JPH07270416A - 酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 細菌由来のルシフェラーゼを使用する酵素免
疫測定法において、酵素活性の失活を伴わない方法を提
供する。 【構成】 ルシフェラーゼを標識酵素とする酵素標識抗
体又は酵素標識抗原を使用する酵素免疫測定法におい
て、細菌由来のルシフェラーゼを用い、チオール基を導
入する架橋試薬を用いてルシフェラーゼにチオール基を
導入した後、チオール基に特異的に反応する酸化剤又は
メルカプチド形成剤を添加して前記ルシフェラーゼ中の
チオール基を保護した後、二価性架橋剤を用いて前記ル
シフェラーゼに抗体又は抗原を結合させ、その後還元剤
を加えてチオール基保護基を解離せしめることにより酵
素標識抗体又は酵素標識抗原を調製する酵素免疫測定
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細菌由来のルシフェラ
ーゼの酵素活性の失活を防止して迅速な測定をすること
ができる酵素免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＩｇＥ抗体等の生体内微量物質を測定し
て病気の診断等に用いる臨床化学分析は近年その開発が
進み、そのうち免疫測定法は、血清等の複雑な生体混合
物中から免疫反応で特異的に微量物質を同定できること
から重視されはじめている。上記免疫測定法の中でも、
標識酵素を用いる酵素免疫測定法は、放射性同位元素を
用いることもなく廉価で危険な廃棄物を伴わず、しかも
測定感度、精度ともに放射性同位元素を用いる測定法と
同程度であることから注目されている。

【０００３】上記酵素免疫測定法において、酵素として
発光酵素であるウミホタル由来のルシフェラーゼを使用
して測定効果を上げる技術が特開平５−１１３４４３号
公報に開示されている。しかしながら、上記ウミホタル
由来のルシフェラーゼは糖蛋白質であり、遺伝子組み換
え技術を応用するとしても遺伝子宿主として大腸菌等の
細菌を用いることができず大量生産をすることができな
い点、また基質であるルシフェリンの化学合成が煩雑で
ある点、等の問題があった。

【０００４】一方、同じルシフェラーゼであっても細菌
由来のものは、遺伝子組み換え技術を応用することがで
き大量生産に優れている。しかしながら、酵素の化学修
飾により活性が失活するため、抗体又は抗原との結合を
必要とする酵素免疫測定法においては使用することが困
難であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、細菌由来のルシフェラーゼを使用する酵素免疫測定
法において、酵素活性の失活を伴わない方法を提供する
ことを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、ルシフ
ェラーゼを標識酵素とする酵素標識抗体又は酵素標識抗
原を使用する酵素免疫測定法において、細菌由来のルシ
フェラーゼを用い、チオール基を導入する架橋試薬を用
いてルシフェラーゼにチオール基を導入した後、チオー
ル基に特異的に反応する酸化剤又はメルカプチド形成剤
を添加して前記ルシフェラーゼ中のチオール基を保護し
た後、二価性架橋剤を用いて前記ルシフェラーゼに抗体
又は抗原を結合させ、その後還元剤を加えてチオール基
保護基を解離せしめることるより酵素標識抗体又は酵素
標識抗原を調製するところに存する。

【０００７】本発明においては、細胞由来のルシフェラ
ーゼを使用する。上記細菌由来ルシフェラーゼを生産す
る方法としては、野性型細菌又は遺伝子組換え体のいず
れを用いてもよく、野性型細菌としては、例えば、ビブ
リオ ハルベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）、ビ
ブリオ フィチェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｃｈｅｒ
ｉ）、フォトバクテリウム フォスフォレウム（Ｐｈｏ
ｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）等が
挙げられる。また遺伝子組換え体としては、上記細菌よ
り酵素生産をコードする遺伝子をクローニングした大腸
菌等の細菌を用いることができる。

【０００８】上記ルシフェラーゼを生産する細菌は、ま
ず、ＬＢ培地等を用いて培養し、培養液を７０００〜１
００００ｒｐｍ程度の速度で遠心分離操作し、沈殿する
菌体を回収する。この菌体を、例えば、超音波処理によ
る物理的方法、リゾチーム・ＥＤＴＡ等の化学的処理等
により粉砕し、８０００〜１２０００ｒｐｍ程度の速度
の遠心分離操作により上清液を回収し、これを菌体抽出
液とする。この菌体抽出液を限外ろ過法等にかけて低分
子物質等を除去した後、イオン交換カラムクロマトグラ
フィー（ＤＥＡＥセファロース等）、ゲルろ過カラムク
ロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００
等）を用いて精製する。

