JPH11512281A

JPH11512281A - 化学発光システム用のシグナル発生酵素としてのバナジウムブロモペルオキシダーゼの使用、試験キットおよび分析方法

Info

Publication number: JPH11512281A
Application number: JP9511210A
Authority: JP
Inventors: エリックフリードマン，アラン; フィンガーグロールクス，サラ; バトラー，アリソン
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-16
Publication date: 1999-10-26
Also published as: EP0892855A1; KR19990044308A; CA2234912A1; CN1200766A; AU714933B2; AU6952996A; US5811253A; ATE208424T1; DE69616832D1; NO980812L; EP0892855B1; NO980812D0; WO1997009447A1

Abstract

(57)【要約】本発明の水性組成物、試験キットおよび方法を用いて、分析物の存在下で検出可能な化学発光シグナルを生成させることにより、過酸化水素またはバナジウムブロモペルオキシダーゼを検出することができる。２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン誘導体；ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源；およびペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物を含んで成る組成物を使うことにより、シグナル発生並びに反応速度論が改善される。

Description

【発明の詳細な説明】化学発光システム用のシグナル発生酵素としてのバナジウムブロモペルオキシダーゼの使用、試験キットおよび分析方法発明の分野本発明は、シグナル発生酵素としてバナジウムブロモペルオキシダーゼを使った、化学発光組成物、試験キットおよび様々な分析物の検出方法に関する。発明の背景水性液体中の分析物（analyte）の濃度に比例して検出可能な出力を生じることのできる試薬の組合せと該液体とを接触させることにより水性液体の定量または定性分析を実施することは周知の技術である。１つの有用なアッセイ形式は、適当な試薬と接触すると、分析物が適当な酵素の存在下で酸素と反応して、分析物の濃度に比例して過酸化水素を生成するという酵素反応を利用するものである。次いで、試験液体中の分析物の濃度に比例した過酸化水素の反応により、検出可能な生成物が誘導される。このようにしてグルコース、トリグリセリド、尿酸、コレステロールおよびクレアチンキナーゼのような分析物を検出することができる。それらのアッセイでは一般にペルオキシダーゼが用いられる。別のアッセイ形式では、系に既に添加されている過酸化水素の存在下でペルオキシダーゼを反応させて特定の分析物の量を測定する。例えば、そのようなアッセイの代表として、標識としてペルオキシダーゼを使用する特異的結合アッセイにおけるリガンドの特異的結合が挙げられる。この場合の測定は溶液中で、表面上で、または診断試験装置中で実施することができる。このアッセイにより生成されるシグナルは、周知のシグナル発生試薬を使った比色シグナル、化学発光シグナルまたは蛍光シグナルのいずれかであり得る。着目の分析物の存在の結果として光の放出を生むペルオキシダーゼ依存性の発光または発光測定アッセイには幾つかの主要なタイプがある。これらのアッセイは化学発光アッセイとしても知られており、例えはKricKa他への米国特許第4,72 9,950号明細書およびその中に引用された文献中に記載されている。様々な芳香族アミン類およびフェノール類、例えば４−ヨードフェノールが、そのようなアッセイにおいて光の生成を増強するのに有用である（Kricka他への米国特許第4, 598,044号明細書を参照のこと）。Friedman他への米国特許第5,372,931号明細書は、シグナルの発生を増強するために或る種の４′−ヒドロキシおよびアルコキシ置換フェニルまたはナフチル電子移動剤を使用する水性組成物を開示している。従来技術の増強型ペルオキシダーゼ依存性化学発光システムは、イムノアッセイに適当な光シグナルを生じるけれども、従来技術の試薬製剤は幾つかの既知の欠点を有する。例えば、上述したような化学発光増強剤を含む試薬組成物は一層複雑であり、貯蔵不安定になりやすい。従来技術の製剤においては数種類の試薬の活性を厳密に調節する必要があるので、相当な製造上の問題が生じる。更に、従来技術のシグナル速度論はペルオキシダーゼレベルの強関数であり、これは非線形の検量線をもたらし得る。最近、BulterおよびWalkerは、過酸化水素と臭化物アニオンの存在下で、有力な酸化剤である活性臭素種を触媒的に生成する、水生および海生藻類から抽出されたバナジウムブロモペルオキシダーゼ酵素群並びに陸生地衣類および真菌類から抽出された幾つかを記載した。（Butler他，Chem．Revs.，93，pp.1937-1944 ，1993およびその中の参考文献；並びにWever他，Blochem．Phys．Acta，830 ，pp.181-186，1 985およびその中の参考文献を参照のこと）。前述した両文献とも参考として本明細書中に組み込まれる。大部分のハロペルオキシダーゼが抱える問題の１つは、それらの最適ｐＨが一般に低いｐＨ域、即ち３〜５にあることである。これは、ペルオキシアニオンに依存するペルオキシダーゼを使用する化学発光システムに問題を提供する。