JPH07252299A - ヒルジン誘導体およびその製造方法 - Google Patents

ヒルジン誘導体およびその製造方法

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JPH07252299A
JPH07252299A JP7021384A JP2138495A JPH07252299A JP H07252299 A JPH07252299 A JP H07252299A JP 7021384 A JP7021384 A JP 7021384A JP 2138495 A JP2138495 A JP 2138495A JP H07252299 A JPH07252299 A JP H07252299A
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hirudin
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phenyl
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Ranier Obermeier
ライナー・オーベルマイアー
Juergen Ludwig
ユルゲン・ルートヴイヒ
Dominique Tripier
ドミニク・トリピエ
Max Dr Hropot
マクス・フロポト
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Hoechst AG
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒルジン誘導体、ヒルジン分子の一部をアミ
ン誘導体で選択的に酵素置換することによるそれらの製
造、およびヒルジン誘導体の医薬としての使用に関す
る。 【効果】 ヒルジン誘導体は抗凝固作用を有する医薬の
製造に適している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、ヒルジン誘導体、分子の一部の
アミン誘導体での選択的酵素置換によるそれらの製造、
およびヒルジン誘導体の医薬としての使用に関する。
【０００２】ヒルジンは、６５のアミノ酸残基から構成
され、ヒル（Hirudo medicinalis）の唾液腺から単離で
きる蛋白質である。トロンビンの選択的阻害剤として、
それは凝固阻害作用を有する〔Pharmazie 36、633−660
(1981)〕。この単一鎖ポリペプチドは３個のジスルフィ
ド橋を有し、これらが位置１〜４９のアミノ酸の間のド
メインを強力に畳まれたコンパクトな蛋白質三次構造と
して安定化する。直線状のＣ−末端アミノ酸配列５５〜
６５はトロンビンに結合するためのアンカー配列を提供
する。天然のヒルジンは位置６３のチロシン残基のフェ
ノール性のＯＨ基上に硫酸基をもち、これによって、酸
性アミノ酸残基のクラスターにより既に生じているこの
配列領域の酸性の性質が強化されている。硫酸基を除去
すると、ヒルジン／トロンビン相互作用における６０pm
ol〜２０fmolの範囲の解離定数Ｋ Dの値が上昇する。
【０００３】化学的および酵素的に製造されるヒルジン
の誘導体はEP 0 493 588（ニトロ基、ハロゲン置換）お
よびDE 4 224 213（Ｃ末端、酵素的アミド化）に見出す
ことができる。Ｎ−末端の遊離アミノ基またはリジン側
鎖と糖類またはポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）の接
合体がUS 4 179 337およびUS 4 847 325に示されてい
る。
【０００４】長時間作用型医薬として用いるため、ヒル
ジンの慣用のポリエチレングリコールの誘導体がヒルジ
ンに含まれるアミノ酸の官能基とポリエチレングリコー
ル残基（ＰＥＧ）との化学的カップリングによって製造
される（EP 0 345 616参照）。これらの条件下では、一
般にこれらの残基はヒルジン分子中の数個の官能基に結
合できることから、特定の化合物は製造されない。
【０００５】ヒルジンは分子内にアミノ酸のリジン、チ
ロシンおよびフェニルアラニンをそれぞれ３個、２個お
よび１個の位置に含有する。蛋白質中のこのような部位
