JPH045653B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）に対す
有効なワクチンに関するものであり、詳しくはＢ
型肝炎ウイルスの感染機作に関する新たな知見に
もとづいて、その感染を防止するための新しいタ
イプのワクチンを提供するものである。 Ｂ型肝炎は主として血液を介して感染するウイ
ルス性疾患である。 Ｂ型肝炎ウイルスは、1970年にDaneらによつ
て、オーストラリア抗原（Au抗原、HBs抗原）、
陽性血内に確認されたものであつて、二重構造を
した球形DNAウイルスである。 HBVに感染したヒトの血清を遠心して電子顕
微鏡下で観察すると、直径42nmの大型球形粒子
（Dane粒子）、直径22nmの小型球形粒子および管
状粒子が見出される。 Dane粒子は、中心に直径27nmの内部粒子
（core粒子）を有し、また表面には外殻がある。
core粒子内には、分子量約1.6×106の２本鎖
DNAとDNAポリメラーゼが含まれている。 Dane粒子の外殻は、HBs抗原（HBsAg）活性
を有し、これとは別にcore粒子表面にはHBc抗
原（HBcAg）活性がある。またcore粒子には分
子量約19000（P19）の単位核蛋白が存在するが、
P19の一部はcore粒子の表面に露出して、そのＮ
末端側の部分はHBe抗原（HBeAg）活性をも
つ。HBeAgは血中に出現することがある。 したがつて、HBV関連抗原としては、
HBcAg，HBsAg，HBeAgの三種類が現在知ら
れている。 また、HBsAgには共通抗原として「ａ」があ
るが、さらに抗原性の違いからadr.adw，ayw，
ayrの４種のサブタイプが知られている。これら
サブタイプは、HBV株の違いによつて、産生さ
れるHBsAgのアミノ酸配列に多少の違いが生じ
たものと考えられる。 Ｂ型肝炎はHBVキヤリアの血液が輸注される
ことにより、受血者に高率に発生するほか、注射
針やカミソリの刃についた微量の血液によつて感
染することがありうる。 日本において、年間激症肝炎4400例、急性肝炎
18万例、慢性肝炎30万例、肝硬変12万例が存在す
ると推定される肝疾患のうち、各30％程度が、ま
た原発性肝癌8400例のうち約50％がＢ型肝炎ウイ
ルスによつて発生すると推定されている。 さらに無症候のHBVキヤリア（HBV保有者）
は世界で約２億人、わが国では約300万人も存在
すると推定され、全人口に対するキヤリアの割合
は日本が先進国中最高の値を示している。したが
つて、HBVキヤリアの血液を介してＢ型肝炎が
感染する危険が大きい。 そのため、Ｂ型肝炎ウイルスに対して、ワクチ
ネーシヨンが望まれ、とくに有効でかつ副作用の
少ないワクチンの研究と開発が切望されていた。 現在供用されているＢ型肝炎ワクチンは、
HBV陽性血からHBs抗原を分離精製し、不活性
化したものであるが、HBVが現在培養増殖でき
ず、原料であるHBV陽性血を大量に確保するこ
とが困難であるとともに、コストが高いこと、異
物蛋白や未知のウイルス等が混入することによる
危険を完全に免れない欠点があつた。 したがつて、HBVに対する合成ワクチンの必
要性が示唆されてきたが、本願の発明者らは、Ｂ
型肝炎ウイルスに対して有効であり、かつ安全性
に優れたポリペプタイドワクチンを発明した。 本願は本願発明者らによる、Ｂ型肝炎ウイルス
とヒト肝細胞の付着に関する新たな知見に基礎を
置くものである。すなわち、Ｂ型肝炎ウイルス
が、肝細胞表面のPoly−HSA（重合したヒト血清
アルブミン）を介して、ヒトの肝細胞に特異的に
付着することを突き止め、さらにＢ型肝炎ウイル
ス粒子上のPoly−HSA受容体が、HBsAgの如何
なる部位に位置するかの探索をつづけた。 その結果、HBeAg陽性血漿由来のHBsAg粒子
から精製したＰ３１ポリペプタイド上に、Poly
−HSAに対する受容体が存在することを解明し
た。これに対し、HBsAg粒子から精製したＰ２
２ポリペプタイドはPoly−HSAに付着せず、し
たがつてＰ２２上にはPoly−HSAに対する受容
体が存在しないことを見出した。 さらにＰ３１ポリペプタイドとＢ型肝炎ウイル
スの遺伝情報との関係を探索した結果、Ｐ３１は
HBV−DNAのＳ領域によりコードされる226残
基のアミノ酸からなるＰ２２とその上流に存在す
るPre−Ｓ隣接領域によつてコードされる55個の
アミノ酸によつて構成されることを解明した（図
１）。 したがつて上記55個のアミノ酸からなる部分に
Poly−HSA受容体が存在する事が推測された。
事実Ｐ３１をCNBrで切断する事により単離した
上記55個のアミノ酸からなるペプタイドはPoly
−HSAと結合する事が解明された。 以上の知見にもとづき、本願の発明者らは、Ｂ
型肝炎ウイルスに対する新しいワクチン、ポリペ
プタイドワクチンＰ３１を発明した。 本発明のポリペプタイドワクチンＰ３１はＢ型
肝炎ウイルスのPoly−HSA受容体をブロツクす
ることによりHBVがヒト肝細胞に付着するのを
防止するワクチンである。 さらに、本発明のポリペプタイドワクチンＰ３
１は、そのPre−Ｓ領域DNAによりコードされ
るペプタイド部分（Ｎ未端より第４番目アミノ酸
残基Asn）に多糖類が結合している状態（Ｐ３
５）においても、HBVに対するワクチンとして
使用することができるものである。 ポリペプタイドワクチンＰ３１の製造方法は次
のとおりである。 HBeAgが陽性で、かつHBsAg価（Ｒ−PHA
価）の高い血漿を遠心して、Dane粒子を除去し
て得られた上清中の小型粒子を浮上遠心と庶糖に
よるレート遠心によつて得る。 精製した小型粒子（HBsAg粒子）を１％
（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）およ
び１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（２
−ME）を含むトリス−塩酸緩衝液中でインキユ
ベートし、構成ベプタイドに分解する。ポリペプ
タイドはMaizelの方法により、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により、分画し、Ｐ３１ポリペ
プタイド分画を得る。セフアデツクスG25（フア
ルマシア：スウエーデン）を用い水を溶媒として
上記分画をゲル濾過し、遊離のSDSや電気泳動緩
衝液に用いた試薬を除く。ボイドボリユームに溶
出したＰ３１は、凍結乾燥する。 ポリペプタイドＰ３１の物理化学的性質は次の