【０００９】上記ルシフェラーゼ精製法以外にもアフィ
ニティカラムクロマトグラフィー等による精製法も適用
することができる。精製後の酵素はＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動により純度を確認することができ
る。

【００１０】上記ルシフェラーゼは、溶液に溶解して、
架橋剤と反応させチオール基を導入する。上記反応は、
例えば、ルシフェラーゼを１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）等の溶液に溶解し、これに同じ緩衝液又は有
機溶媒等に溶解した上記架橋剤を添加して一定時間イン
キュベートし、必要に応じてアセチル基除去剤を加え
て、さらにインキュベートしてすることができる。上記
架橋剤としては、チオール基以外の官能基、例えば、ア
ミノ基等に特異的に反応して、チオール基を形成するも
のであれば特に限定されない。例えば、Ｓ−アセチルメ
ルカプトスクシニクアンヒドライド、Ｎ−スクシンイミ
ディル−Ｓ−アセチルチオアセート、Ｎ−スクシンイミ
ディル−Ｓ−アセチル−メルカプトアセート、メチル−
３−（４′−ジチオピリジル）プロピオンイミデイト、
メチル−４−メルカプトブチルイミデイト、メチル−３
−メルカプトプロピオンイミデイト、イミノチオラン、
Ｎ−スクシンイミディル−３−（４′−ジチオピリジ
ル）プロピオンイミデイト等が挙げられ、好ましくは、
Ｓ−アセチルメルカプトスクシニクアンヒドライド、Ｎ
−スクシンイミディル−Ｓ−アセチルチオアセート、Ｎ
−スクシンイミディル−Ｓ−アセチル−メルカプトアセ
ート等である。

【００１１】上記ルシフェラーゼと架橋剤との反応は、
ルシフェラーゼのモル濃度：架橋剤のモル濃度＝１：５
〜１：５００においてするのが好ましく、より好ましく
は、１：２０〜１：２００である。反応温度は１０〜４
０℃が好ましく、より好ましくは２０〜３０℃である。
反応時間は、試薬により異なるが、通常は１〜３００分
が好ましく、より好ましくは１５〜６０分である。

【００１２】上記架橋剤Ｓ−アセチルメルカプトスクシ
ニクアンヒドライド、Ｎ−スクシンイミディル−Ｓ−ア
セチルチオアセート、Ｎ−スクシンイミディル−Ｓ−ア
セチル−メルカプトアセート等により導入されたチオー
ル基は、アセチル基によりブロックされているため、ア
セチル基除去剤を加えて、さらにインキュベートする。
上記アセチル基除去剤は特に限定されず、例えば、ハイ
ドロキシルアミン等が挙げられる。インキュベートは上
記ハイドロキシルアミン等を０．０１〜１モル／ｌ、好
ましくは０．０５〜０．２モル／ｌの濃度で添加し、２
０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で、５〜６０分、
好ましくは１０〜３０分行う。

【００１３】上記反応が完結した後、チオール基を導入
したルシフェラーゼと未反応の架橋剤、アセチル基除去
剤等の分離には、分子量の相違に基づく分離方法（例え
ば、透析法、限外ろ過膜法、ゲルろ過カラムクロマトグ
ラフィー等）、酵素に特異的な抗体を用いたアフィニテ
ィカラムクロマトグラフィー等を用いることができる
が、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー法が好ましい。

【００１４】本発明においては、上記チオール基を導入
したルシフェラーゼを溶液に溶解し、チオール基に特異
的に反応する酸化剤又はメルカプチド形成剤と反応させ
ることにより、ルシフェラーゼ中のチオール基を保護す
る。上記反応は、例えば、ルシフェラーゼを１００ｍＭ
りん酸緩衝液（ｐＨ７．０）等の溶液に溶解し、これに
同じ緩衝液等に溶解した上記酸化剤又はメルカプチド形
成剤を添加して一定時間インキュベートしてすることが
できる。

