JPH07252300A - ダック肝炎ウイルスとヒト肝炎ウイルスの抗原融合蛋白質お よび製造方法 - Google Patents
ダック肝炎ウイルスとヒト肝炎ウイルスの抗原融合蛋白質お よび製造方法Info
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、精製分離が容易であるととも
に、モノクローナル抗体を用いたヒト肝炎ウイルス測定
系を構築可能な発現系を開発することを目的とする。 【構成】 本発明は、ダックＢ型肝炎ウイルスのコア
抗原遺伝子内にヒト肝炎ウイルス遺伝子を連結してなる
組み換え遺伝子を宿主細胞に導入して得る融合蛋白質の
発明であり、その抗原融合蛋白質の製造法の発明、該融
合蛋白質を用いた抗体検査キットおよび抗体検出方法の
発明である。 【効果】 本発明の融合蛋白質は、回収・分離・精製
が容易であるとともに、粒子の主要構成成分であるダッ
クＨＢｃ蛋白質がヒトＨＢｅ抗体とは反応性を有しない
ので、外来遺伝子にのみ高い特異性を有する融合蛋白質
が得られ、所望の目的を達成できる。
に、モノクローナル抗体を用いたヒト肝炎ウイルス測定
系を構築可能な発現系を開発することを目的とする。 【構成】 本発明は、ダックＢ型肝炎ウイルスのコア
抗原遺伝子内にヒト肝炎ウイルス遺伝子を連結してなる
組み換え遺伝子を宿主細胞に導入して得る融合蛋白質の
発明であり、その抗原融合蛋白質の製造法の発明、該融
合蛋白質を用いた抗体検査キットおよび抗体検出方法の
発明である。 【効果】 本発明の融合蛋白質は、回収・分離・精製
が容易であるとともに、粒子の主要構成成分であるダッ
クＨＢｃ蛋白質がヒトＨＢｅ抗体とは反応性を有しない
ので、外来遺伝子にのみ高い特異性を有する融合蛋白質
が得られ、所望の目的を達成できる。
Description
【０００１】 本発明は、ダックＢ型肝炎ウイルス（以下「ＤＨＢＶ」
と略称する）コア抗原（以下「ＤＨＢｃ抗原」と略称す
る）遺伝子を含む発現ベクターを用い、これにヒト肝炎
ウイルス遺伝子を連結して作成した組み換え遺伝子を宿
主細胞に導入し、これを発現させて得られる融合蛋白質
の発明、および製造方法の発明、ならびに得られた融合
蛋白質の利用に関する発明である。
と略称する）コア抗原（以下「ＤＨＢｃ抗原」と略称す
る）遺伝子を含む発現ベクターを用い、これにヒト肝炎
ウイルス遺伝子を連結して作成した組み換え遺伝子を宿
主細胞に導入し、これを発現させて得られる融合蛋白質
の発明、および製造方法の発明、ならびに得られた融合
蛋白質の利用に関する発明である。
【０００２】
肝炎ウイルス抗原は、従来からワクチンとして、あるい
はウイルス性肝炎診断薬の材料として用いられてきた。
これには、ウイルスそのものを使用したもの、ウイルス
の一部構成成分を精製、分離したもの、ウイルス抗原の
一部のアミノ酸配列を採用した合成ペプチド、さらには
ウイルス遺伝子の組み換え体を発現させた蛋白質等があ
った。
はウイルス性肝炎診断薬の材料として用いられてきた。
これには、ウイルスそのものを使用したもの、ウイルス
の一部構成成分を精製、分離したもの、ウイルス抗原の
一部のアミノ酸配列を採用した合成ペプチド、さらには
ウイルス遺伝子の組み換え体を発現させた蛋白質等があ
った。
【０００３】 しかしながら、ウイルスそのものやその構成成分を精製
し、これを抗原として利用する場合には、ウイルス感染
患者の血液を材料として使用しなければならないことか
ら、材料の安定供給や回収作業の手間等に問題があり、
さらに安全性の点にも不安を免れないことが指摘されて
いた。 他方、合成ペプチドを用いる場合には、二次構造の模倣
のみでは抗原の立体構造に由来する抗原性が獲得でき
ず、期待された抗原性が得られないという問題があっ
た。
し、これを抗原として利用する場合には、ウイルス感染
患者の血液を材料として使用しなければならないことか
ら、材料の安定供給や回収作業の手間等に問題があり、
さらに安全性の点にも不安を免れないことが指摘されて
いた。 他方、合成ペプチドを用いる場合には、二次構造の模倣
のみでは抗原の立体構造に由来する抗原性が獲得でき
ず、期待された抗原性が得られないという問題があっ
た。
【０００４】 これに対し、ウイルス遺伝子を宿主細胞遺伝子に組み込
み、これを発現させて製造した組み換え体抗原蛋白質を
使用する場合は、大量製造が可能で安定供給が期待でき
るとともに安全性についての不安も低いので、種々の細
胞を用いた多様な発現系を用いる例が報告されている。 しかしながら、組み換え体を用いる場合には、抗原の種
類や宿主細胞の種類によっては発現蛋白質が抗原特異的
な立体構造を構築できず、その結果、免疫原性や抗原性
を十分に発揮されないことが指摘されている。このた
め、発現を希望する抗原毎に発現系を検討し、選択する
ことが必要であった。さらに、抗原単独の発現を行った
場合には、分子量が比較的小さな抗原のときに精製分離
が困難になるという問題があった。
み、これを発現させて製造した組み換え体抗原蛋白質を
使用する場合は、大量製造が可能で安定供給が期待でき
るとともに安全性についての不安も低いので、種々の細
胞を用いた多様な発現系を用いる例が報告されている。 しかしながら、組み換え体を用いる場合には、抗原の種
類や宿主細胞の種類によっては発現蛋白質が抗原特異的
な立体構造を構築できず、その結果、免疫原性や抗原性
を十分に発揮されないことが指摘されている。このた
め、発現を希望する抗原毎に発現系を検討し、選択する
ことが必要であった。さらに、抗原単独の発現を行った
場合には、分子量が比較的小さな抗原のときに精製分離
が困難になるという問題があった。
【０００５】 ヒトＢ型肝炎ウイルス（以下「ＨＢＶ」と略称する）コ
ア抗原（以下「ＨＢｃ抗原」と略称する）遺伝子は、そ
のアミノ基端側、カルボキシル基端側、あるいは中間位
置に他の外来遺伝子を挿入・連結することができ、適当
なベクターを用いて宿主細胞に導入することができる。
これによってＨＢｃ抗原蛋白質と外来遺伝子由来蛋白質
を同時に発現することができ、かつ発現されたＨＢｃ抗
原はコア蛋白質よりなる粒子を形成し、外来遺伝子由来
の蛋白質はその表面上に表出した形で発現されるので、
抗原を精製分離する担体として有用である。また粒子表
面に多数のエピトープを発現できるのて、単一エピトー
プにのみ結合するモノクローナル抗体を利用した測定系
とすることが可能となる。これらのことから、外来遺伝
子のベクターへの導入の際の連結遺伝子として好適であ
ることが知られている。
ア抗原（以下「ＨＢｃ抗原」と略称する）遺伝子は、そ
のアミノ基端側、カルボキシル基端側、あるいは中間位
置に他の外来遺伝子を挿入・連結することができ、適当
なベクターを用いて宿主細胞に導入することができる。
これによってＨＢｃ抗原蛋白質と外来遺伝子由来蛋白質
を同時に発現することができ、かつ発現されたＨＢｃ抗
原はコア蛋白質よりなる粒子を形成し、外来遺伝子由来
の蛋白質はその表面上に表出した形で発現されるので、
抗原を精製分離する担体として有用である。また粒子表
面に多数のエピトープを発現できるのて、単一エピトー
プにのみ結合するモノクローナル抗体を利用した測定系
とすることが可能となる。これらのことから、外来遺伝
子のベクターへの導入の際の連結遺伝子として好適であ
ることが知られている。
【０００６】
以上のように、ＨＢｃ抗原遺伝子は外来遺伝子のベクタ
ー導入に際しての連結遺伝子として優れた特性を有する
が、しかしヒトＨＢｃ抗原遺伝子を使用した場合には発