とおりである。 アミノ酸分析。 10μｇのＰ３１を6N−HClで減圧下110℃で24，
48，72時間加水分解し、曰立アミノ酸分析計835
で測定した。ロイシン、イソロイシン、バリンは
最高値を、スレオニンとセリンは０時間に内そう
した値を用いた。 （均似値） アスパラギン酸 ５ アスパラギン ９ スレオニン 24 セリン 31 グルタミン酸 ２ グルタミン ８ グリシン 18 アラニン ９ バリン 14 メチオニン ７ イソロイシン 16 ロイシン 38 チロシン ６ フエニルアラニン 20 リジン ２ ヒスチジン ２ アルギニン 10 プロリン 32 トリプトフアン 14 システイン 14 末端アミノ酸。 Ｎ末端アミノ酸は手動エドマン分解法により調
べた。Ｃ末端アミノ酸配列は0.2M、エチル・モ
ルフオリン−酢酸（PH.8.5）中で25℃、15分、
30分間カルボキシペプチターゼＡを作用させた
後、アミノ酸分析により決定した。Ｎ末端アミノ
酸はメチオニン、Ｃ末端アミノ酸配列は−バリン
−チロシン−イソロイシンであつた。 分子量 31000ダルトン （測定法SDS−PAGE） 温度安定性 100℃ 20min stable 吸収特性 280nm λmax 190nm shoulder 本願の発明者らはさらにＰ３１のPre−Ｓ領域
のアミノ酸配列のうち、親水性部位で各サブタイ
プ間に共通の部分を選び、これを化学的に合成し
てそのPoly−HSAとの反応性と免疫原性を調べ
た。その結果、Asp−Pro−Arg−Val−Arg−
Gly−Leu−Tyr−Phe（or−Leu）−Pro−Ala−
Gly−Gly−Ser−Ser−Ser−Gly−Thr−Valの
シーケンスを含有する合成ポリペプタイド（Asp
ペプタイド）とPoly−HSA受容体を持たない
HBsAg小型粒子との結合物はAspペプタイドを
介してPoly−HSAと結合する事が明らかになつ
た（表１）。またこのAspペプタイドは免疫原性
をも有することを見出し、これをＢ型肝炎ウイル
スに対するワクチンとすることを発明した。即
ち、このAspペプタイドをモルモツトに免疫して
得られた抗血清は、HBeAg陽性血清から精製し
たHBsAgと結合したが、HBeAb陽性血清から精
製したHBsAgとは殆ど結合しなかつた。このこ
とにより、このAspペプタイドに対する抗体がＢ
型肝炎ウイルス上のPoly−HSA受容体をブロツ
クしＢ型肝炎ウイルスがPoly−HSAを介してヒ
ト肝細胞に付着するのを阻止できる効率の高いワ
クチンであることが明らかになつた。更に、Asp
ペプタイド、精製Ｐ３１、SDS＋2ME処理した
HBsAgを免疫して得られたモノクローナル抗体
のうちAspペプタイドに対する抗体は全例Poly−
HSAとHBsAgの結合を阻止した（表２）。即ち、
Aspペプタイドは非常に効率の高い合成ワクチン
であることが明らかになつた。なお特許請求の範
囲第１項記載のペプタイドのうち、第９番目のア
ミノ酸残基はロイシンに置き換えることができ
る。これはPre−Ｓ領域のアミノ酸配列がサブタ
イプ間で異なり、adrでフエニルアラニンである
のに対しadwではロイシンであることに基づく。
しかし、19残基のアミノ酸からなる合成ペプタイ
ドを免疫して得られる抗体は、adw型HBsAgと
も結合し、サブタイプ共通のものであることがわ
かつた。特許請求の範囲第１項のペプタイドは
Merrifieldらの方法（Merrifield RB Adv.
Enzyme，32 221−296，1969）による固相法で
合成され、合成後、6N−HCl、110℃、24時間、
減圧下で加水分解後、アミノ酸組成を確認したも
のである。 以下、本発明にかかる各ペプタイドについて製
造及び免疫学的検定の実施例を述べる。 実施例 １ 本発明ののポリペプタイドＰ３１，Ｐ３５を次
の方法によつて製造した。 (1) HBsAg粒子の精製 HBsAg陽性で、サブタイプがadrのHBs抗原
価（Ｒ−PHA価）が高い血漿をプールし、37000
×ｇ、16時間の遠心を行い、Dane粒子をペレツ
トとして除去した。上清中の小型粒子を、KBr
による浮上超遠心と庶糖のよるレート（rate）超
遠心によつて得た。 (2) アクリルアミドゲル電気泳動 600mgの精製HBs抗原粒子を１％（ｗ／ｖ）
SDSおよび１％（ｖ／ｖ）２−MEを含む0.01M
トリス−塩酸緩衝液（PH8.0）で90mlにして37℃
30分インキユベートして構成ポリペプタイドに分
解した。そのポリペプタイドをMaizelの方法に
従つてMacro Pageの装置を用い、直径９cm高さ
９cmのポリアクリルアミドカラムによる調製用ゲ
ル電気泳動にかけた。サンプルを９％ポリアクリ
ルアミドゲルで作つた分離用ゲルの上に作製した
濃縮ゲル（３％）上にアプライした。50V定電圧
で２℃で泳動し、30分毎に分画した。HBsAgポ
リペプタイドはセフアデツクスＧ−25で脱塩後、
凍結乾燥した。分析用ゲル電気泳動はSDS−ポリ
アクリルアミドゲルにより、Hoeffer社スラブゲ
ル電気泳動装置を用いて行つた。（即ち、サンプ
ルに指示薬としてブロモフエノールブルーを加
え、その指示薬が濃縮ゲル（３％）内を通過して
いる間は15mAで、また分離用ゲル（10％）に入
つてからは30mAで泳動した。泳動後、蛋白質
は、0.05％（ｗ／ｖ）クーマンシーブリリアント
ブルー染色し、糖はZachariusらの方法による
PAS染色により染色した。これにより構成ポリ
ペプタイドの１つとしてＰ３１，Ｐ３５を得た
（第２図）。構成ポリペプタイド量は蛋白染色した
ゲルをAuto Scanner（ヘレナ社）を用い550nmの
波長でスキヤンして求めた。不純物除去ののち精
製した。 実施例 ２ 特許請求の範囲第１，第２項のペプタイドを次
の方法によつて製造した。 Merrifield固相法に基づき、ペプタイドのＣ末
端のアミノ酸をまず架橋ポリスチレンに縮合させ
ておき、ついでＮ末端の方向に向かつて、ｔ−ブ
トキシカルボニルアミノ酸を１個ずつ順次縮合さ
せていき、Asp−Pro−Arg−Val−Arg−Gly−
Leu−Tyr−Phe−Pro−Ala−Gly−Gly−ser−
Ser−Ser−Gly−Thr−Valのシーケンスからな
るポリペプタイド（Aspペプタイド）を合成し
た。またAspペプタイドの第９アミノ酸残基を
Leuに置換えしたポリペプタイドを合成した。合
成後、6N−HCl，110℃、24時間、減圧下で加水
分解後、アミノ酸組成を確認した。 実施例 ３ ポリペプタイドＰ３１，Ｐ３５の免疫原性（ワ
クチン効果）を次の方法により確認した。 (1) 本発明のポリペプタイドＰ３１のPoly−
