JPH07265077A

JPH07265077A - 抗体可変領域ｄｎａ

Info

Publication number: JPH07265077A
Application number: JP6082693A
Authority: JP
Inventors: Yoshinobu Okuno; 良信奥野; Atsushi Oshima; 淳大島; Hirofumi Yoshioka; 広文吉岡; Takashi Takahata; 貴志高畠; Ikunoshin Katou; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1994-03-30
Filing date: 1994-03-30
Publication date: 1995-10-17
Anticipated expiration: 2015-01-11
Also published as: EP0675199A3; JP2996864B2; EP0675199A2; US5684146A; EP0675199B1; DE69533531D1

Abstract

(57)【要約】【目的】マウスモノクローナル抗体の可変領域をコー
ドするＤＮＡ、及び該可変領域の相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）をコードするＤＮＡを提供する。【構成】（ａ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ
１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのヘマグルチ
ニン分子の幹領域を認識し、Ｈ３Ｎ２サブタイプのヘマ
グルチニン分子の幹領域を認識しない、（ｂ）ヒトイン
フルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２
Ｎ２サブタイプに中和活性を有し、Ｈ３Ｎ２サブタイプ
には中和活性を有さない、の２特性をもつ抗ヒトインフ
ルエンザウイルス抗体の可変領域をコードするＤＮＡ。
該ＤＮＡ中のＣＤＲをコードするＤＮＡ。【効果】遺伝子工学的製造、ウイルスの診断、治療に
有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はインフルエンザウイルス
に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコード
するＤＮＡに関し、遺伝子工学的人工抗体の作製に有用
である。

【０００２】

【従来の技術】インフルエンザウイルスには３つの型
（Ａ、Ｂ及びＣ）があり、インフルエンザの世界的な流
行を起こし、多くの死者がでるのはＡ型のヒトインフル
エンザウイルスによるものである。インフルエンザＡ型
ウイルスは更にウイルス表面タンパク質であるヘマグル
チニン（haemagglutinin：以下、ＨＡと略す）及びノイ
ラミニダーゼ（以下、ＮＡと略す）の抗原性により多く
のサブタイプに分類され、ヒトインフルエンザＡ型ウイ
ルスとしてはＨ１Ｎ１サブクラス、Ｈ２Ｎ２サブクラ
ス、Ｈ３Ｎ２サブクラスの３種が現在知られている。こ
のインフルエンザＡ型ウイルスのＨＡは、球状部領域
（head region)と幹領域（stem region)という二つの構
造の異なった領域で構成され、球状部領域は、ウイルス
が標的細胞に結合するための受容体結合部位を含みＨＡ
の血球凝集活性に関与し、一方、幹領域は、ウイルスの
エンベロープと細胞のエンドソーム膜間の膜融合に必要
な融合ペプチドを含み、融合活性に関与している〔ウイ
リー（Wiley)ら、アニュアルレビューオブバイオ
ケミストリー（Ann. Rev. Biochem.) 、第５６巻、第３
６５〜３９４頁（１９８７）〕。Ｈ１Ｎ１サブタイプ、
Ｈ２Ｎ２サブタイプを認識する抗ＨＡ抗体として従来取
得された抗ＨＡ抗体は、そのすべてがＨＡの球状部領域
を認識するものである。しかし、この領域は最も抗原変
異が起こり易い部位であり、それ故、これらの抗体はヒ
トインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプに共通に反
応するものでなく、また、ウイルスのＨＡの抗原変化に
伴い、認識性を消失するものである。一方、グリーン(C
reen) らは、Ｈ３Ｎ２サブタイプの１種のＨＡの幹領域
のアミノ酸配列より、ポリペプチドを合成し、このポリ
ペプチドに対する抗体を取得しているが、これらの抗体
はウイルスの中和活性が弱く（特表昭５９−５０１７１
４号公報）、また抗原として使用したポリペプチド自体
も、Ｈ３Ｎ２サブタイプで免疫して得たウサギ抗ウイル
ス血清に反応を示さず、抗原性の点でも問題があった
〔セル(Cell)、第２８巻、第４７７〜４８７頁（１９８
２）〕。ヒトインフルエンザＡ型ウイルスは周期的にＨ
ＡとＮＡの型を変えて大流行を引起こし、インフルエン
ザの流行期である冬期前にワクチン接種を受けても、別
の型のウイルスによるインフルエンザが流行するためワ
クチンの効果が期待できないことが多い。しかし、ＨＡ
分子やＮＡ分子中の、ウイルスのサブタイプに共通で、
抗原変異の生じ難い抗原部位、特に立体構造を認識し、
かつ、ウイルスに中和活性を有する抗体を得ることがで
きれば、この抗体はＡ型ウイルスの感染による発症の診
断、予防並びに治療に利用できる。

【０００３】本発明者らは、このインフルエンザＡ型ウ
イルスのサブタイプに交さ認識性を有し、かつ、ウイル
ス中和活性を有する抗体として、下記特性（ａ）及び
（ｂ）を有する抗ヒトインフルエンザウイルス抗体を得
た。（ａ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブ
タイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子の幹領域を認
識し、Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子の幹領域は認識し
ない。（ｂ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブ
タイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプに中和活性を有し、Ｈ３
Ｎ２サブタイプには中和活性を有さない。この抗ヒトイ
ンフルエンザウイルス抗体の例としては HybridomaＣ１
７９（ＦＥＲＭＢＰ−４５１７）より得られるモノク
ローナル抗体Ｃ１７９（以下、単に該抗体をＣ１７９と
略す）があり、Ｃ１７９のインフルエンザウイルスに対
する予防効果も確認されている（特願平４−２７２５３
８号）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このイ
ンフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプに交さ認識性を
有し、かつ、ウイルス中和活性を有するモノクローナル
抗体はマウスのハイブリドーマから導かれたものであ
る。したがって、このマウス抗体をヒト用医薬品として
臨床へ応用するには、その免疫原性によって、種々の制
限が加わる。すなわち、マウス抗体を用いた場合、多く
の場合、免疫応答を誘導し、アナフィラキシーショック
を起こしたり、多数回投与の間に抗体の効果が減少した
り、血中からのクリアランスが極めて速まったりするた
め、実質上治療上の位置は低いものとなる。ヒトモノク
ローナル抗体を臨床使用すれば上記マウス抗体の使用に
伴う困難を克服可能であるが、例えばＣ１７９に相当す
るヒトモノクローナル抗体を所望の特異性及び親和性を
保持し、かつ安定して製造することは、極めて困難であ
る。また、モノクローナル抗体産生細胞株は、一般に継
代と共にその抗体産生能の低下することが知られてお
り、この問題を解決するために抗体産生細胞の細胞クロ
ーニングや抗体遺伝子をクローニング後、遺伝子導入す
ることによって大量発現させることの検討も必要となっ
ている。以上の点を考慮すると、１つの種から導かれた
抗体の可変領域と別の他の種から導かれた抗体の定常領
域とが結合しているキメラ抗体、通常はマウス抗体の可
変領域とヒト抗体の定常領域が結合したキメラ型抗体が
組換えＤＮＡ法で構築されれば、そのキメラ抗体の大部
分はヒト由来であるため、実質上、マウス抗体に比較し
て、上述した免疫原性が低く臨床応用に適した抗体が得
られる。なお、キメラ抗体に関してはショー（Shaw)
ら、ジャーナルオブイムノロジー（Ｊ．Immun.) 、
第１３８巻、第４５３４頁（１９８７）、モリソン（Mo
rrison, Ｓ．Ｌ．）ら、プロシーディングズオブザ
ナショナルアカデミーオブサイエンシーズオ
ブザＵＳＡ（ Pro. Nat. Acad. Sci. ＵＳＡ）、第
８１巻、第６８５１〜６８５５頁（１９８４）等に記載
され一般的な概念として位置づけられている。このよう
に最近ではマウス由来の可変領域及びヒトの定常部領域
からなるキメラ抗体、二種の異った抗原特異性を有する
双特異キメラ抗体、一本鎖抗体、及び抗体活性をもつ相
補性決定領域（ＣＤＲ）に相当するオリゴペプチド等の
開発がなされている。このように、遺伝子工学的手法に
よる抗体の産生、更に、改良抗体の開発において、その
遺伝子の分離、更にアミノ酸配列を含めた構造の解明は
必須である。特に、抗体の特異性が可変領域の中でもＣ
ＤＲという特定の領域に限定されることは当分野ではよ
く知られていることで、例えば抗体の親和性を改良する
目的でＣＤＲのアミノ酸を置換することが広く行われて
おり、ＣＤＲのＤＮＡ塩基、アミノ酸配列の解明は特に
重要である。本発明の目的は、ヒト人体において異物と
して認識され難いキメラ抗体や、相補性決定領域のみを
ヒト型抗体に移植した人工抗体の作製に有用な、マウス
モノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡ、及
び該可変領域の相補性決定領域をコードするＤＮＡを提
供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、下記特性（ａ）及び（ｂ）を有す
る抗ヒトインフルエンザウイルス抗体の可変領域をコー
ドするＤＮＡに関する。（ａ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブ
タイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのヘマグルチニン分子の
幹領域を認識し、Ｈ３Ｎ２サブタイプのヘマグルチニン
分子の幹領域は認識しない。（ｂ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブ
タイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプに中和活性を有し、Ｈ３
Ｎ２サブタイプには中和活性を有さない。また本発明の
第２の発明は、本発明の第１の発明の抗ヒトインフルエ
ンザウイルス抗体の可変領域をコードするＤＮＡ中のＣ
ＤＲをコードするＤＮＡに関する。

【０００６】なお可変領域とは、そのアミノ酸配列中に
少なくともＣＤＲを含有するアミノ酸配列をいう。

【０００７】上記特性（ａ）及び（ｂ）を有する抗ヒト
インフルエンザウイルス抗体の可変領域をコードするＤ
ＮＡをクローン化するためには、遺伝子源として、該抗
体を生産するハイブリドーマを作製することが必要であ
る。このようなハイブリドーマとして特願平４−２７２
５３８号明細書にはＣ１７９を生産するマウスハイブリ
ドーマ（Hybridoma Ｃ１７９：ＦＥＲＭＢＰ−４５１
７）及び該抗体の性質が記載されている。本明細書の参
考例Ａに該ハイブリドーマの作製方法及びＣ１７９の性
状について記載する。

【０００８】マウスモノクローナル抗体の可変領域をコ
ードする目的のＤＮＡをクローン化するためハイブリド
ーマ細胞を破壊し、全ＲＮＡを調製する。次に、この全
ＲＮＡを用い、グブラー、ホフマンの方法に従い、１本
鎖ｃＤＮＡを調製する。次に、オリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いるＤＮＡの伸長法を用いて前記ｃＤＮＡの
有意義な部分の特異的増幅を行う。マウスモノクローナ
ル抗体の重鎖可変領域の増幅のため、配列表の配列番号
１１、１２に示すオリゴヌクレオチドプライマーをそれ
ぞれＰＣＲ用の５′−末端プライマー及び３′−末端プ
ライマーとして使用する。配列表の配列番号１１に示す
オリゴヌクレオチドプライマーを重鎖リーダー配列とハ
イブリダイズし、配列表の配列番号１２に示すオリゴヌ
クレオチドプライマーは重鎖定常領域とハイブリダイズ
する。マウスモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のプラ
イマーを用いた増幅のため、配列表の配列番号１３に示
すオリゴヌクレオチドプライマーを３′−末端プライマ
ーとして使用する。このプライマーはマウスモノクロー
ナル抗体の軽鎖定常領域をハイブリダイズする。

【０００９】一方、Ｃ１７９を高度に精製し、その重
鎖、軽鎖のＮ末端アミノ酸配列を決定する。配列表の配
列番号１４、１５に、モノクローナル抗体重鎖のＮ末端
アミノ酸配列、軽鎖のＮ末端アミノ酸配列をそれぞれ示
す。前記、増幅生成物をｐＴ７ブルーＴ−ベクター（ノ
バジェン社製）、ｐＧＥＭ−４ＺＤＮＡ（プロメガ社
製）等の適当なクローニングベクターに組込み、マウス
モノクローナル抗体の目的とする可変領域をコードする
ＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。クローン化された
ＤＮＡの配列決定を行い、配列表の配列番号３、４に示
される配列を配列表の配列番号１４、１５から予想され
る塩基配列と比較する。その結果、本発明の第１の発明
の１例のＤＮＡ及び該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列
が提供される。その配列を配列表の配列番号１、２に示
す。目的とするＤＮＡのクローン化及びその配列決定を
実施例１、２に具体的に記載する。