は通常セリンプロテアーゼたとえばトリプシンまたはキ
モトリプシンによって切断される。したがって、従来知
られていた酵素半合成法（The Peptide, S. Udenfriend
およびJ. Meienhofer編, 9巻, Acad. Press, NY, 1987,
103-165頁）がヒルジンに適用可能であるとは考えられ
なかった。専門家の知識では、ヒルジンの不活性分解生
成物が優先して形成されるであろうと期待されるのであ
る。
【０００６】本発明においては、ある種の反応条件下に
は、ヒルジンとキモトリプシン、トリプシンまたはそれ
らに匹敵する酵素（たとえば、リジンエンドペプチダー
ゼ）の酵素的半合成反応において選択的ペプチド転移が
起こり、新規な化合物へ導くことが見出された。
【０００７】本発明は、式（Ｉ）または（II） Ａ０-Ａ１-Ａ２-(ヒルジン３-３６)-(Ｙ)，(ヒルジン３７-６５) （Ｉ） Ａ０-Ａ１-Ａ２-(ヒルジン３-６３)-(Ｙ) （II） （式中、Ｙはアミン誘導体であり、Ａ１およびＡ２は互
いに独立にアミノ酸残基であり、Ａ０はアミノ酸残基ま
たは水素原子である）の化合物に関する。
【０００８】式ＩおよびIIにおいて用いられた命名法
は、D. TripierによるFolia Haematol. (Leipzig), 11
5, 30-35(1988)の報告に言及されている。式Ｉ中のコン
マは、基本ヒルジンのアミノ酸配列が位置３６と３７の
間で中断され、この化合物は２つのヒルジンフラグメン
トを含有し、それらがジスルフィド橋によって連結して
いることを意味する。アミン誘導体Ｙは基本ヒルジンの
元の配列の位置３６においてアミノ酸にアミド結合によ
って連結している。式IIは、基本ヒルジンの元の配列の
位置６３におけるアミノ酸にアミド結合によって連結し
たアミン誘導体Ｙを含有する化合物を示す。
【０００９】アミン誘導体Ｙは好ましくは以下の式III
ａまたはIIIｂの化合物である。 Ｈ2Ｎ−Ｒ−Ｘ （IIIａ） Ａ−Ｒ1−Ｘ （IIIｂ） 式中、 Ａはa) アミノ酸残基、または b) ２〜１０個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、 Ｒはa) 分岐状もしくは直鎖状の（Ｃ1〜Ｃ10）−アル
キル、または b) 互いに独立に１個または２個以上の １）フェニル、 ２）インドリル、 ３）イミダゾリル、または ４）１個もしくは２個以上のヒドロキシルで置換された
フェニルで置換された分岐状または直鎖状の（Ｃ1〜Ｃ
10）−アルキル c) フェニル、または d) ナフチルであり、 Ｒ1はa) 水素原子、 b) 共有結合 c) グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクト
ース、リボース、リブロースもしくはキシロースのよう
な糖、 d) ２〜１０個の糖を含む多糖、または e) −〔Ｏ−(ＣＨ2)m〕n−（式中、ｍは整数２、３、
４もしくは５であり、ｎは１〜１００の整数である）で
あり、 Ｘはa) 水素原子、 b) −ＯＲ2、 c) −ＳＲ2、 d) −ＮＨＲ2、 e) −ＣＯＯＲ2、または f) Ａ （式中、Ｒ2は １）水素原子 ２）分岐状もしくは直鎖状の（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキ
ル、 ３）１個または２個以上の ３.１ フェニル、 ３.２ インドリル、 ３.３ イミダゾリル、もしくは ３.４ １個もしくは２個以上のヒドロキシルで置換され
たフェニルで置換された分岐状または直鎖状の（Ｃ1〜
Ｃ10）−アルキル ４）フェニル、または ５）ナフチルである）である。
【００１０】式IIIａまたはIIIｂのアミン誘導体Ｙにお
いては、好ましくは、Ａは２〜５個のアミノ酸残基を有
するペプチドであり、 Ｒは１）フェニル、 ２）インドリル ３）イミダゾリル、または ４）４−ヒドロキシフェニル で置換されたエチルであり、 Ｒ1は−〔Ｏ−(ＣＨ2)m〕n− （式中、ｍは２であり、ｎは２０〜５０の整数である）
であり、Ｘはａ）水素原子、 ｂ）−ＯＲ2、 ｃ）−ＮＨＲ2、または ｄ）−ＣＯＯＲ2 （式中、Ｒ2は 1)水素原子 2)（Ｃ1〜Ｃ5）−アルキル、または 3)フェニルである）である。