HSAに対する反応性をHBeAg陽性の血漿から
分離したHBsAg粒子、Ｐ３５（ポリペプタイ
ドＰ３１に糖が結合したもの）、Ｐ２２（第２
図参照）、Ｐ２７（Ｐ２２に糖が結合したもの）
のPoly−HSAに対する反応性と比較した。固
相としてPoly−HSA、ラベル第２抗体として
抗HBs抗体を用いてサンドウイツチ法により
調べた。 その結果、Ｐ３１，Ｐ３５の滴定曲線は
HBeAg陽性血から得たHBsAg粒子のものと同
一であつて、Poly−HSAに対する反応性が認
められた。他方、Ｐ２２，Ｐ２７は、いずれも
Poly−HSAと反応しなかつた（第３図）。 また、HBsAg粒子および上記各ポリペプタ
イドはモノメリツクな血清アルブミンとは結合
しなかつた。 (2) 種特異性 ヒトおよびチンパンジーのみがＢ型肝炎ウイル
ス（HBV）に感受性を有し、その他の動物は
HBVに対する感受性を有しない。 そこで、本発明のＰ３１の種特異性を調査し
た。種々の動物の重合アルブミンをマイクロタイ
タープレートの穴にコートしてＰ３１との反応性
を検査したところヒトおよびチンパンジーの重合
アルブミンはＰ３１と結合したが、ウサギ、牛、
マウス、馬、卵白、ウツドチヤツクの重合アルブ
ミンはＰ３１と結合しなかつた（第４図）。 実施例 ４ 特許請求の範囲第１項のペプタイドの免疫原性
（ワクチン効果）を次の方法により確認した。 (1) 卵白アルブミン（OVA ovalbumin）とペプ
タイドのカツプリング ペプタイドはカツプリング試薬として１−エチ
ル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド（Sigma chemical U.S.A.）を用いて、
キヤリアープロテインである卵白アルブミン
（Sigma chemical U.S.A.）に結合させた。即ち
合成ペプタイド５mgとOVA1.5mgを0.5mlの生理的
食塩水に溶かし、15mgのカツプリング試薬を加え
た後、室温で、１晩反応させた後、生理的食塩水
に対し２日間透析した。 (2) 免疫 メスのHartley系のモルモツトに１mgペプタイ
ド−卵白アルブミン結合物0.1mlを0.2mlフロイン
トの完全アジユバントとのエマルジヨンとして皮
下に接種した。４週間後に同様に追加免疫を行
い、更にその１週間後に心臓穿刺により採血し、
血液を凝固させ遠心分離により血清を得た。 (3) 検定（ラジオイムノアツセイ） ポリビニルマイクロタイタープレートを用いサ
ンドウイツチ法、インヒビシヨン法でアツセイし
た。 即ち、サンドウイツチ法では固相として重合ヒ
トアルブミン、マウス抗Pre−Ｓモノクローナル
抗体、精製HBsAg（adr，HBeAg陽性血清又は
HBeAb陽性血清由来）精製HBsAg（adw，
HBeAg陽性血清）、プロナーゼ処理HBsAg
（adr）、HBsAgポリペプタイドＰ３１，Ｐ２２、
合成ペプタイドを各々につき、100μｇ／mlの濃
度の溶液100μlをウエルに入れ室温１時間吸着さ
せたものを用いた。 テストサンプル50μlを穴に入れ、37℃90分イン
キユベート後125Iラベル抗HBs抗体、抗Pre−Ｓ
モノクローナル抗体あるいはＰ３１を各々につき
100μl入れ、37℃、90分、インキユベートした。 ウエルを切り取りその放射活性を測定した。各
ステツプの間は生理的食塩水で５回洗浄した。 インヒビシヨン法では、テストサンプル50μlと
125Iラベル抗Pre−Ｓモノクロナール抗体50μlを
37℃、90分インキユベートし、その混合物50μlを
Ｐ３１でコートしたウエルに入れ37℃、90分、イ
ンキユベートした。サンプルのかわりに、緩衝液
を用いた０％インヒビシヨンをもとにテストサン
プルの結果を％インヒビシヨンで示した。尚、ヨ
ード（Ｉ）ラベルはクロラミンＴ法（Green
wood.F.C.（1963）Biochemical，J.89，114−
123）により行い、得られた放射ラベル物質の比
活性は5μCi／μｇであつた。 (4) モノクローナル抗体の作成 Balb／ｃマウス（雌）の腹腔に、Aspペプタ
イド、Ｐ３１、SDS＋2ME処理HBsAgを各々、
フロイントの完全アジユバントとのエマルジヨン
として注入した。３週間Aspペプタイド他各々で
追加免疫し３日後に脾臓細胞（spleen cell）を
得た。融合（Hybridization）、クローニング、
およびそれに続く培養はOi and Herzenbergの
方法（Oi.V.Tら Immunoglobulin producing
hybrid cell lines.In selected methods in
cellular Immunology，Freeman and CO.San
Francisco 351−372，1980）に従つて行つた。 各々の抗体の選択は、例えばP31ではHBeAg
陽性血漿から精製したHBsAg粒子とそれをプロ
ナーゼＥ（科研科学製）で軽く処理しＰ３１とＰ
３５を消失させたHBsAg粒子をヒツジ赤血球に
結合させたものを用いPHA法（Vyas G.Nら
Science 170 332−333 1970）で行つた。抗体
の特異性はＰ３１あるいはＰ２２を固相化し125I
ラベルの抗マウスIgG（Rabbit）を２次抗体とし
たラジオイムノアツセイにより調べた。各々の抗
体を分泌するクローンはマウスの腹腔で増殖させ
た。腹水を得、1.33M硫安で塩析後セフアデツク
スG200（フアルマシア社製）のゲル濾過を行つ
た。 (5) モノクローナル抗体と各ペプタイドとの反応 Aspペプタイドと反応をよくするモノクローナ
ル抗体IgGクラスの８種類を使つて、Poly−
HSAとHBsAgの反応を阻害するかをラジオイム
ノアツセイ、サンドイツチ法で調べたところ全例
が結合を阻止した（表２）。強力なワクチン効果
が得られた。 (6) ペプタイドの免疫原性特性 ペプタイドの免疫原性特性（immunogenicity）
を調べるために、ペプタイドをOVAに結合させ
た結合物（１mg）をフロイントの完全アジユバン
トとの懸濁液として、３匹のモルモツトの皮下に
免疫した。４週間後に追加免疫しその１週間後、
採血した。凝塊（clot）後、得られた血清につい
て、サンドウイツチ法によるラジオイムノアツセ
イにより、抗体の検定（assay）を行つた。 即ち、固相に、HBeAg陽性血から精製した
HBsAg（adr，adw）そのHBsAg（adr）をプロナ
ーゼ処理したもの、HBeAg陽性血から精製した
HBs（adr）、およびHBsAgポリペプタイドＰ３