ヒドロペルオキシドは典型的には約11.5のｐＫａを有するためである。バナジウムブロモペルオキシダーゼは、約６〜10のｐＨ域で効率的に作用する。従来技術において開示された水性シグナル発生組成物は多くの分析方法において顕著な性質を示すけれども、この技術分野においては更なる改良がまだ必要である。例えば、より単純なシグナル発生組成物、即ち、米国特許第5,372,931号明細書に記載された電子移動剤を使用しないもの、を提供する必要がある。更に、既知の従来法に比べて改善された酵素安定性、より大きい感度、および改善されたシグナル出力を有する水性組成物を開発する必要性がまだある。発明の要約本発明において、約6.5〜約10のｐＨを有する、化学発光シグナルを生成する水性分析用組成物を提供することにより、分析用組成物および分析方法への更なる改善の必要性を満たす。詳しくは、上記特性を有する本発明の化学発光シグナル発生組成物は、次のものを含んで成る： (a) バナジウムブロモペルオキシダーゼの触媒活性に応じてシグナルを与える化学発光シグナル発生試薬であって、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン誘導体であるシグナル発生試薬； (b) ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源；および (c) ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物。本発明はまた、バナジウムブロモペルオキシダーゼの触媒活性の結果としての分析物の測定用の診断試験キットも提供する。本発明のこの態様によれば、診断試験キットは下記の成分を含んで成る：（i）上述のシグナル発生組成物、および（ii）バナジウムブロモペルオキシダーゼまたはバナジウムブロモペルオキシダーゼで標識された特異的結合分子。本発明の別の面によれば、バナジウムブロモペルオキシダーゼに応じて検出可能なシグナルを生成する方法が提供される。より詳しくは、本発明の方法は、（A）上述のシグナル発生組成物の存在下でバナジウムブロモペルオキシダーゼを反応させ；そして（B）前記バナジウムブロモペルオキシダーゼの測度として生成した化学発光シグナルを測定することを含んで成る。本発明は更に、特異的結合リガンドの測定のための特異的結合アッセイであって、（A）特異的結合リガンドを該リガンドに特異的なレセプターと共に複合体形成させて特異的結合複合体を形成せしめ；（B）前記レセプターと接合されているか、または前記特異的結合リガンドもしくは前記レセプターのいずれかと反応する特異的結合分子と接合されているバナジウムブロモペルオキシダーゼにより前記特異的結合複合体を標識し；（C）複合体形成しなかった材料をバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識複合体から分離し、前記複合体を上述のシグナル発生組成物と接触させ；そして（D）特異的結合リガンドの測度として生成したシグナルを測定することを含んで成る特異的結合アッセイを提供する。本発明は、様々な化学発光アッセイの使用に関連した既知の従来技術の利点の全てを提供するが、反応スキームにおいて種々のバナジウムブロモペルオキシダーゼ化合物を使用する。既知の従来技術の利点の全てを提供することに加えて、本発明のシグナル発生組成物を使用することによって該アッセイがより高感度になるということを更に認識すべきである。また、本発明の組成物は、発光シグナルがより長期間に渡り一定の強度に保持されるという安定な速度論を証明する。更に、本発明のより単純な組成物は有機増強剤化合物に対する必要条件を取り除く。図面の簡単な説明図１は、本発明の組成物および米国特許第5,372,931号明細書の実施例１に記載の対照組成物を使って得られた化学発光シグナルを表すグラフである。図２は、本発明の組成物および米国特許第5,372,931号明細書の実施例１に記載の対照組成物を使って得られたシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を表すグラフである。図３は、本発明のシグナル発生組成物を使ったバナジウムブロモペルオキシダーゼ反応の速度論を表すグラフである。図４は、同濃度のバナジウムブロモペルオキシダーゼに比較した、50,000アトモルでの米国特許第5.371,931号明細書の実施例１に記載のＨＲＰ対照組成物のシグナル出力を表すグラフである。発明の詳細な説明本発明は、バナジウムブロモペルオキシダーゼの存在に応じて化学発光シグナルを生成するように考案された任意の分析方法において有利に実施することができる。そのようなアッセイは、有機もしくは無機過酸化物（例えば過酸化水素）またはバナジウムブロモペルオキシダーゼの検出、あるいはバナジウムブロモペルオキシダーゼや過酸化水素以外の非免疫学的分析物の検出を伴うことができる。特に、本発明は化学発光シグナルを生じる特異的結合アッセイの実施に有用である。アッセイは定性的もしくは定量的またはその両方であることができ、ヒトまたは動物の生物学的液体、廃液、食品、環境廃水、化学処理液および当業者に容易に明らかである他の検体をはじめとする水性液体中の、生物学的または化学的物質（すなわち、分析物）を検出するのに用いることができる。本発明を用いて、過酸化水素（または別の過酸化物）を測定することができる。その上、本発明は、過酸化水素を生成することができる分析物を測定するのに用いることができ、すなわち該分析物は適当なシグナル発生試薬とバナジウムブロモペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素を生じる１または複数の反応に加わる。