【００１１】式IIIａまたはIIIｂのアミン誘導体Ｙにお
いては、とくに好ましくは、Ａは基ＴｈｒまたはＡｒｇ
からの２〜５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、 Ｒ1はa) 水素原子、 b) 共有結合、 c) グルコース、または d) 分子量１００〜３０００ｇ／molのポリエチレング
リコールであり、Ｘはa) 水素原子、または b) −ＯＲ2（式中、Ｒ2は三級ブチルである）である。 −〔Ｏ−(ＣＨ2)m〕n−基としては、１５００ｇ／molの
分子量をもつものがとくに好ましい。
【００１２】アミノ酸は、天然の、遺伝子によってコー
ド可能な、天然には存在しない、遺伝子によってコード
されない、Ｌ−またはＤ−アミノ酸を意味するものと理
解すべきである。Ｌ−またはＤ−アミノ酸の例には、ア
ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、ス
レオニン、システイン、シスチン、メチオニン、オルニ
チン、シトルリン、アルギニン、リジン、アスパラギ
ン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、フェ
ニルアラニン、チロシン、サイロキシン、プロリン、ヒ
ドロキシプロリン、トリプトファンおよびヒスチジンが
ある。グリシンおよびγ−アミノ酪酸はアミノ酸のその
他の例である。
【００１３】本発明はまた、アミン誘導体とヒルジン
を、プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、好
ましくはキモトリプシン、トリプシン、トリプシン様酵
素またはリジンエンドペプチダーゼの存在下に反応させ
る式ＩおよびIIの化合物の製造方法に関する。
【００１４】使用できるヒルジンの例としてはEP 14286
0、EP 158564、EP 158986、EP 168342、EP 171024、EP
193175、EP 209061、EP 227938、DE 3445517、DE 38055
40.６；Chang, FEBS 164, 307(1983)；Tripier(Folia H
aematol., Leipzig) 115, 30-35(1988)に開示されてい
るヒルジンを挙げることができる。配列表の配列番号：
１にはヒルジンの構造の例が示されている。
【００１５】適当なヒルジンの例は上に引用した参考文
献に記載された化合物、とくにEP 171024、EP 158986、
EP 209061、DE 3805540. ６に記載された化合物であ
り、たとえば、 Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu- 1 5 10 15 Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly- 20 25 30 Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His- 35 40 45 50 Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln 55 60 65 である。
【００１６】これらのヒルジンは本技術分野の熟練者に
はよく知られたペプチド化学の方法または既知の同等な
方法によって製造できる。別法として、上述のヒルジン
は、本技術分野の熟練者にはよく知られた組換えＤＮＡ
法によって得ることもできる。
【００１７】式Ｉの化合物は、ヒルジンと式IIIａまた
はIIIｂの適当なアミン誘導体の過剰量から、トリプシ
ンまたはトリプシン様酵素たとえばリジンエンドペプチ
ダーゼを用いて形成される。適当なアミン誘導体は、ト
リプシンを使用する場合には遊離の（すなわち保護され
ていない）アルギニン側鎖またはリジン側鎖をもたない
誘導体、または、リジンエンドペプチダーゼを使用する
場合には遊離リジン側鎖をもたない誘導体である。ペプ
チド転移は、使用したヒルジンのアミノ酸配列の位置３
６におけるリジン残基のＣ末端で起こる。この反応で
は、ペプチド結合Ｌｙｓ−Ａｓｎ−（３６−３７）で開
裂し、アミン誘導体がＬｙｓ残基のカルボキシル基に明