１，Ｐ２２を用いて、サンプルをインキユベーシ
ヨン後、125I−Ｐ３１と反応させ、放射活性を測
定した（表３）。 ペプタイドを免疫された３匹のモルモツトから
得られた血清はいずれも合成ペプタイドと反応し
た。更にＰ３１（adr）およびHBeAg陽性血か
ら精製したHBsAg（adr，adw）とも結合した。
しかし、一方Pronase処理する事によりＰ３１と
Ｐ３５が消失したHBsAg（adr）、HBeAb陽性血
から精製したHBsAgおよびＰ２２との反応性は
低かつた。この結果から、このペプタイドはモル
モツトに主としてポリペプタイドＰ３１，Ｐ３５
含量の多いHBeAg陽性血中のHBsAgと結合し、
しかもadrとadwの共通部分と反応する抗体を作
らせることが解つた。 特許請求の範囲第２項のペプタイドについても
検査し、その免疫原性を確認した。 実施例 ５ PreS領域ペプタイドの反応性について調べた。 (1) Ｐ３１のPreS領域に対するモノクローナル
抗体Hyb4408の特異性を（表４）に示した。こ
の抗体はＰ３１との反応性は高いがＰ２２との
反応性は低い事からPreS領域に特異的である
ことが解つた。 (2) Ｐ３１からのPre−ｓ領域ペプタイドの分
離。Ｐ３１はＰ２２のＮ末端アミノ酸Metの上
流に55残基のアミノ酸からなるペプタイドが結
合したものと推測され、また、Pre−Ｓ領域に
はMetはＮ末端にのみ存在するので、Ｐ３１を
CNBrで開製することによりPre−Ｓ領域のペ
プタイドを単離した。ここでHBsAg粒子およ
びＰ３１を70％ギ酸、0.1NHClで処理すると
Poly−HSA受容体は完全に失活するのでSDS
溶液中でCNBr開製を行つた。このペプタイド
のアミノ酸分析値から、アラニンを４残基とし
て他のアミノ酸残基数を計算した。 その結果、HBV−DNA塩基配列から推定さ
れるPreS領域のアミノ酸組成（adr）とよく一
致した。 (3) 抗PreSモノクローナル抗体とＰ３１のPreS
ペプタイドとの反応。 単離したPreSペプタイドとＰ３１を免疫し
て得たモノクローナル抗体Hyb−4408との反応
をインヒビシヨンテストによつて調べた。即
ち、種々の濃度のPre−Ｓペプタイドと125Iラ
ベルHyb−4408を予めインキユベートしてお
き、この混合物をＰ３１を固相したウエルに入
れ、インキユベート後カウントを測定した。
Pre−Ｓペプタイドのかわりに生理的食塩水を
用いたものを０％インヒビシヨンコントロール
とし、表５に示した。Pre−Ｓペプタイドの濃
度が増加するにつれＰ３１と125I Hyb4408と
の反応の阻害は大きくなり、３〜100μｇ／mg
ではほゞ直線関係が見られた。この事により単
離されたPresペプタイドは抗Pre−Ｓモノクロ
ーナル抗体（Hyb4408）と結合することが解つ
た。 (4) PolyHSAとPre−Ｓペプタイドとの結合。 単離したPreSペプタイドとPolyHSAの反応性
をPolyHSAを固相に、第２ラベル抗体として抗
Pre−Ｓモノクローナル抗体を用いたサンドイツ
チ法によるラジオイムノアツセイ法で調べた。
（表６）に示したようにPreSペプタイドはPoly−
HSAと結合することが明らかになり、Ｐ３１の
Pre−Ｓ領域にPoly−HSA受容体が存在するこ
とが解つた。
有効なワクチンに関するものであり、詳しくはＢ
型肝炎ウイルスの感染機作に関する新たな知見に
もとづいて、その感染を防止するための新しいタ
イプのワクチンを提供するものである。 Ｂ型肝炎は主として血液を介して感染するウイ
ルス性疾患である。 Ｂ型肝炎ウイルスは、1970年にDaneらによつ
て、オーストラリア抗原（Au抗原、HBs抗原）、
陽性血内に確認されたものであつて、二重構造を
した球形DNAウイルスである。 HBVに感染したヒトの血清を遠心して電子顕
微鏡下で観察すると、直径42nmの大型球形粒子
（Dane粒子）、直径22nmの小型球形粒子および管
状粒子が見出される。 Dane粒子は、中心に直径27nmの内部粒子
（core粒子）を有し、また表面には外殻がある。
core粒子内には、分子量約1.6×106の２本鎖
DNAとDNAポリメラーゼが含まれている。 Dane粒子の外殻は、HBs抗原（HBsAg）活性
を有し、これとは別にcore粒子表面にはHBc抗
原（HBcAg）活性がある。またcore粒子には分
子量約19000（P19）の単位核蛋白が存在するが、
P19の一部はcore粒子の表面に露出して、そのＮ
末端側の部分はHBe抗原（HBeAg）活性をも
つ。HBeAgは血中に出現することがある。 したがつて、HBV関連抗原としては、
HBcAg，HBsAg，HBeAgの三種類が現在知ら
れている。 また、HBsAgには共通抗原として「ａ」があ
るが、さらに抗原性の違いからadr.adw，ayw，
ayrの４種のサブタイプが知られている。これら
サブタイプは、HBV株の違いによつて、産生さ
れるHBsAgのアミノ酸配列に多少の違いが生じ
たものと考えられる。 Ｂ型肝炎はHBVキヤリアの血液が輸注される
ことにより、受血者に高率に発生するほか、注射
針やカミソリの刃についた微量の血液によつて感
染することがありうる。 日本において、年間激症肝炎4400例、急性肝炎
18万例、慢性肝炎30万例、肝硬変12万例が存在す
ると推定される肝疾患のうち、各30％程度が、ま
た原発性肝癌8400例のうち約50％がＢ型肝炎ウイ
ルスによつて発生すると推定されている。 さらに無症候のHBVキヤリア（HBV保有者）
は世界で約２億人、わが国では約300万人も存在
すると推定され、全人口に対するキヤリアの割合
は日本が先進国中最高の値を示している。したが
つて、HBVキヤリアの血液を介してＢ型肝炎が
感染する危険が大きい。 そのため、Ｂ型肝炎ウイルスに対して、ワクチ
ネーシヨンが望まれ、とくに有効でかつ副作用の
少ないワクチンの研究と開発が切望されていた。 現在供用されているＢ型肝炎ワクチンは、
HBV陽性血からHBs抗原を分離精製し、不活性
化したものであるが、HBVが現在培養増殖でき
ず、原料であるHBV陽性血を大量に確保するこ
とが困難であるとともに、コストが高いこと、異
物蛋白や未知のウイルス等が混入することによる
危険を完全に免れない欠点があつた。 したがつて、HBVに対する合成ワクチンの必
要性が示唆されてきたが、本願の発明者らは、Ｂ
型肝炎ウイルスに対して有効であり、かつ安全性
に優れたポリペプタイドワクチンを発明した。 本願は本願発明者らによる、Ｂ型肝炎ウイルス
とヒト肝細胞の付着に関する新たな知見に基礎を