【００１５】上記チオール基に特異的に反応する酸化剤
としては、チオール基に特異的に反応してジスルフィド
を形成し、また還元剤等を添加することで保護基が解離
するものであれば特に限定されない。例えば、よう素、
フェリシアニド、四チオン酸ナトリウム、ｏ−ヨードソ
安息香酸、過酸化水素、テトラニトリメタン、５，５−
ジチオビスニトロ安息香酸、２，２′−及び４，４′−
ジチオピリジン、２，２′−ジチオビス（５−ニトロピ
リジン）、６，６′−ジチオニコチン酸、β−ヒドロキ
シエチル−２，４−ジニトロフェニルジスルフィド、シ
スチン、酸化型グルタチオン、システアミン等が挙げら
れ、好ましくは、ジチオビスニトロ安息香酸、ジチオピ
リジン等である。

【００１６】上記チオール基に特異的に反応するメルカ
プチド形成剤は、チオール基に特異的に反応してメルカ
プチドを形成し、還元剤等を添加することで保護剤が解
離するものであれば特に限定されない。例えば、ｐ−ク
ロロメルクリ安息香酸及びそのナトリウム塩、ｐ−クロ
ロメルクリフェニルスルホン酸ナトリウム塩、サリルガ
ン、酢酸フェニル水銀；２−クロロメルクリ−４−ニト
ロフェノール、２−クロロメルクリ−４，６′−ジニト
ロフェノール、４−クロロメルクリ−２−ニトロフェノ
ール、２，６−ジクロロメルクリ−４−ニトロフェノー
ル、２−アセトキシメルクリ−３−ニトロフェノール等
の水銀化ニトロフェノール類；ジメチルアミノナフタレ
ン−システイン−Ｈｇ⁺ 等が挙げられ、好ましくは、ｐ
−クロロメルクリ安息香酸及びそのナトリウム塩、ｐ−
クロロメルクリフェニルスルホン酸ナトリウム塩であ
る。

【００１７】上記チオール基に特異的に反応する酸化剤
とルシフェラーゼとの反応は、ルシフェラーゼのモル濃
度：酸化剤のモル濃度＝１：５〜１：５００においてす
るのが好ましく、より好ましくは、１：２０〜１：２０
０である。反応温度は１０℃〜４０℃が好ましく、より
好ましくは２０〜３０℃である。反応時間は、条件によ
り異なるが、通常は１分〜３００分が好ましく、より好
ましくは、１５分〜４０分である。

【００１８】上記チオール基に特異的に反応するメルカ
プチド形成剤とルシフェラーゼとの反応は、ルシフェラ
ーゼのモル濃度：メルカプチド形成剤のモル濃度＝１：
５〜１：５００においてするのが好ましく、より好まし
くは、１：２０〜１：２００である。反応温度は１０℃
〜４０℃が好ましく、より好ましくは２０〜３０℃であ
る。反応時間は、条件により異なるが、通常は１０分〜
２４時間が好ましく、より好ましくは、３０分〜１２０
分である。

【００１９】上記反応の完結した後、チオール基を保護
したルシフェラーゼと未反応の酸化剤又はメルカプチド
形成剤等の分離には、分子量の相違に基づく分離方法
（例えば、透析法、限外ろ過膜法、ゲルろ過カラムクロ
マトグラフィー等）、酵素に特異的な抗体を用いたアフ
ィニティカラムクロマトグラフィー等を用いることがで
きるが、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー法が好まし
い。

【００２０】本発明においては、上記チオール基を保護
したルシフェラーゼに二価性架橋剤の溶液を添加して一
定時間インキュベートした後、反応生成物を精製するこ
とによりルシフェラーゼと二価性架橋剤とを反応させ
る。

【００２１】上記二価性架橋剤は、特に限定されない
が、サクシミド基とマレイミド基を有した二価性架橋剤
が望ましく、例えば、Ｎ−スクシンイミデイル−２−マ
レイミドアセテート、Ｎ−スクシンイミデイル−４−マ
レイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミデイル−６−マ
レイミドヘキサノエート、Ｎ−スルホスクシンイミデイ
ル−６−マレイミドヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミ
デイル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレート、Ｎ−スルホスクシンイミデイ
ル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１
−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミデイル−４−
（Ｎ−マレイミドメチル）ベンゾエート、Ｎ−スクシン
イミデイル−３−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スクシ
ンイミデイル−４−（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−
ブチレート等が挙げられるが、水溶性であること、ｐＨ
安定性がよいこと等から特に望ましいのは、Ｎ−スルホ
スクシンイミデイル−６−マレイミドヘキサノエート、
Ｎ−スクシンイミデイル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スル
ホスクシンイミデイル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシレートである。