現されて粒子を形成するヒトＨＢｃ抗原自体が抗原性を
有することから、ヒトまたはヒトと交叉性を有するＨＢ
ｃ抗原をもつ動物の診断には利用できなかった。このた
め、ヒトＨＢｃ抗原との交叉反応性をもたない外来遺伝
子発現蛋白質をコア粒子表面に発現することにより、精
製分離が容易であるとともにモノクローナル抗体を用い
た測定系を構築することが可能な発現系を開発すること
が期待されていた。
ー導入に際しての連結遺伝子として優れた特性を有する
が、しかしヒトＨＢｃ抗原遺伝子を使用した場合には発
現されて粒子を形成するヒトＨＢｃ抗原自体が抗原性を
有することから、ヒトまたはヒトと交叉性を有するＨＢ
ｃ抗原をもつ動物の診断には利用できなかった。このた
め、ヒトＨＢｃ抗原との交叉反応性をもたない外来遺伝
子発現蛋白質をコア粒子表面に発現することにより、精
製分離が容易であるとともにモノクローナル抗体を用い
た測定系を構築することが可能な発現系を開発すること
が期待されていた。
【０００７】
本発明者は、ヒトまたはヒトと交叉性を有するＨＢｃ抗
原をもつ動物の診断にも利用可能な融合蛋白質発現系の
開発研究を進めた結果、ＤＨＢｃ抗原がヒトＨＢｃ抗原
とは交叉反応性を有さず、かつ、その遺伝子配列中にヒ
トＨＢｃ抗原遺伝子には存在しない遺伝子配列を有する
ことから、ＤＨＢｃ抗原遺伝子を用いることによって上
記目的に適した多様な融合蛋白質を発現することが可能
であることを見出し、本発明を完成した。
原をもつ動物の診断にも利用可能な融合蛋白質発現系の
開発研究を進めた結果、ＤＨＢｃ抗原がヒトＨＢｃ抗原
とは交叉反応性を有さず、かつ、その遺伝子配列中にヒ
トＨＢｃ抗原遺伝子には存在しない遺伝子配列を有する
ことから、ＤＨＢｃ抗原遺伝子を用いることによって上
記目的に適した多様な融合蛋白質を発現することが可能
であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】 かかる知見から、本発明者は、ＤＨＢｃ抗原遺伝子の中
間領域を取り去り、この領域にヒトＨＢｅ抗原遺伝子、
ヒトＨＢＶｘ遺伝子、ヒトＨＢＶプレコア遺伝子、ヒト
ＨＢＶプレＳ１抗原遺伝子、ヒトＨＢＶプレＳ２抗原遺
伝子等の種々の外来遺伝子を挿入し、連結した組み換え
体遺伝子を作成し、宿種細胞に導入・発現させて得たＤ
ＨＢｃ抗原と外来遺伝子蛋白よりなる融合蛋白質、なら
びにその製造方法、およびその利用に関する発明を完成
した。
間領域を取り去り、この領域にヒトＨＢｅ抗原遺伝子、
ヒトＨＢＶｘ遺伝子、ヒトＨＢＶプレコア遺伝子、ヒト
ＨＢＶプレＳ１抗原遺伝子、ヒトＨＢＶプレＳ２抗原遺
伝子等の種々の外来遺伝子を挿入し、連結した組み換え
体遺伝子を作成し、宿種細胞に導入・発現させて得たＤ
ＨＢｃ抗原と外来遺伝子蛋白よりなる融合蛋白質、なら
びにその製造方法、およびその利用に関する発明を完成
した。
【０００９】 本発明でＤＨＢｃ抗原遺伝子は、例えば２６２番目の塩
基から３７６番目までの塩基間での中間領域を取り去っ
たものを使用するのが好適である。
基から３７６番目までの塩基間での中間領域を取り去っ
たものを使用するのが好適である。
【００１０】 本発明の融合蛋白質、その製造方法および利用について
概括的に説明すれば、次のとおりである。 ＤＨＢＶ陽性血清からクローニングしたＤＨＢＶ ＤＮ
Ａを鋳型とし、ヌクレオチドプライマーを用いてＤＨＢ
Ｖ抗原遺伝子を遺伝子増幅法（以下「ＰＣＲ」と略称す
る）によって増幅する。 好適なヌクレオチドプライマーとしては、配列番号１な
いし４に示されるものである。
概括的に説明すれば、次のとおりである。 ＤＨＢＶ陽性血清からクローニングしたＤＨＢＶ ＤＮ
Ａを鋳型とし、ヌクレオチドプライマーを用いてＤＨＢ
Ｖ抗原遺伝子を遺伝子増幅法（以下「ＰＣＲ」と略称す
る）によって増幅する。 好適なヌクレオチドプライマーとしては、配列番号１な
いし４に示されるものである。
【００１１】 本発明で発現ベクターとして使用するＤＨＢＶは、北京
ダックより発見されたＤＮＡウイルスであり、１９８０
年にＭａｓｏｎらによって報告された（Ｍａｓｏｎ，
Ｗ．Ｓ．ｅｔａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ．３６）。 ＤＨＢＶは、肝臓を主たる増殖の場とする点でヒトＨＢ
Ｖと類似し、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）、
地リス肝炎ウイルス（ＧＳＨＶ）やヒトＨＢＶとともに
「ヘパドナウイルス」と総称される。 遺伝子の基本的構造やウイルス粒子の形態学的な特徴等
は上記４種のヘパドナウイルスがよく類似しているが、
ＤＮＡ塩基配列の相同性は、哺乳動物のウイルスである
ヒトＨＢＶ、ＷＨＶ、ＧＳＨＶは相互に６０〜７０％の
相同性がみられるのに対し、鳥類のウイルスであるＤＨ
ＢＶはヒトＨＢＶに対して４０％以下の相同性しかもた
ない。 本発明に用いるコア領域は、ヒトＨＢＶ、ＷＨＶ、ＧＳ
ＨＶが１８３〜１８８個のアミノ酸から構成されている
のに対し、ＤＨＢＶでは２６２個のアミノ酸からなる。
ダックより発見されたＤＮＡウイルスであり、１９８０
年にＭａｓｏｎらによって報告された（Ｍａｓｏｎ，
Ｗ．Ｓ．ｅｔａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ．３６）。 ＤＨＢＶは、肝臓を主たる増殖の場とする点でヒトＨＢ
Ｖと類似し、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）、
地リス肝炎ウイルス（ＧＳＨＶ）やヒトＨＢＶとともに
「ヘパドナウイルス」と総称される。 遺伝子の基本的構造やウイルス粒子の形態学的な特徴等
は上記４種のヘパドナウイルスがよく類似しているが、
ＤＮＡ塩基配列の相同性は、哺乳動物のウイルスである
ヒトＨＢＶ、ＷＨＶ、ＧＳＨＶは相互に６０〜７０％の
相同性がみられるのに対し、鳥類のウイルスであるＤＨ
ＢＶはヒトＨＢＶに対して４０％以下の相同性しかもた
ない。 本発明に用いるコア領域は、ヒトＨＢＶ、ＷＨＶ、ＧＳ
ＨＶが１８３〜１８８個のアミノ酸から構成されている
のに対し、ＤＨＢＶでは２６２個のアミノ酸からなる。
【００１２】 本発明においては、ＤＨＢＶウイルスのコア抗原遺伝子
内にヒト肝炎ウイルスを連結するが、使用するＤＨＢＶ
ウイルスのコア抗原遺伝子としては塩基配列１〜２６１
番と３７９〜７８９番のものが好ましい。配列１〜２６
１番の例を配列番号１７に、塩基配列３７９〜７８９番
の例を配列番号１８に示すが、もとより本発明には変異
により配列に変動があったものも含まれる。
内にヒト肝炎ウイルスを連結するが、使用するＤＨＢＶ
ウイルスのコア抗原遺伝子としては塩基配列１〜２６１
番と３７９〜７８９番のものが好ましい。配列１〜２６
１番の例を配列番号１７に、塩基配列３７９〜７８９番
の例を配列番号１８に示すが、もとより本発明には変異
により配列に変動があったものも含まれる。
【００１３】 得られた増幅遺伝子をＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＰｓｔＩの制限酵素で処理した後、プラスミドベク
ターであるｐＴ ｃ９９ＡのＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位
およびＳａｌＩ、ＰｓｔＩ部位に挿入し、ＤＨＢｃの１
−８７アミノ酸配列と１２７−２６３アミノ酸配列を有
し、８８−１２６アミノ酸配列を欠いて、上記欠如部分
にＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、Ｂａｍ
ＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩの制限酵素部位からなるマル
チクローニング部位を有する発現ベクターｐＫＡ２１５
を得る。
Ｉ、ＰｓｔＩの制限酵素で処理した後、プラスミドベク
ターであるｐＴ ｃ９９ＡのＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位
およびＳａｌＩ、ＰｓｔＩ部位に挿入し、ＤＨＢｃの１
−８７アミノ酸配列と１２７−２６３アミノ酸配列を有
し、８８−１２６アミノ酸配列を欠いて、上記欠如部分
にＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、Ｂａｍ
ＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩの制限酵素部位からなるマル
チクローニング部位を有する発現ベクターｐＫＡ２１５
を得る。
【００１４】 他方、ヒトＨＢＶの各抗原遺伝子を特異プライマーを用
いて増幅し、ＥｃｏＲＩならびにＳａｌＩの制限酵素で
処理したのち、マルチクローニング部位を有する発現ベ
クターｐＫＹ２１５のＥｃｏＲＩまたはＳａｌＩの制限
酵素部位に挿入して各抗原遺伝子発現用の発現ベクター
を作成する。
いて増幅し、ＥｃｏＲＩならびにＳａｌＩの制限酵素で
処理したのち、マルチクローニング部位を有する発現ベ
クターｐＫＹ２１５のＥｃｏＲＩまたはＳａｌＩの制限
酵素部位に挿入して各抗原遺伝子発現用の発現ベクター
を作成する。
【００１５】 ヒトＨＢＶの抗原遺伝子としては、ｅ抗原遺伝子、ｘ遺
伝子、プレコア抗原遺伝子、プレＳ１抗原遺伝子、プレ
Ｓ２抗原遺伝子等を使用することができる。 これら抗原遺伝子の配列は配列番号１２ないし１６に示
されるが、変位にもとづいて配列番号に変動があったも
のも本発明に含まれる。 また、本発明はＢ型以外のヒト肝炎ウイルス、例えばＣ
型肝炎ウイルスの抗原遺伝子についても適用することが
できる。
伝子、プレコア抗原遺伝子、プレＳ１抗原遺伝子、プレ
Ｓ２抗原遺伝子等を使用することができる。 これら抗原遺伝子の配列は配列番号１２ないし１６に示
されるが、変位にもとづいて配列番号に変動があったも
のも本発明に含まれる。 また、本発明はＢ型以外のヒト肝炎ウイルス、例えばＣ
型肝炎ウイルスの抗原遺伝子についても適用することが
できる。
【００１６】 得られた発現ベクターは、例えば大腸菌（ＭＣ１０６
１）に塩化カルシウム法でトランスフォームし、１ｍＭ
のＩＰＴＧによって融合蛋白質の発現を誘導する。その
後、大腸菌を集菌し、リゾチーム処理、超音波処理して
溶菌し、硫安沈澱、ＰＥＧ沈澱、ショ糖密度勾配遠心分
離法等公知の方法により精製する。
１）に塩化カルシウム法でトランスフォームし、１ｍＭ
のＩＰＴＧによって融合蛋白質の発現を誘導する。その
後、大腸菌を集菌し、リゾチーム処理、超音波処理して
溶菌し、硫安沈澱、ＰＥＧ沈澱、ショ糖密度勾配遠心分
離法等公知の方法により精製する。
【００１７】 本発明の発現ベクター構築に用いるベクターとしては、
大腸菌のほか、酵母、動物培養細胞等を宿主紀胞として
融合蛋白質を発現することが可能なものてあれはいずれ
であってもよい。その際使用ベクターに特異的な制限酵
素部位、ならびにクローニング部位に適合した制限酵素
の使用が必要である。
大腸菌のほか、酵母、動物培養細胞等を宿主紀胞として
融合蛋白質を発現することが可能なものてあれはいずれ
であってもよい。その際使用ベクターに特異的な制限酵
素部位、ならびにクローニング部位に適合した制限酵素
の使用が必要である。
【００１８】 本発明におけるＤＮＡ技術、ＨＢＶ抗原発現技術は公知
のものを使用すればよく、例えば前者についてはＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
１９８９記載の方法、後者についてはＮａｔｕｒｅ２
９１ ５０３−５０６，１９８１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ，６ ５１−７０，１９８６、Ｇｅｎｅ
４６ １３５−１４１，１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０ １，１９８２等
記載の方法に準処して実施できる。
のものを使用すればよく、例えば前者についてはＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
１９８９記載の方法、後者についてはＮａｔｕｒｅ２
９１ ５０３−５０６，１９８１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ，６ ５１−７０，１９８６、Ｇｅｎｅ
４６ １３５−１４１，１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０ １，１９８２等
記載の方法に準処して実施できる。
【００１９】 宿主細胞へ発現ベクターをトランスフォームする方法
は、導入遺伝子が発現し、目的の融合蛋白質が生産可能
ないかなる方法も利用できる。その方法の例としては、
エレクトロポレーション法、燐酸カルシウム法等があ
る。
は、導入遺伝子が発現し、目的の融合蛋白質が生産可能
ないかなる方法も利用できる。その方法の例としては、
エレクトロポレーション法、燐酸カルシウム法等があ
る。
【００２０】 トランスフォームした細胞株の取得および培養は、公知
の方法、例えばＣｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１
３３，１９９０記載の方法に準じて行うことができる。
培地は、大腸菌、酵母、動物細胞等に使用可能なものを
利用できる。
の方法、例えばＣｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１
３３，１９９０記載の方法に準じて行うことができる。
培地は、大腸菌、酵母、動物細胞等に使用可能なものを
利用できる。
【００２１】 培養後、培養液から細胞を分離し、破壊し、融合蛋白質
を精製する方法としては、公知の技術を採用することが
できる。融合蛋白質の測定は、発現蛋白質をショ糖密度
遠心分離法で分子量よりＨＢｃ抗原蛋白質粒子と同等の
密度を有する分画を得た後、これを試料として目的とす
る外来遺伝子によりコードされる蛋白質に対する抗体を
用いたエンザイム・イムノ・ソルベント・アッセイ法
（以下「ＥＬＩＳＡ」と略称する）により行うことがで
きる。
を精製する方法としては、公知の技術を採用することが
できる。融合蛋白質の測定は、発現蛋白質をショ糖密度
遠心分離法で分子量よりＨＢｃ抗原蛋白質粒子と同等の
密度を有する分画を得た後、これを試料として目的とす
る外来遺伝子によりコードされる蛋白質に対する抗体を
用いたエンザイム・イムノ・ソルベント・アッセイ法
（以下「ＥＬＩＳＡ」と略称する）により行うことがで
きる。
【００２２】 本発明の融合蛋白質は、ヒト肝炎ウイルスに対する抗体
検査に使用することができ、本発明の融合蛋白質は、こ
れを含む抗体検査キットとして用いることができる。
検査に使用することができ、本発明の融合蛋白質は、こ
れを含む抗体検査キットとして用いることができる。
【００２３】
