JPH0725697B2 - ワクチンおよび方法 - Google Patents
ワクチンおよび方法Info
- Publication number
- JPH0725697B2 JPH0725697B2 JP1209519A JP20951989A JPH0725697B2 JP H0725697 B2 JPH0725697 B2 JP H0725697B2 JP 1209519 A JP1209519 A JP 1209519A JP 20951989 A JP20951989 A JP 20951989A JP H0725697 B2 JPH0725697 B2 JP H0725697B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pleuropneumoniae
- serotypes
- strain
- medium
- haemophilus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 claims description 81
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 37
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 21
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 claims description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 13
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims description 7
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 7
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 claims description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 claims 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 12
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 12
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 10
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 10
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 10
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 6
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 2
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 208000014181 Bronchial disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 101000805601 Crotalus atrox Zinc metalloproteinase-disintegrin-like atrolysin-A Proteins 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 208000032923 Lobar pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003529 diazepam Drugs 0.000 description 1
- GUBNMFJOJGDCEL-UHFFFAOYSA-N dicyclomine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1CCCCC1C1(C(=O)OCC[NH+](CC)CC)CCCCC1 GUBNMFJOJGDCEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003219 hemolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002956 necrotizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（Ha
emophilus pleuropneumoniae）により引き起こされるブ
タの、それぞれ、予防および抑制に適当なワクチンなら
びにこのようなワクチンにおける使用に適当なヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（Haemophilus pleuropn
eumoniae）の細胞外タンパク質物質を得る方法に関す
る。
emophilus pleuropneumoniae）により引き起こされるブ
タの、それぞれ、予防および抑制に適当なワクチンなら
びにこのようなワクチンにおける使用に適当なヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（Haemophilus pleuropn
eumoniae）の細胞外タンパク質物質を得る方法に関す
る。
本発明は、要約すれば、次の通りである：本発明は、ヘ
モフィルス・プレウロニューモニアエ（Haemophilus pl
europneumoniae）の少なくとも２つの異なる血清型の菌
株の培地から誘導された細胞外タンパク質物質の混合物
の有効含量に基づく、好ましくは一方において血清型
１、５、６、９および11の群から選択される少なくとも
１つのヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）菌株の培地から誘導された細胞外タンパ
ク質物質および他方において血清型２、３、４および８
の群から選択される少なくとも１つのヘモフィルス・プ
レウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の培
地から誘導された細胞外タンパク質物質の混合物を有効
含量に基づく、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（Haemophilus pleuropneumoniae）、有利にはヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）
のすべての血清型の予防および抑制に適当なワクチンに
関する。
モフィルス・プレウロニューモニアエ（Haemophilus pl
europneumoniae）の少なくとも２つの異なる血清型の菌
株の培地から誘導された細胞外タンパク質物質の混合物
の有効含量に基づく、好ましくは一方において血清型
１、５、６、９および11の群から選択される少なくとも
１つのヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）菌株の培地から誘導された細胞外タンパ
ク質物質および他方において血清型２、３、４および８
の群から選択される少なくとも１つのヘモフィルス・プ
レウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の培
地から誘導された細胞外タンパク質物質の混合物を有効
含量に基づく、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（Haemophilus pleuropneumoniae）、有利にはヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）
のすべての血清型の予防および抑制に適当なワクチンに
関する。
ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneu
moniae）は、現在ブタにおける気管支の最も重要な疾患
の１つであるとみなされる、ブタにおけるヘモフィルス
・プレウロニューモニアエ（Haemophilus pleuropneumo
nia）の原因である［参照、なかでも、マウズスレイ（M
audsley）J.R.ら、カナディアン・ジャーナル・オブ・
マイクロバイオンジー（Can.J.Microbiol.）32、801−8
05（1986）］。この病気の急性段階の主要な症候は高熱
の発生および広範なフィブリン性出血性壊死のの大葉肺
炎であり、これはフィブリン性胸膜炎を伴う。ヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）
により生成する１または２以上のトキシンは上の病因に
おいて有意の役割を演ずると思われる。よりとくに、超
音波処理した非生存性ヘモフィルス・プレウロニューモ
ニアエ（H.pleuropneumoniae）細胞およびヘモフィルス
・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）の培
地から得られた細胞不含上澄み液の両者をブタに気管支
内投与すると、実験的に感染したブタにおいて起こる肺
炎に相当する局所的肺炎を生ずることが観察された。マ
ウズスレイ（Maudsley）J.R.ら、カナディアン・ジャー
ナル・オブ・マイクロバイオロジー（Can.J.Microbio
l.）32、801−805（1986）の論文は、とくにタンパク質
を含有しない、化学的に定められた培地（CDM）の助け
によりヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）により生成した溶血素生成物に集中して
おり、ここでヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）菌株12864（血清型３）の助け
により得られた細胞外溶血素生成物は比較的簡単な方法
で分離することができる；この論文において発見された
生成物は、実験において、熱不安定性タンパク質である
ように思われ、これはそのときワクチン接種の目的で使
用できない。前記溶血素生成物は出血性肺炎をマウスに
おいて誘発する。
moniae）は、現在ブタにおける気管支の最も重要な疾患
の１つであるとみなされる、ブタにおけるヘモフィルス
・プレウロニューモニアエ（Haemophilus pleuropneumo
nia）の原因である［参照、なかでも、マウズスレイ（M
audsley）J.R.ら、カナディアン・ジャーナル・オブ・
マイクロバイオンジー（Can.J.Microbiol.）32、801−8
05（1986）］。この病気の急性段階の主要な症候は高熱
の発生および広範なフィブリン性出血性壊死のの大葉肺