【００２２】上記二価性架橋剤の溶液としては、例え
ば、１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）等が挙げら
れ、上記反応は、例えば、２０〜４０℃で１０〜３０分
程度インキュベートした後、ゲルろ過法で反応生成物を
精製することにより完結させることができる。上記ゲル
ろ過法はファルマシア社製のＰＤ−１０等のパック型簡
便ゲルろ過法等も応用することができる。

【００２３】上記反応の詳細な方法については、「生物
化学実験法２７ 酵素標識法」（石川栄治著、学会出版
センター １９９１）５１〜１５１頁に記載されている
方法に準拠して行うことができる。

【００２４】本発明においては、上記で得た二価性架橋
剤を結合させたチオール基保護ルシフェラーゼについ
て、例えば、１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）等
への必要な緩衝液交換を行った後、抗体又は抗原と反応
させる。

【００２５】上記抗体は、ルシフェラーゼに結合した架
橋剤と反応するチオール基を出現させるため適宜還元し
て用いる。上記抗体としては、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体のいずれを用いることもでき、例え
ば、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ′）₂ 、Ｆ（ａｂ′）等が挙げら
れる。これらの抗体の調製法及び還元法については、
「生物化学実験法２７ 酵素標識法」（石川栄治著、学
会出版センター １９９１）３１〜５０頁に記載されて
いる方法に準拠して行うことができる。

【００２６】上記還元型抗体は、例えば、１００ｍＭり
ん酸緩衝液（ｐＨ６．５）等の溶液に溶解してルシフェ
ラーゼと反応させる。ルシフェラーゼ：抗体の量比は、
１：１〜５：１が好ましく、反応は、２０〜４０℃程度
で１０〜６０分行い、さらに４℃程度で一晩反応させる
のが好ましい。

【００２７】上記抗原は、ルシフェラーゼに結合した二
価性架橋剤と反応させるためにチオール基を有したもの
が望ましいが、チオール基を有さないものについても、
Ｓ−アセチルメルカプトスクシニックアンヒドライド等
を用いてチオール基を導入し、これを用いることもでき
る。上記抗原とルシフェラーゼとの反応及びその条件に
ついては、上記抗体の反応及び反応条件と同様である。

【００２８】本発明においては、ルシフェラーゼと二価
性架橋剤を介して結合した上記抗体又は上記抗原の溶液
に、還元剤を加えてチオール基保護基を解離せしめる。
上記還元剤としては、チオール基とチオール基保護基と
のジスルフィド結合又はメルカプチド結合を２０〜４０
℃、３０分〜４時間程度の温和な条件で開裂せしめるも
のが望ましく、例えば、β−メルカプトエタノール、β
−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチ
オエリスリトール、水素化ほう素ナトリウム、モノチオ
リン酸、亜硫酸塩、チオグリコール酸、還元型グルタチ
オン等が挙げられる。好ましくは、β−メルカプトエタ
ノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイト
ール、ジチオエリスリトール等である。

【００２９】上記チオール基保護基の解離は、上記還元
剤を加えた後、一定時間インキュベートして完結させる
ことができる。還元剤の添加量は、ルシフェラーゼのモ
ル濃度：還元剤のモル濃度＝１：２０〜１：２０００が
好ましく、より好ましくは、１：５０〜１：５００であ
る。反応温度は１０〜４０℃が好ましく、より好ましく
は２０〜３０℃である。反応時間は還元剤により異なる
が１０分〜２４時間が好ましく、より好ましくは３０分
〜１２０分である。

【００３０】上記反応の後の反応生成物の精製は、特に
限定されないが、例えば、分子量の相違に基づく分離方
法（透析法、限外ろ過膜法、ゲルろ過カラムクロマトグ
ラフィー等）が簡便で効率がよい。ゲルろ過法カラムク
ロマトグラフィー法が最適である。