本発明の融合蛋白質は、その密度からコア粒子と融合し
た形で発現していると推定され、その精製が比較的容易
である。 また、導入した外来遺伝子であるヒト肝炎ウイルス遺伝
子の発現蛋白質に反応するとともに、粒子の主要構成成
分であるコア蛋白質はヒト肝炎ウイルス抗体とは反応性
を有しないことが判明した。 したがって、本発明の融合蛋白質は、ＤＨＢｃ蛋白質よ
り成るコア粒子を担体とし、その粒子表面に例えばＨＢ
Ｖのｅ抗原遺伝子、ｘ遺伝子、プレコア抗原遺伝子、プ
レＳ１抗原遺伝子、プレＳ２抗原遺伝子その他の導入遺
伝子抗原を表出すると推認されるので、導入遺伝子由来
の蛋白質にのみ高い抗原特異性を有する。 このため、本発明の融合蛋白質は、抗体誘導担体、検体
検査薬として有効に用いることができる。
た形で発現していると推定され、その精製が比較的容易
である。 また、導入した外来遺伝子であるヒト肝炎ウイルス遺伝
子の発現蛋白質に反応するとともに、粒子の主要構成成
分であるコア蛋白質はヒト肝炎ウイルス抗体とは反応性
を有しないことが判明した。 したがって、本発明の融合蛋白質は、ＤＨＢｃ蛋白質よ
り成るコア粒子を担体とし、その粒子表面に例えばＨＢ
Ｖのｅ抗原遺伝子、ｘ遺伝子、プレコア抗原遺伝子、プ
レＳ１抗原遺伝子、プレＳ２抗原遺伝子その他の導入遺
伝子抗原を表出すると推認されるので、導入遺伝子由来
の蛋白質にのみ高い抗原特異性を有する。 このため、本発明の融合蛋白質は、抗体誘導担体、検体
検査薬として有効に用いることができる。
【００２４】 本発明によって、とくに高いヒトＨＢｅ抗原特異性を有
する融合蛋白質を得ることができる。すなわち、ヒトＨ
Ｂｅ抗原をコードする遺伝子は、ヒトＨＶｃ抗原をコー
ドする遺伝子と同一の読み取り枠に由来し、異なる翻訳
開始点を有する蛋白質であるため、アミノ酸配列の大部
分が同一であり、このために特異性の高いＨＢｅ抗原を
得ることは、従来非常に難しい作業であった。 これに対し、本発明においては、ＨＢｃ抗原遺伝子とし
て、ヒトＨＢｃ抗体とは反応性を有しないＤＨＢｃ抗原
遺伝子を利用する。このため、ヒトＨＢｅ抗原特異性の
高い融合蛋白質が得られる。
する融合蛋白質を得ることができる。すなわち、ヒトＨ
Ｂｅ抗原をコードする遺伝子は、ヒトＨＶｃ抗原をコー
ドする遺伝子と同一の読み取り枠に由来し、異なる翻訳
開始点を有する蛋白質であるため、アミノ酸配列の大部
分が同一であり、このために特異性の高いＨＢｅ抗原を
得ることは、従来非常に難しい作業であった。 これに対し、本発明においては、ＨＢｃ抗原遺伝子とし
て、ヒトＨＢｃ抗体とは反応性を有しないＤＨＢｃ抗原
遺伝子を利用する。このため、ヒトＨＢｅ抗原特異性の
高い融合蛋白質が得られる。
【００２５】
（実施例１） ＤＨＢｃ／ヒトＨＢＶ遺伝子発現ベクターの構築 （１）ヒトＨＢｅ抗原遺伝子の場合 配列番号５および６の配列を有するオリゴヌクレオチド
プライマーを用い、クローン化ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐＮＤ
Ｒ２６０）を鋳型としてヒトＨＢＶ遺伝子塩基配列１８
１４から２３４７番間の領域を含むヒトＨＢｅ抗原還伝
子の増幅を行った。増幅後、制限酵素（ＥｃｏＲＩ）に
て処理し、融合蛋白質発現ベクターであるｐＹＡ２１５
のＥｃｏＲＩ部位に挿入してヒトＨＢｅ抗原融合蛋白質
発現ベクターｐＹＡ２９６を作成した（図１ａ）。
プライマーを用い、クローン化ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐＮＤ
Ｒ２６０）を鋳型としてヒトＨＢＶ遺伝子塩基配列１８
１４から２３４７番間の領域を含むヒトＨＢｅ抗原還伝
子の増幅を行った。増幅後、制限酵素（ＥｃｏＲＩ）に
て処理し、融合蛋白質発現ベクターであるｐＹＡ２１５
のＥｃｏＲＩ部位に挿入してヒトＨＢｅ抗原融合蛋白質
発現ベクターｐＹＡ２９６を作成した（図１ａ）。
【００２６】 （２）ヒトプレＳ１抗原遺伝子の場合 配列番号７および８の配列を有するオリゴヌクレオチド
プライマーを用い、クローン化ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐＮＤ
Ｒ２６０）を鋳型としてヒトＨＢＶ遺伝子塩基配列２８
４８から３２０４番間の領域を含むヒトプレＳ１抗原遺
伝子の増幅を行った。増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよ
びＳａｌＩにて処理し、融合蛋白質発現ベクターである
ｐＹＡ２１５のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位に挿入し
てヒトプレＳＩ融合蛋白質発現ベクターｐＹＡ３０１を
作成した（図１ｂ）。
プライマーを用い、クローン化ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐＮＤ
Ｒ２６０）を鋳型としてヒトＨＢＶ遺伝子塩基配列２８
４８から３２０４番間の領域を含むヒトプレＳ１抗原遺
伝子の増幅を行った。増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよ
びＳａｌＩにて処理し、融合蛋白質発現ベクターである
ｐＹＡ２１５のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位に挿入し
てヒトプレＳＩ融合蛋白質発現ベクターｐＹＡ３０１を
作成した（図１ｂ）。
【００２７】 （３）ヒトＨＢｘ遺伝子の場合 配列番号９および１０の配列を有するオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用い、クローン化ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐＮ
ＤＲ２６０）を鋳型としてヒトＨＢＶ遺伝子塩基配列１
３７４から１８３５番間の領域を含むヒトＨＢｘ遺伝子
の増幅を行った。増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳ
ａｌＩにて処理し、融合蛋白質発現ベクターであるｐＹ
Ａ２１５のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位に挿入してヒ
トＨＢｘ融合蛋白質発現ベクターｐＹＡ２９９を作成し
た（図１ｃ）。
ドプライマーを用い、クローン化ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐＮ
ＤＲ２６０）を鋳型としてヒトＨＢＶ遺伝子塩基配列１
３７４から１８３５番間の領域を含むヒトＨＢｘ遺伝子
の増幅を行った。増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳ
ａｌＩにて処理し、融合蛋白質発現ベクターであるｐＹ
Ａ２１５のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位に挿入してヒ
トＨＢｘ融合蛋白質発現ベクターｐＹＡ２９９を作成し
た（図１ｃ）。
【００２８】 （４）ヒトＨＢＶプレコア遺伝子の場合 配列番号５および１１の配列を有するオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用い、クローン化ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐＮ
ＤＲ２６０）を鋳型としてヒトＨＢＶ遺伝子塩基配列１