【００１０】本発明は更に、本発明の各可変領域のＣＤ
ＲをコードするＤＮＡを提供する。重鎖、軽鎖の各対の
可変領域は抗原結合部位を形成する。重鎖、軽鎖上のこ
の領域は配列の比較的保存された４個のフレームワーク
領域を含み、これらは３個のＣＤＲにより連結されてい
る。このＣＤＲは、可変領域の既知アミノ酸配列と照合
することによって決定される。配列表の配列番号５〜１
０に本発明により提供されるＣＤＲのアミノ酸配列を示
す。

【００１１】本発明は、キメラ抗体やヒト型化抗体の素
材として有用な可変領域やＣＤＲ、及びそれをコードす
るＤＮＡを提供する。本発明の重鎖可変領域、軽鎖可変
領域をコードするＤＮＡを用いることにより、遺伝子工
学的にＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等を作製することができ
る。なおｓｃＦｖとは重鎖可変領域、軽鎖可変領域を数
個のアミノ酸残基からなるスペーサーにより結合させ
て、一本鎖ポリペプチドとしたものである。

【００１２】Ｆｖ作製用のプラスミドとしては特願平５
−２４６１８４号明細書に記載のプラスミドｐＭ１３Ｆ
ｖがあり、このプラスミドを導入した大腸菌ＪＭ１０９
はEscherichia coli JM109／pM13Fvと命名表示し、工業
技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１３６
９８として寄託されている。

【００１３】プラスミドｐＭ１３Ｆｖの遺伝子配列に関
する概略図を図１に示す。図１中でＸ遺伝子に相当する
部分はＨｉｎｄIII −ＳａｌＩ間であり、Ｙ遺伝子はＳ
ａｌＩ−ＳａｌＩ間、Ｚ遺伝子はＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ
間に相当する。このＸ−Ｙ−Ｚに相当するＨｉｎｄIII
−ＥｃｏＲＩサイト間の遺伝子配列を配列表の配列番号
１６に示す。

【００１４】プラスミドｐＭ１３Ｆｖは、一般的なファ
ージミドベクターであるプラスミドｐＴＺ１９Ｒ（ファ
ルマシア社製）のＨｉｎｄIII 、ＥｃｏＲＩサイト間に
Ｘ−Ｙ−Ｚ遺伝子が挿入されている。ベクター由来プロ
モーターの下流にあるＸ遺伝子は、まず、ＳＤ配列（シ
ャイン−ダルガルノの配列）に続いて１つ目の読取り枠
があり、分泌シグナルペプチドと重鎖可変領域（以後、
Ｖ_Hと略す）の融合ポリペプチドがコードされている。
更に、その下流に再度ＳＤ配列があり、分泌シグナルペ
プチドと、軽鎖可変領域（以後、Ｖ_Lと略す）がコード
されている２つ目の読取り枠が続く。Ｖ_L遺伝子の３′
末端部分に制限酵素ＳａｌＩサイトが存在し（配列番号
１６の塩基番号８９１−８９６）、Ｖ_L遺伝子の読取り
枠に続く形で、線状ファージコートタンパク質III の部
分配列（ΔｃｐIII ポリペプチド）をコードする遺伝子
（配列番号１７）を含有するＹ遺伝子がつながってい
る。すなわち、２つ目の読取り枠は、分泌シグナルペプ
チド、Ｖ_L、ΔｃｐIII ポリペプチドの融合ポリペプチ
ドをコードする。Ｙ遺伝子は、Ｙ遺伝子がコードするΔ
ｃｐIII ポリペプチド遺伝子の更に下流にある制限酵素
ＳａｌＩサイトでＺ遺伝子とつながっている。Ｚ遺伝子
は、プロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含む
ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号１８）を含
有する遺伝子である。

【００１５】このような構造のｐＭ１３Ｆｖは制限酵素
ＳａｌＩで完全消化するＹ遺伝子が切り出され、Ｙ遺伝
子を除いた後にセルフライゲーションさせれば、Ｘ遺伝
子とＺ遺伝子はＳａｌＩサイトにて連結され、プラスミ
ドｐＦｖ−ＰＰが得られる。この時、Ｚ遺伝子がコード
するプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含む
ポリペプチドは、Ｘ遺伝子の２つ目の読取り枠に続く形
で連結される。すなわち、プラスミドｐＭ１３Ｆｖを制
限酵素ＳａｌＩで消化してＹ遺伝子を除いた後の遺伝子
がコードする２つ目の読取り枠は、分泌シグナルペプチ
ド、Ｖ_L、プロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個
を含むポリペプチドの融合ポリペプチドをコードする。

【００１６】このプラスミドｐＦｖ−ＰＰにおいて、Ｘ
遺伝子に相当する部分には、ニワトリ卵白リゾチーム
（以下、ＨＥＬと略す）に対するモノクローナル抗体由
来のＦｖ遺伝子が挿入されているが、実際には、Ｆｖ遺
伝子を容易に置換できるように制限酵素サイトが存在す
る。すなわち、配列番号３６で示した塩基配列中塩基番
号１１５−１２０に存在するＰｓｔＩサイトと塩基番号
４６７−４７２に存在するＳｍａＩサイトでプラスミド
ｐＦｖ−ＰＰを切断して挿入されていたＶ_H遺伝子を取
り除き、読取り枠が合うように調製した任意のＶ_H遺伝
子を挿入できる。読取り枠が合うようなＰｓｔＩ−Ｓｍ
ａＩ断片は、ＤＮＡ合成機を用いて合成したＤＮＡでも
良いし、あるいは、従来から用いられている方法によ
り、ＰｓｔＩサイトあるいはＳｍａＩサイトを含むよう
に合成したＶ_H遺伝子増幅用プライマーを用いてＰＣＲ
法により得たＤＮＡ断片をＰｓｔＩ、ＳｍａＩで消化し
て得たＤＮＡ断片でも良い。同様にしてＶ_L遺伝子も配
列表の配列番号３６で示した塩基配列中塩基番号５８３
−５８８に存在するＳａｃＩサイトと塩基番号８９１−
８９６に存在するＳａｌＩサイト間でＶ_L遺伝子をコー
ドするＤＮＡ断片と置換することができる。プラスミド
ｐＦｖ−ＰＰは抗体可変部位を含むポリペプチドとＦｃ
結合能を有するポリペプチドとの融合ポリペプチドを発
現する形に変換されている。

【００１７】この抗体可変部位を含むポリペプチドと、
Ｆｃ結合能を有するポリペプチドの融合ポリペプチド
は、非常に有用である。すなわち、まず第１に、精製が
容易である。例えば、Ｆｃを含む、ポリペプチドあるい
はタンパク質を固定化した樹脂を用いて、培養物から融
合ポリペプチドを回収することができる。第２に、この
融合ポリペプチドを、Ｆｃを含むポリペプチドあるいは
タンパク質、例えばヒトＩｇＧなどと混合することによ
り、安定な多価の抗体複合体を形成する。多価であるた
めに、抗原との結合安定性は、１価である時よりも高
く、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロッティング等の使用に
用いる場合有用である。また、混合するＦｃを含むポリ
ペプチドの性質により検出も容易となり有用である。こ
のような融合ポリペプチドを作製するための抗体可変部
位を含むポリペプチドは、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ
フラグメント、Ｆａｂフラグメントなどどのようなもの
も有効である。

【００１８】例えば配列番号３で示されるＤＮＡを、配
列番号１９で示されるＰｓｔＩサイト導入用のプライマ
ー、及び配列番号２０で示されるＳｍａＩサイト導入用
のプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、プラスミドｐ
ＦＶ−ＰＰに挿入するＶ_HをコードするＤＮＡ（以下、
Ｖ_Hインサートと称す）を調製する。一方、配列番号４
で示されるＤＮＡを、配列番号２１で示されるＳａｃＩ
サイト導入用のプライマー、及び配列番号２２で示され
るＳａｌＩサイト導入用のプライマーを用いてＰＣＲ法
で増幅し、プラスミドｐＦｖ−ＰＰに挿入するＶ_Lをコ
ードするＤＮＡ（以下、Ｖ_Lインサートと称す）を調製
する。次にプラスミドｐＦｖ−ＰＰをＰｓｔＩ、Ｓｍａ
Ｉで切断し、プラスミド部分にＶ_Hインサートを挿入す
る。続いて、Ｖ_Hインサートが挿入されたプラスミドを
ＳａｃＩ、ＳａｌＩで切断し、プラスミド部分にＶ_Lイ
ンサートを挿入することにより、本発明のＶ_H、Ｖ_Lを
コードするＤＮＡの挿入されたプラスミドを調製するこ
とができる。該プラスミドはＴ１９Ｃ１７９Ｆｖｐｒｏ
Ａと命名され、該プラスミドで形質転換された大腸菌Ｂ
ＭＨ７１−１８株は Escherichia coli BMH71-18／T19C
179FvproA と命名されている。この大腸菌を培養するこ
とにより、本発明のＶ_H、Ｖ_Lが、ＦｖとプロテインＡ
のＦｃ結合能を有するポリペプチドとの融合ポリペプチ
ドとして発現させることができる。この融合ポリペプチ
ドはＦｃ結合担体、例えばＩｇＧ−セファロース６ＦＦ
（ファルマシア社製）を用いることにより容易に精製さ
れ、インフルエンザウイルス検出用の人工抗体として使
用することができる。

【００１９】次に、本発明のＶ_H、Ｖ_LをｓｃＦｖの形
で発現させることもできる。例えば配列番号３で示され
るＤＮＡを、前出の配列番号１９で示されるプライマ
ー、及び配列番号２３で表されるリンカー導入用のプラ
イマーを用いてＰＣＲ法で増幅する。次に配列番号２
４、２５でそれぞれ表されるオリゴヌクレオチドをアニ
ーリングさせ、次にＰｓｔＩ、ＳａｃＩで切断し、ｓｃ
Ｆｖ作成用のリンカーを作製する。前出のプラスミドＴ
１９Ｃ１７９ＦｖｐｒｏＡをＰｓｔＩ、ＳａｃＩで切断
し、プラスミド部分にリンカーを挿入する。次に、該プ
ラスミドをＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで切断し、前出のＰＣ
Ｒ増幅ＤＮＡを挿入することにより、Ｖ_Hをコードする
ＤＮＡとＶ_LをコードするＤＮＡがリンカーで結合され
たＤＮＡが挿入されたプラスミドを調製することができ
る。該プラスミドはＴ１９Ｃ１７９ＳｃＦＶｐｒｏＡと
命名され、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＢＭＨ
７１−１８株は Escherichia coli BMH71-18／T19C179S
cFVproA と命名、表示され工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭＰ−１４１９１として寄託されてい
る。

【００２０】この大腸菌を培養することにより、本発明
のＶ_H、Ｖ_Lが、ｓｃＦｖとプロテインＡのＦｃ結合能
を有するポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現
させることができる。この融合ポリペプチドも、ＩｇＧ
−セファロース６ＦＦを用いることにより容易に精製さ
れ、インフルエンザウイルス検出用の人工抗体として使
用することができる。なお、プラスミドＴ１９Ｃ１７９
ＦｖｐｒｏＡ、Ｔ１９Ｃ１７９ＳｃＦＶｐｒｏＡのそれ
ぞれのＶ_LをコードするＤＮＡの次に停止コドンを部位
特異的変異法により作製することができ、このような改
変プラスミドは、本発明のＶ_H、Ｖ_LをコードするＤＮ
Ａを用いたＦｖ発現用、ｓｃＦｖ発現用プラスミドとし
て使用することができる。

【００２１】以上、詳細に説明したように、本発明によ
り、抗ヒトインフルエンザウイルス抗体をコードする遺
伝子のＶ_Hをコードする遺伝子、Ｖ_Lをコードする遺伝
子、ＣＤＲをコードする遺伝子が提供される。これらの
遺伝子はＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、これらを含有する人
工抗体、またキメラ抗体、ヒト型抗体、単一ＣＤＲポリ
ペプチドの作製に有用であり、得られるこれらのタンパ
ク質、ポリペプチドはヒトインフルエンザウイルスの診
断、治療に有用である。

【００２２】なお得られた本発明の遺伝子をプローブと
して厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行えば、
本発明の遺伝子と配列は少し異なるが、本発明のＶ_H、
Ｖ_L、ＣＤＲと同様の性質を示すタンパク質、ポリペプ
チドをコードする遺伝子を得ることができる。ここでい
う厳密な条件下とは、以下の条件下のことをいう。すな
わち、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１
×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリ
ウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１
％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ／mlのサケ精子
ＤＮＡ、５×デンハルツ（Denhardt^,s)（ウシ血清アル
ブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ
０．１％の濃度で含む）を含む溶液中で６５℃で２０時
間プローブとハイブリダイゼーションを行うことをい
う。また本発明のＶ_H、Ｖ_L、ＣＤＲとしてはその活性
に影響の無い範囲でアミノ酸の欠失、置換、挿入、転
置、付加又は再配置されたものでも良く、これらのタン
パク質、ポリペプチドをコードする遺伝子を遺伝子工学
的に作製、使用することもできる。