そのような分析物は、本明細書中では「バナジウムブロモペルオキシダーゼに触媒上関連した分析物」と見なされる。好ましい態様では、本発明のシグナル発生組成物は、特異的結合リガンド、または対応するそのレセプター（すなわち、該リガンドと特異的に結合する物質）の測定に有用である。そのようなリガンドとしては、抗体、抗体断片、および他のタンパク質（リポタンパク質、血液タンパク質、酵素および糖タンパク質を含む）、ハプテン、薬物、ホルモン、ステロイド、毒素、ウイルス、細菌、ビタミン、糖類（多糖類を含む）、脂質、核酸、非タンパク様血液成分、または当業者に容易に判るようなそれらの任意成分が挙げられるが、それに限定されない。上述したように、本発明は、約6.5〜約10のｐＨを有する、化学発光シグナル発生のための分析用組成物であって、 (a) バナジウムブロモペルオキシダーゼの触媒活性に応じてシグナルを提供する化学発光シグナル発生試薬であって、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン誘導体であるシグナル発生試薬； (b) ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源；および (c) ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物を含んで成る組成物に関する。前に指摘したように、本発明のシグナル発生組成物は、その成分の１つとして、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン誘導体（本明細書中では“ＤＰＤ”とも言う）を含有する。化学発光反応において励起状態に変換され、次いで光の放出を伴いながら非励起状態に戻ることができるいずれの遊離型または複合型ＤＰＤでも、本発明の実施に有用である。相当な数のそういった化合物が当技術分野において知られており、それらとしてはKricka他への米国特許第4,598,04 4号明細書およびGrundermann他，Chemiluminescence in Organic Chemistry，Sp ringer-Verlag，Berlin，1987，204-207頁に記載されたものが挙げられる。そのような化合物は一般に「ルミノール型ヒドラジン類」として知られており、その例としてフタル酸ヒドラジン、ナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジン、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジン、フェナントレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジン、フルオレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジン、ベンゾ〔ｇ，ｈ，ｉ〕ペリレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジン、コロネン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジン、および当業者に容易に明白である他のものが挙げられる。特に、本発明において使用できるＤＰＤは次の構造式により定義される：上式中、Ｚ¹，Ｚ²，Ｚ³およびＺ⁴は独立に水素；約１〜約６個の炭素原子を含むアルキル、例えばメチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、sec−ペンチルおよびヘキシル；約２〜約６個の炭素原子を含むアルケニル、例えばエテニル、１−プロペニル、イソブテニル、２−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ビニル、２−（Ｎ，Ｎ−ジイソブチルアミノ）ビニル、２−（Ｎ，Ｎ−ジイソペンチルアミノ）ビニルおよび２−ヘキセニル；ヒドロキシ；約１〜約６個の炭素原子を含むアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、ｔ−ブトキシおよびヘキソキシ；カルボキシ；アルキルまたはアルカノイルで置換されたアミノを含めたアミノ、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、アミド（例えばアセトアミドおよびヘキサナミド）、ジメチルアミノ、ジエチルアミノおよびジイソブチルアミノ；または置換されたアミノアリールを含めたアミノアリール、例えばｐ −（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル、ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェニルおよび５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン−８−イル（ルミニルとしても知られる）である。Ｚ¹とＺ²の少なくとも一方がアミノ（前に定義したような置換アミノを含む）、共役アミノアルケニル（上述したような置換アミノアルケニルを含む）またはアミノアリール、例えばｐ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル、ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェニルおよび５−アミノ− ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン−８−イルである。