白に結合する。これによって、３個のジスルフィド橋に
よって保持される「２本鎖」ヒルジン誘導体が生成す
る。すなわち、２つの末端アミノ酸残基Ａ０、またはＡ
０がない場合にはＡ１、およびＡｓｎ３７（基本ヒルジ
ンアミノ酸配列の位置３７のアスパラギン)がＮ−末端
アミノ酸配列解析(エドマン分解）によって検出でき
て、ヒルジン誘導体は２本鎖構造をもつことが確認され
る。
【００１８】式IIの化合物は、ヒルジンと式IIIａまた
はIIIｂの適当なアミン誘導体の過剰量から、キモトリ
プシンまたは同様の様式で働く酵素を用いて形成され
る。この場合、適当なアミン誘導体は、遊離のチロシン
側鎖をもたない誘導体である。ペプチド転移は、使用し
たヒルジンのアミノ酸配列の位置６３におけるチロシン
残基のＣ末端で起こる。この反応では、基本ヒルジンの
アミノ酸配列の位置６４および６５におけるアミノ酸か
ら構成されるジペプチドがアミン誘導体によって置換さ
れる。
【００１９】アミン誘導体は過剰に使用される。好まし
くは、ヒルジンの量に対して５０〜１５０倍モル過剰の
アミン誘導体を存在させる。アミン誘導体は好ましくは
可能な限り高濃度で使用される。水または水と非プロト
ン性有機溶媒たとえばジメチルホルムアルデヒドとの混
合物が溶媒として有効である。混合物は２５容量（V/
V）％未満の水を含むことが好ましい。水と混和性の有
機溶媒の使用は水に難溶性のアミン誘導体の場合に有利
である。このようにして、反応混合物は均一にすること
ができる。酵素の量は使用されるヒルジンの量の５〜１
０重量％に相当することが好ましい。反応は、好ましく
は４〜６のｐＨ、０℃〜４０℃の温度で、とくに好まし
くは０℃〜１０℃の温度で行われる。使用する酵素は様
々な生物学的起源のものとすることが可能で、たとえば
トリプシンはブタまたはウシ起源のものを使用できる。
【００２０】アミン誘導体としてアミノ酸エステルまた
はオリゴペプチドエステルを使用する場合には、ヒルジ
ンの酵素触媒変換では相当するヒルジン誘導体エステル
が生成する。所望により、エステル基は慣用方法で除去
することができる。しかしながら、中間体のエステル基
の除去は、クロマトグラフィー精製を行った後にのみ実
施するのが有利である。
【００２１】本発明によるヒルジン誘導体の酵素触媒半
合成は、ヒルジンの構造を変換するために組換え方法を
補足する過程である。とくに、遺伝子でコードされない
アミノ酸、たとえばＤ−アミノ酸、または任意のアミン
誘導体が半合成を用いる特定の方法で導入できる。
【００２２】本発明に関わる方法は、たとえば、徐放製
剤として医療に使用できる式ＩまたはIIの特定のヒルジ
ン／ポリエチレングリコール誘導体の製造を可能にす
る。アミノ酸またはオリゴペプチドでエステル化された
ポリエチレングリコールはアミン誘導体としてきわめて
選択的にヒルジンと反応することが可能なので、ポリエ
チレングリコール残基は特定の部位に１回だけ結合す
る。
【００２３】本発明によって製造される他のヒルジン誘
導体には、経皮投与たとえばイオン浸透法によって治療
価値があるものがある。ヒルジン誘導体のイオン浸透法
による投与は本発明の付加的な課題である。
【００２４】本発明はまた、式Ｉおよび／またはIIの化
合物の少なくとも１種の有効量を含有する医薬に関す
る。本発明はさらに式ＩおよびIIの化合物の抗凝固作用
を有する医薬としての使用に関する。
【００２５】遺伝子組換えによって得られた脱硫酸−Ｔ
ｙｒ６３ヒルジン（配列番号：１）を使用する以下の実
施例は、本発明を例示説明するものであって、本発明を
これらの実施例に限定するものではない。
【００２６】例１：ヒルジンの製造 ヒルジンは、たとえば、EP 0324717に従い、ヒルジンを
分泌する酵母細胞内で合成される。ついで、RDiaion HP
20（Mitsubishi Chem.Ind., Japan）を含有するカラム
上クロマトグラフィーに付して、ヒルジンを濃縮させた
（EP 0316650参照）。透析とそれに続くトロンビン−セ
ファロース上のアフィニティークロマトグラフィ−のの
ち、最終的な精製は逆相ＨＰＬＣにより行われた。
【００２７】例２：遺伝子組換えによって得られた脱硫
酸−Ｔｙｒ６３ヒルジン（配列表の配列番号：１）３ｇ