【００２３】本発明の遺伝子を用いて作製される抗体は
Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプを共通認識
し、Ｈ３Ｎ２サブタイプは認識しない。よってＨ３Ｎ２
サブタイプを認識する抗体、例えば特願平５−１１５２
１６号明細書記載のハイブリドーマＡＩ３Ｃ（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４５１６）の産生するモノクローナル抗体ＡＩ
３Ｃ（宝酒造社製：製品名Ｆ４９）、及びヒトインフル
エンザＢ型ウイルス検出用のポリクローナル抗体（宝酒
造社製）と組合せ使用することによって、被検体中のヒ
トインフルエンザウイルスのタイピングを簡便に、高感
度に行うことができる。また本発明の遺伝子を用いて作
製される抗体はＨ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイ
プを共通認識し、かつ中和活性を有するために、当該サ
ブタイプのウイルスが関与する疾病の予防、治療にも有
用である。

【００２４】以下、本発明で使用した抗インフルエンザ
ウイルス抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ発現用プラスミドにつき
参考例により説明する。

【００２５】参考例Ａ１．ウイルスの調製Ｈ１Ｎ１サブタイプとしてＡ／Bangkok ／１０／８３、
Ａ／Yamagata／１２０／８６、Ａ／Osaka ／９３０／８
８、Ａ／Suita ／１／８（以上、大阪大学微生物病研究
所保存株）、Ａ／ＰＲ／８／３４（ＡＴＣＣＶＲ−９
５）、Ａ１／ＦＭ／１／４７（ＡＴＣＣＶＲ−９７）
を用いた。Ｈ２Ｎ２サブタイプとしてＡ／Okuda ／５
７、Ａ／Adachi／２／５７、Ａ／Kumamoto／１／６５、
Ａ／Kaizuka ／２／６５、Ａ／Izumi ／５／６５（以
上、大阪大学微生物病研究所保存株）を用いた。Ｈ３Ｎ
２サブタイプとしてＡ／Fukuoka ／Ｃ２９／８５、Ａ／
Sichuan ／２／８７、Ａ／Ibaraki ／１／９０、Ａ／Su
ita ／１／９０、Ａ／Kitakyushu／１５９／９３（以
上、大阪大学微生物病研究所保存株）、Ａ２／Aichi ／
２／６８（ＡＴＣＣＶＲ−５４７）を用いた。Ｂ型ウ
イルスとしてＢ／Nagasaki／１／８７を用いた。それぞ
れのウイルスを１１日齢の発育鶏卵の尿膜腔内に接種
し、３４℃で４日間培養後、各ウイルスを採取した。

【００２６】２．モノクローナル抗体の調製（１）参考例Ａ−１で調製したＡ／Okuda ／５７のウイ
ルス（３２０ＨＡ単位）をフロイント完全アジュバント
に使用前に懸濁し、１ヵ月間隔で、Balb／ｃマウス腹腔
内注射により、２度免疫し、その１ヵ月後に、同抗原
（３２０ＨＡ単位）のＰＢＳ懸濁液を用い腹腔内注射し
ブーストした。その３日後に、マウスより脾臓を摘出
し、脾細胞を調製した。マウスミエローマとしてはｐ３
×６３Ａｇ８を１０％牛胎児血清添加ＤＭＥ培地で継代
後２日間培養したものを、細胞融合前に生理食塩水で洗
浄し、調製した。次に脾細胞とミエローマ細胞を細胞数
１：５の割合で混合し、遠心分離して上清を除き、沈殿
した細胞塊を充分ほぐした後、かくはんしながら、１ml
の混合液〔ポリエチレングリコール−４０００（２
ｇ）、ＭＥＭ（２ml）、ジメチルスルホキシド〕に加
え、５分間３７℃に保温した後、液の全量が１０mlにな
るようにゆっくりＭＥＭを加えた。次に、遠心分離後、
上清を除き、ゆるやかに細胞をほぐした。これに正常培
地〔ＰＰＭＩ−１６４０に牛胎児血清１０％を加えたも
の〕３０mlを加え、メスピペットを用いてゆるやかに細
胞を懸濁した。

【００２７】懸濁液を９６穴の培養プレートに分注し、
５％のＣＯ₂を含む培養器中で、３７℃で２４時間培養
した。次にＨＡＴ培地を加え、１０〜１４日間培養し
た。続いて培養上清の一部を採り、ハイブリドーマのス
クリーニングを行った。

【００２８】（２）インフルエンザＡ型ウイルスのサブ
タイプ間で交さ反応するモノクローナル抗体を得るため
に、希釈していない、上記培養上清を１次抗体として用
い、３種のサブタイプ（Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ
２）のそれぞれに感染したＭＤＣＫ細胞の染色試験を行
った。染色試験は前出のジャーナルオブクリニカル
ミクロバイオロジーに記載の方法に準じて行った。すな
わち９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン３０
７２：ベクトンディキンソン社製）上で、ヒトインフ
ルエンザＡ型ウイルスの各サブタイプ株（Ｈ１Ｎ１：Ａ
／yamagata／１２０／８６、Ｈ２Ｎ２：Ａ／Okuda ／５
７、Ｈ３Ｎ２：Ａ／Fukuoka ／Ｃ２９／８５）に感染さ
せたＭＤＣＫ細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、
無水エタノールで室温下、１０分間固定した。次にこれ
らの細胞を４種類の抗体〔モノクローナル抗体を含有す
る前記培養上清、ウサギ抗マウスイムノグロブリンＧ血
清（オルガノテクニカ社製）の１０００倍希釈液、ヤギ
抗ウサギイムノグロブリンＧ血清（オルガノテクニカ社
製）の５００倍希釈液、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペ
ルオキシダーゼ複合体（オルガノテクニカ社製）の１０
００倍希釈液〕で連続的に、４０分間ずつ反応させ、処
理細胞をＰＢＳで洗浄した。最後にペルオキシダーゼ反
応を、０．０１％のＨ₂Ｏ₂と０．３mg／mlの３，３′
−ジアミノベンジジン四塩酸のＰＢＳ溶液を用い、グラ
ハム、カルノフスキー（Graham、Karnovsky)の方法〔ジ
ャーナルオブヒストケミストリーアンドサイト
ケミストリー（Ｊ．Histochem. Cytochem.) 、第１４
巻、第２９１〜３０２頁（１９６６）〕で行った。染色
された細胞は通常の光学顕微鏡で観察し、Ｈ１Ｎ１サブ
タイプ感染のＭＤＣＫ細胞及びＨ２Ｎ２サブタイプ感染
のＭＤＣＫ細胞をそれぞれ認識する抗体を選抜した。次
に該抗体産生の確認された細胞が増殖している穴の細胞
を取り出し、限界希釈法を３回行い、目的の細胞をクロ
ーニングし、クローニングされたハイブリドーマ株をHy
bridoma Ｃ１７９、該ハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体をモノクローナル抗体Ｃ１７９と命名し
た。

【００２９】なお、Hybridoma Ｃ１７９は、Hybridoma
Ｃ１７９と表示して、工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭＢＰ−４５１７として寄託されている。

【００３０】（３）プリスタン処理したBalb／ｃマウス
に上記ハイブリドーマ株を５×１０⁶個／匹マウスの腹
腔内に投与した。１０〜２１日後に、腹水ガンを誘発さ
れたマウスから腹水を採り、３０００rpm ／５分の遠心
処理により固型成分を除去し、腹水液を調製した。腹水
液１ml中には約５mgのモノクローナル抗体Ｃ１７９（以
下、単にＣ１７９と略す）が含有されていた。Ｃ１７９
はプロテインＡ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社
製）で精製され、ＩｇＧ２ａタイプの抗体であった。

【００３１】３．モノクローナル抗体の性状（１）参考例Ａ−２−（３）記載の腹水液の１００倍希
釈液を段階希釈し、参考例Ａ−２−（２）記載の染色試
験を行い、Ｃ１７９の抗原認識性を検討した。Ｈ１Ｎ１
サブタイプとしてはＡ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Bangkok
／１０／８３、Ａ／Yamagata／１２０／８６、Ａ／Osak
a ／９３０／８８、Ａ／Suita ／１／８９、Ａ１／ＦＭ
／１／４７、Ｈ２Ｎ２サブタイプとしてはＡ／Okuda ／
５７、Ａ／Adachi／２／５７、Ａ／Kumamoto／１／６
５、Ａ／Kaizuka ／２／６５、Ａ／Izumi ／５／６５、
Ｈ３Ｎ２サブタイプとしてはＡ／Aichi ／２／６８、Ａ
／Fukuoka ／Ｃ２９／８５、Ａ／Sichuan ／２／８７、
Ａ／Ibaraki ／１／９０、Ａ／Suita ／１／９０、Ａ／
Kitakyushu／１５９／９３、更にインフルエンザＢ型ウ
イルスとしてＢ／Nagasaki／１／８７を用いた。Ｃ１７
９はすべてのＨ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイ
プを認識し、Ｈ３Ｎ２サブタイプ、Ｂ型ウイルスは認識
しなかった。

【００３２】（２）抗体の中和活性測定は前出のインフ
ルエンザウイルス迅速フォーカスリダクション中和試験
を、アーカイブズオブビロロジー（Arch. Virol.)
、第８６巻、第１２９〜１３５頁（１９８５）、ミク
ロバイオロジーアンドイムノロジー（Microbiol. I
mmunol.)、第２９巻、第３２７〜３３５頁（１９８５）
に準じて行った。抗体としては参考例Ａ−２−（３）の
腹水液を用い、該抗体は使用前に３倍容のレセプター分
解酵素（ＲＤＥ：武田薬品工業社製）溶液を加え、３７
℃、１８時間反応後、５６℃、４５分間の加熱処理でＲ
ＤＥを欠失させ、最終的に腹水液の１６倍希釈液として
調製し、被検液とし、次のように測定を行った。

【００３３】すなわち９６穴マイクロプレートにＭＤＣ
Ｋ細胞を１０⁴個／穴、分注し、翌日、前記抗体（１６
倍希釈液）の４段階希釈液と、３０フォーカス形成単位
／穴に調製した参考例Ａ−３−（１）記載のそれぞれの
ウイルス液を等量混合し、３７℃で１時間保温した。次
にこの混合液の２５μｌを、前記ＭＤＣＫ細胞の入った
マイクロタイタプレートの各穴に分注し、３０分間、３
７℃で保温した。次に各穴中の溶液を除去し、ＰＢＳで
各穴を洗浄し、次に０．５％トラガカンスガム和光純
薬）及び５μｇ／mlのトリプシンを含有するＭＥＭを添
加した。３７℃で２０〜２４時間、保温後、添加液を除
去し、各穴をＰＢＳで洗浄後、細胞を、室温下、無水エ
タノールで１０分間処理し、細胞を固定した。次に乾燥
し、参考例Ａ−２−（２）記載の染色試験に準じ、細胞
の染色を行った。染色後、細胞を水道水で洗浄し、乾燥
後、光学顕微鏡下、染色されたフォーカス数を、計測し
た。

【００３４】Ｃ１７９は、すべてのＨ１Ｎ１サブタイプ
及びＨ２Ｎ２サブタイプのフォーカス形成を阻害し、強
いウイルス中和活性を示し、一方、Ｈ３Ｎ２サブタイ
プ、Ｂ型ウイルスのフォーカス形成には影響を与えなか
った。また、プラークリダクション中和試験においても
同様な結果を示した。

【００３５】（３）抗体の血球凝集阻害活性（ＨＩ）は
次のように行った。参考例Ａ−３−（２）と同様にＲＤ
Ｅ処理した抗体（３２倍希釈液）を用い、段階希釈液を
調製し、次に参考例Ａ−３−（１）記載の各ウイルス
（１６ＨＡ単位）と混合し、室温で３０分間反応させ
た。その後、ニワトリ赤血球を加えよく混和し、各ウイ
ルスの血球凝集活性に及ぼす抗体の影響を検討した。Ｃ
１７９はすべてのサブタイプのウイルスの血球凝集活性
に影響を与えなかった。