８１４から１９００番間の領域を含むヒトＨＢＶプレコ
ア遺伝子の増幅を行った。増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＳａｌＩにて処理し、融合蛋白質発現ベクターで
あるｐＹＡ２１５のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位に挿
入してヒトＨＢＶプレコア融合蛋白質発現ベクターｐＹ
Ａ２９７を作成した（図１ｄ）。） （５）ヒトプレＳ２抗原遺伝子の場合 クローン化ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐＮＤＲ２６０）を鋳型と
してヒトＨＢＶ遺伝子塩基配列３２０５から１５４番間
の領域を含むヒトＨＢＶプレコア遺伝子の増幅を行っ
た。増幅後制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩにて処理
し、融合蛋白質発現ベクターであるｐＹＡ２１５のＥｃ
ｏＲＩおよびＳａｌＩ部位に挿入してヒトＨＢＶプレＳ
２融合蛋白質発現ベクターｐＹＡ２９８を作成した（図
１ｅ）。 制限酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社
（ドイツ）、ＮＥＢ社（アメリカ）、宝酒造社のもの
を、ＤＮＡリガーゼ、フォファターゼは宝酒造社のもの
を用いた。
ドプライマーを用い、クローン化ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐＮ
ＤＲ２６０）を鋳型としてヒトＨＢＶ遺伝子塩基配列１
８１４から１９００番間の領域を含むヒトＨＢＶプレコ
ア遺伝子の増幅を行った。増幅後、制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＳａｌＩにて処理し、融合蛋白質発現ベクターで
あるｐＹＡ２１５のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位に挿
入してヒトＨＢＶプレコア融合蛋白質発現ベクターｐＹ
Ａ２９７を作成した（図１ｄ）。） （５）ヒトプレＳ２抗原遺伝子の場合 クローン化ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐＮＤＲ２６０）を鋳型と
してヒトＨＢＶ遺伝子塩基配列３２０５から１５４番間
の領域を含むヒトＨＢＶプレコア遺伝子の増幅を行っ
た。増幅後制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩにて処理
し、融合蛋白質発現ベクターであるｐＹＡ２１５のＥｃ
ｏＲＩおよびＳａｌＩ部位に挿入してヒトＨＢＶプレＳ
２融合蛋白質発現ベクターｐＹＡ２９８を作成した（図
１ｅ）。 制限酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社
（ドイツ）、ＮＥＢ社（アメリカ）、宝酒造社のもの
を、ＤＮＡリガーゼ、フォファターゼは宝酒造社のもの
を用いた。
【００２９】 （実施例２） ＤＨＢｃ／ヒトＨＢＶ融合蛋白質の発現と精製 実施例１で得られた発現ベクターｐＹＡ２９６、ｐＹＡ
３０１、ｐＹＡ２９９ｐＹＡ２９７、あるいはｐＹＡ２
９８を大腸菌ＭＣ１０６１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、
アメリカ）に導入し、１夜培養した後、その１００分の
１量を新しい培養液（ＮＢ培地、栄研化学社）に移して
２−３時間培養し、ＩＰＴＧ（Ｎｏｖａ社）を１ｍＭ相
当加えてさらに４−１６時間培養し導入遺伝子の発現を
誘導した。培養終了後、集菌し、リゾチーム処理を行っ
た。リゾチーム処理は、５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、リゾチーム４ｍｇ／ｍｌ（生化学工業社：Ｌｙｓ
ｏｚｙｍｅ，Ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ）溶液を溶菌量の約１
０倍加え、懸濁し、室温に３０分放置した後、１０．０
００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。遠心分離後、沈
澱物に２％ ＮＰ４０、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１％Ｎ
ａＮ３ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
１ｍＭ ＥＤＴＡを１０倍量加え、一晩４℃で攪拌し
た。
３０１、ｐＹＡ２９９ｐＹＡ２９７、あるいはｐＹＡ２
９８を大腸菌ＭＣ１０６１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、
アメリカ）に導入し、１夜培養した後、その１００分の
１量を新しい培養液（ＮＢ培地、栄研化学社）に移して
２−３時間培養し、ＩＰＴＧ（Ｎｏｖａ社）を１ｍＭ相
当加えてさらに４−１６時間培養し導入遺伝子の発現を
誘導した。培養終了後、集菌し、リゾチーム処理を行っ
た。リゾチーム処理は、５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、リゾチーム４ｍｇ／ｍｌ（生化学工業社：Ｌｙｓ
ｏｚｙｍｅ，Ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ）溶液を溶菌量の約１
０倍加え、懸濁し、室温に３０分放置した後、１０．０
００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。遠心分離後、沈
澱物に２％ ＮＰ４０、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１％Ｎ
ａＮ３ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
１ｍＭ ＥＤＴＡを１０倍量加え、一晩４℃で攪拌し
た。
【００３０】 その後、ＤＮａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ社製：ＤＮａｓｅ Ｉ，ＧｒａｄｅＩＩ）を最
終濃度１０μｇ／ｍｌになるよう加え、室温１時間攪拌
反応させＤＮＡを切断した。１０，０００ｒｐｍ、２０
分間の遠心分離で沈澱を得た後、１ｍＭ ＥＤＴＡの緩
衝液を約１０倍量加え、超音波処理した。超音波処理は
Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏ．のＳ
ｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ ３５０を用い、Ｍｉｃｒ
ｏ ｔｉｐ，出力７、ｄｕｔｙ５０％の条件にて５分間
実施した。更に、１０，０００ｒｐｍの遠心分離を２０
分間行い、得られた上清に先のＤＮａｓｅ処理した上清
を加え一つにした。この上清に硫安を加え３５％硫安分
画沈澱を得た。更に１０％ポリエチレングリコール沈澱
を行い、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、
０．９％ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１％ＮａＮ
３緩衝液に溶かした後、６０％ショ糖７ｍｌ、４０％シ
ョ糖１０ｍｌを重層し、Ｂｅｃｋｍａｎｎ ＳＷ２８ロ
