 （ｃ）反応帯域中でサンプルと４つの核酸塩基のそれぞ
れのモノヌクレオチドとを接触させ、 （ｄ）サンプル中のＨＩＶおよびマーカー核酸のコピー
数を増幅し、（ｅ）反応帯域中で、ハイブリダイズし得
る条件下で、増幅したコピー数の核酸と次よりなる群か
ら選択されるＨＩＶ特異的配列を有する第１一本鎖ポリ
ヌクレオチド断片に付着したラベル部分からなる第１Ｈ
ＩＶポリヌクレオチドプローブとを接触させ、 【化２４】 【遺伝子配列があります】および 【遺伝子配列があります】 （ｆ）第１ＨＩＶプローブと存在する全ゆる増幅したコ
ピー数の核酸とをハイブリダイズさせてＨＩＶハイブリ
ッドを形成し、（ｇ）反応帯域中で、ハイブリダイズし
得る条件下で、増幅したコピー数のマーカー核酸とマー
カー核酸の第１部分にハイブリダイズし得る第１一本鎖
ポリヌクレオチド断片に付着したラベル部分からなる第
１ポリヌクレオチドマーカープローブとを接触させ、 （ｈ）第１マーカープローブと存在する全ゆる増幅した
コピー数のマーカー核酸とをハイブリダイズさせてマー
カーハイブリッドを形成し、（ｉ）反応帯域から離間し
た第１試験帯域中で、ハイブリダイズし得る条件下で、
工程（ａ）〜（ｆ）で処理したサンプルの分画とＨＩＶ
プローブ配列の他のものを有する第１試験帯域に結合し
た第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第２ポリヌ
クレオチドＨＩＶプローブとを接触させ、（ｊ）反応帯
域および第１試験帯域から離間した第２試験帯域中で、
マーカー核酸の第２部分にハイブリダイズし得て第２試
験帯域に結合した一本鎖核酸配列からなる第２ポリヌク
レオチドマーカープローブを接触させ、（ｋ）ハイブリ
ッドと試験帯域固定第２プローブとをハイブリダイズさ
せ、（ｌ）必要に応じて試験帯域に結合した核酸を全ゆ
る未結合核酸から分離し、（ｍ）増幅されたマーカー核
酸のコピー数および全ゆるＨＩＶ核酸の存在または非存
在を測定する ことからなる方法。 - 【請求項８１】試験に供するサンプル中の複数の一本鎖
標的核酸を測定する組成物であって、 （ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（このそれぞれのプライマ
ーは、標的核酸の一本鎖の相補的部分に選択的にアニー
ルすることができる）、 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、
（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから反応帯域
中で延長生成物を生成することのできる核酸ポリメラー
ゼ（この延長生成物は、特定のプライマーがアニールす
る一本鎖標的核酸に相補的である）、（ｄ）ラベル部分
とラベル部分に付着した第１一本鎖ポリヌクレオチド断
片とからなる核酸標的のそれぞれについての第１ポリヌ
クレオチドプローブ（第１一本鎖ポリヌクレオチド断片
のそれぞれは、そのそれぞれの標的核酸の第１部分とハ
イブリダイズし得る）、 （ｅ）その標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得て
それぞれの他の標的核酸についての試験帯域から離間し
た試験帯域に結合した第２一本鎖ポリヌクレオチド断片
からなるそれぞれの核酸標的についての第２ポリヌクレ
オチドプローブからなる組成物。 - 【請求項８２】試験に供するサンプル中の複数の一本鎖
標的核酸を測定する組成物であって、 （ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（このプライマーのそれぞ
れは、一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にアニール
することができる）、 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、
（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから反応帯域
中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（この延
長生成物は、特定のプライマーがアニールする一本鎖の
標的核酸に相補的である）、 （ｄ）その標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る
第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系成
分からなるそれぞれの核酸標的についての第１ポリヌク
レオチドプローブ、 （ｅ）その標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る
第２一本鎖ポリヌクレオチド断片と第２ポリヌクレオチ
ド断片に付着した特異的結合実体とからなるそれぞれの
核酸標的についての第２ポリヌクレオチドプローブ、並
びに（ｆ）それぞれ反応帯域およびそれぞれの他の試験
帯域から離間し、それぞれ結合パートナー（これは意図
する標的核酸についての第２プローブに付着した特異的
な結合実体とのみ結合し得る）が付着した複数の試験帯
域からなる組成物。 - 【請求項８３】試験に供するサンプル中の一本鎖標的核
酸を測定する組成物であって、 （ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（このプライマーは、標的
核酸の一本鎖の相補的部分に選択的にアニールし得る）
、 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、
（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的
核酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニー
ルして増幅された核酸配列を与える）、（ｄ）標的核酸
の第１部分に相補的な複数の第１一本鎖ポリヌクレオチ
ド断片が付着した第１粒子からなる第１ポリヌクレオチ
ドプローブ、並びに（ｅ）標的核酸の第２部分に相補的
な複数の第２一本鎖ポリヌクレオチド断片が付着した第
２粒子からなる第２ポリヌクレオチドプローブからなる
組成物。 - 【請求項８４】試験に供するサンプル中の一本鎖標的核
酸を測定する方法であって、 （ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、 （ｂ）ハイブリダイズし得る条件下で標的核酸と（ｉ）
標的核酸の第１部分に相補的な複数の第１一本鎖ポリヌ
クレオチド断片が付着した第１粒子からなる第１ポリヌ
クレオチドプローブ、および（ｉｉ）標的遺伝物質の第
２部分に相補的な複数の第２一本鎖ポリヌクレオチド断
片が付着した第２粒子からなる第２ポリヌクレオチドプ
ローブとを接触させ、 （ｃ）第１ポリヌクレオチド断片と標的核酸の第１部分
とを、および第２断片と標的核酸の第２部分とをハイブ
リダイズさせ、ハイブリダイゼーシヨンにより結果的に
凝集を与え、 （ｄ）凝集を測定する ことからなる方法。
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