を、２０ｇのＴｈｒ(Ｂｕｔ)ＯＢｕｔアセテート（tert
−ブチル基で保護されたスレオニン：製造についてはEP
0056951参照）とともに６mlの水に溶解し、この溶液に
１９０mgのキモトリプシン（Merck, Darmstadt）を加え
る。溶液のｐＨを４.５に調節し、反応混合物を４℃に
７２時間保存する。ついで、反応混合物を１００mlのメ
タノールで希釈し、３００mlのジメチルエーテルを加え
る。得られた沈殿を遠心沈降させる。残留物をもう１回
メタノール／ジエチルエーテル（１：２、V/V）の混合
物で洗浄し、エーテルで洗浄し、ついで遠心沈降させて
減圧下に乾燥する。収量：粗生成物３.６ｇ。
【００２８】粗生成物は、未反応ヒルジン、所望のヒル
ジン誘導体および酵素的切断の結果として生じた副生成
物からなる。粗生成物を分析ＨＰＬＣによって分析する
と、３９.６％の（ヒルジン１−６３）−Ｔｈｒ(Ｂｕ
ｔ)ＯＢｕｔ（６４）、４５.９％の（ヒルジン１−６
５）および６.３％の切断生成物が認められる。粗生成
物は、調製用ＨＰＬＣカラム（５×２５ｃｍ、静止相は
逆相Ｃ18材料である）上でアセトニトリル／水／トリフ
ルオロ酢酸を用いて勾配溶離することにより、クロマト
グラフィーで分離する。その親油性tert−ブチル保護基
により、（ヒルジン１−６３）−Ｔｈｒ(Ｂｕｔ)ＯＢｕ
ｔは著しく遅い保持時間で溶離する。純粋な中間体を含
有する画分を集め、アセトニトリルを減圧下に蒸発さ
せ、水溶液を凍結乾燥する。 収量：（ヒルジン−６３）−Ｔｈｒ(Ｂｕｔ)ＯＢｕｔ
（６４）９６３mg（純度：９３.６％）
【００２９】得られたヒルジン誘導体を２０mlの９５％
トリフルオロ酢酸中に溶解し、この溶液を室温に４５分
間保持する。ついで、それに氷冷ジメチルエーテル１０
０mlを加える。得られた沈殿を遠心分離し、さらに３回
エーテルで洗浄し、ついで減圧下に乾燥する。収量：
（ヒルジン−６３）−Ｔｈｒ６４（配列表配列番号：２
参照）８０２mg。生成物のアミノ酸分析により、アミノ
酸配列から期待される組成が確認される。
【００３０】例３：遺伝子組換えによって得られた脱硫
酸−Ｔｙｒ６３ヒルジン（配列表の配列番号：１）３ｇ
を例２と同様にして、４１ｇのＴｈｒ(Ｂｕｔ)−Ａｒｇ
−Ａｒｇ（標準方法によって合成）および１７０mgのキ
モトリプシン（Merck, Darmstadt）と反応させる。反応
が完結したならば、混合物に３００mlのメタノールおよ
び１５０mlのジメチルエ−テルを加える。遠心分離して
得られた沈殿をメタノール／エーテルで３回、ついでエ
ーテルで洗浄し、真空中で乾燥する。収量：粗生成物
４.８ｇ。分析ＨＰＬＣ（静止相はＣ18シリカゲル、ア
セトニトリル／水／トリフルオロ酢酸で溶離）によれ
ば、以下の組成を示す。すなわち、６５.２％の（ヒル
ジン１−６３）−Ｔｈｒ(Ｂｕｔ)（６４）−Ａｒｇ（６
５）−Ａｒｇ（６６）−ＯＨ；３.９％の（ヒルジン−
６５）；１８.７％の切断生成物が認められる。生成物
のクロマトグラフィーによる精製および単離は例２と同
様に行う。収量：（ヒルジン１−６３）−Ｔｈｒ(Ｂｕ
ｔ)（６４）−Ａｒｇ（６５）−Ａｒｇ（６６）−ＯＨ
１.５５ｇ；純度：９０.３％
【００３１】スレオニン側鎖上のtert−ブチル保護基は
例２の場合のように、既知方法で除去される。収量：
（ヒルジン１−６３）−Ｔｈｒ（６４）−Ａｒｇ（６
５）−Ａｒｇ（６６）−ＯＨ（配列表の配列番号：３）
１.２ｇ。生成物のアミノ酸分析により、アミノ酸配列
から期待される組成が確認される。
【００３２】アカゲザルに静脈内投与（１mg／kg）した
のち、その抗凝固作用を測定すると、このヒルジン誘導
体はその等電点の変化にもかかわらず、出発のヒルジン
の場合と実質的に同一の活性を発揮する〔試験条件は、
J．Juergens, Dtsch. Arch.Klin. Med. 200, 67(1952)
参照〕。
【００３３】例４：遺伝子組換えによって得られた脱硫
酸−Ｔｙｒ６３ヒルジン（配列表の配列番号：１）３ｇ
を例２の場合と同様にして、２０ｇのＴｈｒ(Ｂｕｔ)Ｏ
Ｂｕｔアセテートおよび２００mgのトリプシン（Merck,
Darmstadt）と反応させる。反応は７２時間で終結し、
例２の場合と同様に後処理を行う。収量：粗生成物４.