【００３１】上記により調製した細菌由来ルシフェラー
ゼ標識抗体又は細菌由来ルシフェラーゼ標識抗原を用い
た酵素免疫測定法は、１ステップ法、２ステップ法どち
らにも応用可能であるが、迅速な測定が行える点で１ス
テップ法が好ましい。

【００３２】１ステップ酵素免疫測定法とは、抗体又は
抗原を吸着させた支持体に、定量したい抗原又は抗体及
び酵素標識抗体又は酵素標識抗原を反応させ、反応終了
後、被検体である抗原又は抗体に吸着せず遊離している
酵素標識抗体又は酵素標識抗原を除去し、その後、被検
体である抗原又は抗体に吸着した酵素標識抗体又は酵素
標識抗原の酵素活性を測定して定量する方法である。

【００３３】２ステップ酵素免疫測定法とは、抗体又は
抗原を吸着させた支持体に、定量したい抗原又は抗体を
反応させ、反応終了後洗浄し、その後酵素標識抗体又は
酵素標識抗原を反応させ、反応終了後、被検体である抗
原又は抗体に吸着せず遊離している酵素標識抗体又は酵
素標識抗原を除去し、その後、被検体である抗原又は抗
体に吸着した酵素標識抗体又は酵素標識抗原の酵素活性
を測定して定量する方法である。

【００３４】本発明の細菌由来ルシフェラーゼ標識抗体
又は細菌由来ルシフェラーゼ標識抗原を用いた酵素免疫
測定法は、抗原抗体反応が飽和状態に達していない反応
開始直後の生成複合体量に基づく発光をも検出できるた
め、迅速な測定が可能である。

【００３５】

【作用】細菌由来のルシフェラーゼが抗体又は抗原と結
合した後に活性が消失するのは、抗体又は抗原と結合さ
せるために添加する二価性架橋剤によりルシフェラーゼ
の活性中心付近のチオール基が化学修飾されるためであ
る。そこで、二価性架橋剤と反応させる前に、先ずチオ
ール基を導入する架橋試薬を用いて、チオール基を導入
した後、チオール基を保護基により保護し、その後二価
性架橋剤と反応させ、しかる後に上記保護基を解離させ
て酵素標識抗体又は酵素標識抗原を取得したところ、充
分の活性を有するものが得られ、迅速で高感度の酵素免
疫測定法が提供できるようになった。

【００３６】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例１ 細菌由来ルシフェラーゼ標識抗ＨＢｓ抗体によるＨＢｓ
の測定法 １．細菌由来ルシフェラーゼの取得 特開平２−２３６３号公報に開示された方法により、形
質転換体を培養し、組み換え型のルシフェラーゼを精製
した。形質転換した大腸菌ｐＬＵＸ１８０２を、０．１
ｍＭ ＩＰＴＧ添加ＬＢ培地（１％バクトペプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）５ｌ、３７℃で８
時間培養した後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を
行った。集菌した菌体を１０．８ｇを５０ｍＭりん酸緩
衝液２０ｍｌに縣濁し、超音波処理を１０分間行い破砕
した。破砕液を１００００ｒｐｍで２０分間、遠心分離
操作し上清液約２０ｍｌを回収し、これを菌体破砕液と
した。菌体破砕液を下記条件にて、イオン交換カラムク
ロマトグラフィーにより精製した。

【００３７】カラム担体：Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ１６／１
０（ファルマシア社製） 溶離液：Ａ液 ５０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０） Ｂ液 ３５０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０） 溶出 ：Ａ液からＢ液へのリニアグラジエント 流速 ：３ｍｌ／分

【００３８】カラムより溶出される液を３ｍｌずつ分取
し、それぞれについて発光活性を測定し、活性を示す液
を回収し、限外ろ過膜にて濃縮し、１００ｍＭりん酸緩
衝液（ｐＨ７．０）で希釈した。精製ルシフェラーゼ８
４ｍｇを得た。なお、発光測定はＮＡＤＨ−ＦＭＮオキ
シドレダクターゼ、フラビンモノヌクレオチドを適当量
添加した後、Ｂｉｏ−ｏｒｂｉｔ社製のルミノメーター
Ｌ−１２５１に装着し、分注装置を用いてＮＡＤＨを添
加し、直後から測定を開始し、添加後１分間の発光量の
積算値を測定した。