ーターで、２６，０００ｒｐｍ、４℃にて１６時間遠心
分離し、１ｍｌづつ分画し融合蛋白質試料とした。
ｈｅｉｍ社製：ＤＮａｓｅ Ｉ，ＧｒａｄｅＩＩ）を最
終濃度１０μｇ／ｍｌになるよう加え、室温１時間攪拌
反応させＤＮＡを切断した。１０，０００ｒｐｍ、２０
分間の遠心分離で沈澱を得た後、１ｍＭ ＥＤＴＡの緩
衝液を約１０倍量加え、超音波処理した。超音波処理は
Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏ．のＳ
ｏｎｉｆｉｅｒ ｍｏｄｅｌ ３５０を用い、Ｍｉｃｒ
ｏ ｔｉｐ，出力７、ｄｕｔｙ５０％の条件にて５分間
実施した。更に、１０，０００ｒｐｍの遠心分離を２０
分間行い、得られた上清に先のＤＮａｓｅ処理した上清
を加え一つにした。この上清に硫安を加え３５％硫安分
画沈澱を得た。更に１０％ポリエチレングリコール沈澱
を行い、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、
０．９％ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１％ＮａＮ
３緩衝液に溶かした後、６０％ショ糖７ｍｌ、４０％シ
ョ糖１０ｍｌを重層し、Ｂｅｃｋｍａｎｎ ＳＷ２８ロ
ーターで、２６，０００ｒｐｍ、４℃にて１６時間遠心
分離し、１ｍｌづつ分画し融合蛋白質試料とした。
【００３１】 （実施例３） ＤＨＢｃ／ヒトＨＢｅ融合蛋白質の抗原特異性を、次の
方法に従い各種、ヒトＨＢＶ抗体を用いて確認した。 各種の抗ヒトＨＢｅ抗体または抗ヒトＨＢｃ抗体を固相
した容器にＤＨＢｃ／ヒトＨＢｅ融合蛋白質を反応させ
た後、酵素標識した各種の抗ヒトＨＢｅ抗体または抗ヒ
トＨＢｃ抗体を反応させた。抗ヒトＨＢｅ抗体としてモ
ノクローナル抗体９０４（ａ）、９０５（ｂ）、Ｃ７１
−１７の３種を、抗ヒトＨＢｃ抗体としてモノクローナ
ル抗体３１０５（α）、３１２０（β）の２種を用い
た。 ９６穴マイクロプレートの各ウエルに固相用のモノクロ
ーナル抗体（２０μｇ／ｍｌ・ＰＢＳ）を加えて吸着さ
せた後、融合蛋白質溶液５０μｌを加え室温にて１時間
反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
（リン酸緩衝生理食塩水）にて洗浄し、ＨＲＰ標識した
各モノクローナル抗体を加え１時間反応させた後、ＯＰ
Ｄを加えて４９２ｎｍの吸光度を測定した。
方法に従い各種、ヒトＨＢＶ抗体を用いて確認した。 各種の抗ヒトＨＢｅ抗体または抗ヒトＨＢｃ抗体を固相
した容器にＤＨＢｃ／ヒトＨＢｅ融合蛋白質を反応させ
た後、酵素標識した各種の抗ヒトＨＢｅ抗体または抗ヒ
トＨＢｃ抗体を反応させた。抗ヒトＨＢｅ抗体としてモ
ノクローナル抗体９０４（ａ）、９０５（ｂ）、Ｃ７１
−１７の３種を、抗ヒトＨＢｃ抗体としてモノクローナ
ル抗体３１０５（α）、３１２０（β）の２種を用い
た。 ９６穴マイクロプレートの各ウエルに固相用のモノクロ
ーナル抗体（２０μｇ／ｍｌ・ＰＢＳ）を加えて吸着さ
せた後、融合蛋白質溶液５０μｌを加え室温にて１時間
反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
（リン酸緩衝生理食塩水）にて洗浄し、ＨＲＰ標識した
各モノクローナル抗体を加え１時間反応させた後、ＯＰ
Ｄを加えて４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００３２】 その結果、表１に示すように融合蛋白質は抗ヒトＨＢｅ
抗体とのみ反応し、抗ヒトＨＢｃ抗体とは反応しないこ
とから、コア粒子を形成するＤＨＢｃ蛋白質は抗ヒトＨ
Ｂｃ抗体とは反応せず、ヒト由来の検体を用いる測定系
に影響を与えないことが判明した。
抗体とのみ反応し、抗ヒトＨＢｃ抗体とは反応しないこ
とから、コア粒子を形成するＤＨＢｃ蛋白質は抗ヒトＨ
Ｂｃ抗体とは反応せず、ヒト由来の検体を用いる測定系
に影響を与えないことが判明した。
【００３３】
【表１】
【００３４】 （実施例４） 本発明の各種融合蛋白質の抗原性の確認は、それぞれ次
の抗体を用いて実施例３の方法に従いサンドイッチアッ
セイにより行った。 ＤＨＢｃ／ヒトＨＢｘ融合蛋白質についてはＴｒｐ−ｘ
融合発現蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
後、バンドを切り出し、抽出、生成した１７ｋＤ蛋白質
を抗原として得たモノクローナル抗体９１５３、９１９
０を用いた。 ＤＨＢｃ／ヒトＨＢプレコア融合蛋白質についてはＨＢ
ｃのメチオニンを１番目とした場合の−１１から−１に
相当するアミノ酸配列（プレコア領域のアミノ酸配列）
を有する合成ペプチドに対するモノクローナル抗体Ｐｒ
ｅ−Ｃ５、Ｐｒｅ−Ｃ１４およびモルモットにて作成し
たポリクローナル抗体を用いた。 ＤＨＢｃ／ヒトＨＢプレＳ１融合蛋白質については合成
ペプチド（塩基配列２８４８−３２０４に相当するアミ
ノ酸配列を有する）に対するモノクローナル抗体Ｔ０６
０６とＤａｎｅ粒子を免疫して得られたモノクローナル
抗体６８７０を用いて確認した。 ＤＨＢｃ／ヒトＨＢプレＳ２融合蛋白質についてはモノ
クローナル抗体を用いた市販のプレＳ２抗原測定用ＥＬ
ＩＳＡキット（株式会社特殊免疫研究所社製）を使用し
て確認した。 その結果、いずれの融合蛋白質もヒトＨＢＶに由来する
抗原性を有していることが確認された。
の抗体を用いて実施例３の方法に従いサンドイッチアッ
セイにより行った。 ＤＨＢｃ／ヒトＨＢｘ融合蛋白質についてはＴｒｐ−ｘ
融合発現蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
後、バンドを切り出し、抽出、生成した１７ｋＤ蛋白質
を抗原として得たモノクローナル抗体９１５３、９１９
０を用いた。 ＤＨＢｃ／ヒトＨＢプレコア融合蛋白質についてはＨＢ
ｃのメチオニンを１番目とした場合の−１１から−１に
相当するアミノ酸配列（プレコア領域のアミノ酸配列）
を有する合成ペプチドに対するモノクローナル抗体Ｐｒ
ｅ−Ｃ５、Ｐｒｅ−Ｃ１４およびモルモットにて作成し
たポリクローナル抗体を用いた。 ＤＨＢｃ／ヒトＨＢプレＳ１融合蛋白質については合成
ペプチド（塩基配列２８４８−３２０４に相当するアミ
ノ酸配列を有する）に対するモノクローナル抗体Ｔ０６
０６とＤａｎｅ粒子を免疫して得られたモノクローナル
抗体６８７０を用いて確認した。 ＤＨＢｃ／ヒトＨＢプレＳ２融合蛋白質についてはモノ
クローナル抗体を用いた市販のプレＳ２抗原測定用ＥＬ
ＩＳＡキット（株式会社特殊免疫研究所社製）を使用し
て確認した。 その結果、いずれの融合蛋白質もヒトＨＢＶに由来する
抗原性を有していることが確認された。
【００３５】 （実施例５） ＤＨＢｃ／ヒトＨＢｅ融合蛋白質を用いて、ヒト血清中
のＨＢｅ抗体を次のようにして測定した。 ９６穴マイクロプレートの各ウエルに固相用のモノクロ
ーナル抗体９０４（２０μｇ／ｍｌ・ＰＢＳ）を加えて
吸着させた後、ＤＨＢｃ／ヒトＨＢｅ融合蛋白質溶液５
０μｌを加え室温にて１時間反応させた。０。０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に
て洗浄し、１Ｍまたは２Ｍの尿素を含むＰＢＳで１００
倍に希釈したヒト血清５０μｌを添加し室温にて１時間
反応させた。再び洗浄し、ＨＲＰ標識のウサギ由来抗ヒ
トＩｇＧ抗体を添加し、室温にて１時間反応させた後、