本明細書中で用いる「共役アミノアルケニル」とは、アミノ基からアルケニル基を経由してそれが置換基として結合しているフタラジンジオンの芳香環へと電子共鳴することのできる一価の基を言い、その例としては、例えば、ジアルキルアミノビニル基、例えば２−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ビニル、２−（Ｎ，Ｎ−ジイソブチルアミノ）ビニルおよび２−（Ｎ，Ｎ−ジイソペンチルアミノ）ビニル；並びにジアルキルアミノブタジエニル基、例えば４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ） −１，３−ブタジエン−１−イルが挙げられる。あるいは、Ｚ¹，Ｚ²，Ｚ³およびＺ⁴のいずれか２つの隣接した基、いずれか３つの隣接した基または全ての基（すなわち、２つもしくは３つの隣接基の組合せ、または４つ全部の基）が一緒になって、１または複数の芳香環を含む縮合環系を形成することができる。そのような縮合環は１または複数のヒドロキシにより、アミノ（上述したような置換または非置換の）によりまたは約１〜約４個の炭素原子を有するアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシおよびイソプロポキシにより、置換されてもよい。好ましくは、そのような縮合環は１または複数の第一級、第二級もしくは第三級アミン、ヒドロキシまたはアルコキシにより置換される。代表的な有用ＤＰＤ化合物としては、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（４ −アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールヘミスクシンイミド、Ｎ−（６− アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−エチルイソルミノールおよび７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジドが挙げられるが、それらに限定されない。ルミノール〔５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン〕およびイソルミノール〔６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４− フタラジンジオン〕が好ましく、ルミノールが最も好ましい。他の有用なＤＰＤ化合物の群はGundermann他の上記刊行物の中に記載されており、その例としては、置換または非置換フタル酸ヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナントレンジカルボン酸ヒドラジド、フルオレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ベンゾ〔ｇ，ｈ，ｉ〕ペリレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジドおよびコロネン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、例えば次の構造により表されるもの、が挙げられる：本発明において有用であると当業者が認める別のフタラジンジオン類似体としては、Masuya他への欧州特許出願第91310875.9号、およびYamaguchiへの米国特許第5,324,835号明細書の中に開示されているものが挙げられる。前記刊行物の内容は参考として本明細書中に組み込まれる。上記に示した化合物は商業的に入手可能であるか、または当業者に周知である従来の出発物質および手順を使って調製することができる。本発明のシグナル発生組成物の第二成分は、ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源である。本明細書中で用いる「ハロゲンまたはハロゲン供給源」という語は、本発明の組成物に加えるとハロゲンアニオン、すなわちフッ化物、塩化物、臭化物またはヨウ化物アニオンを生成する任意の物質を意味する。これは塩化物、臭化物およびヨウ化物のようなハロゲンを包含する。ハロゲン供給源は金属または非金属塩、非限定的例として、アンモニウム、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、アリールアンモニウム、置換アリールアンモニウム、ヒドラジニウム、オキソニウム、トロピリウム、スルホニウム塩、を含んで成ってもよい。典型的には、ハロゲン供給源は第ＩＡ族金属塩として組成物に添加されるが、第ＩＡ族金属塩に限定されるわけではない。本発明の特に好ましい態様では、ハロゲン供給源はNaBrまたは臭化アンモニウムである。本明細書中で用いる「擬ハロゲンまたは擬ハロゲン供給源」という語は、本発明の組成物に加えるとハロゲンと同等である高い電子親和力を有するアニオンを提供する任意の物質を意味する。擬ハロゲン供給源は典型的には、第ＩＡ族金属化合物であるが、それに限定されないということに注意すべきである。分析用シグナル発生組成物中に存在することができる適当な擬ハロゲンとしては、CN^-，S CN^-，OCN^-，アジド、イソニトリル等が挙げられるが、それらに限定されない。それらの擬ハロゲンのうちSCN^-が特に好ましい。本発明の分析用組成物の第三成分は、ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物である。