【００３６】（４）抗体の融合阻止活性測定は前出のネ
ーチャー、第３００巻、第６５８〜６５９頁（１９８
２）の方法を改変し行った。すなわち、ＣＶ−１細胞の
モノレーヤー培養物に、参考例Ａ−３−（１）記載の各
ウイルス株をそれぞれ感染させた。２４時間後に、細胞
をＤＭＥＭで２回洗浄し、次にトリプシン添加（１０μ
ｇ／ml）のＤＭＥＭ中で１５分間、３７℃で保温した。
次に細胞をＤＭＥＭで２度洗浄後、参考例Ａ−２−
（３）の腹水液のＤＭＥＭ希釈液を添加し、３７℃で３
０分間保温した。その後、細胞を、ｐＨ５．０に調整し
た融合培地（Ｎａ₂ＣＯ₃無添加のＰＲＭＩ、０．２％
ウシ血清アルブミン、１０mM ＭＥＳ、１０mMＨＥＰＥ
Ｓ）にて、３７℃、２分間処理し、続いて、ＤＭＥＭで
２回洗浄し、融合培地を除去した後、２％ウシ胎児血清
を含むＤＭＥＭで３７℃、３時間保温した。次に、無水
メタノールで細胞を固定し、ギムザ染色した後、光学顕
微鏡でポリカリオン形成の有無を判定した。Ｃ１７９
は、すべてのＨ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイ
プのポリカリオン形成を阻止し、Ｈ３Ｎ２サブタイプ及
びＢ型ウイルスのポリカリオン形成は阻止しなかった。

【００３７】以上、Ｃ１７９はＨ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ
２Ｎ２サブタイプを特異的に認識し、ウイルスの膜融合
を阻害し、中和活性を示す抗体であった。これらの結果
を表１に示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】表中の数字は参考例Ａ−２−（３）の腹水
液の希釈倍数であり、染色力価は染色試験で細胞を染色
可能な該腹水液の最大希釈倍数、中和活性においては対
照の抗体無添加区のフォーカス数の半分まで、フォーカ
スの出現を抑制可能な該腹水液の最大希釈倍数を示す。
また＋はポリカリオン形成が１０００倍希釈の該腹水液
の抗体溶液で完全に阻害されることを意味し、−は１０
倍希釈の該腹水液を用いた時にも全く阻害がみられなか
ったことを意味する。また、３２倍希釈の該腹水液を用
いてもＨＩ活性は認められない。

【００４０】４．インフルエンザウイルスに対する予防
効果インフルエンザウイルスのマウス感染実験を行い、Ｃ１
７９の予防効果を調べた。１０匹のBalb／ｃマウスにＣ
１７９のＰＢＳ溶液（１mg／ml）１匹当り１mlずつ腹腔
内に投与した。１日後に１０００倍希釈したＨ１Ｎ１サ
ブタイプのＡ１／ＦＭ／１／４７（４０００ＨＡ単位）
を２５μｌずつ鼻腔内接種した。対照として１２匹のマ
ウスにはウイルスだけを接種した。

【００４１】図２に示すように、対照群のマウスは８匹
死亡（５日後に２匹、６日後に５匹、８日後に１匹）し
た。また、他の生存マウスは著しく、衰弱していた。一
方、Ｃ１７９を投与したマウスは正常であり、１４日を
経過しても、すべて元気であった。図２はＣ１７９の投
与群、非投与群の生存率を示す図であり、縦軸は生存
率、横軸はウイルス感染後の日数を表す。

【００４２】参考例ＢプラスミドｐＦｖ−ＰＰ、ｐＭ１３Ｆｖの構築ＨＥＬに対するモノクローナル抗体Ｄ1.３由来のＦｖフ
ラグメントをコードするプラスミドｐＳＷ１Ｖ_HＤ1.３
Ｖ_KＤ1.３は、グレッグウインター博士（ケンブリッ
ジ、ＵＫ）より譲渡を受けた。ただし、譲渡を受けたプ
ラスミドは文献記載の配列と多少異なっていた。このプ
ラスミドｐＳＷ１Ｖ_HＤ1.３Ｖ_KＤ1.３はｐＵＣ１９の
ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ間にＦｖフラグメントをコー
ドする遺伝子が挿入されている。このＨｉｎｄIII −Ｅ
ｃｏＲＩ挿入断片に配列を配列番号２６に示す。

【００４３】(1-1) プラスミドｐＦｖ−ＰＰプラスミドｐＳＷ１Ｖ_HＤ1.３Ｖ_KＤ1.３を制限酵素Ｈ
ｉｎｄIII とＳｍａＩで消化しアガロースゲル電気泳動
により分離後、Ｖ_H遺伝子を含む約４７０bpのＤＮＡ断
片を抽出精製した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴＺ
１９Ｒ（ファルマシア社製）のＨｉｎｄIII 、ＳｍａＩ
サイトに挿入し、プラスミドＴ１９ＶＨを得た。また、
プラスミドｐＳＷ１Ｖ_HＤ1.３Ｖ_KＤ1.３を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＳｍａＩで消化しアガロースゲル電気泳動に
より分離後、Ｖ_L遺伝子を含む約４５０bpのＤＮＡ断片
を抽出精製した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴＺ１
８Ｒ（ファルマシア社製）のＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩサイ
トに挿入し、プラスミドＴ１８ＶＬを得た。このプラス
ミドＴ１８ＶＬを鋳型として、配列番号２７に示した制
限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列と、ＳａｌＩ認識配列を持つ
プライマーＶＬ３′ＳａｌＩと配列番号２８に示したｐ
ＴＺ１８Ｒ由来配列であるプライマーＵＰＭＣＳを用い
てＰＣＲを行い、増幅してきたＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII とＥｃｏＲＩで消化した。これをアガロースゲル
電気泳動により分離後ＨｉｎｄIII 、ＥｃｏＲＩ断片を
抽出精製した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴＺ１８
ＲのＨｉｎｄIII 、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、プラス
ミドＴ１８ＶＬＳを得た。このプラスミドＴ１８ＶＬＳ
はＶ₁遺伝子の３′末端側に制限酵素ＳａｌＩ認識配列
を持つ。このプラスミドＴ１８ＶＬＳを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ、ＳｍａＩで消化しアガロースゲル電気泳動により
分離後、Ｖ_L遺伝子を含む約４３０bpのＤＮＡ断片を抽
出精製した。このＤＮＡ断片を先に構築したＶ_H遺伝子
を持つプラスミドＴ１９ＶＨのＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩサ
イトに挿入し、プラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳを得た。こ
のプラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳはｐＴＺ１９Ｒｌａｃプ
ロモーターの下流に、Ｖ_H遺伝子、Ｖ_L遺伝子を持つ。

【００４４】次にプラスミドｐＥＺＺ１８（ファルマシ
ア社製）を鋳型しとて、配列番号２９に示した、制限酵
素ＳａｌＩ認識配列を持つプライマーＰｒｏＡ５′と、
配列番号３０に示した、制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を
持つプライマーＰｒｏＡ３′を用いてＰＣＲ法によりＤ
ＮＡを増幅した。増幅してきた、プロテインＡのＦｃ結
合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドをコードする
遺伝子（配列番号１８）を含むＤＮＡを、制限酵素Ｓａ
ｌＩとＥｃｏＲＩで消化しアガロースゲル電気泳動を行
い約３９０bpのＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ
断片をｐＴＺ１８ＲＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩサイトに導入
しプラスミドＴ１８ＰＡを得た。次にこのプラスミドＴ
１８ＰＡを制限酵素ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩで消化しアガ
ロースゲル電気泳動を行い、約３９０bpのＤＮＡ断片を
抽出精製した。

【００４５】このＤＮＡ断片を先に得たプラスミドＴ１
９ＶＨＶＬＳのＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、
プラスミドｐＦｖ−ＰＰを構築した。このプラスミドｐ
Ｆｖ−ＰＰは、Ｖ_Hフラグメントと、Ｖ_Lフラグメント
のＣ末端にプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造（配
列番号３１の５８アミノ酸残基）２個を含む融合ポリペ
プチドをコードする。

【００４６】(1-2) プラスミドｐＭ１３Ｆｖの構築プラスミドＭ１３ｍｐ１８（宝酒造社製）を鋳型とし
て、配列番号３２で示した、制限酵素ＳａｌＩ認識配列
をプライマーｃｐIII ５′−１と、配列番号３３で示し
た、制限酵素ＳａｌＩ認識配列とＮｈｅＩ認識配列を持
つプライマーｃｐIII ３′を用いてＰＣＲを行い、ｃｐ
III のＣ末端側ポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅
させた。このＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで消化後アガロ
ースゲル電気泳動を行い、約６５０bpのＤＮＡ断片を抽
出精製した。このＤＮＡ断片を参考例Ｂ(1-1) で得たプ
ラスミドｐＦｖ−ＰＰのＳａｌＩサイトに挿入した。得
られたプラスミドのうち、Ｖ_L遺伝子に続いてプライマ
ーｃｐIII ５′−１由来の配列がつながった向きに挿入
されたプラスミドをプラスミドｐＭ１３Ｆｖとした。

【００４７】このプラスミドｐＭ１３Ｆｖは、Ｖ_Hフラ
グメントと、Ｖ_LフラグメントのＣ末端に配列表の配列
番号１７で示した遺伝子がコードする、ΔｃｐIII がつ
ながった融合ポリペプチドとを発現するように構築され
ている。更にこのプラスミドｐＭ１３ＦｖのＨｉｎｄII
I −ＥｃｏＲＩに挿入されたＤＮＡ断片の概略図を図１
に示し、塩基配列を配列表の配列番号１６に示す。この
プラスミドｐＭ１３Ｆｖは、制限酵素ＳａｌＩで消化後
セルフライゲーションを行うことにより容易に参考例Ｂ
(1-1) で構築したプラスミドｐＦｖ−ＰＰの形にするこ
とができる。このプラスミドｐＭ１３Ｆｖを導入した大
腸菌ＪＭ１０９はEscherichia coli JM109／pM13Fvと命
名表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥ
ＲＭＰ−１３６９８として寄託されている。

【００４８】

【実施例】次に、本発明を下記の実施例により具体的に
説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるもの
ではない。

【００４９】実施例１ヒトインフルエンザＡ型ウイ
ルスに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコ
ードするＤＮＡのクローン化ヒトインフルエンザＡ型ウイルスに対するマウスモノク
ローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡを次のよう
にしてクローン化した。

【００５０】（１）全ＲＮＡの調製Ｃ１７９産生ハイブリドーマ（ＦＥＲＭＢＰ−４５１
７）からの全ＲＮＡを、チルグウィン（Chirgwin) ら、
バイオケミストリー（Biochemistry) 、第１８巻、第５
２９４頁（１９７９）に記載されている方法に従って調
製した。すなわち、約１×１０⁷個のＣ１７９産生ハイ
ブリドーマの細胞を２０mlの４Ｍグアニジンチオシアー
ネート（フルカ社製）を加え注射器で５回注入、注出を
繰返し、細胞を溶解させた。次に、溶解後の細胞抽出液
を５．３Ｍ塩化セシウム溶液に重層し、超遠心分離する
ことによりＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡ沈殿物を緩衝液
に溶解し、フェノール処理、クロロホルム処理をしたの
ち、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡを回収し、全ＲＮＡ
を調製した。

【００５１】（２）一本鎖ｃＤＮＡの合成グブラーホフマンの方法に従うｃＤＮＡ合成キット（ｋ
ｉｔ）（アマーシャム社製）を用い、前記のようにして
調製した全ＲＮＡの約５μｇと０．５μｇのオリゴｄ
（Ｔ）プライマーにて、一本鎖ｃＤＮＡを合成し、該ｃ
ＤＮＡをマウスＶ_Hをコードする遺伝子をＰＣＲ法によ
り増幅するために使用した。なお、ｃＤＮＡ合成の反応
条件は４２℃、１２０分間とし、反応後ＲＮａｓｅＡ
（４００μｇ／ml）２μｌを加え、３７℃、２０分間反
応させた。

【００５２】（３）Ｖ_Hをコードする遺伝子のＰＣＲ法
による増幅ジーンアンプ（ GeneAmp）^TMＰＣＲシステム９６００
（パーキン−エルマー社製）を用いてＰＣＲ法を行っ
た。（ａ）ＰＣＲ法に使用するプライマーは、配列番号１１
に示すオリゴヌクレオチドプライマー（マウス重鎖リー
ダー配列とハイブリダイズする）及び配列番号１２に示
すオリゴヌクレオチドプライマー（マウス重鎖定常領域
とハイブリダイズする）を用いた。まず、１０mMトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０mM ＫＣｌ、０．１mM
ｄＡＴＰ、０．１mM ｄＧＴＰ、０．１mM ｄＣＴＰ、
０．１mM ｄＴＴＰ、１．５mM ＭｇＣｌ₂のＰＣＲ反
応緩衝液１０μｌ、２．５ユニットのＤＮＡポリメラー
ゼアンプリタック（Ampli Taq)１μｌ（パーキン
エルマーシータス社製）、各１０pmolのそれぞれの配
列番号１１、１２に示すオリゴヌクレオチドプライマー
各２．５μｌ、実施例１−（２）記載の一本鎖ｃＤＮＡ
１μｌ、及びＨ₂Ｏ８３μｌを含有するＰＣＲ溶液
１００μｌを、９４℃の初期温度にて１分間保持した。
次に９４℃にて１分間、５０℃にて２分間及び７２℃に
て３分間の順序で加熱し、この温度サイクルを３５回反
復した後、反応混合物を更に７２℃にて１０分間保温し
た。