炎であり、これはフィブリン性胸膜炎を伴う。ヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）
により生成する１または２以上のトキシンは上の病因に
おいて有意の役割を演ずると思われる。よりとくに、超
音波処理した非生存性ヘモフィルス・プレウロニューモ
ニアエ（H.pleuropneumoniae）細胞およびヘモフィルス
・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）の培
地から得られた細胞不含上澄み液の両者をブタに気管支
内投与すると、実験的に感染したブタにおいて起こる肺
炎に相当する局所的肺炎を生ずることが観察された。マ
ウズスレイ（Maudsley）J.R.ら、カナディアン・ジャー
ナル・オブ・マイクロバイオロジー（Can.J.Microbio
l.）32、801−805（1986）の論文は、とくにタンパク質
を含有しない、化学的に定められた培地（CDM）の助け
によりヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）により生成した溶血素生成物に集中して
おり、ここでヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）菌株12864（血清型３）の助け
により得られた細胞外溶血素生成物は比較的簡単な方法
で分離することができる；この論文において発見された
生成物は、実験において、熱不安定性タンパク質である
ように思われ、これはそのときワクチン接種の目的で使
用できない。前記溶血素生成物は出血性肺炎をマウスに
おいて誘発する。
「アメリカ微生物学学会の年次会合の要約（Abstracs o
f the Annual Meetig of American Society for Microb
iology）」、Vol.87、No.0、1987、ページ40、Summary
No.B−19、P.J.フェドルカ（Fedorka）らにおいて、ヘ
モフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumo
niae）血清型１および５からの溶血因子および細胞障害
性因子は、同定され、熱不安定およびpH感受性であった
ことが示されている。それらをブタの肺マクロファージ
またはマウスへ投与後、前記因子は明らかに関連する活
性を示した。この要約の終わりにおいて、これらのビル
レンス因子の分離はワクチン開発や病気の照射を助ける
であろうことが考えられる。しかしながら、ヘモフィル
ス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）の
血清型の主要部分またはすべてを処理することができる
万能（universal）ワクチンに関して、何も述べられて
いず、また示唆されていない。
f the Annual Meetig of American Society for Microb
iology）」、Vol.87、No.0、1987、ページ40、Summary
No.B−19、P.J.フェドルカ（Fedorka）らにおいて、ヘ
モフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumo
niae）血清型１および５からの溶血因子および細胞障害
性因子は、同定され、熱不安定およびpH感受性であった
ことが示されている。それらをブタの肺マクロファージ
またはマウスへ投与後、前記因子は明らかに関連する活
性を示した。この要約の終わりにおいて、これらのビル
レンス因子の分離はワクチン開発や病気の照射を助ける
であろうことが考えられる。しかしながら、ヘモフィル
ス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）の
血清型の主要部分またはすべてを処理することができる
万能（universal）ワクチンに関して、何も述べられて
いず、また示唆されていない。
さらに、「アメリカ微生物学学会の年次会合の要約（Ab
stracs of the Annual Meetig of American Society fo
r Microbiology）」、Vol.88、No.0、1988、ページ35、
Summary No.B−37、P.J.フェドルカ（Fedorka）らにお
いて、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）血清型１から誘導された透析した溶血素
はワクチンの活性成分として適当であることが述べられ
ている。このようなワクチンは、問題の血清型菌株で対
抗後、臨床的病気および肺病理学からの顕著な保護を提
供するであろう。この要約の終わりにおいて、明らか
に、溶血素はヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）誘発病気における保護のための
主要な免疫原であると述べられている。しかしながら、
これに関して、この最後の参考文献において、問題の微
生物の細胞障害性因子またはヘモフィルス・プレウロニ
ューモニアエ（H.pleuropneumoniae）の多くの異なる血
清型に対する万能ワクチンの開発について何も述べられ
ていない。
stracs of the Annual Meetig of American Society fo
r Microbiology）」、Vol.88、No.0、1988、ページ35、
Summary No.B−37、P.J.フェドルカ（Fedorka）らにお
いて、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）血清型１から誘導された透析した溶血素
はワクチンの活性成分として適当であることが述べられ
ている。このようなワクチンは、問題の血清型菌株で対
抗後、臨床的病気および肺病理学からの顕著な保護を提
供するであろう。この要約の終わりにおいて、明らか
に、溶血素はヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）誘発病気における保護のための
主要な免疫原であると述べられている。しかしながら、
これに関して、この最後の参考文献において、問題の微
生物の細胞障害性因子またはヘモフィルス・プレウロニ
ューモニアエ（H.pleuropneumoniae）の多くの異なる血
清型に対する万能ワクチンの開発について何も述べられ
ていない。
ブタにおけるヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）のための適切な治療が要求され
ていることを見て、バクテリアの感染により生ずるこの
病気は地方病の過程および高い死亡率を有するので、本
発明者はヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pl
europneumoniae）の既知の血清型の主要なものおよび有
利にはヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）のすべての血清型の、それぞれ、予防お
よび抑制に適当なワクチンの開発に関する、広範に研究
を実施した。これに関して、現在ヘモフィルス・プレウ
ロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）の12の血清型
が知られているが、これらの血清型の発生は領域の間で
異なる。
（H.pleuropneumoniae）のための適切な治療が要求され
ていることを見て、バクテリアの感染により生ずるこの
病気は地方病の過程および高い死亡率を有するので、本
発明者はヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pl
europneumoniae）の既知の血清型の主要なものおよび有
利にはヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）のすべての血清型の、それぞれ、予防お
よび抑制に適当なワクチンの開発に関する、広範に研究
を実施した。これに関して、現在ヘモフィルス・プレウ
ロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）の12の血清型
が知られているが、これらの血清型の発生は領域の間で
異なる。
驚くべきことには、上の目的は、ヘモフィルス・プレウ
ロニューモニアエ（Haemophilus pleuropneumoniae）の
少なくとも２つの異なる血清型の菌株の培地から誘導さ
れた細胞外タンパク質物質の混合物の有効含量を特徴と
するワクチンにより達成することができることが発見さ
れた。
ロニューモニアエ（Haemophilus pleuropneumoniae）の
少なくとも２つの異なる血清型の菌株の培地から誘導さ
れた細胞外タンパク質物質の混合物の有効含量を特徴と
するワクチンにより達成することができることが発見さ
れた。
とくに、本発明は、一方において血清型１、５、６、９
および11の群から選択される少なくとも１つのヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）
菌株の培地から誘導された細胞外タンパク質物質および
他方において血清型２、３、４および８の群から選択さ
れる少なくとも１つのヘモフィルス・プレウロニューモ
ニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の培地から誘導され
た細胞外タンパク質物質の混合物の有効含量からなるワ
クチンに関する。
および11の群から選択される少なくとも１つのヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）
菌株の培地から誘導された細胞外タンパク質物質および
他方において血清型２、３、４および８の群から選択さ
れる少なくとも１つのヘモフィルス・プレウロニューモ
ニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の培地から誘導され
た細胞外タンパク質物質の混合物の有効含量からなるワ
クチンに関する。
問題の細胞外タンパク質物質は、工程： （ａ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）
が添加されている培地でヘモフィルス・プレウロニュー
モニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株を培養し、 （ｂ）（ａ）において得られたヘモフィルス・プレウロ
ニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の有機体
を、血清および／または血清生成物が濃厚にされてお
り、そしてNADを含有しない培地に移しそして培養し、
そして （ｃ）この培地を滅菌濾過して濾液を得る、ことによっ
て得ることができる。
が添加されている培地でヘモフィルス・プレウロニュー
モニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株を培養し、 （ｂ）（ａ）において得られたヘモフィルス・プレウロ
ニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の有機体
を、血清および／または血清生成物が濃厚にされてお
り、そしてNADを含有しない培地に移しそして培養し、
そして （ｃ）この培地を滅菌濾過して濾液を得る、ことによっ
て得ることができる。
上の方法で得られた濾液は、さらに、工程： （１）問題の濾液を、例えば、少なくとも50重量％の硫
酸アンモニウム溶液のような塩含有溶液と混合すること
によって濃縮し、 （２）工程（１）において得られた沈澱をリン酸塩緩衝
液（PBS）中に溶解し、そして （３）工程（２）において得られた生成物をPBSに対し
て透析して、透析したタンパク質物質を得る、 ことにより、必要に応じて、処理することができる。
酸アンモニウム溶液のような塩含有溶液と混合すること
によって濃縮し、 （２）工程（１）において得られた沈澱をリン酸塩緩衝
液（PBS）中に溶解し、そして （３）工程（２）において得られた生成物をPBSに対し
て透析して、透析したタンパク質物質を得る、 ことにより、必要に応じて、処理することができる。
上の方法において得られた、濾液またはタンパク質物質
は、ブタにおいて抗体を発生することができることが発
見された。その結果、驚くべきことには、本発明により
定義されたタンパク質物質の混合物でワクチン接種され
たブタのヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pl
europneumoniae）により感染に対して免疫となる。
は、ブタにおいて抗体を発生することができることが発
見された。その結果、驚くべきことには、本発明により
定義されたタンパク質物質の混合物でワクチン接種され
たブタのヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pl
europneumoniae）により感染に対して免疫となる。
さらに詳しくは、ヘモフィルス・プレウロニューモニア
エ（Haemophilus pleuropneumoniae）を、上の工程
（ａ）において、例えば、0.1％のニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（NAD、Flucka）を添加した、ヒツ
ジ血液寒天上で培養する。この血液寒天平板を、例え
ば、ほぼ37および±５−10％CO2において６〜８時間イ
ンキュベーションした後、洗浄する。このようにして得
られた有機体を、上の工程（ｂ）において、使用して、
血清または血清生成物を含有するが、NADを含有しない
流体培地に接種する。この全体を約37℃においてインキ
ュベーションする。次いで、接種した培地を、例えば、
濾過により滅菌する。
エ（Haemophilus pleuropneumoniae）を、上の工程
（ａ）において、例えば、0.1％のニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（NAD、Flucka）を添加した、ヒツ
ジ血液寒天上で培養する。この血液寒天平板を、例え
ば、ほぼ37および±５−10％CO2において６〜８時間イ
ンキュベーションした後、洗浄する。このようにして得
られた有機体を、上の工程（ｂ）において、使用して、
血清または血清生成物を含有するが、NADを含有しない
流体培地に接種する。この全体を約37℃においてインキ
ュベーションする。次いで、接種した培地を、例えば、
濾過により滅菌する。
商業的に入手可能なフィルターを使用して、本発明によ
る工程（ｃ）を実施する。それらの例は、0.2μｍの孔
大きさを有するMilles GV 膜フィルターおよび0.45μ
ｍの孔大きさを有するGelman Mini Capsule フィルタ
ーである。
る工程（ｃ）を実施する。それらの例は、0.2μｍの孔
大きさを有するMilles GV 膜フィルターおよび0.45μ
ｍの孔大きさを有するGelman Mini Capsule フィルタ
ーである。
得られた濾液は、必要に応じて、１要領部の飽和塩溶
液、例えば、硫酸アンモニウム溶液を１容量部の濾液に
滴々添加することによって、さらに処理することができ
る。次いで、沈澱を遠心により集める。次いで、得られ
た沈澱をPBS中に溶解し、そしてPBSに対して透析する。
次いで、脱塩した物質をワクチンの調製のため使用する
ことができる。さらに、この透析した物質はその中に存
在する特定のトキシン、例えば、細胞障害性トキシン
（CT）および溶血素トキシン（HT）を特性づけるために
使用することができる。
液、例えば、硫酸アンモニウム溶液を１容量部の濾液に
滴々添加することによって、さらに処理することができ
る。次いで、沈澱を遠心により集める。次いで、得られ
た沈澱をPBS中に溶解し、そしてPBSに対して透析する。
次いで、脱塩した物質をワクチンの調製のため使用する
ことができる。さらに、この透析した物質はその中に存
在する特定のトキシン、例えば、細胞障害性トキシン
（CT）および溶血素トキシン（HT）を特性づけるために
使用することができる。
上のトキシンCTおよび、存在場合、HTの生成の過程は、
工程（ｂ）の接種した培地の試料を、肺マクロファージ
または赤血球とともにインキュベーションすることによ
って決定または監視することができる。例えば、ブタの
肺マクロファージおよびヒツジの赤血球をこの目的に使
用することができる。なおマクロファージの細胞の死ま
たは赤血球の溶解をちょうど生ずる試料の希釈は、培地
中のトキシン濃度の速度である。CTおよびHTの生物学的
活性は、それぞれ、CTにより引き起こされる細胞の死お
よびHTにより引き起こされる赤血球の溶解を意味するこ
とを理解すべきである。
工程（ｂ）の接種した培地の試料を、肺マクロファージ
または赤血球とともにインキュベーションすることによ
って決定または監視することができる。例えば、ブタの
肺マクロファージおよびヒツジの赤血球をこの目的に使
用することができる。なおマクロファージの細胞の死ま
たは赤血球の溶解をちょうど生ずる試料の希釈は、培地
中のトキシン濃度の速度である。CTおよびHTの生物学的
活性は、それぞれ、CTにより引き起こされる細胞の死お
よびHTにより引き起こされる赤血球の溶解を意味するこ
とを理解すべきである。
上の方法において得られた生成物は、次のように特性づ
けられる： １）生物学的性質： PBSに対して透析した生成物は細胞障害活性および、培
養した生成物に依存して、溶血活性を有する。そのう
え、透析した生成物は、ブタに気管支内投与すると、ヘ
モフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumo
niae）有機体により引き起こされる胸膜肺炎と組織学的
に同一に胸膜肺炎を引き起こす。
けられる： １）生物学的性質： PBSに対して透析した生成物は細胞障害活性および、培
養した生成物に依存して、溶血活性を有する。そのう
え、透析した生成物は、ブタに気管支内投与すると、ヘ
モフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumo
niae）有機体により引き起こされる胸膜肺炎と組織学的
に同一に胸膜肺炎を引き起こす。
２）温度： −20℃〜−70℃における透析生成物の48時間の凍結乾燥
は、CT活性および存在しうるHT活性に影響を及ぼさな
い。生成物を120℃で１時間加熱後、ブタの肺マクロフ
ァージにおけるCTの生物学的活性およびヒツジの赤血球
におけるHTの存在しうる活性はもはや検出できない。
は、CT活性および存在しうるHT活性に影響を及ぼさな
い。生成物を120℃で１時間加熱後、ブタの肺マクロフ
ァージにおけるCTの生物学的活性およびヒツジの赤血球
におけるHTの存在しうる活性はもはや検出できない。
３）pH: 室温において２時間のNaOHおよびHClによるpHの変化
は、透析生成物のCTおよび存在しうるHTの不活性化に導
かない。
は、透析生成物のCTおよび存在しうるHTの不活性化に導
かない。
４）タンパク質分解酵素： 透析生成物を37℃において１時間ジスパーゼ（Dyspas
e）II、プロテアーゼ、とともにインキュベーションす
ると、CTおよび存在しうるHTの活性を不活性化する。
e）II、プロテアーゼ、とともにインキュベーションす
ると、CTおよび存在しうるHTの活性を不活性化する。
５）貯蔵寿命： 透析しない生成物および透析した生成物のCTおよび存在
しうるHTの活性は−20℃において数カ月間維持される。
しうるHTの活性は−20℃において数カ月間維持される。
６）CTおよびHTの分子量： 血清型２および９の自然CT/HTは、スーパーロース（Sup
erose）６カラムまたはスーパーロース（Superose）12
カラムで、それぞれ、200kDまたは400kDより多少大き
い、分子量を有する；この差は多分複合体の形成により
生ずる。SDS−pageにおいて、血清型９の精製したCT/HT
は２つのバンドから成り、両者は100±10kDの分子量を
有する。CT/HTはPm30,000アミコンフィルターを通過し
ない。
erose）６カラムまたはスーパーロース（Superose）12
カラムで、それぞれ、200kDまたは400kDより多少大き
い、分子量を有する；この差は多分複合体の形成により
生ずる。SDS−pageにおいて、血清型９の精製したCT/HT
は２つのバンドから成り、両者は100±10kDの分子量を
有する。CT/HTはPm30,000アミコンフィルターを通過し
ない。
７）保護： 透析した生成物でワクチン接種したブタは、CTおよびHT
の活性を中和する抗体を発生する。これらの中和性抗体
をもつブタは、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）培養物で感染後、急性肺炎を発
生しない。
の活性を中和する抗体を発生する。これらの中和性抗体
をもつブタは、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）培養物で感染後、急性肺炎を発
生しない。
前述のように、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）の12の血清型は今日まで知られ
ている。ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pl
europneumoniae）のフィールド（field）菌株の研究
は、トキシン（CTおよび可能ならばHT）の生成における
差が血清型に依存し、そして菌株に依存しないことを示
した。
（H.pleuropneumoniae）の12の血清型は今日まで知られ
ている。ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pl
europneumoniae）のフィールド（field）菌株の研究
は、トキシン（CTおよび可能ならばHT）の生成における
差が血清型に依存し、そして菌株に依存しないことを示
した。
下表Ａは、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.