ＯＰＤを加えて４９２ｎｍの吸光度を測定した。抗原特
異性の確認のため市販のＨＢｅ抗体測定用ＥＩＡキット
「イムニスＨＢｅＡｇ／ＡｂＥＩＡ」、ならびにＨＢｅ
抗体測定用ＰＨＡキット「マイセルＨＢｅＡｇ／Ａｂ」
（いずれも株式会社特殊免疫研究所社製）を用いて同じ
ヒト血清検体のＨＢｅ抗体を測定した。 本発明の融合蛋白質を用いた測定方法における陽性判定
をＯＤ４９２≧０．５としたとき、既存のキットと同等
あるいはそれ以上の検出感度を示すことが明らかとな
り、本発明の方法がヒト血清中のＨＢｅ抗体測定に有用
であることが確認された。
のＨＢｅ抗体を次のようにして測定した。 ９６穴マイクロプレートの各ウエルに固相用のモノクロ
ーナル抗体９０４（２０μｇ／ｍｌ・ＰＢＳ）を加えて
吸着させた後、ＤＨＢｃ／ヒトＨＢｅ融合蛋白質溶液５
０μｌを加え室温にて１時間反応させた。０。０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に
て洗浄し、１Ｍまたは２Ｍの尿素を含むＰＢＳで１００
倍に希釈したヒト血清５０μｌを添加し室温にて１時間
反応させた。再び洗浄し、ＨＲＰ標識のウサギ由来抗ヒ
トＩｇＧ抗体を添加し、室温にて１時間反応させた後、
ＯＰＤを加えて４９２ｎｍの吸光度を測定した。抗原特
異性の確認のため市販のＨＢｅ抗体測定用ＥＩＡキット
「イムニスＨＢｅＡｇ／ＡｂＥＩＡ」、ならびにＨＢｅ
抗体測定用ＰＨＡキット「マイセルＨＢｅＡｇ／Ａｂ」
（いずれも株式会社特殊免疫研究所社製）を用いて同じ
ヒト血清検体のＨＢｅ抗体を測定した。 本発明の融合蛋白質を用いた測定方法における陽性判定
をＯＤ４９２≧０．５としたとき、既存のキットと同等
あるいはそれ以上の検出感度を示すことが明らかとな
り、本発明の方法がヒト血清中のＨＢｅ抗体測定に有用
であることが確認された。
【００３６】
【表２】
【００３７】
本発明の融合蛋白質は、粒子の主要構成成分である、Ｄ
ＨＢｃ蛋白質からなるコア蛋白質がヒトＨＢｃ抗体とは
反応性を有しない。このため、外来遺伝子由来の蛋白質
にのみ高い抗原特異性を有する融合蛋白質を得ることが
できる。とくに、外来遺伝子としてヒトＨＢｅ特異遺伝
子を導入した場合、高いヒトＨＢｅ抗原特異性を有する
融合蛋白質が得られる。 このため、本発明の融合蛋白質は、高い抗原性を有する
抗原として、抗原測定試薬の素材や抗体誘導の試料とし
て有効に使用できる。 また、本発明の融合蛋白質製造法は、発現蛋白質の回収
・分離・精製が容易であり、かつ通常モノクローナル抗
体を用いた測定系の開発が困難な抗原の測定法にも利用
可能な抗原の製造方法としても有用である。
ＨＢｃ蛋白質からなるコア蛋白質がヒトＨＢｃ抗体とは
反応性を有しない。このため、外来遺伝子由来の蛋白質
にのみ高い抗原特異性を有する融合蛋白質を得ることが
できる。とくに、外来遺伝子としてヒトＨＢｅ特異遺伝
子を導入した場合、高いヒトＨＢｅ抗原特異性を有する
融合蛋白質が得られる。 このため、本発明の融合蛋白質は、高い抗原性を有する
抗原として、抗原測定試薬の素材や抗体誘導の試料とし
て有効に使用できる。 また、本発明の融合蛋白質製造法は、発現蛋白質の回収
・分離・精製が容易であり、かつ通常モノクローナル抗
体を用いた測定系の開発が困難な抗原の測定法にも利用
可能な抗原の製造方法としても有用である。
【００３８】
【配列表】
【００３９】
【００４０】
【００４１】
【００４２】
【００４３】
【００４４】
【００４５】
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【００５０】
【００５１】
【００５２】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【図１】 ＤＨＢｃ／ヒトＨＢＶ融合蛋白質の発現ベ
クターの模式図。ａ）ＨＢｅ抗原遺伝子を挿入した発現
ベクターｐＹＡ２９６、ｂ）プレＳ１抗原遺伝子を挿入
した発現ベクターｐＹＡ３０１、ｃ）ＨＢｘ抗原遺伝子
を挿入した発現ベクターｐＹＡ２９９、ｄ）プレコア抗
原遺伝子を挿入した発現ベクターｐＹＡ２９７、ｅ）プ
レＳ２抗原遺伝子を挿入した発現ベクターｐＹＡ２９８
をそれぞれ示す。図中、ＤＨＢｃ四角枠上部の数字はダ
ックＨＢｃ遺伝子における塩基番号を、挿入されたヒト
ＨＢＶ各遺伝子の四角枠下部の数字はヒトＨＢＶ遺伝子
における塩基番号をそれぞれ示す。
クターの模式図。ａ）ＨＢｅ抗原遺伝子を挿入した発現
ベクターｐＹＡ２９６、ｂ）プレＳ１抗原遺伝子を挿入
した発現ベクターｐＹＡ３０１、ｃ）ＨＢｘ抗原遺伝子
を挿入した発現ベクターｐＹＡ２９９、ｄ）プレコア抗
原遺伝子を挿入した発現ベクターｐＹＡ２９７、ｅ）プ
レＳ２抗原遺伝子を挿入した発現ベクターｐＹＡ２９８
をそれぞれ示す。図中、ＤＨＢｃ四角枠上部の数字はダ
ックＨＢｃ遺伝子における塩基番号を、挿入されたヒト
ＨＢＶ各遺伝子の四角枠下部の数字はヒトＨＢＶ遺伝子
における塩基番号をそれぞれ示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 33/576 Ｂ
Claims (16)
- 【請求項１】ダックＢ型肝炎ウイルスのコア抗原遺伝子
内にヒト肝炎ウイルス遺伝子を連結してなる組み換え遺
伝子を宿主細胞に導入して得ることを特徴とする融合蛋
白質。 - 【請求項２】組み換え遺伝子がダックＢ型肝炎ウイルス
のコア抗原遺伝子塩基配列１〜２６１番と同３７９〜７
８９番を発現ベクターとして使用し、該発現ベクター内
にヒト肝炎ウイルス遺伝子を連結した組み換え遺伝子で
ある請求項１記載の融合蛋白質。 - 【請求項３】ヒト肝炎ウイルス遺伝子がＢ型肝炎ウイル
スのｅ抗原遺伝子である請求項１または２記載の融合蛋
白質。 - 【請求項４】ヒト肝炎ウイルス遺伝子がＢ型肝炎ウイル
スのｘ遺伝子である請求項１または２記載の融合蛋白
質。 - 【請求項５】ヒト肝炎ウイルス遺伝子がＢ型肝炎ウイル
スのプレコア抗原遺伝子である請求項１または２記載の
融合蛋白質。 - 【請求項６】ヒト肝炎ウイルス遺伝子がＢ型肝炎ウイル
スのプレＳ１抗原遺伝子である請求項１または２記載の
融合蛋白質。 - 【請求項７】ヒト肝炎ウイルス遺伝子がＢ型肝炎ウイル
スのプレＳ２抗原遺伝子である請求項１または２記載の
融合蛋白質。 - 【請求項８】ダックＢ型肝炎ウイルスのコア抗原遺伝子
内にヒト肝炎ウイルス遺伝子を連結した組み換え遺伝子
を宿主細胞に導入して融合蛋白質を得ることを特徴とす
る抗原蛋白質製造法。 - 【請求項９】ダックＢ型肝炎ウイルスのコア抗原遺伝子
塩基配列１〜２６１番と同３７９〜７８９番を発現ベク
ターとして使用し、該発現ベクターにヒト肝炎ウイルス
遺伝子を結合した組み換え遺伝子を宿主細胞に導入する
請求項８記載の抗原蛋白質製造法。 - 【請求項１０】ヒト肝炎ウイルス遺伝子がＢ型肝炎ウイ
ルスのｅ抗原遺伝子である請求項８又は９記載の抗原蛋
白質製造法。 - 【請求項１１】ヒト肝炎ウイルス遺伝子がＢ型肝炎ウイ
ルスのｘ遺伝子である請求項８又は９記載の抗原蛋白質
製造法。 - 【請求項１２】ヒト肝炎ウイルス遺伝子がＢ型肝炎ウイ
ルスのプレコア遺伝子である請求項８又は９記載の抗原
蛋白質製造法。 - 【請求項１３】ヒト肝炎ウイルス遺伝子がＢ型肝炎ウイ
ルスのプレＳ１抗原遺伝子である請求項８又は９記載の
抗原蛋白質製造法。 - 【請求項１４】ヒト肝炎ウイルス遺伝子がＢ型肝炎ウイ
ルスのプレＳ２抗原遺伝子である請求項８又は９記載の
抗原蛋白質製造法。 - 【請求項１５】請求項１ないし７記載の融合蛋白質を用