【００５３】（ｂ）ＰＣＲ生成物の精製前記工程のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ生
成物を、アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ社
製）を用いるアガロースゲル電気泳動により分離した。
約５５０bp長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片よ
り、目的のＤＮＡをスプレック（Suprec) ^TM−０１（Ｄ
ＮＡ回収用フィルター付遠心チューブ：宝酒造社製）を
用いて精製した。

【００５４】（ｃ）ＤＮＡの連結及び形質転換上記工程のようにして調製した約５５０bp長のＤＮＡ断
片約０．２μｇを、プラスミドｐＴ７ブルーＴ−ベクタ
ー約０．１μｇとＤＮＡライゲーションキット（宝酒造
社製）を用いて連結した。次に７μｌの上記連結混合物
を大腸菌ＪＭ１０９のコンピテント細胞２００μｌに加
え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分
間、そして再び氷上で１分間静置した。次いで８００μ
ｌのＳＯＣ培地〔モレキュラークローニング、アラ
ボラトリーマニュアル（Molecular Cloning, A Labor
atory Manual) 、サムブルック（Sambrook) ら、コール
ドスプリングハーバーラボラトリープレス、
（１９８９）〕を加え、３７℃にて１時間インキュベー
トした後、５０μｇ／mlのアンピシリン、０．１mMのイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰ
ＴＧ：宝酒造社製）及び４０μｇ／mlの５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含
有するＬ−ブロス寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７
℃にて一夜インキュベートして、プレート上の白コロニ
ーの大腸菌を選び、形質転換体を得た。この形質転換体
を、５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬ−ブロス
培地５ml中で３７℃にて一夜培養し、そしてこの培養物
から、アルカリ法（前出モレキュラークローニング、
アラボラトリーマニュアル）に従ってプラスミドＤ
ＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドをプラス
ミドｐＣ１７９Ｈと命名した。

【００５５】（４）Ｖ_Lをコードする２本鎖ｃＤＮＡの
合成（ａ）グブラーホフマンの方法に従うｃＤＮＡ合成キッ
トを用い、前記実施例１−（２）のようにして調製した
全ＲＮＡの約５μｇと配列番号１３に示すオリゴヌクレ
オチドプライマー（３′−末端プライマーとして使用す
る）にて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。なお、配列番号１
３に示すオリゴヌクレオチドプライマーは、あらかじ
め、５′−末端ラベリングキット〔宝酒造社製〕を用
い、ラジオアイソトープγ−³²ＰｄＡＴＰにてラベルし
ておいた。

【００５６】（ｂ）２本鎖ｃＤＮＡ合成物の精製前記工程のようにしてｃＤＮＡ合成キットを用いて合成
した２本鎖ｃＤＮＡを、アガロース（ＦＭＣバイオプ
ロダクツ社製）を用いるアガロースゲル電気泳動により
分離した。このゲルについてオートラジオグラフィーを
行い、約４００bp長のシグナルＤＮＡ断片を含有するア
ガロース片より、約４００bp長の２本鎖ｃＤＮＡをスプ
レック−０１を用いて精製した。

【００５７】（ｃ）ＤＮＡの連結及び形質転換実施例１−（３）−（ｃ）記載の方法に従って前記工程
で得た約４００bp長のＤＮＡ断片約０．２μｇをプラス
ミドｐＧＥＭ−４ＺＤＮＡをＨｉｎｃIIで消化すること
により調製したｐＧＥＭ−４ＺＤＮＡ約０．１μｇの平
滑断面と連結し、該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に組
込み、培養後、形質転換体、及びプラスミドＤＮＡを調
製し、こうして得られたプラスミドをプラスミドｐＣ１
７９Ｌと命名した。

【００５８】実施例２可変領域の塩基配列の決定（１）Ｃ１７９のアミノ酸配列の決定（ａ）参考例Ａ−２−（３）に記載の方法で調製した１
００μｇのＣ１７９を０．７Ｍの２−メルカプトエタノ
ール存在下、２％ＳＤＳを含む緩衝液中で９５℃、５分
間加熱し変性させた。次にＳＤＳにより変性させた試料
を１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。泳動
後のゲルを、１０％メタノール、０．１％ＳＤＳを含む
トリス−ε−アミノ−ｎ−カプロン酸緩衝液（ｐＨ９．
２）中に浸し、室温で１５分間振とうした後、セミドラ
イブロッター（ザルトリウス社製）を用いてＰＶＤＦ
膜（ミリポア社製）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜
は、０．１％ＣＢＢ溶液で染色し、６０％メタノールで
脱色した後、Ｈ鎖、Ｌ鎖に相当するタンパク質の染色ス
ポットを切り出して、室温で乾燥させた。（ｂ）アミノ酸配列分析は、気相式シーケンサーＰＳＱ
１（島津製作所製）を用いて、自動エドマン法により行
った。上記工程で得たＰＶＤＦ膜切片をシーケンサーの
リアクションカートリッジに挿入し、ＰＳＱ１装備の
標準プログラムを用いてエドマン分解を行った。エドマ
ン分解によって生じたＰＴＨ−誘導体は、ＰＴＨ−アミ
ノ酸分析システムＰＴＨ１を用いたオンライン法により
分析、同定した。Ｃ１７９重鎖、軽鎖のＮ末端アミノ酸
配列を配列番号１４、１５にそれぞれ示す。なお、重鎖
Ｎ末端アミノ酸配列分析において得られた各ＰＴＨアミ
ノ酸の収率は、軽鎖でのＰＴＨアミノ酸の収率の約１０
％に相当し、重鎖Ｎ末端Ｇｌｕのアミノ基はその大部分
がブロックされていると推定された。

【００５９】（２）ＤＮＡの塩基配列の決定前記のプラスミドｐＣ１７９Ｈ及びプラスミドｐＣ１７
９Ｌ中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、 BcaBEST^TM
ジデオキシシークエンシングキット（宝酒造社
製）を用いて決定した。まず、前記のようにして得られ
たプラスミド約３μｇを０．２ＮＮａＯＨにより変性
し、配列決定用プライマーとアニールさせ、そしてキッ
ト添付の処方に従って³²Ｐ−ｄＣＴＰにより標識した。
次に、標識したＤＮＡを、６％ポリアクリルアミドゲル
にて電気泳動した後、ゲルを乾燥し、そしてオートラジ
オグラフィーにかけることにより塩基配列を決定した。
各プラスミドのｃＤＮＡコード領域の塩基配列を配列番
号３、４にそれぞれ示す。

【００６０】配列番号１４で示す重鎖のＮ末端Ｇｌｕか
らＬｅｕ１８までのアミノ酸配列は、配列番号３で示す
遺伝子の塩基番号１番から５４番までの塩基配列がコー
ドするアミノ酸配列と完全に一致し、プラスミドｐＣ１
７９ＨはマウスＶ_Hをコードする遺伝子を含んで成るプ
ラスミドと決定された。このプラスミドｐＣ１７９Ｈが
含有するＶ_H遺伝子のコードするアミノ酸配列を配列番
号１に示す。次に、配列番号１５で示す軽鎖のＮ末端Ａ
ｓｐからＡｌａ１３までのアミノ酸配列は、配列番号４
で示す遺伝子の塩基番号１番から３９番までの塩基配列
がコードするアミノ酸配列と完全に一致し、プラスミド
ｐＣ１７９Ｌは、マウスＶ_Lをコードする遺伝子を含ん
で成るプラスミドと決定された。このプラスミドｐＣ１
７９Ｌが含有するＶ_L遺伝子のコードするアミノ酸配列
を配列番号２に示す。以上、本発明により配列番号１、
２にそれぞれ示すＶ_H、Ｖ_Lの全アミノ酸配列が決定さ
れ、該アミノ酸配列をコードするＤＮＡが提供された。

【００６１】実施例３ＣＤＲの決定重鎖及び軽鎖の可変領域の全般的構造は、互いに類似性
を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３
つの超可変領域、すなわちＣＤＲにより連結されてい
る。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的良く保存
されているが、一方、ＣＤＲのアミノ酸配列の変異性は
極めて高い〔カバトＥ．Ａ．(Kabat E.A.)ら、シーク
ェンシーズオブプロテインスオブイムノロジカ
ルインテレスト（Sequences of Proteins of Immunol
ogical Interest)、ＵＳデパートメントヘルスアン
ドヒューマンサービセス（１９８３）〕。このよう
な事実に基づき、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスに対
するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配
列（配列番号１、２）を、前記カバトらにより作成され
た抗体のアミノ酸配列のデータベースに当てはめて、相
同性を調べることによりＣＤＲを配列番号５〜１０に示
すごとく決定した。すなわち、配列番号５はＶ_HのＣＤ
Ｒ１、配列番号６はＶ_HのＣＤＲ２、配列番号７はＶ_H
のＣＤＲ３、配列番号８はＶ_LのＣＤＲ１、配列番号９
はＶ_LのＣＤＲ２、配列番号１０はＶ_LのＣＤＲ３のそ
れぞれのアミノ酸配列を示し、本発明によりＶ_H、Ｖ_L
のＣＤＲのアミノ酸配列が決定され、該アミノ酸配列を
それぞれコードするＤＮＡが提供された。

【００６２】実施例４クローン化されたｃＤＮＡの
発現Ｆｖ発現用プラスミドとしては参考例Ｂに示したプラス
ミドｐＦｖ−ＰＰがあり、該プラスミドはＶ_Hをコード
するＤＮＡを組込むためのＰｓｔＩ、ＳｍａＩサイト、
及びＶ_LをコードするＤＮＡを組込むためのＳａｃＩ、
ＳａｌＩサイトを有している。実施例１で調製されたプ
ラスミドｐＣ１７９Ｈ及びプラスミドｐＣ１７９Ｌよ
り、それぞれ調製されるＶ_H遺伝子、Ｖ_L遺伝子をプラ
スミドｐＦｖ−ＰＰ中のＶ_H遺伝子、Ｖ_L遺伝子とそれ
ぞれ置換え、連結するために、プラスミドｐＣ１７９Ｈ
より得られるＶ_H遺伝子の上流端にＰｓｔＩサイト、下
流端にＳｍａＩサイトをＰＣＲ法により導入した。ま
た、プラスミドｐＣ１７９Ｌより得られるＶ_L遺伝子の
上流端にＳａｃＩサイト、下流端にＳａｌＩサイトをＰ
ＣＲ法により導入した。すなわち、配列番号１９で示さ
れるような、ＰｓｔＩサイト導入用のＶ_H前方プライマ
ー、配列番号２０で示されるような、ＳｍａＩサイト導
入用のＶ_L後方プライマー、配列番号２１で示されるよ
うな、ＳａｃＩサイト導入用のＶ_L前方プライマー及
び、配列番号２２で示されるような、ＳａｌＩサイト導
入用のＶ_L後方プライマーを設計し、合成した。次に実
施例１−（３）−（ａ）に記載の方法に準じ、ＰＣＲを
行った。すなわち、プラスミドｐＣ１７９Ｈ（１０μｇ
／μｌ）を１μｌ、配列番号１９、２０でそれぞれ示さ
れるプライマー（２０pmol／μｌ）をそれぞれ２．５μ
ｌ、ＰＣＲ反応緩衝液を１０μｌ、２．５ユニットのＤ
ＮＡポリメラーゼアンプリタックを１μｌ、及びＨ
₂Ｏ８３μｌを含有するＰＣＲ溶液１００μｌを９４
℃（３０秒）、５５℃（１分）、７２℃（３分）の温度
サイクルで、２５回反復のＰＣＲを行い、プラスミドｐ
Ｆｖ−ＰＰに組込むためのＶ_Hインサートを増幅した。
また同様に、プラスミドｐＣ１７９Ｌ、配列番号２１、
２２でそれぞれ示されるプライマーを用いてＰＣＲを同
様に行い、プラスミドｐＦｖ−ＰＰに組込むためのＶ_L
インサートの増幅を行った。