「ペルオキシド」という語は、従来技術において典型的に用いられている無機または有機ペルオキシド化合物を包含する。ペルオキシド生成試薬配合物とは、本発明の組成物に加えるとペルオキシドを生じることができる任意の試薬配合物を包含する意味である。そのようなペルオキシド生成試薬配合物は当業者に周知であり、非限定例としては、ペルボレート、ペルアセテート、尿素ペルオキシド、および有機ペルオキシド、例えば過酸、ペルオキシ安息香酸およびオキソン、並びにヒドロペルオキシドが挙げられる。本発明の分析用組成物は、約6.0〜約8.0のpKaを有する１または複数の適当な生物学的緩衝剤を使って、通常約6.5〜約10、より好ましくは約6.8〜約8.0のpH に緩衝化される。それらの緩衝剤は当業界で周知のものである。そのような緩衝剤の典型例としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−HCI〔Tris-HC l〕；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸〔MES〕；ピペラジン−Ｎ，Ｎ′ −ビス（２−エタンスルホン酸）〔PIPES〕；３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸〔MOPSO〕；リン酸塩緩衝剤などが挙げられるが、それらに限定されない。上述した生物学的緩衝剤のうち、Tris-HClが特に好ましい。本発明の分析用組成物は、有機溶剤、例えばテトラヒドロフラン、アセトニトリル、ヘキサン、ヘキサンの異性体、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールまたはブタノール等を含んでもよい。本発明の分析用組成物は任意の相溶性の比率で有機溶剤の混合物または水−有機溶剤混合物を含んで成ることができ、その比率は必要ならば当業者により周知であるように特定の用途に合わせて決定することができる。本発明のシグナル発生組成物中の各成分の量は、それの意図する用途、試薬類の特定感度、および当業者に良く判るような他の要因によって異なり得る。よって、次の一般的範囲は当業者への指標を与えるものであって、本発明の実施を制限するものではない。具体的には、所望のpHを維持するのに必要である緩衝剤の量を決定する方法は周知であることから、本発明において使われる緩衝剤の量は当業者には容易に明らかである。シグナル発生化合物であるＤＰＤの量は、通常は少なくとも約0.01 ミリモル濃度であり、約0.1〜約10ミリモル濃度の範囲が好ましい。第二成分、すなわちハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源については、通常少なくとも約0.1ミリモル濃度の量で存在する。より好ましくは、ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源はシグナル発生組成物中に約50ミリモル〜約100ミリモル濃度の量で存在する。第三成分、すなわちペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物については、該成分は少なくとも約0.02ミリモル濃度の量でシグナル発生組成物中に存在する。より好ましくは、ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物は約0. 5ミリモル〜約1.0ミリモル濃度の量で存在する。本発明は、遊離形のまたは特異的結合分子（例えば抗体、アビジンまたはビオチン）との標識接合体としてのバナジウムブロモペルオキシダーゼ（VBrPO）と、上述したシグナル発生組成物とを含有するバナジウムブロモペルオキシダーゼ含有水性組成物も提供する。そのような組成物も、本発明のシグナル発生組成物について上述したのと同様に緩衝化することができる。バナジウムブロモペルオキシダーゼまたはバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識特異的結合分子およびシグナル発生組成物の量は、当業者に容易に明白であろう。上述の組成物の他に、本発明は、様々な分析方法（後述）を実施するのに有用であるキット、装置および使用説明書も提供する。個別のまたは一緒にプレミックスしたキット成分の包装は当業者に周知である。一態様では、キットは上述のシグナル発生組成物と、バナジウムブロモペルオキシダーゼまたはバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識特異的結合分子とを含んで成る。「特異的結合分子」とは、レセプターと特異的に結合するであろう任意の生物学的または化学的化合物を意味する。特に有用な標識された特異的結合分子はバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識タンパク質またはオリゴヌクレオチドである。そのようなタンパク質としては抗体およびアビジンが挙げられる。与えられた特異的結合分子に対する適当なレセプターは当業者に周知であり、従ってここでは記載しない。アッセイに有用な他の成分（例えば界面活性剤）を本発明の試験キットの中に含めることができる。本発明の別のキットは、本発明のシグナル発生組成物のみを含んで成る。本明細書中で用いる「バナジウムブロモペルオキシダーゼ」とは、ルミノールのような物質の酸化を触媒して適当なシグナルを生成する任意のバナジウムハロペルオキシダーゼ作用を有する物質（酵素または他のもの）を意味する。本発明において使用することができるタンパク様バナジウムブロモペルオキシダーゼ化合物の特定例はButler他，Chem．Rev.