【００３９】２．ルシフェラーゼへのチオール基の導入 精製したルシフェラーゼ４．０ｍｇ／ｍｌ １．０ｍｌ
にＳ−アセチルメルカプトスクシニクアンヒドライド
（アルドリッチ社製）１７．４ｍｇ／Ｎ，Ｎ−ジメチル
フォルムアミド１００μｌ液を５μｌ添加し、３０℃で
４５分間インキュベートした。インキュベート終了後、
塩化ヒドロキシルアンモニウム（ナカライテスク社製）
０．１モル／ｌ及びＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）
０．０１モル／ｌ水溶液を０．１ｍｌ添加し３０℃で１
５分間インキュベートした。終了後、ファルマシア社製
ＰＤ−１０カラムにて精製し、チオール基を導入したル
シフェラーゼ１．７５ｍｇ／ｍｌ液２．１ｍｌを得た。
この液をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社製）を
用いて濃縮し、ルシフェラーゼ３．４ｍｇ／ｍｌ液を１
ｍｌ回収した。なお、ルシフェラーゼ１分子当たり導入
されたチオール基の数は平均１．９個であった。

【００４０】３．ルシフェラーゼのチオール基の保護 精製したルシフェラーゼ３．４ｍｇ／ｍｌ １．０ｍｌ
に５，５′−ジチオビスニトロ安息香酸（和光純薬社
製）４ｍｇ／１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）１
ｍｌ液を０．２６ｍｌ添加し、２５℃で３０分間インキ
ュベートした。インキュベート終了後、ファルマシア社
製ＰＤ−１０カラムにて精製し、チオール基を保護した
ルシフェラーゼ１．４４ｍｇ／ｍｌ液２．０ｍｌを得
た。保護されたチオール基の数はルシフェラーゼ１分子
当たり１４個であり、また酵素活性は完全に消失してい
た。

【００４１】４．ルシフェラーゼのマレイミド化 上記３．で得たチオール基保護ルシフェラーゼ液１．８
ｍｌにＮ−スルホスクシンイミデイル−６−マレイミド
ヘキサノエート（同仁化学社製）０．８ｍｇ／１００ｍ
Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ液を１１５μｌ添
加し、２５℃で３０分間インキュベートした。インキュ
ベート終了後ファルマシア社製ＰＤ−１０カラムにてゲ
ルろ過精製し、マレイミド化したルシフェラーゼ０．７
２２ｍｇ／ｍｌ液３．２ｍｌを得た。導入されたマレイ
ミド基の数はルシフェラーゼ１分子当たり１．８個であ
った。

【００４２】５．抗ＨＢｓ抗体のＦａｂ′の調製 ウサギ産生抗ＨＢｓ抗体を常法通り、ペプシン（和光純
薬社製）処理することにより得たＦ（ａｂ′）₂ を用い
て調製した。Ｆ（ａｂ′）₂ ０．９７ｍｇ／ｍｌ液１．
７ｍｌをミリポア社のウルトラフリーを用いて緩衝液交
換した。緩衝液は１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．
０）に０．１ＭのＮａＣｌを添加した液に交換した。
０．１Ｍメルカプトエチルアミン（和光純薬社製）と
０．０１ＭＥＤＴＡを添加した同緩衝液１００μｌをこ
のＦ（ａｂ′）₂ 液に添加し、３７℃、９０分間インキ
ュベートした。インキュベート終了後、ファルマシア社
製ＦＰＬＣシステム（カラム担体：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−
１２）により精製した。溶離液を１００ｍＭりん酸緩衝
液（ｐＨ６．０）として、溶出される画分を回収した。
その結果、Ｆａｂ′０．４９ｍｇ／ｍｌ液を２．８ｍｌ
回収した。この液をアミンコ社製のＣＥＮＴＲＩＰ−３
０で濃縮し、１．０ｍｌに濃縮した。Ｆａｂ′に含まれ
るチオール基はＦａｂ′１分子当たり１．０個であっ
た。

【００４３】６．酵素標識抗体の調製 上記４．で作成したマレイミド化ルシフェラーゼ液１．
１ｍｌと上記５．で調製したＦａｂ′液０．５ｍｌを混
合し、２５℃、３０分間インキュベートした。さらに一
晩４℃でインキュベートした。