２ｇ。粗生成物は以下の組成：５５％（ヒルジン１−３
６）−Ｔｈｒ(Ｂｕｔ)−ＯＢｕｔ、（ヒルジン３７−６
５）；３１％未反応ヒルジン；１５％分解生成物を有す
る。クロマトグラフィーによる精製およびそれに続く単
離は例２の場合と同様に行う。収量：（ヒルジン１−３
６）−Ｔｈｒ(Ｂｕｔ)ＯＢｕｔ，（ヒルジン３７−６
５）１.６５ｇ。
【００３４】スレオニン残基のtert−ブチル保護基は例
２の場合のようにして除去される。収量：（ヒルジン１
−３６）−Ｔｈｒ，（ヒルジン３７−６５），１.３
ｇ．ヒルジン誘導体の第一鎖（ヒルジン１−３６）−Ｔ
ｈｒの構造は配列番号：４に、ヒルジン誘導体の第二鎖
（ヒルジン３７−６５）の構造は配列表の配列番号：５
によって示す。生成物のアミノ酸分析により、アミノ酸
配列から期待される組成が確認される。エドマン配列分
析によって、２つのＮ−末端アミノ酸残基、Ｌｅｕ
（１）およびＡｒｇ（３７）が指示される。アカゲザル
に静脈内投与（１mg／kg）したのちにその抗凝固作用を
測定すると、このヒルジン誘導体はその実質的な構造変
化にもかかわらず、驚くべきことに、出発のヒルジンの
場合と実質的に同一の活性を発揮する。
【００３５】例５：Ｈ・Ｔｈｒ−Ｏ−ＰＥＧ1500は、ペ
プチド化学において既知の方法に従い、ポリエチレング
リコールモノメチルエーテルとtert−ブトキシカルボニ
ルスレオニンを、たとえばヒドロキシベンゾトリアゾー
ルとジシクロヘキシルカルボジイミドを用いるワンポッ
ト反応で反応させて製造する。遺伝子組換えによって得
られた脱硫酸−Ｔｙｒ６３ヒルジン（配列表の配列番
号：１）３ｇを８０ｇのＨ・Ｔｈｒ−Ｏ−ＰＥＧ
1500と、例２のように２５０mgのキモトリプシンととも
に反応させる。反応混合物には可溶化剤としてジメチル
ホルムアミドも加える。反応が完結したならば、反応混
合物を２００mlのメタノールで希釈し、ジメチルエーテ
ルを加えて未反応ヒルジンならびにＰＥＧ−ヒルジンを
沈殿させる。
【００３６】遠心沈降させた粗生成物をメタノール／エ
ーテル（２：１，V/V）からなる混合物で３回洗浄し、
減圧下に乾燥する。ＰＥＧ−ヒルジンおよびヒルジンは
例２の場合と同様にして、製造ＨＰＬＣまたは、さらに
好都合には陽イオン交換カラム（Fractogel-EMD-SO3; M
erck, Darmstadt）上クロマトグラフィー精製によって
分離できる。収量：（ヒルジン１−６３）−Ｔｈｒ−Ｏ
−ＰＥＧ，１.９ｇ。配列表の配列番号６参照。
【００３７】生成物のアミノ酸分析により、アミノ酸配
列から期待される組成が確認される。ＰＥＧ接合体の存
在は、希釈水溶液中でキモトリプシン消化し、ついで薄
層クロマトグラフィーを用いてＴｈｒ−Ｏ−ＰＥＧおよ
び遊離スレオニンと比較することによって証明される。
これによると、遊離スレオニンは分析限界内では検出で
きない。
【００３８】例６：遺伝子組換えによって得られた脱硫
酸−Ｔｙｒ６３ヒルジン（配列表の配列番号：１）３ｇ
を６mlの水に２５ｇのＤ−Ｇｌｕ(ＯＢｕｔ)2アセテー
ト（Sigma,Deisenhofen）とともに溶解し、この溶液に
１９０mgのトリプシンを加える。この溶液のｐＨを４.