，93，1937-1944頁(1993)中に見つけることができ、非限定例としてアスコフィルム・ノドサム（Ascophyllum nodosum）、セラミルム・ルブルム（Ceramirum rubrum）、ラミナリア・サッカリナ（Lami naria saccharina ）、フカス・ディスチクス（Fucus distichus）、コラリナ・ピルリフェラ（Corallina pilurifera）、コラリナ・オフィシナリス（Corallin a officinalis ）、マクロシスチス・ピリフェラ（Macrocystis pyrifera）等から得られる酵素が挙げられる。非タンパク様バナジウムブロモペルオキシダーゼ化合物である、Buller他（前掲）、de Boer，FEBS，235，93-97頁(1988)およびRehder他，Inorganica Chom． Acta，136，L7-L10，1987に記載されたもの（これらの参考文献は全て本明細書中に組み込まれる）を本発明において使うこともできる。この非限定例としては、VO(Salen)〔Salen＝オキソ−Ｎ，Ｎ′−ビス（サリチリデン）エチレンジアミン〕およびVO(MeOX)₂〔MeOX＝オキソビス（２−メチルキノリン−８−オラート〕、VO(HSP)(OEt)(HOEt)〔HSP＝Ｎ−（２−ヒドロキシフェニルサリチリデンジエンアミン）〕が挙げられる。それらの非タンパク様バナジウムブロモペルオキシダーゼ化合物のうち、VO(HSP)(OEt)(HOEt)が好ましい。本発明において使われるバナジウムブロモペルオキシダーゼの量は、反応に使われる別の成分の量によって広範囲に渡り異なることができる。有用な量は当業者に容易に明白であろうが、最少量は一般にフェントモル範囲にあるだろう。試験キットの別の態様は、シグナル発生組成物の各成分、および当業者に容易に判るような追加の随意成分を含んで成ることができる。本発明の或る方法では、バナジウムブロモペルオキシダーゼは臨床分析用に「遊離形」（未接合形）で使われる。しかしながら、特異的結合方法では、バナジウムブロモペルオキシダーゼは特異的結合リガンドもしくはそのためのレセプターとの接合体として、または該リガンドもしくはレセプターのいずれかと反応する特異的結合分子との接合体として使われる。このようなアッセイでは、リガンドとレセプターは複合体を形成し、それによって該複合体のまたは複合体形成してない物質の最終検出のためにバナジウムブロモペルオキシダーゼで標識される。前記接合体の調製は、様々な既知技術を使って達成することができる（例えば、Yoshitake他，Eur．J ．Biochem.，101 ，395，1979およびKondo他への米国特許第5,106,732号明細書を参照のこと）。様々な特異的結合アッセイ形式が本発明の実施に有用であり、その例としては、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、免疫化学アッセイ（例えばエンザイムイムノアッセイおよびサンドイッチアッセイ）および当業界で周知の他のものが挙げられる。そのようなアッセイは一般に例えば米国特許第4,598,004号、Holia n他への米国特許第4,745,077号、Shih他への米国特許第5,077,198号、Mauck他への米国特許第5,085,986号、Matthews他，Anal．Biochem.，169 ，1-25頁(1988)、 WO 88/01302（1988年2月25日公開）、Warren他への米国特許第5,082,780号、およびWuへの米国特許第5,387,510号明細書の中に記載されている。上述したように、本発明は更に、バナジウムブロモペルオキシダーゼに応じて検出可能なシグナルを生成する方法であって、（i）(a)２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン誘導体を含んで成る化学発光シグナル発生試薬；(b)ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源；および(c)ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬の存在下でバナジウムブロモペルオキシダーゼを反応させて検出可能な化学発光シグナルを生成せしめ；そして（ii）前記バナジウムブロモペルオキシダーゼの測度として、生成した化学発光シグナルを測定することを含んで成る方法を提供する。本発明の方法の前に、増幅方法、例えばMullis他への米国特許第4,965,188号明細書に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲとして一般に知られている）およびWeiss，Science，251 ，1292-3頁，1991年により概説されているリガーゼ連鎖反応、を先に行って、標的核酸の量を増やした後で、本発明のシグナル発生組成物を使ってそれを検出することができる。従って、本発明の方法は、種々様々な化学的および生物学的材料、例えばアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（酵素、アビジン、抗体および抗原性タンパク質を含む）、炭水化物（単糖類、多糖類、リポ多糖類を含む）、ホルモン（例えばヒト絨毛性性腺剌激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、チロキシン、ろ胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモンおよび成長ホルモン）、代謝産物（例えばグルコース、ラクテートおよびピルベート）、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン（例えばＢ₁₂およびビオチン）、様々な生物体（微生物を含む）からの完全細胞、および薬物（麻酔薬、治療薬および乱用薬物）のいずれの検出にも使うことができる。