pleuropneumoniae）の血清型が異なる菌株により生成さ
れた溶血素の、問題の菌株の細胞毒素／溶血素に対する
レイズ（raise）された抗血清による交差中和の結果を
示す。下表Ｂは、ヘモフィルス・プレウロニューモニア
エ（H.pleuropneumoniae）の11の血清型のCTの生成およ
び、上の方法で透析した生成物の助けによりウサギにお
いて発生した、抗血清の助けによる中和力価を示す。
pleuropneumoniae）の血清型が異なる菌株により生成さ
れた溶血素の、問題の菌株の細胞毒素／溶血素に対する
レイズ（raise）された抗血清による交差中和の結果を
示す。下表Ｂは、ヘモフィルス・プレウロニューモニア
エ（H.pleuropneumoniae）の11の血清型のCTの生成およ
び、上の方法で透析した生成物の助けによりウサギにお
いて発生した、抗血清の助けによる中和力価を示す。
血清型１、５、６、９および11の間の交差中和は、明ら
かに、それぞれ、上の表ＡおよびＢから起こるように思
われる。＊血清型６は、それ自体CTを形成しないが、前
記血清型１、５、６、９および11の菌株に属する抗体と
抗血清を生成する。血清型２、３、４および８を使用す
る群は、相互に関係する血清型の第２群として述べられ
る。
かに、それぞれ、上の表ＡおよびＢから起こるように思
われる。＊血清型６は、それ自体CTを形成しないが、前
記血清型１、５、６、９および11の菌株に属する抗体と
抗血清を生成する。血清型２、３、４および８を使用す
る群は、相互に関係する血清型の第２群として述べられ
る。
最後に、血清型７および12の菌株は別の位置を占める。
これらの血清型は、事実、２つの上に示す群、すなわ
ち、１、２、４、５、６、９および11からの抗血清によ
り中和されるが、血清型３、８および10の血清では中和
されない。さらに、血清型７から誘導された抗血清は、
それぞれ、血清型７および12の菌株を中和する。
これらの血清型は、事実、２つの上に示す群、すなわ
ち、１、２、４、５、６、９および11からの抗血清によ
り中和されるが、血清型３、８および10の血清では中和
されない。さらに、血清型７から誘導された抗血清は、
それぞれ、血清型７および12の菌株を中和する。
要約すると、上の表Ａおよびｂから、２つの上に述べた
血清型、すなわち、一方において、血清型１、５、６、
９および11および、他方において、血清型２、３、４お
よび８から構成されたワクチンは、すべての血清型に有
用である、中和作用を発生させることを引き出すことが
できる。したがって、本発明は、上の方法において得ら
れた、一方において血清型１、５、６、９および11の群
から、例えば、血清型９から選択される少なくとも１つ
のヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropn
eumoniae）菌株の培地から誘導された細胞外タンパク質
物質および他方において血清型２、３、４および８の群
から、例えば、血清型８から選択される少なくとも１つ
のヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropn
eumoniae）菌株の培地から誘導された細胞外タンパク質
物質の組み合わせに基づく、ワクチンに関する。
血清型、すなわち、一方において、血清型１、５、６、
９および11および、他方において、血清型２、３、４お
よび８から構成されたワクチンは、すべての血清型に有
用である、中和作用を発生させることを引き出すことが
できる。したがって、本発明は、上の方法において得ら
れた、一方において血清型１、５、６、９および11の群
から、例えば、血清型９から選択される少なくとも１つ
のヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropn
eumoniae）菌株の培地から誘導された細胞外タンパク質
物質および他方において血清型２、３、４および８の群
から、例えば、血清型８から選択される少なくとも１つ
のヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropn
eumoniae）菌株の培地から誘導された細胞外タンパク質
物質の組み合わせに基づく、ワクチンに関する。
したがって、上から理解されるように、上に示す組み合
わせの助けにより、今日まで研究したすべての血清型、
すなわち、血清型１〜12に対して作用を有するワクチン
を開発することが可能であり、こうして本発明は事実上
万能に適用できるワクチンを提供する。
わせの助けにより、今日まで研究したすべての血清型、
すなわち、血清型１〜12に対して作用を有するワクチン
を開発することが可能であり、こうして本発明は事実上
万能に適用できるワクチンを提供する。
この分野における技術水準から知られている方法および
物質は本発明による調製法を実施するために適当であ
る。さらに詳しくは、「化学的に定義される培地」（CD
M）、その組成は前述の参考文献、カナディアン・ジャ
ーナル・オブ・マイクロバイオロジー（Can.J.Microbio
l.）32、802（1986）に報告されている、を本発明によ
る上に報告した方法の工程（ａ）において成長培地とし
て使用することができる。他の成長培地は、0.6％の酵
母エキスを含むトリプチカーゼー大豆寒天（TSBYE）お
よび５％の脱フィブリンしたヒツジ血液を補充した心臓
浸出寒天［ディフコ（Difco）］（HIS）である。
物質は本発明による調製法を実施するために適当であ
る。さらに詳しくは、「化学的に定義される培地」（CD
M）、その組成は前述の参考文献、カナディアン・ジャ
ーナル・オブ・マイクロバイオロジー（Can.J.Microbio
l.）32、802（1986）に報告されている、を本発明によ
る上に報告した方法の工程（ａ）において成長培地とし
て使用することができる。他の成長培地は、0.6％の酵
母エキスを含むトリプチカーゼー大豆寒天（TSBYE）お
よび５％の脱フィブリンしたヒツジ血液を補充した心臓
浸出寒天［ディフコ（Difco）］（HIS）である。
さらに、参考文献から知られている菌株、例えば、ATOC
27088（血清型１）を本発明による方法において使用
することができる。この研究において使用するヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）
菌株は、本発明者により追跡したか、あるいはこの分野
における研究所から入手した。さらに詳しくは、菌株Sh
ope4074、1536、1421（ATCC 27090）、M62（ATCC 333
78）およびK17（ATCC 33377）、これらは血清型１〜５
の参照菌株であり、J.ニコレット（Nicolet）（ベルン
大学、スイス国）から入手した、菌株FemΦ、これは血
清型６の参照菌株であり、R.ニエルセン（Nielsen）（S
tate Veterinary Serum Laboratory、デンマーク国コペ
ンハーゲン）から入手した（ATCC 33590）、菌株WF8
3、これは血清型７の参照菌株であり、S.ロウゼンダル
（Rosendal）（Dept.Vet.Microbiol.、グエルフ大学、
オンタリオ州グエルフ）、菌株405、D13039および832
9、これらは血清型８、10および12の参照菌株であり、
R.ニエルセン（Nielsen）（State Veterinary Serum La
boratory、デンマーク国コペンハーゲン）から入手し
た、および菌株13261および56153、これらは血清型９お
よび11の参照菌株であり、本発明者から得た。特定の血
清型への血清型の分類は、一般に、この分野において知
られている。そこに示されている１つは、ベテリナリー
・マイクロバイオロジー（Veterinary Microbiolgy）、
13、249−257（1987）に記載されるている。
27088（血清型１）を本発明による方法において使用
することができる。この研究において使用するヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）
菌株は、本発明者により追跡したか、あるいはこの分野
における研究所から入手した。さらに詳しくは、菌株Sh
ope4074、1536、1421（ATCC 27090）、M62（ATCC 333
78）およびK17（ATCC 33377）、これらは血清型１〜５
の参照菌株であり、J.ニコレット（Nicolet）（ベルン
大学、スイス国）から入手した、菌株FemΦ、これは血
清型６の参照菌株であり、R.ニエルセン（Nielsen）（S
tate Veterinary Serum Laboratory、デンマーク国コペ
ンハーゲン）から入手した（ATCC 33590）、菌株WF8
3、これは血清型７の参照菌株であり、S.ロウゼンダル
（Rosendal）（Dept.Vet.Microbiol.、グエルフ大学、
オンタリオ州グエルフ）、菌株405、D13039および832
9、これらは血清型８、10および12の参照菌株であり、
R.ニエルセン（Nielsen）（State Veterinary Serum La
boratory、デンマーク国コペンハーゲン）から入手し
た、および菌株13261および56153、これらは血清型９お
よび11の参照菌株であり、本発明者から得た。特定の血
清型への血清型の分類は、一般に、この分野において知
られている。そこに示されている１つは、ベテリナリー
・マイクロバイオロジー（Veterinary Microbiolgy）、
13、249−257（1987）に記載されるている。
次の実施例によって、本発明をさらに説明する。
実施例Ｉ 工程（ａ） 接種物の調製 ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneu
moniae）菌株13261を、0.1％のニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（NAD）を補充したヒツジ血液寒天（SB
V）上で培養した。SBV平板を５％のCO2および37℃にお
いて６時間インキュベーションした。その後、平板を5m
lのイーグル塩類を含むイーグル最小必須培地（EMEM）
ですすぎ、そして得られるバクテリア懸濁液を４℃にお
いて一夜貯蔵し、次いでこれを次の日に使用した。コロ
ニー形成単位（CFU）の数を、SBV上でバクテリア懸濁液
の10倍希釈物をインキュベーションすることによって決
定した。
moniae）菌株13261を、0.1％のニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（NAD）を補充したヒツジ血液寒天（SB
V）上で培養した。SBV平板を５％のCO2および37℃にお
いて６時間インキュベーションした。その後、平板を5m
lのイーグル塩類を含むイーグル最小必須培地（EMEM）
ですすぎ、そして得られるバクテリア懸濁液を４℃にお
いて一夜貯蔵し、次いでこれを次の日に使用した。コロ
ニー形成単位（CFU）の数を、SBV上でバクテリア懸濁液
の10倍希釈物をインキュベーションすることによって決
定した。
工程（ｂ） 細胞毒素および溶血素（HT）の生成工程は、次のように
実施した。
実施した。