置くものである。すなわち、Ｂ型肝炎ウイルス
が、肝細胞表面のPoly−HSA（重合したヒト血清
アルブミン）を介して、ヒトの肝細胞に特異的に
付着することを突き止め、さらにＢ型肝炎ウイル
ス粒子上のPoly−HSA受容体が、HBsAgの如何
なる部位に位置するかの探索をつづけた。 その結果、HBeAg陽性血漿由来のHBsAg粒子
から精製したＰ３１ポリペプタイド上に、Poly
−HSAに対する受容体が存在することを解明し
た。これに対し、HBsAg粒子から精製したＰ２
２ポリペプタイドはPoly−HSAに付着せず、し
たがつてＰ２２上にはPoly−HSAに対する受容
体が存在しないことを見出した。 さらにＰ３１ポリペプタイドとＢ型肝炎ウイル
スの遺伝情報との関係を探索した結果、Ｐ３１は
HBV−DNAのＳ領域によりコードされる226残
基のアミノ酸からなるＰ２２とその上流に存在す
るPre−Ｓ隣接領域によつてコードされる55個の
アミノ酸によつて構成されることを解明した（図
１）。 したがつて上記55個のアミノ酸からなる部分に
Poly−HSA受容体が存在する事が推測された。
事実Ｐ３１をCNBrで切断する事により単離した
上記55個のアミノ酸からなるペプタイドはPoly
−HSAと結合する事が解明された。 以上の知見にもとづき、本願の発明者らは、Ｂ
型肝炎ウイルスに対する新しいワクチン、ポリペ
プタイドワクチンＰ３１を発明した。 本発明のポリペプタイドワクチンＰ３１はＢ型
肝炎ウイルスのPoly−HSA受容体をブロツクす
ることによりHBVがヒト肝細胞に付着するのを
防止するワクチンである。 さらに、本発明のポリペプタイドワクチンＰ３
１は、そのPre−Ｓ領域DNAによりコードされ
るペプタイド部分（Ｎ未端より第４番目アミノ酸
残基Asn）に多糖類が結合している状態（Ｐ３
５）においても、HBVに対するワクチンとして
使用することができるものである。 ポリペプタイドワクチンＰ３１の製造方法は次
のとおりである。 HBeAgが陽性で、かつHBsAg価（Ｒ−PHA
価）の高い血漿を遠心して、Dane粒子を除去し
て得られた上清中の小型粒子を浮上遠心と庶糖に
よるレート遠心によつて得る。 精製した小型粒子（HBsAg粒子）を１％
（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）およ
び１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（２
−ME）を含むトリス−塩酸緩衝液中でインキユ
ベートし、構成ベプタイドに分解する。ポリペプ
タイドはMaizelの方法により、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により、分画し、Ｐ３１ポリペ
プタイド分画を得る。セフアデツクスG25（フア
ルマシア：スウエーデン）を用い水を溶媒として
上記分画をゲル濾過し、遊離のSDSや電気泳動緩
衝液に用いた試薬を除く。ボイドボリユームに溶
出したＰ３１は、凍結乾燥する。 ポリペプタイドＰ３１の物理化学的性質は次の
とおりである。 アミノ酸分析。 10μｇのＰ３１を6N−HClで減圧下110℃で24，
48，72時間加水分解し、曰立アミノ酸分析計835
で測定した。ロイシン、イソロイシン、バリンは
最高値を、スレオニンとセリンは０時間に内そう
した値を用いた。 （均似値） アスパラギン酸 ５ アスパラギン ９ スレオニン 24 セリン 31 グルタミン酸 ２ グルタミン ８ グリシン 18 アラニン ９ バリン 14 メチオニン ７ イソロイシン 16 ロイシン 38 チロシン ６ フエニルアラニン 20 リジン ２ ヒスチジン ２ アルギニン 10 プロリン 32 トリプトフアン 14 システイン 14 末端アミノ酸。 Ｎ末端アミノ酸は手動エドマン分解法により調
べた。Ｃ末端アミノ酸配列は0.2M、エチル・モ
ルフオリン−酢酸（PH.8.5）中で25℃、15分、
30分間カルボキシペプチターゼＡを作用させた
後、アミノ酸分析により決定した。Ｎ末端アミノ
酸はメチオニン、Ｃ末端アミノ酸配列は−バリン
−チロシン−イソロイシンであつた。 分子量 31000ダルトン （測定法SDS−PAGE） 温度安定性 100℃ 20min stable 吸収特性 280nm λmax 190nm shoulder 本願の発明者らはさらにＰ３１のPre−Ｓ領域
のアミノ酸配列のうち、親水性部位で各サブタイ
プ間に共通の部分を選び、これを化学的に合成し
てそのPoly−HSAとの反応性と免疫原性を調べ
た。その結果、Asp−Pro−Arg−Val−Arg−
Gly−Leu−Tyr−Phe（or−Leu）−Pro−Ala−
Gly−Gly−Ser−Ser−Ser−Gly−Thr−Valの
シーケンスを含有する合成ポリペプタイド（Asp
ペプタイド）とPoly−HSA受容体を持たない
HBsAg小型粒子との結合物はAspペプタイドを
介してPoly−HSAと結合する事が明らかになつ
た（表１）。またこのAspペプタイドは免疫原性
をも有することを見出し、これをＢ型肝炎ウイル
スに対するワクチンとすることを発明した。即
ち、このAspペプタイドをモルモツトに免疫して
得られた抗血清は、HBeAg陽性血清から精製し
たHBsAgと結合したが、HBeAb陽性血清から精
製したHBsAgとは殆ど結合しなかつた。このこ
とにより、このAspペプタイドに対する抗体がＢ
型肝炎ウイルス上のPoly−HSA受容体をブロツ
クしＢ型肝炎ウイルスがPoly−HSAを介してヒ
ト肝細胞に付着するのを阻止できる効率の高いワ
クチンであることが明らかになつた。更に、Asp
ペプタイド、精製Ｐ３１、SDS＋2ME処理した
HBsAgを免疫して得られたモノクローナル抗体
のうちAspペプタイドに対する抗体は全例Poly−
HSAとHBsAgの結合を阻止した（表２）。即ち、
Aspペプタイドは非常に効率の高い合成ワクチン
であることが明らかになつた。なお特許請求の範
囲第１項記載のペプタイドのうち、第９番目のア
ミノ酸残基はロイシンに置き換えることができ
る。これはPre−Ｓ領域のアミノ酸配列がサブタ
イプ間で異なり、adrでフエニルアラニンである
のに対しadwではロイシンであることに基づく。
しかし、19残基のアミノ酸からなる合成ペプタイ
ドを免疫して得られる抗体は、adw型HBsAgと
も結合し、サブタイプ共通のものであることがわ
かつた。特許請求の範囲第１項のペプタイドは
Merrifieldらの方法（Merrifield RB Adv.