【００４４】７．還元剤の添加 上記６．で調製した酵素標識抗体液に、ジチオスレイト
ール（和光純薬社製）０．０２ＭとＥＤＴＡ０．０１Ｍ
を含んだ１００ｍＭりん酸緩衝液０．２ｍｌを添加し、
２５℃、９０分間インキュベートした。インキュベート
終了後、ファルマシア社製ＦＰＬＣシステム（カラム担
体：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２）により精製し、酵素標識
抗体４ｍｌを回収した。同液を１００ｍＭりん酸緩衝液
（ｐＨ７．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１％ウシ血
清アルブミンで１０μｇ／ｍｌとなるように希釈して評
価した。同液を９３ｍｌ得た。

【００４５】８．ＨＢｓの検出 上記５．のウサギ産生抗ＨＢｓポリクローナル抗体のＦ
（ａｂ′）₂ 画分を１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．
０）、１００ｍＭＮａＣｌを用いて１０μｇ／ｍｌに調
製して、２００μｌをルシフェラーゼ活性測定用ポリス
チレンチューブに添加し、３０℃、６０分さらに４℃、
一晩インキュベートした。３ｍｌの１００ｍＭりん酸緩
衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭＮａＣｌで３回洗浄し
た後、ブロッキング液として１％ウシ血清アルブミン添
加１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ
ＮａＣｌ２００μｌをチューブに添加し、３０℃、６０
分インキュベートした。３ｍｌの１００ｍＭりん酸緩衝
液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭＮａＣｌで３回洗浄した
のち、実験に用いた。このチューブに１００ｍＭりん酸
緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１％
ウシ血清アルブミンに溶解した各種濃度のＨＢｓを添加
し、３７℃で３０分間インキュベートし、３ｍｌの１０
０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭＮａＣ
ｌ、０．１％ウシ血清アルブミンで２回洗浄した。上記
酵素標識抗体液を２００μｌ添加し、１５分間インキュ
ベートしたのち、３ｍｌの１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１％ウシ血清ア
ルブミンで２回洗浄した。１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１％ウシ血清ア
ルブミンを２００μｌ添加し、このチューブの発光を測
定した。

【００４６】なお、発光測定はＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシ
ドレダクターゼ、フラビンモノヌクレオチドを適当量添
加した後、Ｂｉｏ−ｏｒｂｉｔ社製のルミノメーターＬ
−１２５１に装着し、分注装置を用いてＮＡＤＨを添加
し、直後から測定を開始し、添加後１分間の発光量の積
算値を測定した。その結果を表１に示した。

【００４７】

【表１】

【００４８】実施例２ 細菌由来ルシフェラーゼ標識抗ＨＢｓ抗体によるＨＢｓ
の測定法 １．細菌由来ルシフェラーゼの取得 実施例１と同様に行った。

【００４９】２．ルシフェラーゼへのチオール基の導入 精製したルシフェラーゼ４．０ｍｇ／ｍｌ １．０ｍｌ
にＮ−スクシンイミディル−Ｓ−アセチルチオアセート
（ベーリンガーマンハイム山之内社製）１１．６ｍｇ／
エタノール１００μｌ液を５μｌ添加し、２５℃で３０
分間インキュベートした。インキュベート終了後、塩化
ヒドロキシルアンモニウム（ナカライテスク社製）０．
１モル／ｌ及びＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）０．０
１モル／ｌ水溶液を０．１ｍｌを添加し３０℃で１５分
間インキュベートした。インキュベート終了後、ファル
マシア社製ＰＤ−１０カラムにて精製し、チオール基を
導入したルシフェラーゼ１．８２ｍｇ／ｍｌ液２．１ｍ
ｌを得た。この液をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコ
ン社製）を用いて濃縮し、ルシフェラーゼ３．４ｍｇ／
ｍｌ液を１ｍｌ回収した。なお、ルシフェラーゼ１分子
当たり導入されたチオール基の数は平均１．９個であっ
た。