特に有用な本発明の特異的結合方法は、着目のリガンドが同時にまたは所望の順序で少なくとも第一および第二のレセプターと複合体を形成するサンドイッチアッセイとして当業界で知られているものである。前記レセプターのうちの１つは、吸着により、共有結合または他の既知の接着方法により適当な支持体（例えばマイクロタイタープレート；重合体粒子、磁性粒子またはガラス粒子；フィルム；膜；濾紙；および当業界で周知の他のもの）上に固定化されているか、または追加の複合体形成もしくは反応を通して固定化することができる。例えば、レセプターを、支持体上に固定化されているそれの対応するレセプター成分（例えばアビジン）と反応する特異的結合成分（例えば、ビオチン）を使って標識することができる。サンドイッチアッセイでは、着目のリガンドのための第二のレセプターをバナジウムブロモペルオキシダーゼで標識することができ、または追加の特異的結合反応を通してバナジウムブロモペルオキシダーゼで標識する（例えばアビジン− ビオチン複合体を通してリガンドを標識する）ことができる。標識の検出は、上述したシグナル発生組成物を使って達成される。好ましい態様では、着目のリガンドは、抗体が反応性である抗原性物質、または相補的核酸（例えばオリゴヌクレオチド）がハイブリダイズできる核酸である。次の実施例は本発明の範囲を例示するために与えられる。それらの実施例は例示目的にのみ与えられるのであって、その中に具体的に表現されている発明をそれだけに限定すべきではない。別記したもの以外の全ての試薬および装置は、イーストマン・コダック・カンパニーまたは他の商業源から入手した。実施例１水性化学発光組成物の調製化学発光シグナルを提供する水性組成物を次のようにして調製した： 0.05Ｍ Tris-HCl緩衝剤中に10μＭのジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA ）と0.01ＭのNaBrを含有する緩衝液（pH 8.0）を調製した。二液型混合物からシグナル発生組成物を調製した。第一液は1.0 mMのルミノールNaを含み、第二液は1.0 mM H₂O₂を含み、両者とも上記緩衝液中に調製した。それらの二液を使用直前に混合した。次いで約５〜約50,000アトモルの範囲の既知濃度のバナジウムブロモペルオキシダーゼを添加した。バナジウムブロモペルオキシダーゼ（原液；４℃で貯蔵）を0.05M Tris-HCl， pH 8.0，0.01％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中に系列希釈した。それらの酵素溶液を、上記のシグナル発生組成物の入った不透明マイクロタイタープレートにピペットで添加した。次いでDYNATECH（商標）ML3000ルミノメーターを使って37℃で組成物の化学発光シグナルを測定した。図１は、バナジウムブロモペルオキシダーゼについての上記条件下での化学発光出力（ｔ＝5.0分で1.0秒積分）並びに米国特許第5,372,931号明細書の実施例１の水性化学発光組成物を使った西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）についてのシグナル出力を示す。この図面は、本発明のシグナル発生組成物が、第5,37 2,931号特許に必要とされる増強剤または電子移動剤を必要とすることなく、同米国特許明細書中に開示された組成物に匹敵するシグナルを生成することを示す。図２は、前記第5,372,931 号特許明細書に開示された組成物に比較した、本発明のシグナル発生組成物を使った場合のシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）、および大幅に減少したバックグラウンドという追加の利点を示す。表１のデータ（pH 7.5およびpH 8.0の前記緩衝液中）は、本発明の組成物を使って生じた相対化学発光シグナルおよびシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を示す。バナジウムブロモペルオキシダーゼを、４−ヨードフェニル〔AM ERLITE（商標）系〕または３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリドを使う西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）増強系と比較した。表１に示した結果は、本発明のバナジウムブロモペルオキシダーゼ系が従来技術に開示されたＨＲＰ増強系よりも10倍低濃度（すなわち１０分の１の濃度）の酵素レベルを検出することができることを指摘する。実施例２水性化学発光組成物の調製化学発光シグナルを与える水性組成物を次のようにして調製した： 0.05Ｍ MES緩衝剤中に10μＭのジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）と0. 05ＭのNaBrを含有する緩衝液（pH 7.0）を調製した。二液型混合物からシグナル発生組成物を調製した。第一液は1.0mMのルミノールNaと300 μM の３′−Cl−４′−ヒドロキシアセトアニリドまたは４−ヨードフェノールのいずれかの増強剤を含んだ。第二液は1.0 mM H₂O₂を含んだ。両液とも上記緩衝液中に調製した。それらの二液を使用直前に混合した。