表Ｃに示すような12倍地を、２×108CFU/mlのヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）
13261とともにインキュベーションした。培養物を37℃
において震盪インキュベーター内で６時間インキュベー
ションした。
ルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）
13261とともにインキュベーションした。培養物を37℃
において震盪インキュベーター内で６時間インキュベー
ションした。
工程（ｃ） バクテリアの倍地の滅菌濾過 バクテリア懸濁液の遠心（10分、800×ｇ）後、懸濁液
はフィルター（0.2μm;Gelman）の助けにより滅菌し、
次いでCTおよびHTの力価を決定した。CTの力価は、窒素
ですべての肺胞のマクロファージの希釈物を着色する、
上澄み液の最大希釈の逆数の値として表し、そしてHTの
力価は50％のSRBC（ヒツジ赤血球）を溶血する最大希釈
の逆数の値として表した。
はフィルター（0.2μm;Gelman）の助けにより滅菌し、
次いでCTおよびHTの力価を決定した。CTの力価は、窒素
ですべての肺胞のマクロファージの希釈物を着色する、
上澄み液の最大希釈の逆数の値として表し、そしてHTの
力価は50％のSRBC（ヒツジ赤血球）を溶血する最大希釈
の逆数の値として表した。
CTおよびHTの生成工程（工程ｂ）において使用した２×
108CFU/mlのヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）13261を、第１図に示すよう
に、CTおよびHTの生成について、接続した。この図面か
ら明らかなように、109CFU/mlより多いバクテリア懸濁
液を使用するインキュベーションはより高いトキシンの
生成を生じない。
108CFU/mlのヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）13261を、第１図に示すよう
に、CTおよびHTの生成について、接続した。この図面か
ら明らかなように、109CFU/mlより多いバクテリア懸濁
液を使用するインキュベーションはより高いトキシンの
生成を生じない。
上の表Ｃから明らかなように、血清または血清生成物で
濃縮したが、NADを含有しない培地は、さらに最高のCT
およびHTの力価を与えた；これらの力価は、ヘモフィル
ス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）に
対して有効なワクチンが、必要に応じて濃縮物をさらに
処理した後、得られた上澄み液から調製することができ
るような値を有する。
濃縮したが、NADを含有しない培地は、さらに最高のCT
およびHTの力価を与えた；これらの力価は、ヘモフィル
ス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）に
対して有効なワクチンが、必要に応じて濃縮物をさらに
処理した後、得られた上澄み液から調製することができ
るような値を有する。
本発明による上の方法は、表ＡおよびＢの記載する血清
型１〜12の他の菌株を使用して反復した。しかしなが
ら、これらの試験は、本発明による方法により培養され
たすべての菌株（血清型６の菌株FemΦを除く）は細胞
毒素を生成したが、溶血素の生成は血清型１、５、９、
10および11の菌株の場合においてのみ観察することがで
きることを示した。
型１〜12の他の菌株を使用して反復した。しかしなが
ら、これらの試験は、本発明による方法により培養され
たすべての菌株（血清型６の菌株FemΦを除く）は細胞
毒素を生成したが、溶血素の生成は血清型１、５、９、
10および11の菌株の場合においてのみ観察することがで
きることを示した。
実施例II この実施例は、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）に対する本発明によるワクチン
でワクチン接種したSPFブタの免疫性を示す。
（H.pleuropneumoniae）に対する本発明によるワクチン
でワクチン接種したSPFブタの免疫性を示す。
工程（ａ） 接種の調製 ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneu
moniae）菌株13261を、0.1％のニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（NAD）を補充したヒツジ血液寒天（SB
V）上で培養した。SBV平板を５％のCO2および37℃にお
いて６時間インキュベーションした。その後、平板を5m
lのイーグル塩類を含むイーグル最小必須培地（EMEM）
ですすぎ、そして得られるバクテリア懸濁液を４℃にお
いて一夜貯蔵し、次いでこれを次の日に使用した。
moniae）菌株13261を、0.1％のニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（NAD）を補充したヒツジ血液寒天（SB
V）上で培養した。SBV平板を５％のCO2および37℃にお
いて６時間インキュベーションした。その後、平板を5m
lのイーグル塩類を含むイーグル最小必須培地（EMEM）
ですすぎ、そして得られるバクテリア懸濁液を４℃にお
いて一夜貯蔵し、次いでこれを次の日に使用した。
工程（ｂ） トキシン生成工程 血清プラス（Serm Plus）（Hazleton Research Product
s Inc.、米国カンサス州レネクサ）を、24時間連続的に
攪拌しながら、EMEM（v/v9:1）に対して透析した。2.5
％の血清プラスをコンディショニングしたEMEMに添加
し、そして接種を工程（ａ）に従いバクテリア懸濁液の
２×108CFU/mlを使用して実施した。培養物を37℃にお
いて６時間インキュベーションした。次いで、培養物を
遠心し（15分、×4000g）、次いで等しい体積の飽和硫
酸アンモニウム溶液を上澄み液にゆっくり添加した。上
澄み液を４℃において連続的に攪拌しながら一夜貯蔵
し、次の日に遠心した（60分×8000g）。沈澱をリン酸
塩緩衝液（PBS;0.123モルのNaCl、0.01モルのNa2HPO4、
0.032モルのKH2PO4;pH7.2）中に溶解し、そしてPBSに対
して24時間透析し、濾過して（Gelman 0.2μｍ）無菌
の生成物を得、これを最後に油中で乳化した（v/v 1:
1）。
s Inc.、米国カンサス州レネクサ）を、24時間連続的に
攪拌しながら、EMEM（v/v9:1）に対して透析した。2.5
％の血清プラスをコンディショニングしたEMEMに添加
し、そして接種を工程（ａ）に従いバクテリア懸濁液の
２×108CFU/mlを使用して実施した。培養物を37℃にお
いて６時間インキュベーションした。次いで、培養物を
遠心し（15分、×4000g）、次いで等しい体積の飽和硫
酸アンモニウム溶液を上澄み液にゆっくり添加した。上
澄み液を４℃において連続的に攪拌しながら一夜貯蔵
し、次の日に遠心した（60分×8000g）。沈澱をリン酸
塩緩衝液（PBS;0.123モルのNaCl、0.01モルのNa2HPO4、
0.032モルのKH2PO4;pH7.2）中に溶解し、そしてPBSに対
して24時間透析し、濾過して（Gelman 0.2μｍ）無菌
の生成物を得、これを最後に油中で乳化した（v/v 1:
1）。
工程（ｃ） ブタのワクチン接種 特定の病原性不含（SPF）ブタ［交差飼育した（cross−
bred）グレートヨークシャイヤー×ダッチ・ランドレー
ス］の生後６週を、ワクチン接種試験に使用した。この
試験において、６頭のブタを筋肉内に６週および10週に
ワクチン接種し、一方４頭のブタを対照運動として使用
した。感染の４日前に、12週において、ブタを耳の静脈
中にカテーテル挿入して、頻繁な血液の試料採取を可能
とする。血液試料を各耳のカテーテルから排気したEDT
A、Liヘパリンおよび血清の管中にあつめた。試料はブ
タからワクチン接種前に、接種に先行する４日間２回／
日で、そして接種後（PIH）０、２、４、６、９、12、1
8、24、30、36、42および48時間に採取した。ブタの体
温は、血液試料を採取するときおよびブタを臨床的症候
について検査するとき、決定した。接種後48時間に、ブ
タをバルビツール酸塩の静脈内注射により殺し、そして
直ち検死した。
bred）グレートヨークシャイヤー×ダッチ・ランドレー
ス］の生後６週を、ワクチン接種試験に使用した。この
試験において、６頭のブタを筋肉内に６週および10週に
ワクチン接種し、一方４頭のブタを対照運動として使用
した。感染の４日前に、12週において、ブタを耳の静脈
中にカテーテル挿入して、頻繁な血液の試料採取を可能
とする。血液試料を各耳のカテーテルから排気したEDT
A、Liヘパリンおよび血清の管中にあつめた。試料はブ
タからワクチン接種前に、接種に先行する４日間２回／
日で、そして接種後（PIH）０、２、４、６、９、12、1
8、24、30、36、42および48時間に採取した。ブタの体
温は、血液試料を採取するときおよびブタを臨床的症候
について検査するとき、決定した。接種後48時間に、ブ
タをバルビツール酸塩の静脈内注射により殺し、そして
直ち検死した。
感染は気管支内接種により行った。ここで、ブタをジア
ゼパム（Hoffman La Roche）で気絶させ、そして頭を垂
直位置にした。引き続いて、カテーテル（Cordis Europ
a N.V.、オランダ国）を、喉頭を通して、気管支中に挿
入し、次いで10mlの103CFUのヘモフィルス・プレウロニ
ューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株13261を含有
する接種液体をゆっくり注射した。次いで、カテーテル
を急速に除去し、そしてブタの喉をマッサージしてせき
を防止した。
ゼパム（Hoffman La Roche）で気絶させ、そして頭を垂
直位置にした。引き続いて、カテーテル（Cordis Europ
a N.V.、オランダ国）を、喉頭を通して、気管支中に挿
入し、次いで10mlの103CFUのヘモフィルス・プレウロニ
ューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株13261を含有
する接種液体をゆっくり注射した。次いで、カテーテル
を急速に除去し、そしてブタの喉をマッサージしてせき
を防止した。
結果 103CFUのヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pl
europneumoniae）菌株13261の気管支内接種後、ワクチ
ン接種しないすべてのブタは影響を受け、そしてPIH9か
ら呼吸困難を示したが、ワクチン接種したブタは臨床的
病気の症候を示さなかった。
europneumoniae）菌株13261の気管支内接種後、ワクチ
ン接種しないすべてのブタは影響を受け、そしてPIH9か
ら呼吸困難を示したが、ワクチン接種したブタは臨床的
病気の症候を示さなかった。
熱を発生しなかったワクチン接種したブタと対照的に、
ワクチン接種しないブタはPIH12において熱のピークに
到達した（第２図参照）。
ワクチン接種しないブタはPIH12において熱のピークに
到達した（第２図参照）。
ワクチン接種したブタは、ヘモフィルス・プレウロニュ
ーモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株13261の溶血素
および細胞毒素に対する中和性抗体を発生した。
ーモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株13261の溶血素
および細胞毒素に対する中和性抗体を発生した。
検死において、すべてのワクチン接種しないブタは、ほ
ぼ75gの肺の右横隔膜葉の急性フィブリン性壊死性胸膜
肺炎を示した。ワクチン接種したブタのいずれも、接種
部位において出血の病巣をもつ局所的カタル性肺炎を発
生した１頭のブタを除外して、肺炎を発生しなかった。
ワクチン接種した部位において頚筋肉中の硬化または他
の異常は観察されなかった。
ぼ75gの肺の右横隔膜葉の急性フィブリン性壊死性胸膜
肺炎を示した。ワクチン接種したブタのいずれも、接種
部位において出血の病巣をもつ局所的カタル性肺炎を発
生した１頭のブタを除外して、肺炎を発生しなかった。
ワクチン接種した部位において頚筋肉中の硬化または他
の異常は観察されなかった。
以上のことから明らかなように、細胞毒素および溶血素
でワクチン接種したブタは、103CFUのヘモフィルス・プ
レウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株1326
1の感染に対して保護された。これと対照的に、全細胞
ワクチンまたはヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）のカプセル抽出物を有するワク
チンで接種したブタの免疫化は、相同感染に対して完全
な保護を提供しない［ロウセンダル（Rosendal）S.ら、
ブタにおけるヘモフィルス・プレウロニューモニアエの
カプセル抽出物の保護的効能（Protective efficacy of
capsule extracts Hasmophilus pleuropneumoniae in
pigs）、Vet.Microbiol.、12、ページ229−240］。
でワクチン接種したブタは、103CFUのヘモフィルス・プ
レウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株1326
1の感染に対して保護された。これと対照的に、全細胞
ワクチンまたはヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）のカプセル抽出物を有するワク
チンで接種したブタの免疫化は、相同感染に対して完全
な保護を提供しない［ロウセンダル（Rosendal）S.ら、
ブタにおけるヘモフィルス・プレウロニューモニアエの
カプセル抽出物の保護的効能（Protective efficacy of
capsule extracts Hasmophilus pleuropneumoniae in
pigs）、Vet.Microbiol.、12、ページ229−240］。
要約すると、本発明によるヘモフィルス・プレウロニュ
ーモニアエ（H.pleuropneumoniae）ワクチンの効能は、
ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneu
moniae）トキシンに対する中和性抗体を発生するが、血
清特異的抗原性質に対する抗体を発生しないという能力
に基づくと結論することができる。
ーモニアエ（H.pleuropneumoniae）ワクチンの効能は、
ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneu
moniae）トキシンに対する中和性抗体を発生するが、血
清特異的抗原性質に対する抗体を発生しないという能力
に基づくと結論することができる。
本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。
１、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（Haemophi
lus pleuropneumoniae）の少なくとも２つの異なる血清
型の菌株の培地から誘導された細胞外タンパク質物質の
混合物の有効含量を特徴とする、ブタにおけるヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（Haemophilus pleuropn
eumoniae）の予防および抑制に適当な万能ワクチン。
lus pleuropneumoniae）の少なくとも２つの異なる血清
型の菌株の培地から誘導された細胞外タンパク質物質の
混合物の有効含量を特徴とする、ブタにおけるヘモフィ
ルス・プレウロニューモニアエ（Haemophilus pleuropn
eumoniae）の予防および抑制に適当な万能ワクチン。
２、一方において血清型１、５、６、９および11の群か
ら選択される少なくとも１つのヘモフィルス・プレウロ
ニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の培地から
誘導された細胞外タンパク質物質および他方において血
清型２、３、４および８の群から選択される少なくとも
１つのヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）菌株の培地から誘導された細胞外タンパ
ク質物質の混合物の有効含量を特徴とする、上記第１項
記載の万能ワクチン。
ら選択される少なくとも１つのヘモフィルス・プレウロ
ニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の培地から
誘導された細胞外タンパク質物質および他方において血
清型２、３、４および８の群から選択される少なくとも
１つのヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）菌株の培地から誘導された細胞外タンパ
ク質物質の混合物の有効含量を特徴とする、上記第１項
記載の万能ワクチン。
３、問題の少なくとも２つのヘモフィルス・プレウロニ
ューモニアエ（Haemophilus pleuropneumoniae）の血清
型の菌株の培地の滅菌濾過により得られた細胞外タンパ
ク質物質の有効含量を特徴とする、上記第１または２項
記載の万能ワクチン。
ューモニアエ（Haemophilus pleuropneumoniae）の血清
型の菌株の培地の滅菌濾過により得られた細胞外タンパ
ク質物質の有効含量を特徴とする、上記第１または２項
記載の万能ワクチン。
４、工程： （ａ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）
が添加されている培地でヘモフィルス・プレウロニュー
モニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株を培養し、 （ｂ）（ａ）において得られたヘモフィルス・プレウロ
ニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の有機体
を、血清および／または血清生成物が濃厚にされてお
り、そしてNADを含有しない培地に移しそして培養し、
そして （ｃ）この培地を滅菌濾過して濾液を得る、ことを特徴
とする、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（Haem
ophilus pleuropneumoniae）菌株の細胞外タンパク質物
質を得る方法。
が添加されている培地でヘモフィルス・プレウロニュー
モニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株を培養し、 （ｂ）（ａ）において得られたヘモフィルス・プレウロ
ニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の有機体
を、血清および／または血清生成物が濃厚にされてお
り、そしてNADを含有しない培地に移しそして培養し、
そして （ｃ）この培地を滅菌濾過して濾液を得る、ことを特徴
とする、ヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（Haem
ophilus pleuropneumoniae）菌株の細胞外タンパク質物
質を得る方法。
５、血清型１、２、３、４、５、６、８、９および11か
ら選択されるヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）菌株を工程（ａ）において使用
することを特徴とする、上記第４項記載の方法。
ら選択されるヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）菌株を工程（ａ）において使用
することを特徴とする、上記第４項記載の方法。
６、工程（ａ）および／または（ｂ）において示すイン
キュベーションを30〜40℃の範囲、好ましくは37℃の温
度において実施することを特徴とする、上記第４または
５項記載の方法。
キュベーションを30〜40℃の範囲、好ましくは37℃の温
度において実施することを特徴とする、上記第４または
５項記載の方法。
７、工程： （１）問題の濾液を、例えば、少なくとも50重量％の硫
酸アンモニウム溶液のような塩含有溶液と混合すること
によって濃縮し、 （２）工程（１）において得られた沈澱をリン酸塩緩衝
液（PBS）中に溶解し、そして （３）工程（２）において得られた生成物をPBSに対し
て透析して、透析したタンパク質物質を得る、 ことを特徴とする、上記第４〜６項のいずれかに記載の
方法により得られた濾液を処理する方法。
酸アンモニウム溶液のような塩含有溶液と混合すること
によって濃縮し、 （２）工程（１）において得られた沈澱をリン酸塩緩衝
液（PBS）中に溶解し、そして （３）工程（２）において得られた生成物をPBSに対し
て透析して、透析したタンパク質物質を得る、 ことを特徴とする、上記第４〜６項のいずれかに記載の
方法により得られた濾液を処理する方法。
８、飽和硫酸アンモニウム溶液を工程（１）において使
用することを特徴とする、上記第７項記載の方法。
用することを特徴とする、上記第７項記載の方法。
９、上記第４〜８項のいずれかに記載の方法により得ら
れ、一方において血清型１、５、６、９および11の群か
ら選択される少なくとも１つのヘモフィルス・プレウロ
ニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株および他方
において血清型２、３、４および８の群から選択される
少なくとも１つのヘモフィルス・プレウロニューモニア
エ（H.pleuropneumoniae）菌株の培地から誘導されたタ
ンパク質物質の混合物の有効含量を特徴とする、ブタに
おいてヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）の予防および抑制に適当なワクチン。
れ、一方において血清型１、５、６、９および11の群か
ら選択される少なくとも１つのヘモフィルス・プレウロ
ニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株および他方
において血清型２、３、４および８の群から選択される
少なくとも１つのヘモフィルス・プレウロニューモニア