５に調節し、反応混合物を４℃に７２時間保存する。そ
の後の操作および後処理は例２の場合と同様に行う。２
つのペプチド鎖からなる生成物の構造は、構成配列であ
る配列番号：７および配列番号５の配列表を参照された
い。
【００３９】例７：遺伝子組換えによって得られた脱硫
酸−Ｔｙｒ６３ヒルジン（配列表の配列番号：１）３ｇ
を６mlの水に３０ｇのＤ−Ｇｌｕ(ＯＢｕｔ)2アセテー
ト（Sigma,Deisenhofen）とともに溶解し、この溶液に
１９０mgのキモトリプシンを加える。溶液のｐＨを４.
５に調節し、反応混合物を４℃に７２時間保存する。以
後の操作および後処理は例２の場合と同様に行う。生成
物の構造は一本鎖からなる（配列表の配列番号：８）。
【００４０】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：６５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物：脱硫酸−Ｔｙｒ６３−ヒルジン 配列の特徴 特徴を表す記号：蛋白質 存在位置：１．．６５ 配列 Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ １ ５ １０ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ １５ ２０ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ２５ ３０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ ３５ ４０ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ ４５ ５０ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ ５５ ６０ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ６５
【００４１】配列番号：２ 配列の長さ：６４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物：ヒルジン誘導体 配列の特徴 特徴を表す記号：蛋白質 存在位置：１．．６４ 配列 Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ １ ５ １０ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ １５ ２０ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ２５ ３０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ ３５ ４０ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ ４５ ５０ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ ５５ ６０ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
【００４２】配列番号：３ 配列の長さ：６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物：ヒルジン誘導体 配列の特徴 特徴を表す記号：蛋白質 存在位置：１．．６６ 配列 Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ １ ５ １０ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ １５ ２０ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ２５ ３０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ ３５ ４０ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ ４５ ５０ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ ５５ ６０ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ ６５
【００４３】配列番号：４ 配列の長さ：３７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列の特徴 特徴を表す記号：蛋白質 存在位置：１．．３７ 配列 Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ １ ５ １０ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ １５ ２０ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ２５ ３０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ３５
【００４４】配列番号：５ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列の特徴 特徴を表す記号：蛋白質 存在位置：１．．２９ 配列 Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ １ ５ １０ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ １５ ２０ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ２５
【００４５】配列番号：６ 配列の長さ：６４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物：ヒルジン誘導体 配列の特徴 特徴を表す記号：蛋白質 存在位置：１．．６４ 配列 Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ １ ５ １０ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ １５ ２０ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ２５ ３０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ ３５ ４０ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ ４５ ５０ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ ５５ ６０ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｘａａ
【００４６】配列番号：７ 配列の長さ：３７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列の特徴 特徴を表す記号：蛋白質 存在位置：１．．３７ 配列 Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ １ ５ １０ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ １５ ２０ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ２５ ３０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｘａａ ３５
【００４７】配列番号：８ 配列の長さ：６４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物：ヒルジン誘導体 配列の特徴 特徴を表す記号：蛋白質 存在位置：１．．６４ 配列 Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ １ ５ １０ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ １５ ２０ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ２５ ３０ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ ３５ ４０ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ ４５ ５０ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ ５５ ６０ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｘａａ
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｂ 9282−4Ｂ Ｃ 9282−4Ｂ (72)発明者 ドミニク・トリピエ ドイツ連邦共和国デー−65817エプシユタ イン．イム・キルシユガルテン16 (72)発明者 マクス・フロポト ドイツ連邦共和国デー−65439フレールス ハイム．フリードリヒ−シユトルツ−シユ トラーセ13

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式（Ｉ）または（II） Ａ０-Ａ１-Ａ２-(ヒルジン３-３６)-(Ｙ)，(ヒルジン３７-６５) （Ｉ） Ａ０-Ａ１-Ａ２-(ヒルジン３-６３)-(Ｙ) （II） ｛式中、 Ａ１はアミノ酸残基であり、 Ａ２はアミノ酸残基であり、 Ａ０はアミノ酸残基または水素原子であり、 Ｙは式IIIａまたはIIIｂ Ｈ2Ｎ−Ｒ−Ｘ （IIIａ） Ａ−Ｒ1−Ｘ （IIIｂ） 〔式中、 Ａはa) アミノ酸残基、または b) ２〜１０個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
    り、 Ｒはa) 分岐状もしくは直鎖状の（Ｃ1〜Ｃ10）−アル
    キル、または b) 互いに独立に１個または２個以上の １）フェニル、 ２）インドリル、 ３）イミダゾリル、または ４）１個もしくは２個以上のヒドロキシルで置換された
    フェニルで置換された分岐状または直鎖状の（Ｃ1〜Ｃ
    10）−アルキル、 c) フェニル、または d) ナフチルであり、 Ｒ1はa) 水素原子、 b) 共有結合 c) グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクト
    ース、リボース、リブロースもしくはキシロースのよう
    な糖、 d) ２〜１０個の糖を含む多糖、または e) −〔Ｏ−(ＣＨ2)m〕n−（式中、ｍは整数２、３、
    ４もしくは５であり、ｎは１〜１００の整数である）で
    あり、 Ｘはa) 水素原子、 b) −ＯＲ2、 c) −ＳＲ2、 d) −ＮＨＲ2、 e) −ＣＯＯＲ2、または f) Ａ （式中、Ｒ2は １）水素原子、 ２）分岐状もしくは直鎖状の（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキ
    ル、 ３）１個または２個以上の ３.１ フェニル、 ３.２ インドリル、 ３.３ イミダゾリル、もしくは ３.４ １もしくは２個以上のヒドロキシルで置換された
    フェニルで置換された分岐状または直鎖状の（Ｃ1〜Ｃ
    10）−アルキル ４）フェニル、または ５）ナフチルである）である〕のアミン誘導体である｝
    の化合物。
  2. 【請求項２】 Ａは２〜５個のアミノ酸残基を有するペ
    プチドであり、 Ｒは１）フェニル、 ２）インドリル、 ３）イミダゾリル、または ４）４-ヒドロキシフェニルで置換されたエチルであ
    り、 Ｒ1は−〔Ｏ−(ＣＨ2)m〕n− （式中、ｍは２であり、ｎは２０〜５０の整数である）
    であり、 Ｘはａ）水素原子、 ｂ）−ＯＲ2、 ｃ）−ＮＨＲ2、または ｄ）−ＣＯＯＲ2 （式中、Ｒ2は 1) 水素原子 2) （Ｃ1〜Ｃ5）−アルキル、または 3) フェニルである） である請求項１に記載の式ＩまたはIIの化合物。
  3. 【請求項３】 Ａは基ＴｈｒまたはＡｒｇからの２〜５
    個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、 Ｒ1はａ）水素原子、 ｂ）共有結合、 ｃ）グルコース、または ｄ）分子量１００〜３０００ｇ／molのポリエチレング
    リコールであり、 Ｘはａ）水素原子、または ｂ）−ＯＲ2（式中、Ｒ2は 三級ブチルである） である請求項１または２に記載の式ＩまたはIIの化合
    物。
  4. 【請求項４】 Ｒ1は分子量１５００ｇ／molのポリエチ
    レン残基である請求項１〜３のいずれかに記載の式Ｉま
    たはIIの化合物。
  5. 【請求項５】 式IIIａまたはIIIｂのアミン誘導体をプ
    ロテアーゼの存在下にヒルジンと反応させる請求項１〜
    ４に記載の化合物の製造方法。
  6. 【請求項６】 キモトリプシン、トリプシンまたはトリ
    プシン様酵素たとえばリジンエンドペプチダーゼの群か
    らのペプチダーゼを使用する請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 請求項１〜４に記載の化合物を含有する
    医薬。
  8. 【請求項８】 抗凝固作用を有する医薬の製造のための
    請求項１〜４に記載の式ＩまたはIIの化合物の使用。
  9. 【請求項９】 経皮投与とくにイオン浸透法による請求
    項７に記載の医薬の使用。
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