【００６３】各ＰＣＲ増幅産物をＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、
及びＳａｃＩ、ＳａｌＩをそれぞれ用い切断した後、ア
ガロースゲル電気泳動で泳動させ、ゲル抜きを行い、ス
プレック−０１にて、それぞれ精製し、Ｖ_Hインサート
及びＶ_Lインサートを調製した。次にプラスミドｐＦｖ
−ＰＰをＰｓｔＩとＳｍａＩで切断し、アガロースゲル
電気泳動で泳動させ、プラスミド部分をゲル抜きし、更
にそれをスプレック−０１にて精製した。この精製プラ
スミドにＶ_Hインサートを挿入し、次に該プラスミドを
大腸菌ＢＭＨ７１−１８株で増やし、クローン体よりプ
ラスミドをアルカリ抽出法にて調製後、得られたプラス
ミドをＳａｃＩとＳａｌＩで切断した。続いて、このプ
ラスミドをアガロースゲル電気泳動で泳動し、プラスミ
ド部分をゲル抜きし、更にスプレット−０１にて精製し
た。精製プラスミドにＶ_Lインサートを挿入し、次に該
プラスミドを大腸菌ＢＭＨ７１−１８株で増やし、クロ
ーン体を得た。次に該クローン体よりプラスミドを調製
し、Ｖ_Hインサート、Ｖ_Lインサートの塩基配列を解析
し、ＰＣＲ法による増幅中にエラーが生じなかったこと
を確認し、Ｃ１７９のＦｖを発現するプラスミドをプラ
スミドＴ１９Ｃ１７９ＦｖｐｒｏＡと命名した。このプ
ラスミドで形質転換した大腸菌ＢＭＨ７１−１８株は大
腸菌BMH71-18／T19C179FvproA と命名した。

【００６４】この形質転換体はＣ１７９のＦｖとプロテ
インＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個との融合ポリペプ
チド（以下、Ｃ１７９Ｆｖ−ＰＰと略す）を発現する。
Ｃ１７９Ｆｖ−ＰＰをコードする塩基配列を配列番号３
４に示す。なお配列番号３４に示すＤＮＡ配列中、塩基
番号１０６から４６５はＶ_Hをコードする配列であり、
塩基番号６０１から９０２は、Ｖ_Lをコードする配列で
ある。また、塩基番号９２８から１１０１、及び塩基番
号１１０２から１２７５は、プロテインＡのＦ_C結合ド
メイン様構造をそれぞれコードする配列である。発現し
たＣ１７９Ｆｖ−ＰＰは、ＩｇＧ−セファロース６ＦＦ
によって簡単に精製することができる。またプラスミド
Ｔ１９Ｃ１７９ＦｖｐｒｏＡのＶ_Lインサートの後にス
トップコドンを部位特異的変異方法により導入すること
により、Ｃ１７９のＦｖのみを発現するプラスミドに改
変することができる。

【００６５】（２）ｓｃＦｖ発現プラスミドの作製Ｖ_Hインサート、Ｖ_Lインサート間にリンカーを導入
し、ｓｃＦｖ発現用のプラスミドを以下のように作製し
た。

【００６６】（ａ）ｓｃＦｖ用Ｖ_Hインサートの調製、
精製配列番号２３で示されるリンカー導入用プライマーを設
計し、合成した。次に該プライマー及び前出の配列番号
１９で示されるＰｓｔＩサイト導入用プライマーを用
い、プラスミドｐＣ１７９Ｈを鋳型とし、ｓｃＦｖ用Ｖ
_HインサートのＰＣＲ増幅を行った。すなわち、プラス
ミドｐＣ１７９Ｈ（１０μｇ／μｌ）を１μｌ、配列番
号１９、２３でそれぞれ表されるプライマー（２０pmol
／μｌ）をそれぞれ５μｌ、ＰＣＲ反応緩衝液１０μ
ｌ、２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼアンプリタ
ックを１μｌ、及びＨ₂Ｏを７８μｌを含有するＰＣＲ
溶液１００μｌを９４℃（３０秒）、５５℃（１分
間）、７２℃（１分間）の温度サイクルで２５回反復の
ＰＣＲを行い、ｓｃＦｖ用Ｖ_Hインサートを増幅した。

【００６７】（ｂ）ＰＣＲ生成物の精製、及び断片化前記工程のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ生
成物を、エタノール沈殿により回収した。次に、ＤＮＡ
沈殿物を１０ユニットの制限酵素ＰｓｔＩ及びＢａｍＨ
Ｉにより３７℃にて４時間消化し、そして生ずるＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動により分離した。約３５
０bp長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片よりスプレ
ック−０１を用いて該ＤＮＡ断片を精製した。

【００６８】（ｃ）ｓｃＦｖ用リンカーの調製、及び精
製配列番号２４、２５でそれぞれ示されるリンカー合成用
のオリゴヌクレオチドを設計し、合成した。次に該オリ
ゴヌクレオチドを各々２００pmolずつ加え、６５℃で５
分間反応後、室温でゆっくりとアニーリングさせた。次
に、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造社製）を用
いて、末端平滑を行った。その後、そのＤＮＡ溶液を１
０ユニットのＰｓｔＩ及びＳａｃＩにより３７℃にて４
時間消化し、生ずるＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳
動により分離した。約６０bp長のＤＮＡ断片を含有する
アガロース片よりスプレック−０１を用いて該ＤＮＡ断
片を精製した。

【００６９】（ｄ）ｓｃＦｖ発現プラスミドの構築前出のプラスミドＴ１９Ｃ１７９ＦｖｐｒｏＡをＰｓｔ
Ｉ及びＳａｃＩで消化することで調製したプラスミド部
分に、前出のｓｃＦｖ用リンカーをＤＮＡライゲーショ
ンキットを用いて挿入した。更にそのｓｃＦｖ用リン
カーが挿入されたプラスミドを大腸菌ＢＭＨ７１−１８
株で増やし、クローン体よりプラスミドをアルカリ抽出
法にて調製後、ｓｃＦｖ用リンカーが挿入されたプラス
ミドを２μｇ調製した。次に該プラスミドをＰｓｔＩと
ＢａｍＨＩで消化することで調製したプラスミド部分
に、前出のｓｃＦｖ用Ｖ_HインサートをＤＮＡライゲー
ションキットを用いて、挿入した。次に該プラスミド
で大腸菌ＢＭＨ７１−１８株を形質転換し、該形質転換
体を増殖させ、クローン体を得た。次に該クローン体よ
りプラスミドを調製し、ｓｃＦｖ用Ｖ_Hインサート、ｓ
ｃＦｖ用リンカー、Ｖ_Lインサートの塩基配列を確認
し、ＰＣＲ法による増幅中やリンカー導入の際にエラー
が生じなかったことを確認し、Ｃ１７９のｓｃＦｖを発
現するプラスミドをプラスミドＴ１９Ｃ１７９ＳｃＦＶ
ｐｒｏＡと命名した。このプラスミドで形質転換した大
腸菌ＢＭＨ７１−１８株は Escherichia coli BMH71-18
／T19C179ScFVproA と命名、表示され、工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１４１９１として
寄託されている。なお本発明のＶ_H遺伝子、Ｖ_L遺伝
子、各ＣＤＲをコードするＤＮＡは当該プラスミドＴ１
９Ｃ１７９ＳｃＦｖｐｒｏＡより調製できる。

【００７０】（ｅ）Ｃ１７９型ｓｃＦｖの発現前記に示したように調製した形質転換体を５０μｇ／ml
のアンピシリン及び０．１％グルコースを含む２×ＹＴ
培地（前出モレキュラークローニング、アラボラトリ
ーマニュアル）に接種し、３０℃で一晩振とう培養し
た。この培養物１mlを１００mlの５０μｇ／mlアンピシ
リン、０．１％グルコースを含む２×ＹＴ培地に接種し
３０℃で振とう培養した。培養液の濁度が分光光度計で
Ｏ．Ｄ．₆₀₀＝１となったところで最終濃度１mMとなる
ようにＩＰＴＧを添加し、更に３０℃で２０時間振とう
培養した。培養後、遠心分離により菌体を得た。更に菌
体を１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５mlに懸
濁後、超音波処理にて菌体をつぶし、遠心分離により上
清を得た。得られた上清約５mlを０．４５μｍ、０．２
２μｍのフィルター（ミリポア社製）の順番でろ過し
た。このろ液からのｓｃＦｖフラグメントの精製には、
ＩｇＧセファロース６ＦＦ（ファルマシア社製）を用い
た。すなわち、ＩｇＧセファロース６ＦＦを充てんした
カラムに、ろ液をゆっくりと通すことでｓｃＦｖフラグ
メントを吸着させ、結合用緩衝液〔１０mMトリス−塩酸
緩衝液ｐＨ８．０、１４０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴ
Ａ、０．１mM ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフ
ルオライド）〕で洗浄後、５０mMのグリシン・塩酸緩衝
液（ｐＨ２．５）で溶出させた。溶出液を１Ｍのトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）ですばやく中和し、Ｃ１７
９のｓｃＦｖとプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造
２個との融合ポリペプチド（以下、ｓｃＦｖ−ＰＰと略
す）を得た。なおこのｓｃＦｖ−ＰＰをコードする塩基
配列を配列番号３５に示す。なお配列番号３５に示すＤ
ＮＡ配列中、塩基番号１０６から４７１はＶ_Hをコード
する配列であり、塩基番号５２９から８３０は、Ｖ_Lを
コードする配列である。また、塩基番号８５６から１０
２９、及び塩基番号１０３０から１２０３は、プロテイ
ンＡのＦ_C結合ドメイン様構造をそれぞれコードする配
列である。なおまた、プラスミドＴ１９Ｃ１７９ＳｃＦ
ＶｐｒｏＡのＶ_Lインサートの後にストップコドンを部
位特異的変異方法により導入することによりＣ１７９の
ｓｃＦｖのみを発現するプラスミドに改変することがで
きる。

【００７１】実施例５ヒトインフルエンザＡ型ウイ
ルスの検出本発明により得られるｓｃＦｖによるヒトインフルエン
ザＡ型ウイルスの検出を、ＥＬＩＳＡ法にて以下のよう
に行った。９６穴マイクロタイタープレート（ファルコ
ン３０７２：ベクトンディキンソン社製）の各ウエル
に、実施例４で調製した、Ｃ１７９の抗体可変領域が発
現した。ｓｃＦ_V−ＰＰ（１０μg/ml）を１００μｌ加
えた。次にプレートを３７℃、１時間３０分間保温し、
ｓｃＦ_V−ＰＰをプレートに固定化した後、ブロッキン
グ用タンパク質溶液（ブロックエース：雪印社製）を用
いてブロッキングを行った。ブロッキング後、ヒトイン
フルエンザＡ型ウイルスとして、参考例Ａ−１に記載の
方法で調製したＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１サブタイ
プ）、Ａ／Okuda ／５７（Ｈ２Ｎ２サブタイプ）、Ａ２
／Aichi ／２／６８（Ｈ３Ｎ２サブタイプ）の各サブタ
イプの各ウイルス希釈液（１０ＨＡ単位／ml）１００μ
l を検定用の各ウエルにそれぞれ加え、１時間反応さ
せ、０．０５％ツウィーン−２０を含むＰＢＳで洗浄し
た。次に、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスに結合製を
示す、抗Ａ／Okuda ／５７血清（宝酒造社製）の５００
倍希釈液１００μｌを加え、１時間反応させた。なお、
抗Ａ／Okuda ／５７血清は次のように作製した。すなわ
ちＡ／Okuda ／５７（５０００ＨＡ単位）をフロイント
完全アジュバントに使用前に懸濁し、１ヵ月間隔で、筋
肉内注射により、ウサギに２度免疫した。２回目の筋肉
内注射の１０日後に、心臓より全採血し、血清を調製
し、抗Ａ／Okuda ／５７血清を得た。前出の抗Ａ／Okud
a ／５７血清反応液は洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗ウサギイムノグロブリンＧ溶液（カッペル社製）の
希釈液１００μｌを加えた。１時間３０分間保温の後、
ペルオキシダーゼ反応を、基質緩衝液〔０．０３％のＨ
₂Ｏ₂、１mg／mlのｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩の
クエン酸−リン酸溶液（ｐＨ５．２）〕を加え、室温で
５分間反応させた。次に２Ｍの硫酸を加えることにより
反応を停止させ、４９２nmにおける吸光度を測定し、ｓ
ｃＦｖ−ＰＰの各サブタイプへの結合性を検定した。こ
の結果を表２に示す。なお、上記結合性の検定、対照は
各３連で行い、表２の４９２nmでの吸光度は、その平均
値が示されている。

【００７２】

【表２】表２ ─────────────────────── ウイルス・サブタイプ４９２nm 吸光度 ─────────────────────── Ｈ１Ｎ１０．１５０Ｈ２Ｎ２０．３０３Ｈ３Ｎ２０．０７４対照０．０７４ ───────────────────────

【００７３】表２で明らかなように、本発明により得ら
れたｓｃＦｖはＨ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイ
プに結合性を示し、Ｈ３Ｎ２サブタイプとは結合性を示
さない。よって、本発明で得られたｓｃＦｖ−ＰＰはヒ
トインフルエンザＡ型ウイルスの検出、タイピングが有
用である。

【００７４】

【発明の効果】本発明により、ヒトインフルエンザウイ
ルスのＨ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプを共通
認識し、かつ、該ウイルスに対し、中和活性を有するモ
ノクローナル抗体の可変領域、ＣＤＲをコードする遺伝
子が特定され、これらの遺伝子は種々の人工抗体、抗原
結合性ポリペプチドの遺伝子工学的製造において有用で
ある。また、得られた人工抗体、ポリペプチドは、ヒト
インフルエンザウイルスの診断、治療に有用である。