次いで約５〜約50,000アトモルの範囲の既知濃度のバナジウムブロモペルオキシダーゼを添加した。バナジウムブロモペルオキシダーゼ（原液；４℃で貯蔵）を0.05M Tris-HCl， pH 8.0，0.01％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中に系列希釈した。それらの酵素溶液を、上記のシグナル発生組成物の入った不透明マイクロタイタープレートにピペットで添加した。対照の場合には、第一液が増強剤を全く含まなかった。次いでDYNATECH（商標）ML3000ルミノメーターを使って37℃でｔ＝5.0分で1.0秒積分を使って組成物の化学発光シグナルを測定した。表２は、本発明のバナジウムブロモペルオキシダーゼ系がＨＲＰ系で使われる増強剤によって正の効果を受けないことを示す。前記第5,372,931号米国特許明細書に開示されたＨＲＰ系を上回る本発明の別の利点は、図３および４に示されるように、様々な濃度での系の速度論が長期間に渡り本質的に一定に保持されることである。これは、従来技術のＨＲＰ系を使ったシグナルが劇的に且つ即座に減衰する一方で、本発明の組成物を使って得られたシグナルはまったく一定のままであることを示す図４により明白に例証される。上記態様および実施例は本発明の範囲と精神を例示するために与えられる。それらの態様および実施例は、当業者に別の態様および実施例を明らかにするであろう。それらの別の態様および実施例は本発明の考えの中に含まれる。従って、本発明は添付の請求の範囲によってのみ制限されるだろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フリードマン，アランエリックアメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，サマーシアードライブ 120 (72)発明者グロールクス，サラフィンガーアメリカ合衆国，ニューヨーク 14519, オンタリオ，フィッシャーロード 6794 (72)発明者バトラー，アリソンアメリカ合衆国，カリフォルニア 93111, サンタバーバラ，サンアントニオクリークロード 1263

Claims

【特許請求の範囲】１．約6.5〜約10のpHを有する、化学発光シグナルを与える分析用組成物であって、 (a) バナジウムブロモペルオキシダーゼの触媒活性に応じてシグナルを与える化学発光シグナル発生試薬であって、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン誘導体を含んで成るシグナル発生試楽； (b) ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源；および (c) ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物を含んで成る分析用組成物。２．前記ハロゲン供給源が金属塩または非金属塩である、請求項１に記載の分析用組成物。３．前記ハロゲン供給源がNaBrである、請求項２に記載の分析用組成物。４．前記擬ハロゲン供給源がそれの配位子の１つとしてCN^-，SCN^-，OCN^-，アジドまたはイソニトリルを含有する金属化合物である、請求項１に記載の分析用組成物。５．水性混合物を更に含んで成る、請求項１に記載の分析用組成物。６．水性有機溶剤混合物を更に含んで成る、請求項１に記載の分析用組成物。７．バナジウムブロモペルオキシダーゼまたはバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識特異的結合分子を更に含んで成る、請求項１に記載の分析用組成物。８．前記バナジウムブロモペルオキシダーゼがタンパク様または非タンパク様である、請求項７に記載の分析用組成物。９．バナジウムブロモペルオキシダーゼの触媒活性の結果として分析物の測定を行うための診断試験キットであって、（i）(a) バナジウムブロモペルオキシダーゼの触媒活性に応じてシグナルを与える化学発光シグナル発生試薬であって、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン誘導体を含んで成るシグナル発生試薬； (b) ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源；および (c) ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物を含んで成る、約6.5〜約10のpHを有する化学発光シグナルを与える分析用組成物を含んで成る診断試験キット。 10．特異的結合リガンドを特異的結合相手と反応させて特異的結合複合体を形成せしめそして前記複合体を検出することを含んで成り、ここで前記特異的結合複合体を検出するための標識としてペルオキシダーゼを使用する特異的結合リガンドの測定のための特異的結合アッセイにおいて、前記標識としてバナジウムブロモペルオキシダーゼを使用し、そしてバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識特異的結合複合体を (a) ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン誘導体を含んで成る化学発光シグナル発生試薬； (b) ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源；および (c) ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物と接触せしめて検出可能な化学発光シグナルを生じさせることを特徴とする改良方法。