Enzyme，32 221−296，1969）による固相法で
合成され、合成後、6N−HCl、110℃、24時間、
減圧下で加水分解後、アミノ酸組成を確認したも
のである。 以下、本発明にかかる各ペプタイドについて製
造及び免疫学的検定の実施例を述べる。 実施例 １ 本発明ののポリペプタイドＰ３１，Ｐ３５を次
の方法によつて製造した。 (1) HBsAg粒子の精製 HBsAg陽性で、サブタイプがadrのHBs抗原
価（Ｒ−PHA価）が高い血漿をプールし、37000
×ｇ、16時間の遠心を行い、Dane粒子をペレツ
トとして除去した。上清中の小型粒子を、KBr
による浮上超遠心と庶糖のよるレート（rate）超
遠心によつて得た。 (2) アクリルアミドゲル電気泳動 600mgの精製HBs抗原粒子を１％（ｗ／ｖ）
SDSおよび１％（ｖ／ｖ）２−MEを含む0.01M
トリス−塩酸緩衝液（PH8.0）で90mlにして37℃
30分インキユベートして構成ポリペプタイドに分
解した。そのポリペプタイドをMaizelの方法に
従つてMacro Pageの装置を用い、直径９cm高さ
９cmのポリアクリルアミドカラムによる調製用ゲ
ル電気泳動にかけた。サンプルを９％ポリアクリ
ルアミドゲルで作つた分離用ゲルの上に作製した
濃縮ゲル（３％）上にアプライした。50V定電圧
で２℃で泳動し、30分毎に分画した。HBsAgポ
リペプタイドはセフアデツクスＧ−25で脱塩後、
凍結乾燥した。分析用ゲル電気泳動はSDS−ポリ
アクリルアミドゲルにより、Hoeffer社スラブゲ
ル電気泳動装置を用いて行つた。（即ち、サンプ
ルに指示薬としてブロモフエノールブルーを加
え、その指示薬が濃縮ゲル（３％）内を通過して
いる間は15mAで、また分離用ゲル（10％）に入
つてからは30mAで泳動した。泳動後、蛋白質
は、0.05％（ｗ／ｖ）クーマンシーブリリアント
ブルー染色し、糖はZachariusらの方法による
PAS染色により染色した。これにより構成ポリ
ペプタイドの１つとしてＰ３１，Ｐ３５を得た
（第２図）。構成ポリペプタイド量は蛋白染色した
ゲルをAuto Scanner（ヘレナ社）を用い550nmの
波長でスキヤンして求めた。不純物除去ののち精
製した。 実施例 ２ 特許請求の範囲第１，第２項のペプタイドを次
の方法によつて製造した。 Merrifield固相法に基づき、ペプタイドのＣ末
端のアミノ酸をまず架橋ポリスチレンに縮合させ
ておき、ついでＮ末端の方向に向かつて、ｔ−ブ
トキシカルボニルアミノ酸を１個ずつ順次縮合さ
せていき、Asp−Pro−Arg−Val−Arg−Gly−
Leu−Tyr−Phe−Pro−Ala−Gly−Gly−ser−
Ser−Ser−Gly−Thr−Valのシーケンスからな
るポリペプタイド（Aspペプタイド）を合成し
た。またAspペプタイドの第９アミノ酸残基を
Leuに置換えしたポリペプタイドを合成した。合
成後、6N−HCl，110℃、24時間、減圧下で加水
分解後、アミノ酸組成を確認した。 実施例 ３ ポリペプタイドＰ３１，Ｐ３５の免疫原性（ワ
クチン効果）を次の方法により確認した。 (1) 本発明のポリペプタイドＰ３１のPoly−
HSAに対する反応性をHBeAg陽性の血漿から
分離したHBsAg粒子、Ｐ３５（ポリペプタイ
ドＰ３１に糖が結合したもの）、Ｐ２２（第２
図参照）、Ｐ２７（Ｐ２２に糖が結合したもの）
のPoly−HSAに対する反応性と比較した。固
相としてPoly−HSA、ラベル第２抗体として
抗HBs抗体を用いてサンドウイツチ法により
調べた。 その結果、Ｐ３１，Ｐ３５の滴定曲線は
HBeAg陽性血から得たHBsAg粒子のものと同
一であつて、Poly−HSAに対する反応性が認
められた。他方、Ｐ２２，Ｐ２７は、いずれも
Poly−HSAと反応しなかつた（第３図）。 また、HBsAg粒子および上記各ポリペプタ
イドはモノメリツクな血清アルブミンとは結合
しなかつた。 (2) 種特異性 ヒトおよびチンパンジーのみがＢ型肝炎ウイル
ス（HBV）に感受性を有し、その他の動物は
HBVに対する感受性を有しない。 そこで、本発明のＰ３１の種特異性を調査し
た。種々の動物の重合アルブミンをマイクロタイ
タープレートの穴にコートしてＰ３１との反応性
を検査したところヒトおよびチンパンジーの重合
アルブミンはＰ３１と結合したが、ウサギ、牛、
マウス、馬、卵白、ウツドチヤツクの重合アルブ
ミンはＰ３１と結合しなかつた（第４図）。 実施例 ４ 特許請求の範囲第１項のペプタイドの免疫原性
（ワクチン効果）を次の方法により確認した。 (1) 卵白アルブミン（OVA ovalbumin）とペプ
タイドのカツプリング ペプタイドはカツプリング試薬として１−エチ
ル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド（Sigma chemical U.S.A.）を用いて、
キヤリアープロテインである卵白アルブミン
（Sigma chemical U.S.A.）に結合させた。即ち
合成ペプタイド５mgとOVA1.5mgを0.5mlの生理的
食塩水に溶かし、15mgのカツプリング試薬を加え
た後、室温で、１晩反応させた後、生理的食塩水
に対し２日間透析した。 (2) 免疫 メスのHartley系のモルモツトに１mgペプタイ
ド−卵白アルブミン結合物0.1mlを0.2mlフロイン
トの完全アジユバントとのエマルジヨンとして皮
下に接種した。４週間後に同様に追加免疫を行
い、更にその１週間後に心臓穿刺により採血し、
血液を凝固させ遠心分離により血清を得た。 (3) 検定（ラジオイムノアツセイ） ポリビニルマイクロタイタープレートを用いサ
ンドウイツチ法、インヒビシヨン法でアツセイし
た。 即ち、サンドウイツチ法では固相として重合ヒ
トアルブミン、マウス抗Pre−Ｓモノクローナル
抗体、精製HBsAg（adr，HBeAg陽性血清又は
HBeAb陽性血清由来）精製HBsAg（adw，
HBeAg陽性血清）、プロナーゼ処理HBsAg
（adr）、HBsAgポリペプタイドＰ３１，Ｐ２２、
合成ペプタイドを各々につき、100μｇ／mlの濃
度の溶液100μlをウエルに入れ室温１時間吸着さ
せたものを用いた。 テストサンプル50μlを穴に入れ、37℃90分イン
キユベート後125Iラベル抗HBs抗体、抗Pre−Ｓ
モノクローナル抗体あるいはＰ３１を各々につき
100μl入れ、37℃、90分、インキユベートした。 ウエルを切り取りその放射活性を測定した。各
ステツプの間は生理的食塩水で５回洗浄した。 インヒビシヨン法では、テストサンプル50μlと
125Iラベル抗Pre−Ｓモノクロナール抗体50μlを
37℃、90分インキユベートし、その混合物50μlを
Ｐ３１でコートしたウエルに入れ37℃、90分、イ
ンキユベートした。サンプルのかわりに、緩衝液
を用いた０％インヒビシヨンをもとにテストサン
プルの結果を％インヒビシヨンで示した。尚、ヨ
ード（Ｉ）ラベルはクロラミンＴ法（Green
wood.F.C.（1963）Biochemical，J.89，114−
123）により行い、得られた放射ラベル物質の比
活性は5μCi／μｇであつた。 (4) モノクローナル抗体の作成 Balb／ｃマウス（雌）の腹腔に、Aspペプタ
イド、Ｐ３１、SDS＋2ME処理HBsAgを各々、
フロイントの完全アジユバントとのエマルジヨン
として注入した。３週間Aspペプタイド他各々で
追加免疫し３日後に脾臓細胞（spleen cell）を
得た。融合（Hybridization）、クローニング、
およびそれに続く培養はOi and Herzenbergの
方法（Oi.V.Tら Immunoglobulin producing
hybrid cell lines.In selected methods in
cellular Immunology，Freeman and CO.San
Francisco 351−372，1980）に従つて行つた。 各々の抗体の選択は、例えばP31ではHBeAg
陽性血漿から精製したHBsAg粒子とそれをプロ
ナーゼＥ（科研科学製）で軽く処理しＰ３１とＰ
３５を消失させたHBsAg粒子をヒツジ赤血球に
結合させたものを用いPHA法（Vyas G.Nら
Science 170 332−333 1970）で行つた。抗体
の特異性はＰ３１あるいはＰ２２を固相化し125I
ラベルの抗マウスIgG（Rabbit）を２次抗体とし
たラジオイムノアツセイにより調べた。各々の抗
体を分泌するクローンはマウスの腹腔で増殖させ
た。腹水を得、1.33M硫安で塩析後セフアデツク
スG200（フアルマシア社製）のゲル濾過を行つ
た。 (5) モノクローナル抗体と各ペプタイドとの反応 Aspペプタイドと反応をよくするモノクローナ
ル抗体IgGクラスの８種類を使つて、Poly−
HSAとHBsAgの反応を阻害するかをラジオイム
ノアツセイ、サンドイツチ法で調べたところ全例
が結合を阻止した（表２）。強力なワクチン効果
が得られた。 (6) ペプタイドの免疫原性特性 ペプタイドの免疫原性特性（immunogenicity）
を調べるために、ペプタイドをOVAに結合させ
た結合物（１mg）をフロイントの完全アジユバン
トとの懸濁液として、３匹のモルモツトの皮下に
免疫した。４週間後に追加免疫しその１週間後、
採血した。凝塊（clot）後、得られた血清につい
て、サンドウイツチ法によるラジオイムノアツセ
イにより、抗体の検定（assay）を行つた。 即ち、固相に、HBeAg陽性血から精製した
HBsAg（adr，adw）そのHBsAg（adr）をプロナ
ーゼ処理したもの、HBeAg陽性血から精製した
HBs（adr）、およびHBsAgポリペプタイドＰ３
１，Ｐ２２を用いて、サンプルをインキユベーシ
ヨン後、125I−Ｐ３１と反応させ、放射活性を測
定した（表３）。 ペプタイドを免疫された３匹のモルモツトから
得られた血清はいずれも合成ペプタイドと反応し
た。更にＰ３１（adr）およびHBeAg陽性血か
ら精製したHBsAg（adr，adw）とも結合した。
しかし、一方Pronase処理する事によりＰ３１と
Ｐ３５が消失したHBsAg（adr）、HBeAb陽性血
から精製したHBsAgおよびＰ２２との反応性は
低かつた。この結果から、このペプタイドはモル
モツトに主としてポリペプタイドＰ３１，Ｐ３５
含量の多いHBeAg陽性血中のHBsAgと結合し、
しかもadrとadwの共通部分と反応する抗体を作
らせることが解つた。 特許請求の範囲第２項のペプタイドについても
検査し、その免疫原性を確認した。 実施例 ５ PreS領域ペプタイドの反応性について調べた。 (1) Ｐ３１のPreS領域に対するモノクローナル
抗体Hyb4408の特異性を（表４）に示した。こ
の抗体はＰ３１との反応性は高いがＰ２２との
反応性は低い事からPreS領域に特異的である
ことが解つた。 (2) Ｐ３１からのPre−ｓ領域ペプタイドの分
離。Ｐ３１はＰ２２のＮ末端アミノ酸Metの上
流に55残基のアミノ酸からなるペプタイドが結
合したものと推測され、また、Pre−Ｓ領域に
はMetはＮ末端にのみ存在するので、Ｐ３１を
CNBrで開製することによりPre−Ｓ領域のペ
プタイドを単離した。ここでHBsAg粒子およ
びＰ３１を70％ギ酸、0.1NHClで処理すると
Poly−HSA受容体は完全に失活するのでSDS
溶液中でCNBr開製を行つた。このペプタイド
のアミノ酸分析値から、アラニンを４残基とし
て他のアミノ酸残基数を計算した。 その結果、HBV−DNA塩基配列から推定さ
れるPreS領域のアミノ酸組成（adr）とよく一
致した。 (3) 抗PreSモノクローナル抗体とＰ３１のPreS
ペプタイドとの反応。 単離したPreSペプタイドとＰ３１を免疫し