【００７５】

【配列表】

【００７６】配列番号：1 配列の長さ：116 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Phe Thr Leu Thr 20 25 30 Asp Asp Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu 35 40 45 Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asp Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr 50 55 60 Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 65 70 75 Asn Ser Gln Ser Ile Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Val 80 85 90 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Lys Gly Tyr Phe 95 100 105 Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 110 115

【００７７】配列番号：2 配列の長さ：98 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Gly Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly 20 25 30 Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Leu Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe 95

【００７８】配列番号：3 配列の長さ：347 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GAG GTG AAG CTG GTG GAG TCT GGA GGA GGC CTG GTA CAG CCT GGG 45 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 GGT TCT CTG AGA CTC TCC TGT GGA ACT TCT GGA TTC ACC CTC ACT 90 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Phe Thr Leu Thr 20 25 30 GAT GAC TAC ATG ACC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG GCA CTT 135 Asp Asp Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu 35 40 45 GAG TGG TTG GGT TTT ATT AGA GAC AGA GCT AAT GGT TAC ACA ACA 180 Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asp Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr 50 55 60 GAG TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAT 225 Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 65 70 75 AAT TCC CAA AGC ATC GTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GTT 270 Asn Ser Gln Ser Ile Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Val 80 85 90 GAG GAC AGT GCC ACT TAT TAC TGT GCA AGG CCC AAA GGC TAC TTT 315 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Lys Gly Tyr Phe 95 100 105 CCC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA AC 347 Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 110 115

【００７９】配列番号：4 配列の長さ：295 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：mRNA to cDNA 配列： GAC ATT CAG ATG ACC CAG TCT CCT GCC TCC CAG TCT GCA TCT CTG 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 GGA GAA AGT GTC ACC ATC ACA TGC CTG GCA AGT CAG ACC ATT GGT 90 Gly Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly 20 25 30 ACA TGG TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA TCT CCT CAG 135 Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln 35 40 45 CTC CTG ATT TAT GCT GCA ACC AGC TTG GCA GAT GGG GTC CCA TCA 180 Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 50 55 60 AGG TTC AGT GGT AGT GGA TCT GGC ACA AAA TTT TCC TTC AAG ATC 225 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile 65 70 75 AGC AGC CTA CAG GCT GAA GAT TTT GTA AGT TAT TAC TGT CAA CAA 270 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 CTT TAC AGT ACT CCG TGG ACG TTC G 295 Leu Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe 95

【００８０】配列番号：5 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：C179 重鎖

【００８１】配列番号：6 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチド起源： C179 重鎖配列： Phe Ile Arg Asp Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu 1 5 10

【００８２】配列番号：7 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：C179重鎖

【００８３】配列番号：8 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチド起源： C179 軽鎖

【００８４】配列番号：9 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：C179軽鎖

【００８５】配列番号：10 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：C179軽鎖

【００８６】配列番号：11 配列の長さ：33 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GGGAATTCAT GRASTTSKGG YTMARCTKGR TTT 33

【００８７】配列番号：12 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ARTARCCCTT GACCAGGCAT 20

【００８８】配列番号：13 配列の長さ：14 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TGGTGGGAAG ATGG 14

【００８９】配列番号：14 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：C179重鎖配列： Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu

【００９０】配列番号：15 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源：C179軽鎖配列： Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala 1 5 10

【００９１】配列番号：16 配列の長さ：1952 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列： AAGCTTGCAT GCAAATTCTA TTTCAAGGAG ACAGTCATAA TGAAATACCT ATTGCCTACG 60 GCAGCCGCTG GATTGTTATT ACTCGCTGCC CAACCAGCGA TGGCCCAGGT GCAGCTGCAG 120 GAGTCAGGAC CTGGCCTGGT GGCGCCCTCA CAGAGCCTGT CCATCACATG CACCGTCTCA 180 GGGTTCTCAT TAACCGGCTA TGGTGTAAAC TGGGTTCGCC AGCCTCCAGG AAAGGGTCTG 240 GAGTGGCTGG GAATGATTTG GGGTGATGGA AACACAGACT ATAATTCAGC TCTCAAATCC 300 AGACTGAGCA TCAGCAAGGA CAACTCCAAG AGCCAAGTTT TCTTAAAAAT GAACAGTCTG 360 CACACTGATG ACACAGCCAG GTACTACTGT GCCAGAGAGA GAGATTATAG GCTTGACTAC 420 TGGGGCCAAG GCACCACGGT CACCGTCTCC TCATAATAAG AGCTATCCCG GGAGCTTGCA 480 TGCAAATTCT ATTTCAAGGA GACAGTCATA ATGAAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT 540 GGATTGTTAT TACTCGCTGC CCAACCAGCG ATGGCCGACA TCGAGCTCAC CCAGTCTCCA 600 GCCTCCCTTT CTGCGTCTGT GGGAGAAACT GTCACCATCA CATGTCGAGC AAGTGGGAAT 660 ATTCACAATT ATTTAGCATG GTATCAGCAG AAACAGGGAA AATCTCCTCA GCTCCTGGTC 720 TATTATACAA CAACCTTAGC AGATGGTGTG CCATCAAGGT TCAGTGGCAG TGGATCAGGA 780 ACACAATATT CTCTCAAGAT CAACAGCCTG CAACCTGAAG ATTTTGGGAG TTATTACTGT 840 CAACATTTTT GGAGTACTCC TCGGACGTTC GGTGGAGGCA CCAAGCTGGA GTCGACTCCA 900 TTCGTTTGTG AATATCAAGG CCAATCGTCT GACCTGCCTC AACCTCCTGT CAATGCTGGC 960 GGCGGCTCTG GTGGTGGTTC TGGTGGCGGC TCTGAGGGTG GTGGCTCTGA GGGTGGCGGT 1020 TCTGAGGGTG GCGGCTCTGA GGGAGGCGGT TCCGGTGGTG GCTCTGGTTC CGGTGATTTT 1080 GATTATGAAA AGATGGCAAA CGCTAATAAG GGGGCTATGA CCGAAAATGC CGATGAAAAC 1140 GCGCTACAGT CTGACGCTAA AGGCAAACTT GATTCTGTCG CTACTGATTA CGGTGCTGCT 1200 ATCGATGGTT TCATTGGTGA CGTTTCCGGC CTTGCTAATG GTAATGGTGC TACTGGTGAT 1260 TTTGCTGGCT CTAATTCCCA AATGGCTCAA GTCGGTGACG GTGATAATTC ACCTTTAATG 1320 AATAATTTCC GTCAATATTT ACCTTCCCTC CCTCAATCGG TTGAATGTCG CCCTTTTGTC 1380 TTTAGCGCTG GTAAACCATA TGAATTTTCT ATTGATTGTG ACAAAATAAA CTTATTCCGT 1440 GGTGTCTTTG CGTTTCTTTT ATATGTTGCC ACCTTTATGT ATGTATTTTC TACGTTTGCT 1500 AACATACTGC GTAATAAGGA GTCTTAATCA TGCCAGTTCT TTTGGGTGCT AGCTGTCGAC 1560 TGCGCAACAC GATGAAGCCG TAGACAACAA ATTCAACAAA GAACAACAAA ACGCGTTCTA 1620 TGAGATCTTA CATTTACCTA ACTTAAACGA AGAACAACGA AACGCCTTCA TCCAAAGTTT 1680 AAAAGATGAC CCAAGCCAAA GCGCTAACCT TTTAGCAGAA GCTAAAAAGC TAAATGATGC 1740 TCAGGCGCCG AAAGTAGACA ACAAATTCAA CAAAGAACAA CAAAACGCGT TCTATGAGAT 1800 CTTACATTTA CCTAACTTAA ACGAAGAACA ACGAAACGCC TTCATCCAAA GTTTAAAAGA 1860 TGACCCAAGC CAAAGCGCTA ACCTTTTAGC AGAAGCTAAA AAGCTAAATG ATGCTCAGGC 1920 GCCGAAAGTA GACGCGAATT AGCTGGGAAT TC 1952

【００９２】配列番号：17 配列の長さ：630 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列： CCATTCGTTT GTGAATATCA AGGCCAATCG TCTGACCTGC CTCAACCTCC TGTCAATGCT 60 GGCGGCGGCT CTGGTGGTGG TTCTGGTGGC GGCTCTGAGG GTGGTGGCTC TGAGGGTGGC 120 GGTTCTGAGG GTGGCGGCTC TGAGGGAGGC GGTTCCGGTG GTGGCTCTGG TTCCGGTGAT 180 TTTGATTATG AAAAGATGGC AAACGCTAAT AAGGGGGCTA TGACCGAAAA TGCCGATGAA 240 AACGCGCTAC AGTCTGACGC TAAAGGCAAA CTTGATTCTG TCGCTACTGA TTACGGTGCT 300 GCTATCGATG GTTTCATTGG TGACGTTTCC GGCCTTGCTA ATGGTAATGG TGCTACTGGT 360 GATTTTGCTG GCTCTAATTC CCAAATGGCT CAAGTCGGTG ACGGTGATAA TTCACCTTTA 420 ATGAATAATT TCCGTCAATA TTTACCTTCC CTCCCTCAAT CGGTTGAATG TCGCCCTTTT 480 GTCTTTAGCG CTGGTAAACC ATATGAATTT TCTATTGATT GTGACAAAAT AAACTTATTC 540 CGTGGTGTCT TTGCGTTTCT TTTATATGTT GCCACCTTTA TGTATGTATT TTCTACGTTT 600 GCTAACATAC TGCGTAATAA GGAGTCTTAA 630

【００９３】配列番号：18 配列の長さ：348 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列： GTAGACAACA AATTCAACAA AGAACAACAA AACGCGTTCT ATGAGATCTT ACATTTACCT 60 AACTTAAACG AAGAACAACG AAACGCCTTC ATCCAAAGTT TAAAAGATGA CCCAAGCCAA 120 AGCGCTAACC TTTTAGCAGA AGCTAAAAAG CTAAATGATG CTCAGGCGCC GAAAGTAGAC 180 AACAAATTCA ACAAAGAACA ACAAAACGCG TTCTATGAGA TCTTACATTT ACCTAACTTA 240 AACGAAGAAC AACGAAACGC CTTCATCCAA AGTTTAAAAG ATGACCCAAG CCAAAGCGCT 300 AACCTTTTAG CAGAAGCTAA AAAGCTAAAT GATGCTCAGG CGCCGAAA 348

【００９４】配列番号：19 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CGGATCCTGC AGGAGTCTGG AGGAGGCCTG 30

【００９５】配列番号：20 配列の長さ：42 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CGGATCCCGG GATAGCTCTT ATTAGACGAT GACTGAGGTT CC 42

【００９６】配列番号：21 配列の長さ：31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GGAATTCGAG CTCACCCAGT CTCCTGCCTC C 31

【００９７】配列番号：22 配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GGAATTCTAC GTCGACTCCA GCTTGGTGCC TCCAC 35

【００９８】配列番号：23 配列の長さ：37 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CCCGGATCCA CCGCCACCTG AGGAGACGAT GACTGAG 37

【００９９】配列番号：24 配列の長さ：43 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CTACACTGCA GATGGATCCG GCGGTGGTGG GTCGGGTGGC GGC 43

【０１００】配列番号：25 配列の長さ：42 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CCCGAGCTCG ATGTCAGATC CGCCGCCACC CGACCCACCA CC 42

【０１０１】配列番号：26 配列の長さ：923 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列： AAGCTTGCAT GCAAATTCTA TTTCAAGGAG ACAGTCATAA TGAAATACCT ATTGCCTACG 60 GCAGCCGCTG GATTGTTATT ACTCGCTGCC CAACCAGCGA TGGCCCAGGT GCAGCTGCAG 120 GAGTCAGGAC CTGGCCTGGT GGCGCCCTCA CAGAGCCTGT CCATCACATG CACCGTCTCA 180 GGGTTCTCAT TAACCGGCTA TGGTGTAAAC TGGGTTCGCC AGCCTCCAGG AAAGGGTCTG 240 GAGTGGCTGG GAATGATTTG GGGTGATGGA AACACAGACT ATAATTCAGC TCTCAAATCC 300 AGACTGAGCA TCAGCAAGGA CAACTCCAAG AGCCAAGTTT TCTTAAAAAT GAACAGTCTG 360 CACACTGATG ACACAGCCAG GTACTACTGT GCCAGAGAGA GAGATTATAG GCTTGACTAC 420 TGGGGCCAAG GCACCACGGT CACCGTCTCC TCATAATAAG AGCTATCCCG GGAGCTTGCA 480 TGCAAATTCT ATTTCAAGGA GACAGTCATA ATGAAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT 540 GGATTGTTAT TACTCGCTGC CCAACCAGCG ATGGCCGACA TCGAGCTCAC CCAGTCTCCA 600 GCCTCCCTTT CTGCGTCTGT GGGAGAAACT GTCACCATCA CATGTCGAGC AAGTGGGAAT 660 ATTCACAATT ATTTAGCATG GTATCAGCAG AAACAGGGAA AATCTCCTCA GCTCCTGGTC 720 TATTATACAA CAACCTTAGC AGATGGTGTG CCATCAAGGT TCAGTGGCAG TGGATCAGGA 780 ACACAATATT CTCTCAAGAT CAACAGCCTG CAACCTGAAG ATTTTGGGAG TTATTACTGT 840 CAACATTTTT GGAGTACTCC TCGGACGTTC GGTGGAGGCA CCAAGCTGGA AATCAAACGG 900 TAATAAGGAT CCAGCTCGAA TTC 923