いた抗体検査キット。 - 【請求項１６】請求項１ないし７記載の融合蛋白質を用
いる抗体検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6079181A JPH07252300A (ja) | 1994-03-11 | 1994-03-11 | ダック肝炎ウイルスとヒト肝炎ウイルスの抗原融合蛋白質お よび製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6079181A JPH07252300A (ja) | 1994-03-11 | 1994-03-11 | ダック肝炎ウイルスとヒト肝炎ウイルスの抗原融合蛋白質お よび製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07252300A true JPH07252300A (ja) | 1995-10-03 |
Family
ID=13682816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6079181A Pending JPH07252300A (ja) | 1994-03-11 | 1994-03-11 | ダック肝炎ウイルスとヒト肝炎ウイルスの抗原融合蛋白質お よび製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07252300A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1165773A4 (en) * | 1999-02-02 | 2005-01-05 | Biocache Pharmaceuticals Inc | IMPROVED PLATFORM FOR PRESENTING ANTIGENS |
| US6887464B1 (en) * | 1999-02-02 | 2005-05-03 | Biocache Pharmaceuticals, Inc. | Advanced antigen presentation platform |
| US7144712B2 (en) | 2003-07-30 | 2006-12-05 | Vaccine Research Institute Of San Diego | Human hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof |
| US7320795B2 (en) | 2003-07-30 | 2008-01-22 | Vaccine Research Institute Of San Diego | Rodent hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof |
| US7883843B2 (en) | 2003-07-30 | 2011-02-08 | Vaccine Research Institute Of San Diego | Hepatitis virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof |
| CN102716484A (zh) * | 2012-05-31 | 2012-10-10 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉及其制备方法 |
| CN102716483A (zh) * | 2012-05-31 | 2012-10-10 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种鸭瘟卵黄抗体冻干粉及其制备方法 |
| CN102772799A (zh) * | 2012-05-31 | 2012-11-14 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种鸭病毒性肝炎、鸭瘟二联卵黄抗体冻干粉及其制备方法 |
-
1994
- 1994-03-11 JP JP6079181A patent/JPH07252300A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1165773A4 (en) * | 1999-02-02 | 2005-01-05 | Biocache Pharmaceuticals Inc | IMPROVED PLATFORM FOR PRESENTING ANTIGENS |
| US6887464B1 (en) * | 1999-02-02 | 2005-05-03 | Biocache Pharmaceuticals, Inc. | Advanced antigen presentation platform |
| US7279555B2 (en) | 1999-02-02 | 2007-10-09 | Virginia Commonwealth University | Advanced antigen presentation platform |
| US7144712B2 (en) | 2003-07-30 | 2006-12-05 | Vaccine Research Institute Of San Diego | Human hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof |
| US7320795B2 (en) | 2003-07-30 | 2008-01-22 | Vaccine Research Institute Of San Diego | Rodent hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof |
| US7811576B2 (en) | 2003-07-30 | 2010-10-12 | Vaccine Research Institute Of San Diego | Rodent hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof |
| US7883843B2 (en) | 2003-07-30 | 2011-02-08 | Vaccine Research Institute Of San Diego | Hepatitis virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof |
| CN102716484A (zh) * | 2012-05-31 | 2012-10-10 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉及其制备方法 |
| CN102716483A (zh) * | 2012-05-31 | 2012-10-10 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种鸭瘟卵黄抗体冻干粉及其制备方法 |
| CN102772799A (zh) * | 2012-05-31 | 2012-11-14 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种鸭病毒性肝炎、鸭瘟二联卵黄抗体冻干粉及其制备方法 |
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