て得たモノクローナル抗体Hyb−4408との反応
をインヒビシヨンテストによつて調べた。即
ち、種々の濃度のPre−Ｓペプタイドと125Iラ
ベルHyb−4408を予めインキユベートしてお
き、この混合物をＰ３１を固相したウエルに入
れ、インキユベート後カウントを測定した。
Pre−Ｓペプタイドのかわりに生理的食塩水を
用いたものを０％インヒビシヨンコントロール
とし、表５に示した。Pre−Ｓペプタイドの濃
度が増加するにつれＰ３１と125I Hyb4408と
の反応の阻害は大きくなり、３〜100μｇ／mg
ではほゞ直線関係が見られた。この事により単
離されたPresペプタイドは抗Pre−Ｓモノクロ
ーナル抗体（Hyb4408）と結合することが解つ
た。 (4) PolyHSAとPre−Ｓペプタイドとの結合。 単離したPreSペプタイドとPolyHSAの反応性
をPolyHSAを固相に、第２ラベル抗体として抗
Pre−Ｓモノクローナル抗体を用いたサンドイツ
チ法によるラジオイムノアツセイ法で調べた。
（表６）に示したようにPreSペプタイドはPoly−
HSAと結合することが明らかになり、Ｐ３１の
Pre−Ｓ領域にPoly−HSA受容体が存在するこ
とが解つた。
【表】
【表】
クローナル抗体
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
第１図は、ポリペプタイドＰ２２，Ｐ２７と
Poly−HSAへの結合部位を持つポリペプタイド
Ｐ３１，Ｐ３５の構成図（aaはアミノ酸残基）。 第２図は、HBs抗原ポリペプタイドのSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動 構成ペプタイドに分解されたHBs抗原粒子Ａ
をＰ３５，Ｂ，Ｐ３１，Ｃと同様に分析用SDSゲ
ル電気泳動し、タンパクと炭水化物について染色
を行つた（A′，B′，C′）矢印はＰ３５，Ｐ３１，
Ｐ２７，Ｐ２２の位置を示す。 第３図は、HBs抗原ポリペプタイドとヒト血
清重合アルブミンの反応性を示す。HBe抗原陽
性血漿より得た20nmのHBs抗原粒子と３種の
HBs抗原ポリペプタイドＰ３１，Ｐ３５，Ｐ２
２をPoly−HSAでコートしたウエル中でインキ
ユベートした。結合したポリペプタイド、および
粒子はアイソトープラベル抗HBs抗体で検出し
た。 黒丸１はＰ３１、白丸２はＰ３５、白三角３は
Ｐ２２、黒三角４はHBs抗原粒子を示す。Ｐ２
７はＰ２２と類似した結合曲線を示した。 第４図は、種々の動物種の重合アルブミンによ
るＰ３１のヒト血清重合アルブミンへの結合の阻
害を示す。Ｐ３１は濃度を段階的に上げたヒト血
清重合アルブミン、チンパンジー重合アルブミン
とインキユベートし、Poly−HSAでコートした
ウエルへ移した。ウエルは洗浄し、結合したＰ３
１をアイソトープラベル抗HBs抗体で検出した。
固定化したPoly−HSAとＰ３１の結合阻害率
（％）で結果を示した。 黒丸Ａはヒト重合アルブミン、白四角Ｂはチン
パンジー重合アルブミンを示す。他の動物の重合
アルブミンによる阻害は１濃度（１mg／ml）で行
い矢印で示した。Ｃはウサギ、Ｄはウシ、Ｅはマ
ウス、Ｆはウマ、Ｇは卵白、Ｈはウツドチヤツク
を示す。
Poly−HSAへの結合部位を持つポリペプタイド
Ｐ３１，Ｐ３５の構成図（aaはアミノ酸残基）。 第２図は、HBs抗原ポリペプタイドのSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動 構成ペプタイドに分解されたHBs抗原粒子Ａ
をＰ３５，Ｂ，Ｐ３１，Ｃと同様に分析用SDSゲ
ル電気泳動し、タンパクと炭水化物について染色
を行つた（A′，B′，C′）矢印はＰ３５，Ｐ３１，
Ｐ２７，Ｐ２２の位置を示す。 第３図は、HBs抗原ポリペプタイドとヒト血
清重合アルブミンの反応性を示す。HBe抗原陽
性血漿より得た20nmのHBs抗原粒子と３種の
HBs抗原ポリペプタイドＰ３１，Ｐ３５，Ｐ２
２をPoly−HSAでコートしたウエル中でインキ
ユベートした。結合したポリペプタイド、および
粒子はアイソトープラベル抗HBs抗体で検出し
た。 黒丸１はＰ３１、白丸２はＰ３５、白三角３は
Ｐ２２、黒三角４はHBs抗原粒子を示す。Ｐ２
７はＰ２２と類似した結合曲線を示した。 第４図は、種々の動物種の重合アルブミンによ
るＰ３１のヒト血清重合アルブミンへの結合の阻
害を示す。Ｐ３１は濃度を段階的に上げたヒト血
清重合アルブミン、チンパンジー重合アルブミン
とインキユベートし、Poly−HSAでコートした
ウエルへ移した。ウエルは洗浄し、結合したＰ３
１をアイソトープラベル抗HBs抗体で検出した。
固定化したPoly−HSAとＰ３１の結合阻害率
（％）で結果を示した。 黒丸Ａはヒト重合アルブミン、白四角Ｂはチン
パンジー重合アルブミンを示す。他の動物の重合
アルブミンによる阻害は１濃度（１mg／ml）で行
い矢印で示した。Ｃはウサギ、Ｄはウシ、Ｅはマ
ウス、Ｆはウマ、Ｇは卵白、Ｈはウツドチヤツク
を示す。
Claims (1)
- １ Asp−Pro−Arg−Val−Arg−Gly−Leu−
Tyr−Ｘ−Pro−Ala−Gly−Gly−Ser−Ser−
Ser−Gly−Thr−Valのシーケンスからなり、Ｘ
がPheまたはLeuから選ばれたアミノ酸残基であ
つて、重合したヒト血清アルブミンに対する受容
体を有し、Ｂ型肝炎ウイルスの肝細胞に対する付
着を阻止する、Ｂ型肝炎ポリペプタイドワクチ
ン。
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| JP15912484A JPS6137738A (ja) | 1984-07-31 | 1984-07-31 | Ｂ型肝炎ワクチン |
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