エ（H.pleuropneumoniae）菌株の培地から誘導されたタ
ンパク質物質の混合物の有効含量を特徴とする、ブタに
おいてヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）の予防および抑制に適当なワクチン。
第１図は、107〜109CFU/mlのヘモフィルス・プレウロニ
ューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株のバクテリア
懸濁液とともにインキュベーションすることによるCTお
よびHTの産生のグラフである。 第２図は、103CFUのヘモフィルス・プレウロニューモニ
アエ（H.pleuropneumoniae）菌株13261による気管支内
の感染後の、ワクチン接種および非ワクチン接種のブタ
の直腸の温度（±SEM）のグラフである。 第３図は、ワクチン接種および非ワクチン接種のブタに
おけるヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）菌株13261の溶血素に対する中和性抗体
のグラフである。 第４図は、ワクチン接種および非ワクチン接種のブタに
おけるヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）菌株13261の細胞毒素に対する中和性抗
体のグラフである。
ューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株のバクテリア
懸濁液とともにインキュベーションすることによるCTお
よびHTの産生のグラフである。 第２図は、103CFUのヘモフィルス・プレウロニューモニ
アエ（H.pleuropneumoniae）菌株13261による気管支内
の感染後の、ワクチン接種および非ワクチン接種のブタ
の直腸の温度（±SEM）のグラフである。 第３図は、ワクチン接種および非ワクチン接種のブタに
おけるヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）菌株13261の溶血素に対する中和性抗体
のグラフである。 第４図は、ワクチン接種および非ワクチン接種のブタに
おけるヘモフィルス・プレウロニューモニアエ（H.pleu
ropneumoniae）菌株13261の細胞毒素に対する中和性抗
体のグラフである。
フロントページの続き (56)参考文献 Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａ ｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ａｍ ｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．88, Ｎｏ．０，1988，ｐａｇｅ35，Ｓｕｍｍａ ｒｙ Ｎｏ．Ｂ−37
Claims (6)
- 【請求項１】一方において血清型１、５、６、９および
11の群から選択される少なくとも１つのヘモフィルス・
プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の
培地から誘導された細胞外タンパク質物質および他方に
おいて血清型２、３、４および８の群から選択される少
なくとも１つのヘモフィルス・プレウロニューモニアエ
（H.pleuropneumoniae）菌株の培地から誘導された細胞
外タンパク質物質の混合物を有効量含むことを特徴とす
る、ブタにおけるヘモフィルス・プレウロニューモニア
エ（Haemophilus pleuropneumoniae）の予防および抑制
に適する万能ワクチン。 - 【請求項２】（ａ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（NAD）が添加された培地で血清型１、２、３、
４、５、６、８、９および11から選択されるヘモフィル
ス・プレウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌
株を培養し、 （ｂ）（ａ）において得られたヘモフィルス・プレウロ
ニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の有機体
を、血清および／または血清生成物が富化されており、
そしてNADを含有しない培地に移して培養し、 （ｃ）この培地を滅菌濾過して濾液を得て細胞外タンパ
ク質物質を提供し、そして （ｄ）一方において血清型１、５、６、９および11の群
から選択される少なくとも１つのヘモフィルス・プレウ
ロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株および他
方において血清型２、３、４および８の群から選択され
る少なくとも１つのヘモフィルス・プレウロニューモニ
アエ（H.pleuropneumoniae）菌株の培地から誘導された
細胞外タンパク質物質を組み合わせる、 ことを特徴とする請求項１記載のワクチンの製造方法。 - 【請求項３】工程（ａ）および／または（ｂ）の培養が
30〜40℃の温度で実施されることを特徴とする請求項２
記載の製造方法。 - 【請求項４】請求項２に記載の方法によって得られる濾
液の処理方法であって、 （１）問題の濾液を一定の塩含有溶液と混合することに
より沈殿を形成させてその濾液を濃縮し、 （２）（１）で得られた沈殿をリン酸緩衝生理食塩溶液
（PBS）に溶解し、そして （３）（２）で得られた生成物をPBSに対して透析して
透析タンパク質物質を提供する、 ことを特徴とする処理方法。 - 【請求項５】工程（１）で飽和硫酸アンモニウム溶液が
使用されることを特徴とする請求項４記載の処理方法。 - 【請求項６】請求項２〜５項のいずかに記載の方法によ
り得られ、一方において血清型１、５、６、９および11
の群から選択される少なくとも１つのヘモフィルス・プ
レウロニューモニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株およ
び他方において血清型２、３、４および８の群から選択
される少なくとも１つのヘモフィルス・プレウロニュー
モニアエ（H.pleuropneumoniae）菌株の培地から誘導さ
れた細胞外タンパク質物質の混合物を有効量含むことを
特徴とする、ブタにおいてヘモフィルス・プレウロニュ
ーモニアエ（H.pleuropneumoniae）の予防および抑制に
適するワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8802007A NL8802007A (nl) | 1988-08-12 | 1988-08-12 | Vaccin, geschikt voor de profylaxe respectievelijk de bestrijding van de door haemophilus pleuropneumoniae teweeggebrachte ziekte bij varkens alsmede werkwijze voor het winnen van extracellulair eiwitachtig materiaal van haemophilus pleuropneumonie, geschikt voor toepassing in dergelijke vaccins. |
| NL8802007 | 1988-08-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02152930A JPH02152930A (ja) | 1990-06-12 |
| JPH0725697B2 true JPH0725697B2 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=19852751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1209519A Expired - Fee Related JPH0725697B2 (ja) | 1988-08-12 | 1989-08-11 | ワクチンおよび方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5254340A (ja) |
| EP (1) | EP0354628B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0725697B2 (ja) |
| AR (1) | AR243385A1 (ja) |
| AT (1) | ATE103816T1 (ja) |
| CA (1) | CA1334388C (ja) |
| DE (1) | DE68914362T2 (ja) |
| DK (1) | DK394889A (ja) |
| ES (1) | ES2055010T3 (ja) |
| NL (1) | NL8802007A (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5641653A (en) * | 1989-10-31 | 1997-06-24 | The Texas A&M University System | DNA encoding Actinobacillus pleuropneumoniae hemolysin |
| EP0453024B1 (en) * | 1990-04-20 | 1995-05-31 | Akzo Nobel N.V. | Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine |
| KR100258772B1 (ko) * | 1990-12-19 | 2000-08-01 | 피터씨.리챠드슨 | 돼지의 흉막폐염 백신 조성물 |
| US5994525A (en) * | 1991-06-28 | 1999-11-30 | Kamp; Elbarte Margriet | Nucleic acid encoding Actinobacillus pleuropneumoniae cytolytic proteins |
| JPH05262666A (ja) * | 1992-03-24 | 1993-10-12 | Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | 豚胸膜肺炎多価ワクチン |
| US7008790B1 (en) * | 1993-08-12 | 2006-03-07 | Classen Immunotherapies, Inc. | Method and composition for an early vaccine to protect against both common infectious diseases and chronic immune mediated disorders or their sequelae |
| US5728385A (en) * | 1993-08-12 | 1998-03-17 | Classen Immunotherapies, Inc. | Method and composition for an early vaccine to protect against both common infectious diseases and chronic immune mediated disorders or their sequelae |