【０１０２】配列番号：27 配列の長さ：34 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GCGAATTCTA AGTCGACTCC AGCTTGGTGC CTCC 34

【０１０３】配列番号：28 配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CGACGTTGTA AAACGACGGC CAGTG 25

【０１０４】配列番号：29 配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GCGTCGACTG CGCAACACGA TGAAGCC 27

【０１０５】配列番号：30 配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ACGAATTCCC AGCTAATTCG CGTCTAC 27

【０１０６】配列番号：31 配列の長さ：58 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 20 25 30 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu 35 40 45 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55

【０１０７】配列番号：32 配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GAGTCGACTC CATTCGTTTG TGAAT 25

【０１０８】配列番号：33 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CTGTCGACAG CTAGCACCCA AAAGAACTGG 30

【０１０９】配列番号：34 配列の長さ：1300 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列： AAGCTTGCAT GCAAATTCTA TTTCAAGGAG ACAGTCATA ATG AAA TAC CTA TTG 54 Met Lys Tyr Leu Leu 1 5 CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG 99 Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala 10 15 20 ATG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGA GGA GGC CTG GTA CAG 144 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 25 30 35 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCC TGT GGA ACT TCT GGA TTC ACC 189 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Phe Thr 40 45 50 CTC ACT GAT GAC TAC ATG ACC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG 234 Leu Thr Asp Asp Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys 55 60 65 GCA CTT GAG TGG TTG GGT TTT ATT AGA GAC AGA GCT AAT GGT TAC 279 Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asp Arg Ala Asn Gly Tyr 70 75 80 ACA ACA GAG TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC 324 Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 85 90 95 AGA GAT AAT TCC CAA AGC ATC GTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG 369 Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu 100 105 110 AGA GTT GAG GAC AGT GCC ACT TAT TAC TGT GCA AGG CCC AAA GGC 414 Arg Val Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Lys Gly 115 120 125 TAC TTT CCC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC 459 Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 130 135 140 ATC GTC TAATAAGAGC TATCCCGGGA GCTTGCATGC AAATTCTATT TCAAGGAGAC 515 Ile Val AGTCATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA 564 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu 1 5 10 CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCC GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT 609 Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser 15 20 25 CCT GCC TCC CAG TCT GCA TCT CTG GGA GAA AGT GTC ACC ATC ACA 654 Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly Glu Ser Val Thr Ile Thr 30 35 40 TGC CTG GCA AGT CAG ACC ATT GGT ACA TGG TTA GCA TGG TAT CAG 699 Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln 45 50 55 CAG AAA CCA GGG AAA TCT CCT CAG CTC CTG ATT TAT GCT GCA ACC 744 Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr 60 65 70 AGC TTG GCA GAT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGT AGT GGA TCT 789 Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 75 80 85 GGC ACA AAA TTT TCC TTC AAG ATC AGC AGC CTA CAG GCT GAA GAT 834 Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 90 95 100 TTT GTA AGT TAT TAC TGT CAA CAA CTT TAC AGT ACT CCG TGG ACG 879 Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 105 110 115 TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAG TCG ACT GCG CAA CAC GAT GAA 924 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ser Thr Ala Gln His Asp Glu 120 125 130 GCC GTA GAC AAC AAA TTC AAC AAA GAA CAA CAA AAC GCG TTC TAT 969 Ala Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 135 140 145 GAG ATC TTA CAT TTA CCT AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGA AAC GCC 1014 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala 150 155 160 TTC ATC CAA AGT TTA AAA GAT GAC CCA AGC CAA AGC GCT AAC CTT 1059 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu 165 170 175 TTA GCA GAA GCT AAA AAG CTA AAT GAT GCT CAG GCG CCG AAA GTA 1104 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val 180 185 190 GAC AAC AAA TTC AAC AAA GAA CAA CAA AAC GCG TTC TAT GAG ATC 1149 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 195 200 205 TTA CAT TTA CCT AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGA AAC GCC TTC ATC 1194 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile 210 215 220 CAA AGT TTA AAA GAT GAC CCA AGC CAA AGC GCT AAC CTT TTA GCA 1239 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala 225 230 235 GAA GCT AAA AAG CTA AAT GAT GCT CAG GCG CCG AAA GTA GAC GCG 1284 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala 240 245 250 AAT TAGCTGGGAA TTC 1300 Asn 255

【０１１０】配列番号：35 配列の長さ：1228 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列： AAGCTTGCAT GCAAATTCTA TTTCAAGGAG ACAGTCATA ATG AAA TAC CTA TTG 54 Met Lys Tyr Leu Leu 1 5 CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG 99 Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala 10 15 20 ATG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGA GGA GGC CTG GTA CAG 144 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 25 30 35 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCC TGT GGA ACT TCT GGA TTC ACC 189 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Phe Thr 40 45 50 CTC ACT GAT GAC TAC ATG ACC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG 234 Leu Thr Asp Asp Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys 55 60 65 GCA CTT GAG TGG TTG GGT TTT ATT AGA GAC AGA GCT AAT GGT TAC 279 Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asp Arg Ala Asn Gly Tyr 70 75 80 ACA ACA GAG TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC 324 Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 85 90 95 AGA GAT AAT TCC CAA AGC ATC GTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG 369 Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu 100 105 110 AGA GTT GAG GAC AGT GCC ACT TAT TAC TGT GCA AGG CCC AAA GGC 414 Arg Val Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Lys Gly 115 120 125 TAC TTT CCC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC 459 Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 130 135 140 ATC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGA TCC GGC GGT GGT GGG TCG GGT 504 Ile Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 145 150 155 GGC GGC GGA TCT GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCT GCC TCC CAG 549 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln 160 165 170 TCT GCA TCT CTG GGA GAA AGT GTC ACC ATC ACA TGC CTG GCA AGT 594 Ser Ala Ser Leu Gly Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser 175 180 185 CAG ACC ATT GGT ACA TGG TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG 639 Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 190 195 200 AAA TCT CCT CAG CTC CTG ATT TAT GCT GCA ACC AGC TTG GCA GAT 684 Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp 205 210 215 GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGT AGT GGA TCT GGC ACA AAA TTT 729 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe 220 225 230 TCC TTC AAG ATC AGC AGC CTA CAG GCT GAA GAT TTT GTA AGT TAT 774 Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Val Ser Tyr 235 240 245 TAC TGT CAA CAA CTT TAC AGT ACT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGC 819 Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly 250 255 260 ACC AAG CTG GAG TCG ACT GCG CAA CAC GAT GAA GCC GTA GAC AAC 864 Thr Lys Leu Glu Ser Thr Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Asn 265 270 275 AAA TTC AAC AAA GAA CAA CAA AAC GCG TTC TAT GAG ATC TTA CAT 909 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 280 285 290 TTA CCT AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGA AAC GCC TTC ATC CAA AGT 954 Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser 295 300 305 TTA AAA GAT GAC CCA AGC CAA AGC GCT AAC CTT TTA GCA GAA GCT 999 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 310 315 320 AAA AAG CTA AAT GAT GCT CAG GCG CCG AAA GTA GAC AAC AAA TTC 1044 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe 325 330 335 AAC AAA GAA CAA CAA AAC GCG TTC TAT GAG ATC TTA CAT TTA CCT 1089 Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 340 345 350 AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGA AAC GCC TTC ATC CAA AGT TTA AAA 1134 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys 355 360 365 GAT GAC CCA AGC CAA AGC GCT AAC CTT TTA GCA GAA GCT AAA AAG 1179 Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys 370 375 380 CTA AAT GAT GCT CAG GCG CCG AAA GTA GAC GCG AAT TAGCTGGGAA 1225 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Asn 385 390 TTC 1228

【０１１１】配列番号：36 配列の長さ：1288 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列： AAGCTTGCAT GCAAATTCTA TTTCAAGGAG ACAGTCATAA TGAAATACCT ATTGCCTACG 60 GCAGCCGCTG GATTGTTATT ACTCGCTGCC CAACCAGCGA TGGCCCAGGT GCAGCTGCAG 120 GAGTCAGGAC CTGGCCTGGT GGCGCCCTCA CAGAGCCTGT CCATCACATG CACCGTCTCA 180 GGGTTCTCAT TAACCGGCTA TGGTGTAAAC TGGGTTCGCC AGCCTCCAGG AAAGGGTCTG 240 GAGTGGCTGG GAATGATTTG GGGTGATGGA AACACAGACT ATAATTCAGC TCTCAAATCC 300 AGACTGAGCA TCAGCAAGGA CAACTCCAAG AGCCAAGTTT TCTTAAAAAT GAACAGTCTG 360 CACACTGATG ACACAGCCAG GTACTACTGT GCCAGAGAGA GAGATTATAG GCTTGACTAC 420 TGGGGCCAAG GCACCACGGT CACCGTCTCC TCATAATAAG AGCTATCCCG GGAGCTTGCA 480 TGCAAATTCT ATTTCAAGGA GACAGTCATA ATGAAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT 540 GGATTGTTAT TACTCGCTGC CCAACCAGCG ATGGCCGACA TCGAGCTCAC CCAGTCTCCA 600 GCCTCCCTTT CTGCGTCTGT GGGAGAAACT GTCACCATCA CATGTCGAGC AAGTGGGAAT 660 ATTCACAATT ATTTAGCATG GTATCAGCAG AAACAGGGAA AATCTCCTCA GCTCCTGGTC 720 TATTATACAA CAACCTTAGC AGATGGTGTG CCATCAAGGT TCAGTGGCAG TGGATCAGGA 780 ACACAATATT CTCTCAAGAT CAACAGCCTG CAACCTGAAG ATTTTGGGAG TTATTACTGT 840 CAACATTTTT GGAGTACTCC TCGGACGTTC GGTGGAGGCA CCAAGCTGGA GTCGACTGCG 900 CAACACGATG AAGCCGTAGA CAACAAATTC AACAAAGAAC AACAAAACGC GTTCTATGAG 960 ATCTTACATT TACCTAACTT AAACGAAGAA CAACGAAACG CCTTCATCCA AAGTTTAAAA 1020 GATGACCCAA GCCAAAGCGC TAACCTTTTA GCAGAAGCTA AAAAGCTAAA TGATGCTCAG 1080 GCGCCGAAAG TAGACAACAA ATTCAACAAA GAACAACAAA ACGCGTTCTA TGAGATCTTA 1140 CATTTACCTA ACTTAAACGA AGAACAACGA AACGCCTTCA TCCAAAGTTT AAAAGATGAC 1200 CCAAGCCAAA GCGCTAACCT TTTAGCAGAA GCTAAAAAGC TAAATGATGC TCAGGCGCCG 1260 AAAGTAGACG CGAATTAGCT GGGAATTC 1288

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＭ１３ＦｖのＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ挿入
断片とその付近の概略図である。

【図２】インフルエンザウイルス感染群の生存率を示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 9161−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 Ｌ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者高畠貴志愛知県名古屋市名東区西里町５丁目55番地 (72)発明者加藤郁之進滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記特性（ａ）及び（ｂ）を有する抗ヒ
トインフルエンザウイルス抗体の可変領域をコードする
ＤＮＡ。（ａ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブ
タイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのヘマグルチニン分子の
幹領域を認識し、Ｈ３Ｎ２サブタイプのヘマグルチニン
分子の幹領域は認識しない。（ｂ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブ
タイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプに中和活性を有し、Ｈ３
Ｎ２サブタイプには中和活性を有さない。
【請求項２】配列表の配列番号１、２に示されるアミ
ノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を有する請求
項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】配列表の配列番号３、４に示される塩基
配列を有する請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】請求項３記載のＤＮＡにハイブリダイズ
可能な請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項５】請求項１記載の抗ヒトインフルエンザウ
イルス抗体の可変領域をコードするＤＮＡ中の相補性決
定領域をコードするＤＮＡ。
【請求項６】配列表の配列番号５、６、７、８、９、
１０で示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩
基配列を有する請求項５記載のＤＮＡ。