【００５０】３．ルシフェラーゼのチオール基の保護 精製したルシフェラーゼ３．４ｍｇ／ｍｌ１．０ｍｌに
４，４′−ジチオピリジン（和光純薬社製）２．２ｍｇ
／１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ液を
０．４２ｍｌ添加し、３０℃で２０分間インキュベート
した。インキュベート終了後、ファルマシア社製ＰＤ−
１０カラムにて精製し、チオール基を保護したルシフェ
ラーゼ１．３２ｍｇ／ｍｌ液２．０ｍｌを得た。保護さ
れたチオール基の数はルシフェラーゼ１分子当たり１４
個であり、また酵素活性は完全に消失していた。

【００５１】４．ルシフェラーゼのマレイミド化 上記３．で得たチオール基保護ルシフェラーゼ液１．８
ｍｌにＮ−スルホスクシンイミデイル−４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（ＰＩＥＲＣＥ社製）０．８ｍｇ／１００ｍＭりん酸緩
衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ液を１０８μｌ添加し、２５
℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了
後、ファルマシア社製ＰＤ−１０カラムにてゲルろ過精
製し、マレイミド化したルシフェラーゼ０．７０８ｍｇ
／ｍｌ液３．２ｍｌを得た。導入されたマレイミド基の
数はルシフェラーゼ１分子当たり１．５個であった。

【００５２】５．抗ＨＢｓ抗体のＦａｂ′調製 実施例１と同様に行った。 ６．酵素標識抗体の調製 上記４．で作成したマレイミド化ルシフェラーゼ液１．
１ｍｌと上記５．で調製したＦａｂ′液０．５ｍｌを混
合し、２５℃、３０分間インキュベートした。さらに一
晩４℃でインキュベートした。

【００５３】７．還元剤の添加 上記６．で調製した酵素標識抗体液に、メルカプトエタ
ノール（和光純薬社製）０．０２ＭとＥＤＴＡ０．０１
Ｍを含んだ１００ｍＭりん酸緩衝液０．２ｍｌを添加
し、２５℃、９０分間インキュベートした。インキュベ
ート終了後、ファルマシア社製ＦＰＬＣシステム（カラ
ム担体：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２）により精製し、酵素
標識抗体４ｍｌを回収した。同液を１００ｍＭりん酸緩
衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１％ウ
シ血清アルブミンで１０μｇ／ｍｌとなるように希釈し
て評価した。同液を８８ｍｌ得た。 ８．ＨＢｓの検出 実施例１と同様に行った。その結果を表２に示した。

【００５４】

【表２】

【００５５】比較例１ チオール基を保護しないルシフェラーゼを用いたＨＢｓ
測定用酵素標識抗体の調製 １．細菌由来ルシフェラーゼの取得 実施例１と同様に行った。 ２．ルシフェラーゼのマレイミド化 ルシフェラーゼ液１．８ｍｌにＮ−スルホスクシンイミ
デイル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（ＰＩＥＲＣＥ社製）０．８ｍ
ｇ／１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ液を
１０８μｌ添加し、２５℃で３０分間インキュベートし
た。インキュベート終了後にファルマシア社製ＰＤ−１
０カラムにてゲルろ過精製した液を回収したが、それら
はいずれも分子量が３０万以上の高分子であり、また酵
素活性が完全に失活したものであり、酵素の重合体と考
えられた。この液に実施例１で調製したＦａｂ′を添加
したが、結合体は全く得られなかった。

【００５６】

【発明の効果】本発明の酵素免疫測定法は、ルシフェラ
ーゼにチオール基を導入し保護した後に酵素標識抗体又
は酵素標識抗原を調製してその後保護基を解離させたも
のであるので、細菌由来ルシフェラーゼの酵素活性の失
活がより少なく、迅速かつ効率がよい。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ルシフェラーゼを標識酵素とする酵素標
   識抗体又は酵素標識抗原を使用する酵素免疫測定法にお
   いて、細菌由来のルシフェラーゼを用い、チオール基を
   導入する架橋試薬を用いてルシフェラーゼにチオール基
   を導入した後、チオール基に特異的に反応する酸化剤又
   はメルカプチド形成剤を添加して前記ルシフェラーゼ中
   のチオール基を保護した後、二価性架橋剤を用いて前記
   ルシフェラーゼに抗体又は抗原を結合させ、その後還元
   剤を加えてチオール基保護基を解離せしめることにより
   酵素標識抗体又は酵素標識抗原を調製することを特徴と
   する酵素免疫測定法