| US5925354A (en) | 1995-11-30 | 1999-07-20 | Michigan State University | Riboflavin mutants as vaccines against Actinobacillus pleuropneumoniae |
| CN116350641B (zh) * | 2023-02-07 | 2024-09-24 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 桧木醇与磺胺异恶唑组合物及其在抑制细菌中的应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK138379A (da) * | 1979-04-04 | 1980-10-05 | Nordisk Droge & Kemikalie | Vaccine imod pleuropneumonia (ondartet lungesyge) hos svin dens anvendelse samt fremgangsmaade og substat til dyrkning specielt aerob fermentering af mikroorganismen haemophilus pleuropneumoniae |
-
1988
- 1988-08-12 NL NL8802007A patent/NL8802007A/nl not_active Application Discontinuation
-
1989
- 1989-08-10 CA CA000607962A patent/CA1334388C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-08-11 ES ES89202080T patent/ES2055010T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-11 DE DE68914362T patent/DE68914362T2/de not_active Revoked
- 1989-08-11 JP JP1209519A patent/JPH0725697B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-08-11 AT AT89202080T patent/ATE103816T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-08-11 AR AR89314639A patent/AR243385A1/es active
- 1989-08-11 DK DK394889A patent/DK394889A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-08-11 EP EP89202080A patent/EP0354628B1/en not_active Revoked
- 1989-08-11 US US07/392,781 patent/US5254340A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＡｂｓｔｒａｃｔｓｏｆｔｈｅＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．８８，Ｎｏ．０，１９８８，ｐａｇｅ３５，ＳｕｍｍａｒｙＮｏ．Ｂ−３７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE68914362T2 (de) | 1994-10-20 |
| AR243385A1 (es) | 1993-08-31 |
| CA1334388C (en) | 1995-02-14 |
| EP0354628B1 (en) | 1994-04-06 |
| DE68914362D1 (de) | 1994-05-11 |
| DK394889A (da) | 1990-02-13 |
| NL8802007A (nl) | 1990-03-01 |
| ATE103816T1 (de) | 1994-04-15 |
| ES2055010T3 (es) | 1994-08-16 |
| JPH02152930A (ja) | 1990-06-12 |
| EP0354628A1 (en) | 1990-02-14 |
| US5254340A (en) | 1993-10-19 |
| DK394889D0 (da) | 1989-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Guinée et al. | Escherichia coli associated with neonatal diarrhoea in piglets and calves | |
| Sato et al. | Role of pili in the pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa burn infection | |
| Bowdre et al. | Edema and hemoconcentration in mice experimentally infected with Vibrio vulnificus | |
| Njoku-Obi et al. | Production and nature of Listeria monocytogenes hemolysins | |
| Inzana et al. | Characterization of a non-hemolytic mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5: role of the 110 kilodalton hemolysin in virulence and immunoprotection | |
| JPH0725697B2 (ja) | ワクチンおよび方法 | |
| JPH0764752B2 (ja) | 酵素−洗浄剤抽出ストレプトコツカス・エクイワクチンの調製方法 | |
| Lopez-Alvarez et al. | Occurrence of the Vir plasmid among animal and human strains of invasive Escherichia coli | |
| Preston et al. | Experimental pertussis infection in the rabbit: similarities with infection in primates | |
| Gaastra et al. | Isolation and characterisation of dog uropathogenic Proteus mirabilis strains | |
| Lallier et al. | Antigenic differentiation of pili from non-virulent and fish-pathogenic strains of Aeromonas hydrophila. | |
| Cary et al. | Slide agglutination technique for the rapid differentiation of Mima polymorpha and Herellea from the Neisseriae | |
| Baloda et al. | Cell-Surface Properties of Enterotoxigenic and Cytotoxic Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium Studies on Hemagglutination, Cell-Surface Hydrophobicity, Attachment to Human Intestinal Cells and Fibronectin-Binding | |
| Pollitzer et al. | Cholera studies: 4. Problems in immunology | |
| DE69333402T2 (de) | Impfstoff beinhaltend bacterin und toxoid aus pasteurella haemolytica typ a-1 | |
| Duncan | Streptococcal growth and toxin production in vivo | |
| Kaura et al. | Enterotoxigenicity and invasiveness of Salmonella species | |
| JP2537042B2 (ja) | ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチン用原株の製造法および生菌ワクチン | |
| US4465665A (en) | Detoxified E. coli neurotoxin, preparation thereof and immunological preparations containing it | |
| DE69130953T2 (de) | Immunverstärkung von impfstoffen, besonders von impfstoffen gegen schweinepleuropneumonie | |
| Munoz | I. IMMUNOLOGICAL AND OTHER BIOLOGICAL ACTIVITIES OF BORDETELLA PERTUSSIS ANTIGENS | |
| CA1189790A (en) | Process and a substrate for the aerobic fermentation of haemophilus pleuropneumoniae | |
| BALODA et al. | Cell-Surface Properties of Enterotoxigenic and Cytotoxic Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium | |
| Schultz | Incidence of antibodies to, sereotypes and antibiotic sensitivity of Haemophilus pleuropneumoniae in Iowa swine | |
| WO2025262270A1 (en) | Culture media and methods for cultivating bordetella bacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090322 Year of fee payment: 14 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |