JPH07274968A - 組織因子経路阻害剤の製造法 - Google Patents
組織因子経路阻害剤の製造法Info
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- JPH07274968A JPH07274968A JP5040210A JP4021093A JPH07274968A JP H07274968 A JPH07274968 A JP H07274968A JP 5040210 A JP5040210 A JP 5040210A JP 4021093 A JP4021093 A JP 4021093A JP H07274968 A JPH07274968 A JP H07274968A
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- sulfonate
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
-
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 大腸菌の培養による組織因子経路阻害剤の産
生において、組織因子誘導凝固の抑制活性が大きくかつ
均質性の高い組織因子経路阻害剤を高い発現レベルで製
造する方法を提供する。 【構成】 宿主としての大腸菌において組織因子経路阻
害剤（ＴＦＰＩ）の非グリコシル化体の発現を行い、そ
の蛋白質の試験管内リフォールド処理により高度に活性
なＴＦＰＩを得、その際大腸菌細胞から単離された細胞
封入体を（１）細胞封入体をサルファイトリシスに付し
てＴＦＰＩ−Ｓ−スルフォネートを形成し、（２）その
スルフォネートをアニオン交換クロマトグラフィーで精
製し、（３）そのスルフォネートをジスルフィド交換反
応でリフォールドし、そして（４）リフォールドされた
活性なＴＦＰＩをカチオン交換クロマトグラフィーで精
製する。
生において、組織因子誘導凝固の抑制活性が大きくかつ
均質性の高い組織因子経路阻害剤を高い発現レベルで製
造する方法を提供する。 【構成】 宿主としての大腸菌において組織因子経路阻
害剤（ＴＦＰＩ）の非グリコシル化体の発現を行い、そ
の蛋白質の試験管内リフォールド処理により高度に活性
なＴＦＰＩを得、その際大腸菌細胞から単離された細胞
封入体を（１）細胞封入体をサルファイトリシスに付し
てＴＦＰＩ−Ｓ−スルフォネートを形成し、（２）その
スルフォネートをアニオン交換クロマトグラフィーで精
製し、（３）そのスルフォネートをジスルフィド交換反
応でリフォールドし、そして（４）リフォールドされた
活性なＴＦＰＩをカチオン交換クロマトグラフィーで精
製する。
Description
【産業上の利用分野】
【０００１】本発明は組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）
として知られ、またリポ蛋白質が会合した凝固抑制剤
（ＬＡＣＩ）としても知られる血液凝固抑制剤の新規な
製造法に関する。
として知られ、またリポ蛋白質が会合した凝固抑制剤
（ＬＡＣＩ）としても知られる血液凝固抑制剤の新規な
製造法に関する。
【０００２】血漿は本明細書において組織因子経路阻害
剤（ＴＦＰＩ）と称される多価のクニッツ型凝固抑制剤
を含有する。この組織因子経路阻害剤と言う名称はアム
ステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）で１９９１年６月３
０日に開催されたインターナショナル ソサイティー
オン トロンボシス アンド ヘモスタシス（Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｎ Ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉｓ ａｎｄＨｅｍｏｓｔａｓｉｓ）で認めら
れたものである。ＴＦＰＩは、ブロッツェ（Ｂｒｏｚ
ｅ）及びミレチフ（Ｍｉｌｅｔｉｃｈ）がＰｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、１９８６−
１８９０（１９８７）に記載するように、初めヒトのヘ
パトーム細胞であるＨｅｐ Ｇ２から精製され、続いて
ノボツニー（Ｎｏｖｏｔｎｙ）等がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．、２６４、１８８３２−１８８３７（１９８９）
において報告しているようにヒトの血漿から、またブン
（Ｗｕｎ）等がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１
６０９６−１６１０１（１９９０）に開示しているよう
にチャング（Ｃｈａｎｇ）ヘパトーム及びＳＫヘパトー
ムの細胞から精製された。ＴＦＰＩ ｃＤＮＡはブン等
がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、６００１−６０
０４（１９８８）に、またギラルド（Ｇｉｒａｒｄ）等
がＴｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、５５、３７−５０（１９８
９）に記載するように胎盤及び内皮のｃＤＮＡライブラ
リーから単離された。ｃＤＮＡ配列から推定されるＴＦ
ＰＩの主たるアミノ酸配列は、ＴＦＰＩが高度に負に帯
電したアミノ末端、３つの直列のクニッツ型抑制性ドメ
イン及び高度に正に帯電したカルボキシル末端を含有し
ていることを示している。ＴＦＰＩの第一クニッツ−ド
メインは因子ＶＩＩa ／組織因子複合体の抑制に必要と
され、またＴＦＰＩの第二クニッツ−ドメインは、ギラ
ルド等のＮａｔｕｒｅ、３２８、５１８−５２０（１９
８９）によれば、因子Ｘa の抑制に応答可能であるが、
他方第三クニッツ−ドメインの機能は未知のままであ
る。米国特許第５，１０６，８３３号明細書も参照され
たい。ＴＦＰＩは不活性な因子Ｘa ：ＴＦＰＩ：因子Ｖ
ＩＩa ：組織因子の４次複合体を形成することによって
生体内で凝固の開始を制限する機能を奏すると考えられ
る。ＴＦＰＩについてのこれ以上の背景情報はラパポー
ト（Ｒａｐａｐｏｒｔ）及びロッツェ等による最近の総
説、即ちラパポートのＢｌｏｏｄ、７３、３５９−３６
５（１９８９）及びブロッツェ等のＢｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、２９、７５３９−７５４６（１９９０）を参照
することによって知ることができる。
剤（ＴＦＰＩ）と称される多価のクニッツ型凝固抑制剤
を含有する。この組織因子経路阻害剤と言う名称はアム
ステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）で１９９１年６月３
０日に開催されたインターナショナル ソサイティー
オン トロンボシス アンド ヘモスタシス（Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｎ Ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉｓ ａｎｄＨｅｍｏｓｔａｓｉｓ）で認めら
れたものである。ＴＦＰＩは、ブロッツェ（Ｂｒｏｚ
ｅ）及びミレチフ（Ｍｉｌｅｔｉｃｈ）がＰｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、１９８６−
１８９０（１９８７）に記載するように、初めヒトのヘ
パトーム細胞であるＨｅｐ Ｇ２から精製され、続いて
ノボツニー（Ｎｏｖｏｔｎｙ）等がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．、２６４、１８８３２−１８８３７（１９８９）
において報告しているようにヒトの血漿から、またブン
（Ｗｕｎ）等がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１
６０９６−１６１０１（１９９０）に開示しているよう
にチャング（Ｃｈａｎｇ）ヘパトーム及びＳＫヘパトー
ムの細胞から精製された。ＴＦＰＩ ｃＤＮＡはブン等
がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、６００１−６０
０４（１９８８）に、またギラルド（Ｇｉｒａｒｄ）等
がＴｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、５５、３７−５０（１９８
９）に記載するように胎盤及び内皮のｃＤＮＡライブラ
リーから単離された。ｃＤＮＡ配列から推定されるＴＦ
ＰＩの主たるアミノ酸配列は、ＴＦＰＩが高度に負に帯
電したアミノ末端、３つの直列のクニッツ型抑制性ドメ
イン及び高度に正に帯電したカルボキシル末端を含有し
ていることを示している。ＴＦＰＩの第一クニッツ−ド
メインは因子ＶＩＩa ／組織因子複合体の抑制に必要と
され、またＴＦＰＩの第二クニッツ−ドメインは、ギラ
ルド等のＮａｔｕｒｅ、３２８、５１８−５２０（１９
８９）によれば、因子Ｘa の抑制に応答可能であるが、
他方第三クニッツ−ドメインの機能は未知のままであ
る。米国特許第５，１０６，８３３号明細書も参照され
たい。ＴＦＰＩは不活性な因子Ｘa ：ＴＦＰＩ：因子Ｖ
ＩＩa ：組織因子の４次複合体を形成することによって
生体内で凝固の開始を制限する機能を奏すると考えられ
る。ＴＦＰＩについてのこれ以上の背景情報はラパポー
ト（Ｒａｐａｐｏｒｔ）及びロッツェ等による最近の総
説、即ちラパポートのＢｌｏｏｄ、７３、３５９−３６
５（１９８９）及びブロッツェ等のＢｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、２９、７５３９−７５４６（１９９０）を参照
することによって知ることができる。
【０００３】組換えＴＦＰＩはデイ（Ｄａｙ）等がＢｌ
ｏｏｄ、７６、１５３８−１５４５（１９９０）に開示
するマウスＣ１２７細胞；ペダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅ
ｎ）等がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１６７８
６−１６７９３（１９９０）において報告する新生ハム
スターの腎細胞；チャイニーズハムスターの卵細胞；及
びヒトＳＫヘパトーム細胞を含めて哺乳類の細胞宿主を
使用してグリコシル化蛋白質として発現された。Ｃ１２
７ＴＦＰＩは動物実験で使用され、そしてラビットにお
ける組織因子誘導脈管内凝固の抑制（デイ等の上記文
献）及びイヌにおける血栓崩壊後の動脈の再閉塞の予防
［ハスケル（Ｈａｓｋｅｌ）等のＣｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ、８４、８２１−８２７（１９９１）］に有効である
ことが示された。
ｏｏｄ、７６、１５３８−１５４５（１９９０）に開示
するマウスＣ１２７細胞；ペダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅ
ｎ）等がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１６７８
６−１６７９３（１９９０）において報告する新生ハム
スターの腎細胞；チャイニーズハムスターの卵細胞；及
びヒトＳＫヘパトーム細胞を含めて哺乳類の細胞宿主を
使用してグリコシル化蛋白質として発現された。Ｃ１２
７ＴＦＰＩは動物実験で使用され、そしてラビットにお
ける組織因子誘導脈管内凝固の抑制（デイ等の上記文
献）及びイヌにおける血栓崩壊後の動脈の再閉塞の予防
［ハスケル（Ｈａｓｋｅｌ）等のＣｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ、８４、８２１−８２７（１９９１）］に有効である
ことが示された。
【０００４】ＴＦＰＩのアミノ酸残基数２７６個の蛋白
質をコード化するＴＦＰＩ ｃＤＮＡのクローニングは
ブン等の米国特許第４，９６６，８５２号明細書に更に
記載されている。この米国特許明細書の開示を本明細書
において引用、参照するものとする。
質をコード化するＴＦＰＩ ｃＤＮＡのクローニングは
ブン等の米国特許第４，９６６，８５２号明細書に更に
記載されている。この米国特許明細書の開示を本明細書
において引用、参照するものとする。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】以上のような従来の方
法には、しかし、ＴＦＰＩをリフォールドすると活性が
大きく低下すること、大腸菌の培養によるＴＦＰＩの産
生において大腸菌におけるＴＦＰＩの発現レベルが低い
こと、及び産生ＴＦＰＩの均質性が低いこと等の問題が
依然として残されている。
法には、しかし、ＴＦＰＩをリフォールドすると活性が
大きく低下すること、大腸菌の培養によるＴＦＰＩの産
生において大腸菌におけるＴＦＰＩの発現レベルが低い
こと、及び産生ＴＦＰＩの均質性が低いこと等の問題が
依然として残されている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】発明の簡単な説明 本発明によれば、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）の新
規な製造法が提供される。この方法は宿主としての大腸
菌においてＴＦＰＩの非グリコシル化体の発現を行い、
その蛋白質の試験管内リフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）処
理、即ち再折り畳み処理により高度に活性なＴＦＰＩを
得ることを含む。この方法によれば、ＴＦＰＩはこれを
コードするｃＤＮＡを含有する複製可能な発現ベクター
により形質転換されている大腸菌宿主細胞をそのＴＦＰ
Ｉを産生させるのに十分な発酵条件下で培養し、それら
大腸菌細胞を収穫し、収穫された大腸菌細胞から細胞封
入体を単離し、そしてそれら細胞封入体を、本発明の１
つの態様（Ａ）においては
規な製造法が提供される。この方法は宿主としての大腸
菌においてＴＦＰＩの非グリコシル化体の発現を行い、
その蛋白質の試験管内リフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）処
理、即ち再折り畳み処理により高度に活性なＴＦＰＩを
得ることを含む。この方法によれば、ＴＦＰＩはこれを
コードするｃＤＮＡを含有する複製可能な発現ベクター
により形質転換されている大腸菌宿主細胞をそのＴＦＰ
Ｉを産生させるのに十分な発酵条件下で培養し、それら
大腸菌細胞を収穫し、収穫された大腸菌細胞から細胞封
入体を単離し、そしてそれら細胞封入体を、本発明の１
つの態様（Ａ）においては
【０００７】（１）それら細胞封入体をサルファイトリ
シス（ｓｕｌｆｉｔｏｌｙｓｉｓ）に付してＴＦＰＩ−
Ｓ−スルフォネートを形成し、
シス（ｓｕｌｆｉｔｏｌｙｓｉｓ）に付してＴＦＰＩ−
Ｓ−スルフォネートを形成し、
【０００８】（２）そのＴＦＰＩ−Ｓ−スルフォネート
をアニオン交換クロマトグラフィーで精製し、
をアニオン交換クロマトグラフィーで精製し、
【０００９】（３）そのＴＦＰＩ−Ｓ−スルフォネート
をジスルフィド交換反応でリフォールドし、そして
をジスルフィド交換反応でリフォールドし、そして
【００１０】（４）リフォールドされた活性なＴＦＰＩ
をカチオン交換クロマトグラフィーで精製すること
をカチオン交換クロマトグラフィーで精製すること
【００１１】を含んで成る段階的精製に付すことによっ
て製造される。
て製造される。
【００１２】本発明のもう１つの態様（Ｂ）によれば、
上記細胞封入体は
上記細胞封入体は
【００１３】（１）それら細胞封入体を尿素中でのβ−
メルカプトエタノールによる還元に付して還元されたＴ
ＦＰＩを形成し、
メルカプトエタノールによる還元に付して還元されたＴ
ＦＰＩを形成し、
【００１４】（２）その還元ＴＦＰＩをカチオン交換ク
ロマトグラフィーで精製し、
ロマトグラフィーで精製し、
【００１５】（３）その還元ＴＦＰＩを尿素中でのジス
ルフィド交換反応でリフォールドし、そして
ルフィド交換反応でリフォールドし、そして
【００１６】（４）リフォールドされた活性なＴＦＰＩ
をカチオン交換クロマトグラフィーで精製することを含
んで成る段階的精製プロセスに付される。
をカチオン交換クロマトグラフィーで精製することを含
んで成る段階的精製プロセスに付される。
【００１７】上記の両精製プロセスで使用するためのイ
オン交換樹脂の実例は、例えばバイオ ラド社（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）から市販されるＡＧ５０１−Ｘ８混合床イオ
ン交換体；モノ（ＭＯＮＯ）Ｑ ＨＲ５／５；モノＳ
ＨＲ５／５；モノＳ ＨＲ１０／１０；及びファーマシ
ア社（Ｐｈａｒｍｃｉａ）から市販されるハイロード
（ＨｉＬｏａｄ）１０／１６Ｑセファローズ（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ）イオン交換体等の常用の市販品である。
オン交換樹脂の実例は、例えばバイオ ラド社（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）から市販されるＡＧ５０１−Ｘ８混合床イオ
ン交換体；モノ（ＭＯＮＯ）Ｑ ＨＲ５／５；モノＳ
ＨＲ５／５；モノＳ ＨＲ１０／１０；及びファーマシ
ア社（Ｐｈａｒｍｃｉａ）から市販されるハイロード
（ＨｉＬｏａｄ）１０／１６Ｑセファローズ（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ）イオン交換体等の常用の市販品である。
【００１８】粗製の可溶化された細胞封入体の米国特許
第４，９２３，９６７号明細書に記載される方法等の方
法による還元／再酸化によって、及びスルホン化／ジス
ルフィド交換反応によってＴＦＰＩをリフォールドする
と活性の大きな低下がもたらされた。予想外にも、ＴＦ
ＰＩをリフォールド処理工程に先立ってスルホン化で精
製し、続いて本発明の方法の態様（Ａ）に従ってアニオ
ン交換クロマトグラフィーを行うと、後記の実施例１か
ら分かるように組織因子誘導凝固時間検定の抑制におい
て高度に精製された、フル−レングス（ｆｕｌｌ−ｌｅ
ｎｇｔｈ）のＳＫヘパトーム誘導ＴＦＰＩより２倍高い
比活性がもたらされた。このことはＴＦＰＩ上の炭水化
物がＴＦＰＩの活性には必要とされないことを示唆して
いる。大腸菌誘導ＴＦＰＩのこれらの利点は、グリコシ
ル化ＳＫヘパトーム誘導ＴＦＰＩが、ブン等がＪ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１６０９６−１６１０１
（１９９０）において報告している他の哺乳類の細胞源
から単離されたＴＦＰＩより相当に高い比活性を有する
ことは今までに示されていなかったことから、驚くべき
ことである。
第４，９２３，９６７号明細書に記載される方法等の方
法による還元／再酸化によって、及びスルホン化／ジス
ルフィド交換反応によってＴＦＰＩをリフォールドする
と活性の大きな低下がもたらされた。予想外にも、ＴＦ
ＰＩをリフォールド処理工程に先立ってスルホン化で精
製し、続いて本発明の方法の態様（Ａ）に従ってアニオ
ン交換クロマトグラフィーを行うと、後記の実施例１か
ら分かるように組織因子誘導凝固時間検定の抑制におい
て高度に精製された、フル−レングス（ｆｕｌｌ−ｌｅ
ｎｇｔｈ）のＳＫヘパトーム誘導ＴＦＰＩより２倍高い
比活性がもたらされた。このことはＴＦＰＩ上の炭水化
物がＴＦＰＩの活性には必要とされないことを示唆して
いる。大腸菌誘導ＴＦＰＩのこれらの利点は、グリコシ
ル化ＳＫヘパトーム誘導ＴＦＰＩが、ブン等がＪ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１６０９６−１６１０１
（１９９０）において報告している他の哺乳類の細胞源
から単離されたＴＦＰＩより相当に高い比活性を有する
ことは今までに示されていなかったことから、驚くべき
ことである。
【００１９】大腸菌におけるＴＦＰＩの産生は、ＴＦＰ
Ｉが大きさが約３２，０００ダルトンで、９個のジスル
フィド結合（Ｃｙｓ残基数１８個）を有する高度に組織
化された蛋白質である点で更に予想外のことであった。
極めて複雑なリフォールディング機構が達成されている
に違いない。このような複雑な蛋白質が大腸菌中で発酵
用ブイヨン、即ち液体培地に対して１０ｍｇ／リットル
を越える最終産生収量で製造されたことを示す文献の例
は、それがあっても数例でしかない。本発明によれば、
１００ｍｇ／リットルを越える発現レベルが大腸菌発現
系により達成された。比較すると、匹敵する分子量を有
するもう１つの高度に組織化された蛋白質であるレニン
の産生は大腸菌中では達成されなかった。
Ｉが大きさが約３２，０００ダルトンで、９個のジスル
フィド結合（Ｃｙｓ残基数１８個）を有する高度に組織
化された蛋白質である点で更に予想外のことであった。
極めて複雑なリフォールディング機構が達成されている
に違いない。このような複雑な蛋白質が大腸菌中で発酵
用ブイヨン、即ち液体培地に対して１０ｍｇ／リットル
を越える最終産生収量で製造されたことを示す文献の例
は、それがあっても数例でしかない。本発明によれば、
１００ｍｇ／リットルを越える発現レベルが大腸菌発現
系により達成された。比較すると、匹敵する分子量を有
するもう１つの高度に組織化された蛋白質であるレニン
の産生は大腸菌中では達成されなかった。
【００２０】本発明のもう１つの利点は、かなりの不均
質性を示すＳＫヘパトーム誘導物質によるよりも均質性
のレベルが実質的に高いＴＦＰＩ生成物が得られること
である。蛋白質の不均質性は毒性、免疫原性及び副次的
な影響の可能性を高め得るものである。不均質性を減少
させる試みを行うには更に複雑でコストの高い生成プロ
セスが必要とされる。不均質性が存在するときは、分析
及び監視の方法は効果が少なく［例えば、エレクトロス
プレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分光分析］、
かつ更にコストが高くなる。大腸菌の発現系ではなく哺
乳類の発現系から製造されたＴＦＰＩには、次のような
幾つかの不均質性群が現れることが観察されている。
質性を示すＳＫヘパトーム誘導物質によるよりも均質性
のレベルが実質的に高いＴＦＰＩ生成物が得られること
である。蛋白質の不均質性は毒性、免疫原性及び副次的
な影響の可能性を高め得るものである。不均質性を減少
させる試みを行うには更に複雑でコストの高い生成プロ
セスが必要とされる。不均質性が存在するときは、分析
及び監視の方法は効果が少なく［例えば、エレクトロス
プレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分光分析］、
かつ更にコストが高くなる。大腸菌の発現系ではなく哺
乳類の発現系から製造されたＴＦＰＩには、次のような
幾つかの不均質性群が現れることが観察されている。
【００２１】Ａ．燐酸化 哺乳類の発現系はＴＦＰＩのＳｅｒ−２を色々な程度に
燐酸化することが観察された（燐酸化の典型的な値は全
産生ＴＦＰＩの２５％である）。燐酸化はプロトロンビ
ンの血餅形成活性に影響を及ぼさない。大腸菌発現系か
ら産生されたＴＦＰＩは燐酸化されない。エレクトロス
プレー質量分光分析は、ＳＫ ＨｅｐＴＦＰＩが燐酸化
された種と燐酸化されていない種との混合物であること
を示している。
燐酸化することが観察された（燐酸化の典型的な値は全
産生ＴＦＰＩの２５％である）。燐酸化はプロトロンビ
ンの血餅形成活性に影響を及ぼさない。大腸菌発現系か
ら産生されたＴＦＰＩは燐酸化されない。エレクトロス
プレー質量分光分析は、ＳＫ ＨｅｐＴＦＰＩが燐酸化
された種と燐酸化されていない種との混合物であること
を示している。
【００２２】Ｂ．蛋白質の加水分解により誘導される内
部開裂 ＣＨＯ、Ｃ−１２７及びＳＫ Ｈｅｐから産生されたＴ
ＦＰＩはＡｒｇ−１９９及びＡｒｇ−８３等の内部部位
に内部蛋白質加水分解性開裂を持つ種を含有することが
恒常的に観察された。これらの開裂は哺乳類発現系から
産生されたＴＦＰＩは収穫前に長期間媒体プロテアーゼ
に暴露されなければならないこのと結果であると考えら
れる。大腸菌ＴＦＰＩはより少量の内部蛋白質加水分解
性開裂しか含有しないことが観察された。これはＴＦＰ
Ｉが不溶性の屈折性体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ ｂｏｄ
ｙ）中の大腸菌内に封鎖され、これらの屈折性体がそれ
らが可溶化される時間前に洗浄されて細胞プロテアーゼ
を含まなくなる結果であると考えられる。
部開裂 ＣＨＯ、Ｃ−１２７及びＳＫ Ｈｅｐから産生されたＴ
ＦＰＩはＡｒｇ−１９９及びＡｒｇ−８３等の内部部位
に内部蛋白質加水分解性開裂を持つ種を含有することが
恒常的に観察された。これらの開裂は哺乳類発現系から
産生されたＴＦＰＩは収穫前に長期間媒体プロテアーゼ
に暴露されなければならないこのと結果であると考えら
れる。大腸菌ＴＦＰＩはより少量の内部蛋白質加水分解
性開裂しか含有しないことが観察された。これはＴＦＰ
Ｉが不溶性の屈折性体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ ｂｏｄ
ｙ）中の大腸菌内に封鎖され、これらの屈折性体がそれ
らが可溶化される時間前に洗浄されて細胞プロテアーゼ
を含まなくなる結果であると考えられる。
【００２３】Ｃ．グリコシル化 ＣＨＯ、Ｃ−１２７及びＳＫ Ｈｅｐから産生されたＴ
ＦＰＩは多重部位で広範にグリコシル化される。哺乳類
産生ＴＦＰＩの質量の約３０％は炭水化物に由来するも
のである。蛋白質加水分解マッピング及び質量分光デー
ターはこれらのグリコシル化部位に高度の不均質性が存
在することを示している。大腸菌産生ＴＦＰＩはグリコ
シル化されない。
ＦＰＩは多重部位で広範にグリコシル化される。哺乳類
産生ＴＦＰＩの質量の約３０％は炭水化物に由来するも
のである。蛋白質加水分解マッピング及び質量分光デー
ターはこれらのグリコシル化部位に高度の不均質性が存
在することを示している。大腸菌産生ＴＦＰＩはグリコ
シル化されない。
【００２４】本発明の１つの好ましい態様によれば、Ｎ
−末端アラニン残基が、そうでなければＮ−末端メチオ
ニン残基であるであろうものの大腸菌中での発現を改良
し、その完全処理を遂行するためにＴＦＰＩ配列に組み
込まれる。用語法上の便宜のために、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．、２６３、６００１−６００４（１９８８）に
おいてブン等により；Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、５５、
３７−５０（１９８９）においてギラルド等により；ま
た米国特許第４，４６６，８５２号明細書において従来
公にされたＴＦＰＩ（ＬＡＣＩ）の２７６個のアミノ酸
配列の番号表示系を本明細書でそのまま用い、そしてＮ
−末端アラニン残基には−１を与える。しかして、大腸
菌において産生されるＴＦＰＩのこの好ましい態様はア
ミノ酸残基２７７個の蛋白質である。本明細書で使用さ
れているＴＦＰＩなる用語はアミノ酸２７６個のＴＦＰ
Ｉ蛋白質とアミノ酸２７７個のＡｌａ−ＴＦＰＩ蛋白質
の両者を含むことを意味する。
−末端アラニン残基が、そうでなければＮ−末端メチオ
ニン残基であるであろうものの大腸菌中での発現を改良
し、その完全処理を遂行するためにＴＦＰＩ配列に組み
込まれる。用語法上の便宜のために、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．、２６３、６００１−６００４（１９８８）に
おいてブン等により；Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、５５、
３７−５０（１９８９）においてギラルド等により；ま
た米国特許第４，４６６，８５２号明細書において従来
公にされたＴＦＰＩ（ＬＡＣＩ）の２７６個のアミノ酸
配列の番号表示系を本明細書でそのまま用い、そしてＮ
−末端アラニン残基には−１を与える。しかして、大腸
菌において産生されるＴＦＰＩのこの好ましい態様はア
ミノ酸残基２７７個の蛋白質である。本明細書で使用さ
れているＴＦＰＩなる用語はアミノ酸２７６個のＴＦＰ
Ｉ蛋白質とアミノ酸２７７個のＡｌａ−ＴＦＰＩ蛋白質
の両者を含むことを意味する。
【００２５】ＴＦＰＩをコードするｃＤＮＡを挿入する
ことができる好ましい複製可能な発現ベクターは、例え
ばオリンズ（Ｏｌｉｎｓ）等がＧｅｎｅ、７３、２２７
−２３５（１９８８）に、またオリンズとラングワラ
（Ｒａｎｇｗａｌａ）がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２
６４、１６９７３−１６９７６（１９８９）に記載する
ようなものであって、これらはｒｅｃＡプロモーター
（Ｐrec Ａ）、及びバクテリオファージＴ７ファージ遺
伝子１０リーダー（Ｇ１０−Ｌ−ＲＢＳ）から誘導され
るリボソーム−結合部位を含有する、ｐＢＲ３２７に基
づくプラスミドである。このようなベクターは大腸菌中
で外来遺伝子の高められた発現に適していることが知ら
れている。このようなベクターの実例は図１１及び図１
２にそれぞれ示されるプラスミドｐＭＯＮ５５５７及び
ｐＭＯＮ５７６６である。大腸菌中で外来遺伝子を発現
させるためのこれらの及び他のそのようなベクターは、
例えばブン等がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、６
００１−６００４（１９８８）に、ギラルド等がＴｈｒ
ｏｍｂ．Ｒｅｓ．、５５、３７−５０（１９８９）に、
そしてブン等が米国特許第４，９６６，８５２号明細書
に記載するＴＦＰＩ用のｃＤＮＡを常用の組み替えＤＮ
Ａ法で挿入することができる。例えば、Ｎ．Ｙ．州コー
ルド スプリング ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）のコールド スプリング ハーバー
ラボラトリー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｒｙ）刊行（１９８２年）のマニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌを参照されたい。プラスミドｐＢＲ３２７はソベロン
（Ｓｏｂｅｒｏｎ）等がＧｅｎｅ、９、２８７−３０５
（１９８０）に記載する市販プラスミドｐＢＲ３２２の
３２７３ｂｐ欠失誘導体であって、ジェンバンク（Ｇｅ
ｎｂａｎｋ）においてＳＹＮＰ３２７と言うインデック
スが付けられている。
ことができる好ましい複製可能な発現ベクターは、例え
ばオリンズ（Ｏｌｉｎｓ）等がＧｅｎｅ、７３、２２７
−２３５（１９８８）に、またオリンズとラングワラ
（Ｒａｎｇｗａｌａ）がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２
６４、１６９７３−１６９７６（１９８９）に記載する
ようなものであって、これらはｒｅｃＡプロモーター
（Ｐrec Ａ）、及びバクテリオファージＴ７ファージ遺
伝子１０リーダー（Ｇ１０−Ｌ−ＲＢＳ）から誘導され
るリボソーム−結合部位を含有する、ｐＢＲ３２７に基
づくプラスミドである。このようなベクターは大腸菌中
で外来遺伝子の高められた発現に適していることが知ら
れている。このようなベクターの実例は図１１及び図１
２にそれぞれ示されるプラスミドｐＭＯＮ５５５７及び
ｐＭＯＮ５７６６である。大腸菌中で外来遺伝子を発現
させるためのこれらの及び他のそのようなベクターは、
例えばブン等がＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、６
００１−６００４（１９８８）に、ギラルド等がＴｈｒ
ｏｍｂ．Ｒｅｓ．、５５、３７−５０（１９８９）に、
そしてブン等が米国特許第４，９６６，８５２号明細書
に記載するＴＦＰＩ用のｃＤＮＡを常用の組み替えＤＮ
Ａ法で挿入することができる。例えば、Ｎ．Ｙ．州コー
ルド スプリング ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）のコールド スプリング ハーバー
ラボラトリー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｒｙ）刊行（１９８２年）のマニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌを参照されたい。プラスミドｐＢＲ３２７はソベロン
（Ｓｏｂｅｒｏｎ）等がＧｅｎｅ、９、２８７−３０５
（１９８０）に記載する市販プラスミドｐＢＲ３２２の
３２７３ｂｐ欠失誘導体であって、ジェンバンク（Ｇｅ
ｎｂａｎｋ）においてＳＹＮＰ３２７と言うインデック
スが付けられている。
【００２６】発明の詳しい説明 本明細書は特許請求の範囲を以て本発明をなすと見なさ
れる主題を特に指摘し、かつ明確に特許請求するもので
あることを結論するものであるが、本発明は添付図面と
共に次の好ましい態様の詳細な説明から更によく理解さ
れると考えられる。
れる主題を特に指摘し、かつ明確に特許請求するもので
あることを結論するものであるが、本発明は添付図面と
共に次の好ましい態様の詳細な説明から更によく理解さ
れると考えられる。
【００２７】図面において、図１は２つの部分、即ち図
１Ａと図１ＢにモノＱ ＨＲ５／５アニオン交換カラム
によるスルホン化された細胞封入体のクロマトグラフィ
ーを示すものである。細胞封入体は後記の実施例１の方
法の項に記載されるように可溶化され、かつスルホン化
された。スルホン化試料２ｍＬ（ミリリットル）（生重
量として細胞封入体２０ｍｇに相当）をＮａＣｌ・０．
１５Ｍを含有するＱ−緩衝液（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ・２０
ｍＭ、ｐＨ８、尿素６Ｍ及びＢｒｉｊ３５ノニオン系洗
浄剤０．０１％）中で前以て平衡にされたモノＱ ＨＲ
５／５カラムの上に装填した。カラムは上記平衡用緩衝
液１５ｍＬで洗浄され、そしてＱ−緩衝液中で勾配剤
（ＮａＣｌ・０．１５〜０．４Ｍ）３０ｍＬで溶離され
た。各画分１ｍＬを採集した。（Ａ）モノＱ−クロマト
グラム。実線：２８０ｎｍにおける吸光度；鎖線：Ｎａ
Ｃｌの勾配。フル−レングスのＴＦＰＩ蛋白質の大部分
を含有する太い横棒線で示される画分をリフォールド処
理試験用にプールした。（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。各指
定画分１０μＬ（マイクロリットル）を電気泳動のため
に１０〜２０％勾配のゲルの上に装填した。ゲルはコー
マシー ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染
色した。ＭＷが印されたレーンに分子量の標準値を入れ
た。予備カラム試料をＰｒｅ−と印されたレーンに入れ
た。
１Ａと図１ＢにモノＱ ＨＲ５／５アニオン交換カラム
によるスルホン化された細胞封入体のクロマトグラフィ
ーを示すものである。細胞封入体は後記の実施例１の方
法の項に記載されるように可溶化され、かつスルホン化
された。スルホン化試料２ｍＬ（ミリリットル）（生重
量として細胞封入体２０ｍｇに相当）をＮａＣｌ・０．
１５Ｍを含有するＱ−緩衝液（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ・２０
ｍＭ、ｐＨ８、尿素６Ｍ及びＢｒｉｊ３５ノニオン系洗
浄剤０．０１％）中で前以て平衡にされたモノＱ ＨＲ
５／５カラムの上に装填した。カラムは上記平衡用緩衝
液１５ｍＬで洗浄され、そしてＱ−緩衝液中で勾配剤
（ＮａＣｌ・０．１５〜０．４Ｍ）３０ｍＬで溶離され
た。各画分１ｍＬを採集した。（Ａ）モノＱ−クロマト
グラム。実線：２８０ｎｍにおける吸光度；鎖線：Ｎａ
Ｃｌの勾配。フル−レングスのＴＦＰＩ蛋白質の大部分
を含有する太い横棒線で示される画分をリフォールド処
理試験用にプールした。（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。各指
定画分１０μＬ（マイクロリットル）を電気泳動のため
に１０〜２０％勾配のゲルの上に装填した。ゲルはコー
マシー ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染
色した。ＭＷが印されたレーンに分子量の標準値を入れ
た。予備カラム試料をＰｒｅ−と印されたレーンに入れ
た。
【００２８】図２はハイロードＱセファローズ１６／１
０アニオン交換樹脂カラムによるスルホン化細胞封入体
のクロマトグラフィーを示す。スルホン化細胞封入体は
後記実施例１の方法の項に記載されるようにして製造さ
れた。スルホン化試料４０ｍＬ（生重量として細胞封入
体０．５６ｇに相当）をＮａＣｌ・０．１５Ｍを含有す
るＱ−緩衝液中で前以て平衡にされたハイロードＱセフ
ァローズ１６／１０の上に装填した。カラムは平衡用緩
衝液２４０ｍＬで洗浄され、次いでＱ−緩衝液中勾配剤
（ＮａＣｌ・０．１５〜０．４Ｍ）３９６ｍＬで溶離さ
れた。実線：２８０ｎｍにおける吸光度；鎖線：ＮａＣ
ｌの勾配。太い横棒線で指定された画分（４３〜５０）
はリフォールド処理用にプールした。インセット（ｉｎ
ｓｅｔ）：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。各指定画分１０μＬを１
０〜２０％勾配のゲルの上に装填した。ゲルは電気泳動
後にコーマシー ブルーで染色した。
０アニオン交換樹脂カラムによるスルホン化細胞封入体
のクロマトグラフィーを示す。スルホン化細胞封入体は
後記実施例１の方法の項に記載されるようにして製造さ
れた。スルホン化試料４０ｍＬ（生重量として細胞封入
体０．５６ｇに相当）をＮａＣｌ・０．１５Ｍを含有す
るＱ−緩衝液中で前以て平衡にされたハイロードＱセフ
ァローズ１６／１０の上に装填した。カラムは平衡用緩
衝液２４０ｍＬで洗浄され、次いでＱ−緩衝液中勾配剤
（ＮａＣｌ・０．１５〜０．４Ｍ）３９６ｍＬで溶離さ
れた。実線：２８０ｎｍにおける吸光度；鎖線：ＮａＣ
ｌの勾配。太い横棒線で指定された画分（４３〜５０）
はリフォールド処理用にプールした。インセット（ｉｎ
ｓｅｔ）：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。各指定画分１０μＬを１
０〜２０％勾配のゲルの上に装填した。ゲルは電気泳動
後にコーマシー ブルーで染色した。
【００２９】図３は大腸菌ＴＦＰＩのサルファイトリシ
ス／リフォールド中の比活性の増加を示すグラフであ
る。ハイロードＱセファローズからの、プールされた、
スルホン化されたフル−レングスのＴＦＰＩをＮａＣｌ
・０．３Ｍを含有するＱ−緩衝液で吸光度Ａ280nm ＝
０．０７まで希釈した。固体のＬ−システインを最終濃
度が２ｍＭになるまで加えた。この溶液を室温で２４時
間インキュベートし、水により１：１で希釈し、Ｌ−シ
ステイン１ｍＭを加え、そして室温で更に２４時間及び
４℃で最大８日間までの期間インキュベートした。組織
因子誘導凝固時間検定法を用いて活性を測定し、フル−
レングスのＳＫヘパトームＴＦＰＩの標準製剤の活性と
比較した。比活性は１：１０希釈度のリフォールド混合
物が補充された血漿の血餅形成時間を標準カーブと比較
することによって得た。標準カーブの構成は、精製ＳＫ
ヘパトームＴＦＰＩが補充された血漿の血餅形成に基づ
くものであった。これらの値は誤差バーで示される標準
偏差を持つ３種の製剤の平均である。
ス／リフォールド中の比活性の増加を示すグラフであ
る。ハイロードＱセファローズからの、プールされた、
スルホン化されたフル−レングスのＴＦＰＩをＮａＣｌ
・０．３Ｍを含有するＱ−緩衝液で吸光度Ａ280nm ＝
０．０７まで希釈した。固体のＬ−システインを最終濃
度が２ｍＭになるまで加えた。この溶液を室温で２４時
間インキュベートし、水により１：１で希釈し、Ｌ−シ
ステイン１ｍＭを加え、そして室温で更に２４時間及び
４℃で最大８日間までの期間インキュベートした。組織
因子誘導凝固時間検定法を用いて活性を測定し、フル−
レングスのＳＫヘパトームＴＦＰＩの標準製剤の活性と
比較した。比活性は１：１０希釈度のリフォールド混合
物が補充された血漿の血餅形成時間を標準カーブと比較
することによって得た。標準カーブの構成は、精製ＳＫ
ヘパトームＴＦＰＩが補充された血漿の血餅形成に基づ
くものであった。これらの値は誤差バーで示される標準
偏差を持つ３種の製剤の平均である。
【００３０】図４はリフォールド混合物のモノＳ ＨＲ
５／５カチオン交換カラム上でのクロマトグラフィーに
よる分画を示すものである。７日間のリフォールド処理
溶液を酢酸１０ｍＭの添加でｐＨ４．５まで酸性化し、
アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＭ１０膜を用いる限外濾過
で２５倍に濃縮した。濃縮試料２ｍＬをＳ−緩衝液（燐
酸ナトリウム２０ｍＭ、ｐＨ６．４、尿素６Ｍ）で前以
て平衡にされたモノＳＨＲ５／５カラムの上に装填し
た。カラムはＳ−緩衝液１０ｍＬで洗浄され、Ｓ−緩衝
液中ＮａＣｌ・０〜０．７Ｍより成る勾配剤７０ｍＬで
溶離されたた。各画分１ｍＬを採集した。実線：２８０
ｎｍにおける吸光度；鎖線：ＮａＣｌの勾配；黒塗り
円：画分５２に対する比活性。比活性は血餅形成時間を
ｍＬ当たりのミリ吸光度単位の画分５２の濃度に対して
プロットして構成された標準カーブと比較することによ
って組織因子誘導凝固時間検定法を用いて測定した。イ
ンセット：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。各指定画分１０μＬを１
０〜２０％勾配のゲルの上に装填した。ゲルを電気泳動
後にコーマシー ブルーで染色した。ＭＷは分子量の標
準値が付けられているレーンである。ｐｒｅ−と印され
ているレーンは予備カラム試料である。分子量の表示の
左側の試料は還元されなかったものであり、同右側の試
料は２−メルカプトエタノールを３．３％含有する試料
緩衝液中で還元され、そして３分間沸騰された後電気泳
動を行ったものである。
５／５カチオン交換カラム上でのクロマトグラフィーに
よる分画を示すものである。７日間のリフォールド処理
溶液を酢酸１０ｍＭの添加でｐＨ４．５まで酸性化し、
アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＭ１０膜を用いる限外濾過
で２５倍に濃縮した。濃縮試料２ｍＬをＳ−緩衝液（燐
酸ナトリウム２０ｍＭ、ｐＨ６．４、尿素６Ｍ）で前以
て平衡にされたモノＳＨＲ５／５カラムの上に装填し
た。カラムはＳ−緩衝液１０ｍＬで洗浄され、Ｓ−緩衝
液中ＮａＣｌ・０〜０．７Ｍより成る勾配剤７０ｍＬで
溶離されたた。各画分１ｍＬを採集した。実線：２８０
ｎｍにおける吸光度；鎖線：ＮａＣｌの勾配；黒塗り
円：画分５２に対する比活性。比活性は血餅形成時間を
ｍＬ当たりのミリ吸光度単位の画分５２の濃度に対して
プロットして構成された標準カーブと比較することによ
って組織因子誘導凝固時間検定法を用いて測定した。イ
ンセット：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。各指定画分１０μＬを１
０〜２０％勾配のゲルの上に装填した。ゲルを電気泳動
後にコーマシー ブルーで染色した。ＭＷは分子量の標
準値が付けられているレーンである。ｐｒｅ−と印され
ているレーンは予備カラム試料である。分子量の表示の
左側の試料は還元されなかったものであり、同右側の試
料は２−メルカプトエタノールを３．３％含有する試料
緩衝液中で還元され、そして３分間沸騰された後電気泳
動を行ったものである。
【００３１】図５は３つの部分、即ち図５Ａ、図５Ｂ及
び図５Ｃにリフォールド混合物についてのモノＳ ＨＲ
５／５カチオン交換カラムクロマトグラフィーの最適化
を示すものである。リフォールド混合物２ｍＬを酢酸１
０ｍＭの添加でｐＨ４．５まで酸性化し、そして出発緩
衝液中で前以て平衡にされたモノＳ ＨＲ５／５カラム
の上に装填した。（Ａ）及び（Ｂ）についての出発緩衝
液はＳ−緩衝液より成り、（Ｃ）についての出発緩衝液
はＮａＣｌ・０．３Ｍが補充されたＳ−緩衝液より成
る。カラムは出発緩衝液１０ｍＬで、続いて各パネルに
指定される通りのＮａＣｌ勾配剤で洗浄された。実線：
２８０ｎｍにおける吸光度；黒塗り円：ブランク実験。
ＮａＣｌ勾配剤は（Ａ）については２０ｍＭ／ｍＬ、
（Ｂ）については１０ｍＭ／ｍＬであった。パネル
（Ｃ）において、カラムはＳ−緩衝液中０．３ＭのＮａ
Ｃｌ・１０ｍＬで、続いて１０ｍＭ／ｍＬのＮａＣｌ勾
配剤で洗浄された。
び図５Ｃにリフォールド混合物についてのモノＳ ＨＲ
５／５カチオン交換カラムクロマトグラフィーの最適化
を示すものである。リフォールド混合物２ｍＬを酢酸１
０ｍＭの添加でｐＨ４．５まで酸性化し、そして出発緩
衝液中で前以て平衡にされたモノＳ ＨＲ５／５カラム
の上に装填した。（Ａ）及び（Ｂ）についての出発緩衝
液はＳ−緩衝液より成り、（Ｃ）についての出発緩衝液
はＮａＣｌ・０．３Ｍが補充されたＳ−緩衝液より成
る。カラムは出発緩衝液１０ｍＬで、続いて各パネルに
指定される通りのＮａＣｌ勾配剤で洗浄された。実線：
２８０ｎｍにおける吸光度；黒塗り円：ブランク実験。
ＮａＣｌ勾配剤は（Ａ）については２０ｍＭ／ｍＬ、
（Ｂ）については１０ｍＭ／ｍＬであった。パネル
（Ｃ）において、カラムはＳ−緩衝液中０．３ＭのＮａ
Ｃｌ・１０ｍＬで、続いて１０ｍＭ／ｍＬのＮａＣｌ勾
配剤で洗浄された。
【００３２】図６はリフォールド混合物についてのモノ
Ｓ ＨＲ１０／１６カチオン交換カラムによるクロマト
グラフィーを示すものである。リフォールド混合物（１
０５０ｍＬ）を酢酸１０ｍＭの添加でｐＨ４．５まで酸
性化し、ＹＭ１０膜を用いる限外濾過で７５倍に濃縮し
た。濃縮液をＮａＣｌ・０．３Ｍを含有するＳ−緩衝液
中で前以て平衡にされたモノＳ ＨＲ１０／１６カラム
の上に装填した。カラムは平衡用緩衝液１２０ｍＬ（１
５カラム容量）で洗浄され、そしてＳ−緩衝液中ＮａＣ
ｌ・０．３〜０．５Ｍの勾配剤で溶離された。実線：２
８０ｎｍにおける吸光度；鎖線：ＮａＣｌの勾配。太い
横棒線はＴＦＰＩ活性の大部分を有するプールされた画
分（２０〜２５）を示す。インセット：ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ。レーン１：分子量の標準値；レーン２：非還元性緩
衝液中のプールされた画分２０〜２５；レーン３：２−
メルカプトエタノール３．３％を含有する試料緩衝液中
で還元され、３分間沸騰させた後電気泳動を行った、プ
ールされた画分２０〜２５。
Ｓ ＨＲ１０／１６カチオン交換カラムによるクロマト
グラフィーを示すものである。リフォールド混合物（１
０５０ｍＬ）を酢酸１０ｍＭの添加でｐＨ４．５まで酸
性化し、ＹＭ１０膜を用いる限外濾過で７５倍に濃縮し
た。濃縮液をＮａＣｌ・０．３Ｍを含有するＳ−緩衝液
中で前以て平衡にされたモノＳ ＨＲ１０／１６カラム
の上に装填した。カラムは平衡用緩衝液１２０ｍＬ（１
５カラム容量）で洗浄され、そしてＳ−緩衝液中ＮａＣ
ｌ・０．３〜０．５Ｍの勾配剤で溶離された。実線：２
８０ｎｍにおける吸光度；鎖線：ＮａＣｌの勾配。太い
横棒線はＴＦＰＩ活性の大部分を有するプールされた画
分（２０〜２５）を示す。インセット：ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ。レーン１：分子量の標準値；レーン２：非還元性緩
衝液中のプールされた画分２０〜２５；レーン３：２−
メルカプトエタノール３．３％を含有する試料緩衝液中
で還元され、３分間沸騰させた後電気泳動を行った、プ
ールされた画分２０〜２５。
【００３３】図７は精製ＳＫヘパトームＴＦＰＩ及びリ
フォールドされた大腸菌ＴＦＰＩによるウシ因子Ｘa の
阻害を示すグラフである。フル−レングスのＳＫヘパト
ームＴＦＰＩをモノクローナル抗−ＴＦＰＩ−Ｉｇがカ
ップリングされたセファローズ４Ｂカラム、及びモノＳ
カラムによる、細胞の状態調節された媒体の常法によ
るクロマトグラフィーによって単離した。モノクローナ
ル抗−ＬＡＣＩ−Ｉｇ−セファローズ４Ｂカラムによる
通常の免疫クロマトグラフィーについては、例えばデイ
等のＢｌｏｏｄ、７６、１５３８−１５４５（１９９
０）及びイン プレス社（Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ）刊（１９
９２年）のブン等によるＴｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ
ａｓ．を参照されたい。ウシ因子Ｘa の阻害は基質とし
てスペクトロツァイム（Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ）Ｘa
を使用するアミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）検定法
で測定した。ＴＦＰＩ濃度はアミノ酸分析と吸光度の測
定で評価した。ＴＦＰＩのモル濃度の計算に、モル消衰
係数・Ｅ280nm ＝２．９０×１０4 及びＳＫ ＴＦＰＩ
及び大腸菌ＴＦＰＩについてそれぞれ３８，０００及び
３２，０００の分子量を用いた。供給業者［アメリカン
ダイアグノスティカ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃａ）］が測定したウシ因子Ｘa の濃度はブン
等のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１６０９６−
１６１０１（１９９０）による、ｐ−ニトロフェニル
ｐ’−グアニジノベンゾエートによる活性部位の滴定に
よって得られた値に匹敵する。中抜き円：大腸菌ＴＦＰ
Ｉ；黒塗り円：ＳＫ ＴＦＰＩ。
フォールドされた大腸菌ＴＦＰＩによるウシ因子Ｘa の
阻害を示すグラフである。フル−レングスのＳＫヘパト
ームＴＦＰＩをモノクローナル抗−ＴＦＰＩ−Ｉｇがカ
ップリングされたセファローズ４Ｂカラム、及びモノＳ
カラムによる、細胞の状態調節された媒体の常法によ
るクロマトグラフィーによって単離した。モノクローナ
ル抗−ＬＡＣＩ−Ｉｇ−セファローズ４Ｂカラムによる
通常の免疫クロマトグラフィーについては、例えばデイ
等のＢｌｏｏｄ、７６、１５３８−１５４５（１９９
０）及びイン プレス社（Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ）刊（１９
９２年）のブン等によるＴｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ
ａｓ．を参照されたい。ウシ因子Ｘa の阻害は基質とし
てスペクトロツァイム（Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ）Ｘa
を使用するアミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）検定法
で測定した。ＴＦＰＩ濃度はアミノ酸分析と吸光度の測
定で評価した。ＴＦＰＩのモル濃度の計算に、モル消衰
係数・Ｅ280nm ＝２．９０×１０4 及びＳＫ ＴＦＰＩ
及び大腸菌ＴＦＰＩについてそれぞれ３８，０００及び
３２，０００の分子量を用いた。供給業者［アメリカン
ダイアグノスティカ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃａ）］が測定したウシ因子Ｘa の濃度はブン
等のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１６０９６−
１６１０１（１９９０）による、ｐ−ニトロフェニル
ｐ’−グアニジノベンゾエートによる活性部位の滴定に
よって得られた値に匹敵する。中抜き円：大腸菌ＴＦＰ
Ｉ；黒塗り円：ＳＫ ＴＦＰＩ。
【００３４】図８はヒト血漿の組織因子誘導凝固の抑制
におけるフル−レングスのＳＫヘパトームＴＦＰＩの抑
制活性とリフォールドされた大腸菌ＴＦＰＩの抑制活性
との比較を示すグラフである。組織因子誘導凝固時間検
定は後記実施例１の方法の項に記載される通りに行っ
た。ＴＦＰＩはアミノ酸分析と２８０ｎｍにおける吸光
度の測定によって定量した。吸光度の測定でＴＦＰＩ・
１ｍＡ（１×１０-3吸光度単位）が３４．５ｎＭに相当
することが見いだされた。中抜き円：大腸菌ＴＦＰＩ；
黒塗り円：ＳＫ ＴＦＰＩ。
におけるフル−レングスのＳＫヘパトームＴＦＰＩの抑
制活性とリフォールドされた大腸菌ＴＦＰＩの抑制活性
との比較を示すグラフである。組織因子誘導凝固時間検
定は後記実施例１の方法の項に記載される通りに行っ
た。ＴＦＰＩはアミノ酸分析と２８０ｎｍにおける吸光
度の測定によって定量した。吸光度の測定でＴＦＰＩ・
１ｍＡ（１×１０-3吸光度単位）が３４．５ｎＭに相当
することが見いだされた。中抜き円：大腸菌ＴＦＰＩ；
黒塗り円：ＳＫ ＴＦＰＩ。
【００３５】図９は本明細書に記載される本発明の方法
の態様（Ａ）及び（Ｂ）によって製造されたＴＦＰＩの
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルによる
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析の結果を示すもので
ある。ＴＦＰＩの第一バンドは還元ゲルと元々のゲルに
対して同じであった。元々のゲルでは、実施例１、態様
（Ａ）によって製造されたＴＦＰＩはより高含量の二量
体種を有していることが分かるが、これに対して実施例
２、態様（Ｂ）によって製造されたＴＦＰＩはより低分
子量の（Ｃ−末端側が一部切断された）種をより高含量
で有していることが分かる。分子量のレーンは左側（カ
ラム２本）と右側（カラム１本）に示され、分子量の標
準値は図９の右側にキロダルトン（ｋＤａ）で示されて
いる。
の態様（Ａ）及び（Ｂ）によって製造されたＴＦＰＩの
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルによる
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析の結果を示すもので
ある。ＴＦＰＩの第一バンドは還元ゲルと元々のゲルに
対して同じであった。元々のゲルでは、実施例１、態様
（Ａ）によって製造されたＴＦＰＩはより高含量の二量
体種を有していることが分かるが、これに対して実施例
２、態様（Ｂ）によって製造されたＴＦＰＩはより低分
子量の（Ｃ−末端側が一部切断された）種をより高含量
で有していることが分かる。分子量のレーンは左側（カ
ラム２本）と右側（カラム１本）に示され、分子量の標
準値は図９の右側にキロダルトン（ｋＤａ）で示されて
いる。
【００３６】図１０はアミノ酸残基２７７個のＡｌａ−
ＴＦＰＩ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］の３つのクニッツ
ドメインについてのスルホヒドリル結合を示している二
次構造の模式図である。残基１〜２７６は前に述べたＴ
ＦＰＩ（ＬＡＣＩ）の公になっている配列に相当し、Ｎ
−末端アラニンには−１が与えられている。
ＴＦＰＩ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］の３つのクニッツ
ドメインについてのスルホヒドリル結合を示している二
次構造の模式図である。残基１〜２７６は前に述べたＴ
ＦＰＩ（ＬＡＣＩ）の公になっている配列に相当し、Ｎ
−末端アラニンには−１が与えられている。
【００３７】図１１はＴＦＰＩ ｃＤＮＡの挿入に適し
た３８５７ｂｐの発現ベクターであるプラスミドｐＭＯ
Ｎ５５５７のマップを示す略図である。ｐＭＯＮ５５５
７はｒｅｃＡプロモーター（ＰｒｅｃＡ）、翻訳エンハ
ンサー要素及びバクテリオファージＴ７の遺伝子１０リ
ーダー（Ｇ１０Ｌ）に由来するリボソーム結合部位、並
びにＴ７転写ターミネーター（Ｔ７ ｔｅｒｍ）を含有
する、ｐＢＲ３２７に基づくプラスミドである。
た３８５７ｂｐの発現ベクターであるプラスミドｐＭＯ
Ｎ５５５７のマップを示す略図である。ｐＭＯＮ５５５
７はｒｅｃＡプロモーター（ＰｒｅｃＡ）、翻訳エンハ
ンサー要素及びバクテリオファージＴ７の遺伝子１０リ
ーダー（Ｇ１０Ｌ）に由来するリボソーム結合部位、並
びにＴ７転写ターミネーター（Ｔ７ ｔｅｒｍ）を含有
する、ｐＢＲ３２７に基づくプラスミドである。
【００３８】図１２はＴＦＰＩ ｃＤＮＡの挿入に適し
た、３６５２ｂｐの発現ベクターであるプラスミドｐＭ
ＯＮ５７６６のマップを示す略図である。ｐＭＯＮ５７
６６はＰｒｅｃＡ、Ｇ１０Ｌ、多重クローニング部位リ
ンカー、Ｍ１３複製オリジン（ｏｒｉ−Ｍ１３）を含有
する、ｐＢＲ３２７に基づくプラスミドである。
た、３６５２ｂｐの発現ベクターであるプラスミドｐＭ
ＯＮ５７６６のマップを示す略図である。ｐＭＯＮ５７
６６はＰｒｅｃＡ、Ｇ１０Ｌ、多重クローニング部位リ
ンカー、Ｍ１３複製オリジン（ｏｒｉ−Ｍ１３）を含有
する、ｐＢＲ３２７に基づくプラスミドである。
【００３９】
【実施例】特定の好ましい態様を更に詳細に説明するた
めに、次の代表的な、実験室規模の製造研究を行った。
ただし、本発明はこれら特定の実施例又はその中に記載
される特定の細部に限定されるものではないことは了解
されるだろう。実施例１は本発明の態様（Ａ）を例証す
るものであり、実施例２は本発明の態様（Ｂ）を例証す
るものである。
めに、次の代表的な、実験室規模の製造研究を行った。
ただし、本発明はこれら特定の実施例又はその中に記載
される特定の細部に限定されるものではないことは了解
されるだろう。実施例１は本発明の態様（Ａ）を例証す
るものであり、実施例２は本発明の態様（Ｂ）を例証す
るものである。
【００４０】実施例１ 材料 尿素［セクエナル（ｓｅｑｕｅｎａｌ）級］とＢｒｉｊ
３５ノニオン系界面活性剤はピアース社（Ｐｉｅｒｃ
ｅ）から入手した。混合床樹脂ＡＧ５０１−Ｘ８イオン
交換体はバイオ ラド社から購入した。モノＱ ＨＲ５
／５アニオン交換樹脂とハイロードＱセファローズアニ
オン交換樹脂、及びモノＳ ＨＲ５／５カチオン交換樹
脂とモノＳ ＨＲ１０／１６カチオン交換樹脂はファー
マシア社から入手した。トロンボプラスチン試薬［シム
プラスチン エクセル（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ Ｅｘｃ
ｅｌ：登録商標）］はオルガノン テクニカ社（Ｏｒｇ
ａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．）から入手し
た。ウシ因子Ｘa とスペクトロツァイムＸa はアメリカ
ン ダイアグノスチカ社によって供給された。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ用の１０〜２０％勾配のゲルは統合されたセパ
レーション システムズ社（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）から入手した。
３５ノニオン系界面活性剤はピアース社（Ｐｉｅｒｃ
ｅ）から入手した。混合床樹脂ＡＧ５０１−Ｘ８イオン
交換体はバイオ ラド社から購入した。モノＱ ＨＲ５
／５アニオン交換樹脂とハイロードＱセファローズアニ
オン交換樹脂、及びモノＳ ＨＲ５／５カチオン交換樹
脂とモノＳ ＨＲ１０／１６カチオン交換樹脂はファー
マシア社から入手した。トロンボプラスチン試薬［シム
プラスチン エクセル（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ Ｅｘｃ
ｅｌ：登録商標）］はオルガノン テクニカ社（Ｏｒｇ
ａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．）から入手し
た。ウシ因子Ｘa とスペクトロツァイムＸa はアメリカ
ン ダイアグノスチカ社によって供給された。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ用の１０〜２０％勾配のゲルは統合されたセパ
レーション システムズ社（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）から入手した。
【００４１】方法 発現ベクター及びクローニング法 フル−レングスのヒトＴＦＰＩ ｃＤＮＡ［ブン等の
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、６００１−６００
４（１９８８）］を１．４ＫｂのＥｃｏＲＩ断片として
Ｍ１３ｍｐ１８ファージのＤＮＡクローニング用ベクタ
ーにクローンした。部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄ
ｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［オリゴヌ
クレオチド特異的試験管内変異誘発系、バーション２；
アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］を用いてＮｃｏＩ
部位を開始ＡＴＧにおいて導入した。そのＴＦＰＩ遺伝
子を次にＮｃｏＩ／ＭａｅＩＩＩ側のみが平滑化された
断片としてｐＭＯＮ５５５７にクローンした（図１
１）。その際、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ側のみが平
滑化された端は新しいベクターｐＭＯＮ９３０８をもた
した。ＭａｅＩＩＩ部位はＴＦＰＩ ｃＤＮＡ中の停止
コドンから１５ｂｐ下流にある。この発現ベクターはｒ
ｅｃＡプロモーター、オリンズとラングワラがＪ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４、１６９７３−１６９７６
（１９８９）に記載する、バクテリオファージＴ７の遺
伝子１０リーダーに由来する翻訳エンハンサー要素とリ
ボソーム結合用部位、及びＴ７転写ターミネーターを含
有していた。プラスミドｐＭＯＮ５５５７もＴＦＰＩ遺
伝子により置換されてプラスミドｐＭＯＮ９３０８を形
成する関係のない配列、即ちｂＳＴ遺伝子（ウシのソマ
トトロピン）を含有している。
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、６００１−６００
４（１９８８）］を１．４ＫｂのＥｃｏＲＩ断片として
Ｍ１３ｍｐ１８ファージのＤＮＡクローニング用ベクタ
ーにクローンした。部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄ
ｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［オリゴヌ
クレオチド特異的試験管内変異誘発系、バーション２；
アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］を用いてＮｃｏＩ
部位を開始ＡＴＧにおいて導入した。そのＴＦＰＩ遺伝
子を次にＮｃｏＩ／ＭａｅＩＩＩ側のみが平滑化された
断片としてｐＭＯＮ５５５７にクローンした（図１
１）。その際、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ側のみが平
滑化された端は新しいベクターｐＭＯＮ９３０８をもた
した。ＭａｅＩＩＩ部位はＴＦＰＩ ｃＤＮＡ中の停止
コドンから１５ｂｐ下流にある。この発現ベクターはｒ
ｅｃＡプロモーター、オリンズとラングワラがＪ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４、１６９７３−１６９７６
（１９８９）に記載する、バクテリオファージＴ７の遺
伝子１０リーダーに由来する翻訳エンハンサー要素とリ
ボソーム結合用部位、及びＴ７転写ターミネーターを含
有していた。プラスミドｐＭＯＮ５５５７もＴＦＰＩ遺
伝子により置換されてプラスミドｐＭＯＮ９３０８を形
成する関係のない配列、即ちｂＳＴ遺伝子（ウシのソマ
トトロピン）を含有している。
【００４２】ｐＭＯＮ９３０８のＮｃｏＩ／ＮｓｉＩ断
片を次に合成ＤＮＡ断片で置換した。合成ＤＮＡ断片は
（１）アラニンコード用コドンを第二の位置において導
入し、（２）遺伝子の５’部のＡ−Ｔ濃厚度（ｒｉｃｈ
ｎｅｓｓ）を高め、そして（３）大腸菌のコドン使用の
用法を改良すべく設計されたものである。各鎖について
２種ずつ４種のオリゴヌクレオチドを使用した。全塩基
置換（上側のケースにおいて指定される）はサイレント
変化（ｓｉｌｅｎｔ ｃｈａｎｇｅ）である。ＥＣＴＦ
ＰＩ２及び３は５’部において燐酸化された［Ｎ．Ｙ．
州コールド スプリング ハーバーのコールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリー社の刊行（１９８２年）
に係るマニアティス等のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ］。
ＥＣＴＦＰＩ １及び２とＥＣＴＦＰＩ ３及び４を７
０℃で５分間インキュベートし、そして室温までゆっく
り冷却することによってキナーゼ緩衝液中でアニーリン
グした。これらの断片をＮｃｏＩ／ＮｓｉＩで消化され
たｐＭＯＮ９３０８にクローンした。ＰＣＲ拡大法を用
いてＴＦＰＩ遺伝子の３’端においてＴＡＡ終止コドン
のみならずＨｉｎｄＩＩＩ部位も導入した。ＰＣＲプラ
イマーであるＴＦＰＩｔｅｒｍ及びＴＦＰＩｔｅｒｍ２
を以下に示す。そのＴＦＰＩ遺伝子を次にＮＣＯＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＭＯＮ５７６６（図１２）に
移動させた。得られたプラスミドはｐＭＯＮ６８７０で
あった。
片を次に合成ＤＮＡ断片で置換した。合成ＤＮＡ断片は
（１）アラニンコード用コドンを第二の位置において導
入し、（２）遺伝子の５’部のＡ−Ｔ濃厚度（ｒｉｃｈ
ｎｅｓｓ）を高め、そして（３）大腸菌のコドン使用の
用法を改良すべく設計されたものである。各鎖について
２種ずつ４種のオリゴヌクレオチドを使用した。全塩基
置換（上側のケースにおいて指定される）はサイレント
変化（ｓｉｌｅｎｔ ｃｈａｎｇｅ）である。ＥＣＴＦ
ＰＩ２及び３は５’部において燐酸化された［Ｎ．Ｙ．
州コールド スプリング ハーバーのコールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリー社の刊行（１９８２年）
に係るマニアティス等のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ］。
ＥＣＴＦＰＩ １及び２とＥＣＴＦＰＩ ３及び４を７
０℃で５分間インキュベートし、そして室温までゆっく
り冷却することによってキナーゼ緩衝液中でアニーリン
グした。これらの断片をＮｃｏＩ／ＮｓｉＩで消化され
たｐＭＯＮ９３０８にクローンした。ＰＣＲ拡大法を用
いてＴＦＰＩ遺伝子の３’端においてＴＡＡ終止コドン
のみならずＨｉｎｄＩＩＩ部位も導入した。ＰＣＲプラ
イマーであるＴＦＰＩｔｅｒｍ及びＴＦＰＩｔｅｒｍ２
を以下に示す。そのＴＦＰＩ遺伝子を次にＮＣＯＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＭＯＮ５７６６（図１２）に
移動させた。得られたプラスミドはｐＭＯＮ６８７０で
あった。
【化１】
【００４３】ｐＭＯＮ６８７０をＢｇＩＩＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩを用いて消化した。発現カセットを含有するこの
断片をＢｇＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたｐ
ＭＯＮ６７１０［オブコビッツ（Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚ）
等のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、９７３７−９７
４５（１９９０）］にクローンした。得られたプラスミ
ドｐＭＯＮ６８７５はｔａｃプロモーター、バクテリオ
ファージＴ７からのＧ１０リーダー、Ｍｅｔ−Ａｌａ
ＴＦＰＩ及びｐ２２転写用ターミネーターを含んでい
る。これらのプラスミドをＴＦＰＩ蛋白質の発現のため
にＪＭ１０１からのＦ’を含有するＭＯＮ１０５（ｒｐ
ｏＤ＋ｒｐｏＨ３５８）に形質転換させた。
ＩＩＩを用いて消化した。発現カセットを含有するこの
断片をＢｇＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたｐ
ＭＯＮ６７１０［オブコビッツ（Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚ）
等のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、９７３７−９７
４５（１９９０）］にクローンした。得られたプラスミ
ドｐＭＯＮ６８７５はｔａｃプロモーター、バクテリオ
ファージＴ７からのＧ１０リーダー、Ｍｅｔ−Ａｌａ
ＴＦＰＩ及びｐ２２転写用ターミネーターを含んでい
る。これらのプラスミドをＴＦＰＩ蛋白質の発現のため
にＪＭ１０１からのＦ’を含有するＭＯＮ１０５（ｒｐ
ｏＤ＋ｒｐｏＨ３５８）に形質転換させた。
【００４４】発酵 １０リットルずつの発酵をバイオスタッドＥ発酵体（Ｂ
ｉｏｓｔａｄ Ｅ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒｓ）［Ｂ．ブラ
ウン（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）］中２０ｇ／Ｌ（リットル）の
カザミノ酸が補充されたＭ９の、塩を最小限度で含む媒
体中で行った。発酵は温度３７℃、撹拌速度１０００ｒ
ｐｍ、空気流量１５Ｌ／分及び背圧１０ｐｓｉで行っ
た。ｐＨは水酸化アンモニウムで７．０に制御した。発
酵ブイヨン中の残留グルコース濃度は１．０＋／−０．
１ｇ／Ｌに自動制御した。５５０ｎｍにおける光学濃度
４６．０において、温度を３７℃から３０℃にシフトさ
せ、そして発酵体にイソプロピル β−Ｄチオガラクト
ピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１．０ｍＭになる
まで加えた。培養物をアミコンＤＣ１０Ｌ濃縮器で濃縮
し、続いてベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｊ２−２１遠
心分離機で遠心分離することによって４時間の後誘導期
間収穫した。１０リットルの発酵で生重量として細胞ペ
ースト３３５〜４５６ｇ（平均３７６＋／−４６ｇ、ｎ
＝６）が生成した。細胞ペーストを更に以下の処理を行
うために−８０℃で凍結させた。
ｉｏｓｔａｄ Ｅ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒｓ）［Ｂ．ブラ
ウン（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）］中２０ｇ／Ｌ（リットル）の
カザミノ酸が補充されたＭ９の、塩を最小限度で含む媒
体中で行った。発酵は温度３７℃、撹拌速度１０００ｒ
ｐｍ、空気流量１５Ｌ／分及び背圧１０ｐｓｉで行っ
た。ｐＨは水酸化アンモニウムで７．０に制御した。発
酵ブイヨン中の残留グルコース濃度は１．０＋／−０．
１ｇ／Ｌに自動制御した。５５０ｎｍにおける光学濃度
４６．０において、温度を３７℃から３０℃にシフトさ
せ、そして発酵体にイソプロピル β−Ｄチオガラクト
ピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１．０ｍＭになる
まで加えた。培養物をアミコンＤＣ１０Ｌ濃縮器で濃縮
し、続いてベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｊ２−２１遠
心分離機で遠心分離することによって４時間の後誘導期
間収穫した。１０リットルの発酵で生重量として細胞ペ
ースト３３５〜４５６ｇ（平均３７６＋／−４６ｇ、ｎ
＝６）が生成した。細胞ペーストを更に以下の処理を行
うために−８０℃で凍結させた。
【００４５】細胞封入体の単離 大腸菌の凍結された細胞ペーストをミリ（Ｍｉｌｌｉ）
−Ｑ冷水に濃度７５ｇ／Ｌで再懸濁させた。これらの細
胞をホモジナイザー［ウルトラ−ツラックス（Ｕｌｔｒ
ａ−Ｔｕｒｒａｘ）モデルＳＤ−４５］により氷上に３
０分間完全に分散させた。細胞をマントン−ガウリン
（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ）ホモジナイザー（モデ
ル１５Ｍ−８ＴＡ）に１２，０００ｐｓｉで３回通すこ
とによって機械的に溶解させた。細胞封入体をソーバル
（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ−２Ｂ遠心分離機でそのＧＳＡ
ローターに１０，０００ｒｐｍ（１６，２７０×ｇ）に
おいて２０分間遠心分離した。上層液は捨てた。細胞封
入体のペッレトを採集し、ミリ−Ｑ冷水１Ｌに再懸濁
し、そしてウルトラ−ツラックス ホモジナイザーを用
いて氷上に３０分間分散させた。細胞封入体をマントン
−ガウリン ホモジナイザーを通して氷上に２回以上循
環させた。細胞封入体を前のようにソーバルＲＣ−２Ｂ
遠心分離機でペレット化した。溶解した大腸菌のグラム
毎に約６０ｍｇの細胞封入体が採集された。これら細胞
封入体を−８０℃で貯蔵した。
−Ｑ冷水に濃度７５ｇ／Ｌで再懸濁させた。これらの細
胞をホモジナイザー［ウルトラ−ツラックス（Ｕｌｔｒ
ａ−Ｔｕｒｒａｘ）モデルＳＤ−４５］により氷上に３
０分間完全に分散させた。細胞をマントン−ガウリン
（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ）ホモジナイザー（モデ
ル１５Ｍ−８ＴＡ）に１２，０００ｐｓｉで３回通すこ
とによって機械的に溶解させた。細胞封入体をソーバル
（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ−２Ｂ遠心分離機でそのＧＳＡ
ローターに１０，０００ｒｐｍ（１６，２７０×ｇ）に
おいて２０分間遠心分離した。上層液は捨てた。細胞封
入体のペッレトを採集し、ミリ−Ｑ冷水１Ｌに再懸濁
し、そしてウルトラ−ツラックス ホモジナイザーを用
いて氷上に３０分間分散させた。細胞封入体をマントン
−ガウリン ホモジナイザーを通して氷上に２回以上循
環させた。細胞封入体を前のようにソーバルＲＣ−２Ｂ
遠心分離機でペレット化した。溶解した大腸菌のグラム
毎に約６０ｍｇの細胞封入体が採集された。これら細胞
封入体を−８０℃で貯蔵した。
【００４６】緩衝液の調製 大腸菌ＴＦＰＩのスルホン化とリフォールド処理に使用
した緩衝液は全て高濃度の尿素を含有していた。尿素溶
液をバイオ−ラド混合床樹脂ＡＧ５０１−Ｘ６により室
温で少なくとも２０分間処理し、そして０．２μｍのフ
ィルターを通して濾過した後緩衝液と混合した。クロマ
トグラフィーに使用した溶液は全て０．２μｍのフィル
ターで濾過し、ハウス バキューム（ｈｏｕｓｅ ｖａ
ｃｕｕｍ）下で約１０分間音波処理した。
した緩衝液は全て高濃度の尿素を含有していた。尿素溶
液をバイオ−ラド混合床樹脂ＡＧ５０１−Ｘ６により室
温で少なくとも２０分間処理し、そして０．２μｍのフ
ィルターを通して濾過した後緩衝液と混合した。クロマ
トグラフィーに使用した溶液は全て０．２μｍのフィル
ターで濾過し、ハウス バキューム（ｈｏｕｓｅ ｖａ
ｃｕｕｍ）下で約１０分間音波処理した。
【００４７】細胞封入体のスルホン化 細胞封入体１ｇ（生重量）をトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣ
ｌ・５０ｍＭ、ｐＨ８及び尿素７．５Ｍを含有する溶液
に均質化と渦巻き混合によって分散させた。細胞封入体
が大部分溶解された後、亜硫酸ナトリウム８００ｍｇを
加え、その混合物を室温で３０分間振盪した。次いで、
亜ジチオン酸ナトリウム４００ｍｇを加え、その混合物
を４℃で１晩振盪した。その溶液を、スペクラポー（Ｓ
ｐｅｃｔｒａｐｏｒ）＃２膜を使用して４℃においてト
リス／ＨＣｌ・２０ｍＭ、ｐＨ８及び尿素４Ｍを含有す
る溶液４００ｍＬに対して５時間以上透析した。透析さ
れた溶液を４８，４００×ｇで１時間遠心分離し、０．
２μｍのフィルターを通して濾過し、複数の既知少量に
分け、そして−８０℃で貯蔵した。
ｌ・５０ｍＭ、ｐＨ８及び尿素７．５Ｍを含有する溶液
に均質化と渦巻き混合によって分散させた。細胞封入体
が大部分溶解された後、亜硫酸ナトリウム８００ｍｇを
加え、その混合物を室温で３０分間振盪した。次いで、
亜ジチオン酸ナトリウム４００ｍｇを加え、その混合物
を４℃で１晩振盪した。その溶液を、スペクラポー（Ｓ
ｐｅｃｔｒａｐｏｒ）＃２膜を使用して４℃においてト
リス／ＨＣｌ・２０ｍＭ、ｐＨ８及び尿素４Ｍを含有す
る溶液４００ｍＬに対して５時間以上透析した。透析さ
れた溶液を４８，４００×ｇで１時間遠心分離し、０．
２μｍのフィルターを通して濾過し、複数の既知少量に
分け、そして−８０℃で貯蔵した。
【００４８】スルホン化ＴＦＰＩのアニオン交換クロマ
トグラフィー 小規模実験において、スルホン化され、かつ透析された
細胞封入体をモノＱＨＲ５／５アニオン交換カラムによ
り分別した。即ち、カラムをＮａＣｌ・０．１５Ｍを含
有するＱ−緩衝液（トリス／ＨＣｌ・２０ｍＭ、ｐＨ
８、Ｂｒｉｊ３５ノニオン系界面活性剤０．０１％）中
で前以て平衡にさせた。スルホン化細胞封入体２ｍＬを
このカラムに装填した。カラムを次に上記平衡用緩衝液
１５ｍＬで洗浄し、そしてＱ−緩衝液中勾配剤（ＮａＣ
ｌ・０．１５〜０．４Ｍ）３０ｍＬにより溶離した。各
画分１ｍＬを採集した。更に大きな規模の実験におい
て、スルホン化試料４０ｍＬ（生重量として細胞封入体
０．５６ｇに相当）をＮａＣｌ・０．１５Ｍを含有する
Ｑ−緩衝液中で前以て平衡にされたハイロードＱセファ
ローズ１６／１０アニオン交換カラムの上に装填した。
カラムを平衡用緩衝液２４０ｍＬで洗浄し、次いでＱ−
緩衝液中勾配剤（ＮａＣｌ・０．１５〜０．４Ｍ）３９
６ｍＬで溶離した。各画分９ｍＬを採集した。両クロマ
トグラフィーはファーマシアＦＰＬＣ系で室温において
実施した。
トグラフィー 小規模実験において、スルホン化され、かつ透析された
細胞封入体をモノＱＨＲ５／５アニオン交換カラムによ
り分別した。即ち、カラムをＮａＣｌ・０．１５Ｍを含
有するＱ−緩衝液（トリス／ＨＣｌ・２０ｍＭ、ｐＨ
８、Ｂｒｉｊ３５ノニオン系界面活性剤０．０１％）中
で前以て平衡にさせた。スルホン化細胞封入体２ｍＬを
このカラムに装填した。カラムを次に上記平衡用緩衝液
１５ｍＬで洗浄し、そしてＱ−緩衝液中勾配剤（ＮａＣ
ｌ・０．１５〜０．４Ｍ）３０ｍＬにより溶離した。各
画分１ｍＬを採集した。更に大きな規模の実験におい
て、スルホン化試料４０ｍＬ（生重量として細胞封入体
０．５６ｇに相当）をＮａＣｌ・０．１５Ｍを含有する
Ｑ−緩衝液中で前以て平衡にされたハイロードＱセファ
ローズ１６／１０アニオン交換カラムの上に装填した。
カラムを平衡用緩衝液２４０ｍＬで洗浄し、次いでＱ−
緩衝液中勾配剤（ＮａＣｌ・０．１５〜０．４Ｍ）３９
６ｍＬで溶離した。各画分９ｍＬを採集した。両クロマ
トグラフィーはファーマシアＦＰＬＣ系で室温において
実施した。
【００４９】スルホン化ＴＦＰＩのリフォールド アニオン交換クロマトグラフィーからの、プールされ
た、スルホン化されたフル−レングスのＴＦＰＩをＮａ
Ｃｌ・０．３Ｍを含有するＱ−緩衝液を用いて２８０ｎ
ｍにおける吸光度０．０７ Ｏ．Ｄ．単位になるまで希
釈した。固体のＬ−システインを最終濃度が２ｍＭにな
るまで加えた。この溶液を室温で２４時間インキュベー
トし、水で１：１に希釈し、Ｌ−システイン１ｍＬを加
え、室温で更に２４時間インキュベートし、次いで４℃
で最長で８日間までインキュベートした。
た、スルホン化されたフル−レングスのＴＦＰＩをＮａ
Ｃｌ・０．３Ｍを含有するＱ−緩衝液を用いて２８０ｎ
ｍにおける吸光度０．０７ Ｏ．Ｄ．単位になるまで希
釈した。固体のＬ−システインを最終濃度が２ｍＭにな
るまで加えた。この溶液を室温で２４時間インキュベー
トし、水で１：１に希釈し、Ｌ−システイン１ｍＬを加
え、室温で更に２４時間インキュベートし、次いで４℃
で最長で８日間までインキュベートした。
【００５０】リフォールド混合物のモノＳクロマトグラ
フィー 分析実験において、リフォールド混合物２ｍＬをＳ−緩
衝液（燐酸ナトリウム２０ｍＭ、ｐＨ６．４、尿素６
Ｍ）中で前以て平衡にされたモノＳ ＨＲ５／５カチオ
ン交換カラムの上に装填した。カラムを上記平衡用緩衝
液１０ｍＬで洗浄し、そしてＳ−緩衝液中のＮａＣｌ・
０〜０．７Ｍより成る勾配剤７０ｍＬにより溶離した。
各画分１ｍＬを採集した。製造実験において、上記再生
混合物をｐＨ４．５まで酸性化し、７５倍に濃縮し、そ
してＮａＣｌ・０．３Ｍを含有するＳ−緩衝液中で前以
て平衡にされたモノＳ ＨＲ１０／１６アニオン交換カ
ラムの上に装填した。カラムを上記平衡用緩衝液１５カ
ラム容量で洗浄し、そしてＳ−緩衝液中ＮａＣｌ・０．
３〜０．５Ｍで溶離した。
フィー 分析実験において、リフォールド混合物２ｍＬをＳ−緩
衝液（燐酸ナトリウム２０ｍＭ、ｐＨ６．４、尿素６
Ｍ）中で前以て平衡にされたモノＳ ＨＲ５／５カチオ
ン交換カラムの上に装填した。カラムを上記平衡用緩衝
液１０ｍＬで洗浄し、そしてＳ−緩衝液中のＮａＣｌ・
０〜０．７Ｍより成る勾配剤７０ｍＬにより溶離した。
各画分１ｍＬを採集した。製造実験において、上記再生
混合物をｐＨ４．５まで酸性化し、７５倍に濃縮し、そ
してＮａＣｌ・０．３Ｍを含有するＳ−緩衝液中で前以
て平衡にされたモノＳ ＨＲ１０／１６アニオン交換カ
ラムの上に装填した。カラムを上記平衡用緩衝液１５カ
ラム容量で洗浄し、そしてＳ−緩衝液中ＮａＣｌ・０．
３〜０．５Ｍで溶離した。
【００５１】組織因子誘導凝固時間検定 フィブロメーター（Ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）［ベクトン
ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ
社）］血餅タイマーを用いて通常の凝固時間検定を行っ
た。プールしておいたヒト血漿９０μＬをウエル中で３
７℃においてＴＦＰＩ試料又は対照緩衝液１０μＬと１
分間混合し、そして組織因子［シンプラスチン エクセ
ル、ＮａＣｌ・７５ｍＭ、ＣａＣｌ2 ・１２．５ｍＭ及
びウシの血清アルブミン０．５ｍｇ／ｍＬを含有する溶
液に１：６０で希釈したもの］０．２ｍＬを加えて血餅
形成反応を開始させた。
ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ
社）］血餅タイマーを用いて通常の凝固時間検定を行っ
た。プールしておいたヒト血漿９０μＬをウエル中で３
７℃においてＴＦＰＩ試料又は対照緩衝液１０μＬと１
分間混合し、そして組織因子［シンプラスチン エクセ
ル、ＮａＣｌ・７５ｍＭ、ＣａＣｌ2 ・１２．５ｍＭ及
びウシの血清アルブミン０．５ｍｇ／ｍＬを含有する溶
液に１：６０で希釈したもの］０．２ｍＬを加えて血餅
形成反応を開始させた。
【００５２】因子Ｘa 阻害活性のアミド分解検定 ＴＦＰＩ試料のウシ因子Ｘa に対する阻害活性を、検定
用緩衝液がトリス／ＨＣｌ・０．１Ｍ、ｐＨ８．４及び
トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００ノニオン系界面活
性剤０．１％より成っていたことを除けば、ブン等が以
前にＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１６０９６−
１６１０１（１９９０）に記載したスペクトロツァイム
Ｘa の常用アミド分解法により検定した。
用緩衝液がトリス／ＨＣｌ・０．１Ｍ、ｐＨ８．４及び
トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００ノニオン系界面活
性剤０．１％より成っていたことを除けば、ブン等が以
前にＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１６０９６−
１６１０１（１９９０）に記載したスペクトロツァイム
Ｘa の常用アミド分解法により検定した。
【００５３】蛋白質の定量 蛋白質の濃度を２８０ｎｍにおける吸光度により、及び
１１０℃における２４時間のＨＣｌ／気相加水分解後の
アミノ酸の定量分析により定量した。
１１０℃における２４時間のＨＣｌ／気相加水分解後の
アミノ酸の定量分析により定量した。
【００５４】ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲルによる電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ダイイチ（Ｄａｉｉｃｈｉ）予備注型された１０〜２０
％勾配のゲルをＳＤＳ−ＰＡＧＥのために使用した。試
料は未還元、沸騰されないものか、又は３．３％の２−
メルカプトエタノール中で還元され、３分間沸騰させた
後電気泳動を行ったもののいずれかである。ゲルをコー
マシー ブルーで染色した。
ミドゲルによる電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ダイイチ（Ｄａｉｉｃｈｉ）予備注型された１０〜２０
％勾配のゲルをＳＤＳ−ＰＡＧＥのために使用した。試
料は未還元、沸騰されないものか、又は３．３％の２−
メルカプトエタノール中で還元され、３分間沸騰させた
後電気泳動を行ったもののいずれかである。ゲルをコー
マシー ブルーで染色した。
【００５５】結果 大腸菌におけるＴＦＰＩの発現 ３種のベクターを構築し、大腸菌中でのＴＦＰＩの発現
に使用した。第一の構築ベクターであるｐＭＯＮ９３０
８は本来のヒトＴＦＰＩ ｃＤＮＡ配列（開始ＡＴＧは
除く）とｒｅｃＡプロモーターを含有するもので、発現
を非常に低いレベルでしか達成しなかった（全細胞蛋白
質の＜０．５％）。第二の構築ベクターであるｐＭＯＮ
６８７０は第一のものと同様であるが、第二位置におい
てアラニンを導入し、５’−末端のＡ−Ｔ濃厚度を増加
させ、そして大腸菌コドンの扱い方を改良することによ
って変えられたもので、発現レベルを有意には高めなか
った。第三の構築ベクターであるｐＭＯＮ６８７５は第
二のものと同様であるが、ｔａｃプロモーターを使用し
たもので、全細胞蛋白質の約５−１０％の発現レベルを
達成した。このベクターを更なる試験のために使用し
た。３２ｋＤａのＴＦＰＩ蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
び還元後だけののウエスタン血餅形成によって検出可能
であるので、ＴＦＰＩの大部分（＞９０％）は明らか
に、ジスルフィド結合したポリマー体中で細胞封入体に
封鎖された。
に使用した。第一の構築ベクターであるｐＭＯＮ９３０
８は本来のヒトＴＦＰＩ ｃＤＮＡ配列（開始ＡＴＧは
除く）とｒｅｃＡプロモーターを含有するもので、発現
を非常に低いレベルでしか達成しなかった（全細胞蛋白
質の＜０．５％）。第二の構築ベクターであるｐＭＯＮ
６８７０は第一のものと同様であるが、第二位置におい
てアラニンを導入し、５’−末端のＡ−Ｔ濃厚度を増加
させ、そして大腸菌コドンの扱い方を改良することによ
って変えられたもので、発現レベルを有意には高めなか
った。第三の構築ベクターであるｐＭＯＮ６８７５は第
二のものと同様であるが、ｔａｃプロモーターを使用し
たもので、全細胞蛋白質の約５−１０％の発現レベルを
達成した。このベクターを更なる試験のために使用し
た。３２ｋＤａのＴＦＰＩ蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
び還元後だけののウエスタン血餅形成によって検出可能
であるので、ＴＦＰＩの大部分（＞９０％）は明らか
に、ジスルフィド結合したポリマー体中で細胞封入体に
封鎖された。
【００５６】細胞封入体のスルホン化、及びフル−レン
グスのスルホン化ＴＦＰＩの精製 初めの試験において、大腸菌溶菌液又は単離された細胞
封入体は抗−因子Ｘaにより、及び組織因子誘導凝固時
間検定により測定して非常に少ないＴＦＰＩ活性を有し
ていることが見いだされた。粗製の可溶化された細胞封
入体の還元／再酸化反応による、及び同スルホン化／ジ
スルフィド交換反応によるＴＦＰＩのリフォールディン
グでは活性の回復は非常に低かった。従って、スルホン
化を行い、続いてスルホン化ＴＦＰＩ上の負に帯電した
１８個の付加した基を利用してアニオン交換クロマトグ
ラフィーを行うことによってリフォールド処理工程前に
ＴＦＰＩを精製する試みがなされた。これらのスルホン
化細胞封入体をまず図１に示される分析用のモノＱ Ｈ
Ｒ５／５アニオン交換カラムで分別した。流通した各初
期勾配画分は汚染物質である大腸菌蛋白質及び一部切断
されたＴＦＰＩ蛋白質（後者の方が分子量がより小さ
く、抗−ＴＦＰＩ−Ｉｇに対して免疫反応性である）の
多くを含有していた。フル−レングスのＴＦＰＩ−Ｓ−
スルホネートはＮａＣｌ約０．２８Ｍにおいて溶離し
た。スルホン化細胞封入体の分別を図２に示されるハイ
ロードＱセファローズ１６／１０アニオン交換体を用い
て２０倍にスケールアップした。そのクロマトグラムは
明らかにモノＱ ＨＲ５／５アニオン交換カラムのクロ
マトグラムとは若干異なっていたが、フル−レングスの
ＴＦＰＩ−Ｓ−スルホネートの分別はＳＤＳ−ＰＡＧＥ
から判断して明らかに類似していた［図１（Ｂ）及び図
２、インセット］。
グスのスルホン化ＴＦＰＩの精製 初めの試験において、大腸菌溶菌液又は単離された細胞
封入体は抗−因子Ｘaにより、及び組織因子誘導凝固時
間検定により測定して非常に少ないＴＦＰＩ活性を有し
ていることが見いだされた。粗製の可溶化された細胞封
入体の還元／再酸化反応による、及び同スルホン化／ジ
スルフィド交換反応によるＴＦＰＩのリフォールディン
グでは活性の回復は非常に低かった。従って、スルホン
化を行い、続いてスルホン化ＴＦＰＩ上の負に帯電した
１８個の付加した基を利用してアニオン交換クロマトグ
ラフィーを行うことによってリフォールド処理工程前に
ＴＦＰＩを精製する試みがなされた。これらのスルホン
化細胞封入体をまず図１に示される分析用のモノＱ Ｈ
Ｒ５／５アニオン交換カラムで分別した。流通した各初
期勾配画分は汚染物質である大腸菌蛋白質及び一部切断
されたＴＦＰＩ蛋白質（後者の方が分子量がより小さ
く、抗−ＴＦＰＩ−Ｉｇに対して免疫反応性である）の
多くを含有していた。フル−レングスのＴＦＰＩ−Ｓ−
スルホネートはＮａＣｌ約０．２８Ｍにおいて溶離し
た。スルホン化細胞封入体の分別を図２に示されるハイ
ロードＱセファローズ１６／１０アニオン交換体を用い
て２０倍にスケールアップした。そのクロマトグラムは
明らかにモノＱ ＨＲ５／５アニオン交換カラムのクロ
マトグラムとは若干異なっていたが、フル−レングスの
ＴＦＰＩ−Ｓ−スルホネートの分別はＳＤＳ−ＰＡＧＥ
から判断して明らかに類似していた［図１（Ｂ）及び図
２、インセット］。
【００５７】ＴＦＰＩ−Ｓ−スルホネートのリフォール
ド スルホン化ＴＦＰＩは適当な濃度のＬ−システインと混
合すると、リフォールディングと酸化を同時に受けた。
ＴＦＰＩ活性の増加に反映されるリフォールドの効率は
リフォールド条件に依存して大幅に変化する。多数のリ
フォールド条件を比較し、温度、ｐＨ、尿素、Ｌ−シス
テイン及び蛋白質濃度に関して最適化した。２段階リフ
ォールドが最適のようであった。第一段階において、プ
ールされたフル−レングスのＴＦＰＩ−Ｓ−スルホネー
トを２８０ｎｍにおける吸光度０．０７−Ｏ．Ｄ．単位
に調整し、新しいＬ−システイン２ｍＭを添加し、その
混合物を室温で２４時間インキュベートした。この期間
中にＴＦＰＩの活性が比較用の標準として役立つフル−
レングスのＳＫヘパトームＴＦＰＩに対して０から約１
２％まで増加した。第二段階において、その溶液を水に
より１：１で希釈し、そして新しいＬ−システインを最
終濃度が１ｍＭになるまで添加した。この混合物を室温
で２４時間インキュベートしたが、その間に比活性は
２．６倍増加してＳＫ ＴＦＰＩのそれの３１％になっ
た。その溶液を次に４℃において数日間放置したが、そ
の間にＴＦＰＩの活性は初めの２４時間でＳＫ ＴＦＰ
Ｉのそれの約６０％まで増加し、続いてＳＫ ＴＦＰＩ
の約６８％まで徐々に増加した（図３）。
ド スルホン化ＴＦＰＩは適当な濃度のＬ−システインと混
合すると、リフォールディングと酸化を同時に受けた。
ＴＦＰＩ活性の増加に反映されるリフォールドの効率は
リフォールド条件に依存して大幅に変化する。多数のリ
フォールド条件を比較し、温度、ｐＨ、尿素、Ｌ−シス
テイン及び蛋白質濃度に関して最適化した。２段階リフ
ォールドが最適のようであった。第一段階において、プ
ールされたフル−レングスのＴＦＰＩ−Ｓ−スルホネー
トを２８０ｎｍにおける吸光度０．０７−Ｏ．Ｄ．単位
に調整し、新しいＬ−システイン２ｍＭを添加し、その
混合物を室温で２４時間インキュベートした。この期間
中にＴＦＰＩの活性が比較用の標準として役立つフル−
レングスのＳＫヘパトームＴＦＰＩに対して０から約１
２％まで増加した。第二段階において、その溶液を水に
より１：１で希釈し、そして新しいＬ−システインを最
終濃度が１ｍＭになるまで添加した。この混合物を室温
で２４時間インキュベートしたが、その間に比活性は
２．６倍増加してＳＫ ＴＦＰＩのそれの３１％になっ
た。その溶液を次に４℃において数日間放置したが、そ
の間にＴＦＰＩの活性は初めの２４時間でＳＫ ＴＦＰ
Ｉのそれの約６０％まで増加し、続いてＳＫ ＴＦＰＩ
の約６８％まで徐々に増加した（図３）。
【００５８】リフォールドされた混合物のモノＳクロマ
トグラフィーによる分別 リフォールドされた混合物の比活性は精製された哺乳類
のＳＫ ＴＦＰＩより低かった。このことは前者が正し
くフォールドされた、即ち折り畳まれた分子と誤ってフ
ォールドされた分子の両者を含有しているか、又は部分
的に活性な誤フォールド分子のみを含有していることを
示唆している。このリフォールド混合物を図４に示され
る分析用のモノＳカチオン交換カラムで分別した。ＵＶ
−吸収性の画分をＴＦＰＩ活性について分析した場合、
最高比活性はＮａＣｌ・０．５２Ｍにおいて溶離された
シャープなピーク（画分５２）と関連していた。他の全
画分の比活性は画分５２の比活性の３０％未満であっ
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図４、インセット）は画分
５２がシャープなバンドを含み、他方他の全ての画分
は、予備カラムのリフォールド混合物と共に、非還元性
条件下で拡散した多重バンドより成っていることを示し
た。これらの拡散バンドは還元するとシャープなバンド
になるので、明らかに、主として様々のリフォールド体
としての主としてフル−レングスのＴＦＰＩである（右
側にある最後の２つのレーンを参照されたい）。図５は
分析規模でのモノＳクロマトグラフィーの最適化を示す
ものである。勾配を更に小さくすることによって、ピー
クの分割は更に良くなり、そして蛋白質は全て明らかに
より低いＮａＣｌ濃度で溶離した［図５（Ａ）及び
（Ｂ）］。更に、活性ピークをシャドー勾配（ｓｈａｄ
ｏｗ ｇｒａｄｉｅｎｔ）により溶離する前に低活性の
ピークの大部分をＮａＣｌ・０．３Ｍの１０カラム容量
により洗い落とすことが可能であった。
トグラフィーによる分別 リフォールドされた混合物の比活性は精製された哺乳類
のＳＫ ＴＦＰＩより低かった。このことは前者が正し
くフォールドされた、即ち折り畳まれた分子と誤ってフ
ォールドされた分子の両者を含有しているか、又は部分
的に活性な誤フォールド分子のみを含有していることを
示唆している。このリフォールド混合物を図４に示され
る分析用のモノＳカチオン交換カラムで分別した。ＵＶ
−吸収性の画分をＴＦＰＩ活性について分析した場合、
最高比活性はＮａＣｌ・０．５２Ｍにおいて溶離された
シャープなピーク（画分５２）と関連していた。他の全
画分の比活性は画分５２の比活性の３０％未満であっ
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図４、インセット）は画分
５２がシャープなバンドを含み、他方他の全ての画分
は、予備カラムのリフォールド混合物と共に、非還元性
条件下で拡散した多重バンドより成っていることを示し
た。これらの拡散バンドは還元するとシャープなバンド
になるので、明らかに、主として様々のリフォールド体
としての主としてフル−レングスのＴＦＰＩである（右
側にある最後の２つのレーンを参照されたい）。図５は
分析規模でのモノＳクロマトグラフィーの最適化を示す
ものである。勾配を更に小さくすることによって、ピー
クの分割は更に良くなり、そして蛋白質は全て明らかに
より低いＮａＣｌ濃度で溶離した［図５（Ａ）及び
（Ｂ）］。更に、活性ピークをシャドー勾配（ｓｈａｄ
ｏｗ ｇｒａｄｉｅｎｔ）により溶離する前に低活性の
ピークの大部分をＮａＣｌ・０．３Ｍの１０カラム容量
により洗い落とすことが可能であった。
【００５９】上記の結果に基づいて、クロマトグラフィ
ーを図６に示されるモノＳ ＨＲ１０／１６カチオン交
換カラムを用いてスケールアップした。カラムを、低活
性ピークを全て本質的に洗い落とすＮａＣｌ・０．３Ｍ
の１５カラム容量により洗浄した。その後、シャドー勾
配は活性なＴＦＰＩを含有する蛋白質のピークを溶離し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図６、インセット）は還元
性条件下でも、或いは非還元性条件下でもシャープなバ
ンドを与えたことを示している。還元されかつ沸騰され
た蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて若干ゆっくり移行
した。
ーを図６に示されるモノＳ ＨＲ１０／１６カチオン交
換カラムを用いてスケールアップした。カラムを、低活
性ピークを全て本質的に洗い落とすＮａＣｌ・０．３Ｍ
の１５カラム容量により洗浄した。その後、シャドー勾
配は活性なＴＦＰＩを含有する蛋白質のピークを溶離し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図６、インセット）は還元
性条件下でも、或いは非還元性条件下でもシャープなバ
ンドを与えたことを示している。還元されかつ沸騰され
た蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて若干ゆっくり移行
した。
【００６０】リフォールドされたＴＦＰＩと因子Ｘa と
の相互作用の化学量論関係 活性なリフォールドされた大腸菌ＴＦＰＩによるウシ因
子Ｘa の阻害をスペクトロツァイムＸa を用いて残留ア
ミド分解活性を測定することによって調べた。図７に示
されるように、ウシ因子Ｘa の完全阻害をもたらすＴＦ
ＰＩ対ウシ因子Ｘa のモル比は１：１であった（白抜き
円）。比較のために示すと、ＳＫ ＴＦＰＩとウシ因子
Ｘa との相互作用の化学量論関係も１：１であった（黒
塗り円）。
の相互作用の化学量論関係 活性なリフォールドされた大腸菌ＴＦＰＩによるウシ因
子Ｘa の阻害をスペクトロツァイムＸa を用いて残留ア
ミド分解活性を測定することによって調べた。図７に示
されるように、ウシ因子Ｘa の完全阻害をもたらすＴＦ
ＰＩ対ウシ因子Ｘa のモル比は１：１であった（白抜き
円）。比較のために示すと、ＳＫ ＴＦＰＩとウシ因子
Ｘa との相互作用の化学量論関係も１：１であった（黒
塗り円）。
【００６１】組織因子誘導凝固の抑制 活性なリフォールドされた大腸菌ＴＦＰＩのヒト血漿中
における組織因子誘導凝固の抑制能を精製されたＳＫ
ＴＦＰＩの同抑制能と比較した。図８に示される通り、
大腸菌ＴＦＰＩの活性は同じ血餅形成時間の延長状態を
もたらす各ＴＦＰＩの濃度から判定して、モル当たり基
準でＳＫ ＴＦＰＩより約２倍以上活性であった。
における組織因子誘導凝固の抑制能を精製されたＳＫ
ＴＦＰＩの同抑制能と比較した。図８に示される通り、
大腸菌ＴＦＰＩの活性は同じ血餅形成時間の延長状態を
もたらす各ＴＦＰＩの濃度から判定して、モル当たり基
準でＳＫ ＴＦＰＩより約２倍以上活性であった。
【００６２】
【表１】 表１：活性な大腸菌ＴＦＰＩのリフォールド及び精製の概要 容量 比活性a 収率 Ａ280nm （ｍＬ) 全Ａ280nm (SK 単位/mA) (％) 出発物質 細胞封入体 - - - - - 0.56g スルホン化 細胞封入体 6.1 25 153 0 - ハイロードQ プール 0.8 46 37 0 - リフォールド混合物 0.035 1050 37 0.66 100 モノS プール 0.142 48 6.8 2.0 18
【００６３】a 比活性は方法の項に記載した組織因子誘
導凝固時間検定により測定した。１ＳＫ単位は精製され
たフル−レングスのＳＫヘプトームＴＦＰＩ・１ｍＡ
（２８０ｎｍにおける１×１０-3吸光度単位）によって
もたらされる活性量に相当する活性量と定義される。
導凝固時間検定により測定した。１ＳＫ単位は精製され
たフル−レングスのＳＫヘプトームＴＦＰＩ・１ｍＡ
（２８０ｎｍにおける１×１０-3吸光度単位）によって
もたらされる活性量に相当する活性量と定義される。
【００６４】実施例２ 上記実施例１で製造した細胞封入体を別の方法としての
次の精製プロセスに付した。
次の精製プロセスに付した。
【００６５】予備リフォールドカチオン交換クロマトグ
ラフィー 洗浄した細胞封入体のペレットを尿素８Ｍ、ＮａＨＰＯ
4 ・０．０５Ｍ、Ｂ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）
５％、ｐＨ８．５（ブイヨン１Ｌ相当の各細胞封入体に
対して緩衝液６０ｍＬ）に懸濁させた。この溶液をアダ
ムス ニューテーター（Ａｄａｍｓ Ｎｕｔａｔｏｒ）
振盪テーブル［バクスター／サイエンティフィック プ
ロダクツ社（Ｂａｘｔｅｒ／Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ）］を用いて６〜８℃において１時間穏
やかに撹拌し、そして３７，０００×Ｇで２時間遠心分
離した。上層液を尿素６Ｍ、ＮａＨＰＯ4 ・０．０５
Ｍ、ＢＭＥ５％、ｐＨ７．０（平衡用緩衝液）で１０倍
に希釈し、そして０．２２μｍのズラポアー（Ｄｕｒａ
ｐｏｒｅ）ＰＶＤＦフィルター媒体（ミリポアー社から
市販されるポリビニリデンジフルオリドのマイクロ濾過
膜フィルター）を通して濾過した。この透明になった溶
液を平衡用緩衝液少なくとも１５カラム容量で平衡にさ
れたＳＰ−６５０−Ｓカチオン交換ゲル樹脂［トソハー
ス（ＴｏｓｏＨａａｓ）、トソー社（Ｔｏｓｏｈ Ｃｏ
ｒｐ．）及びローム アンド ハース社（Ｒｏｈｍ ａ
ｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏ．）からのトヨパール（Ｔｏｙｏ
ｐｅａｒｌ）］のカラムの上に装填した。小規模研究の
ために、４．４×１６ｃｍのカラムにブイヨン５Ｌ相当
を装填した。更に大規模の研究のために、９．０×１８
ｃｍのカラムにブイヨン１５〜２０Ｌ相当を装填した。
線流量１０〜１５ｃｍ／時で装填した後、カラムを平衡
用緩衝液１０カラム容量で洗浄した。そのカラムを平衡
用緩衝液中ＮａＣｌ・０〜０．１４Ｍの直線勾配を用い
て、ＮａＣｌ・１ｍＭ／分において溶離した。ＮａＣｌ
濃度を２カラム容量について０．１４Ｍに保持すると、
その間に主ピークが溶離した。各画分２５ｍＬを採集
し、ＴＦＰＩ含量についてＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析し、その後プールした。許容できる画分
を撹拌された細胞（アミコン）を用いて２０ｍｇ／ｍＬ
まで濃縮し、そして緩衝液を脱塩用ゲルであるバイオー
ラドＰ６ＤＧを用いて尿素６Ｍ、ＮａＯＡｃ・５０ｍ
Ｍ、ＮａＣｌ・０．５Ｍ、ｐＨ４．５に交換した。これ
らの画分を次に必要になるまで−４０℃において貯蔵し
た。
ラフィー 洗浄した細胞封入体のペレットを尿素８Ｍ、ＮａＨＰＯ
4 ・０．０５Ｍ、Ｂ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）
５％、ｐＨ８．５（ブイヨン１Ｌ相当の各細胞封入体に
対して緩衝液６０ｍＬ）に懸濁させた。この溶液をアダ
ムス ニューテーター（Ａｄａｍｓ Ｎｕｔａｔｏｒ）
振盪テーブル［バクスター／サイエンティフィック プ
ロダクツ社（Ｂａｘｔｅｒ／Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ）］を用いて６〜８℃において１時間穏
やかに撹拌し、そして３７，０００×Ｇで２時間遠心分
離した。上層液を尿素６Ｍ、ＮａＨＰＯ4 ・０．０５
Ｍ、ＢＭＥ５％、ｐＨ７．０（平衡用緩衝液）で１０倍
に希釈し、そして０．２２μｍのズラポアー（Ｄｕｒａ
ｐｏｒｅ）ＰＶＤＦフィルター媒体（ミリポアー社から
市販されるポリビニリデンジフルオリドのマイクロ濾過
膜フィルター）を通して濾過した。この透明になった溶
液を平衡用緩衝液少なくとも１５カラム容量で平衡にさ
れたＳＰ−６５０−Ｓカチオン交換ゲル樹脂［トソハー
ス（ＴｏｓｏＨａａｓ）、トソー社（Ｔｏｓｏｈ Ｃｏ
ｒｐ．）及びローム アンド ハース社（Ｒｏｈｍ ａ
ｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏ．）からのトヨパール（Ｔｏｙｏ
ｐｅａｒｌ）］のカラムの上に装填した。小規模研究の
ために、４．４×１６ｃｍのカラムにブイヨン５Ｌ相当
を装填した。更に大規模の研究のために、９．０×１８
ｃｍのカラムにブイヨン１５〜２０Ｌ相当を装填した。
線流量１０〜１５ｃｍ／時で装填した後、カラムを平衡
用緩衝液１０カラム容量で洗浄した。そのカラムを平衡
用緩衝液中ＮａＣｌ・０〜０．１４Ｍの直線勾配を用い
て、ＮａＣｌ・１ｍＭ／分において溶離した。ＮａＣｌ
濃度を２カラム容量について０．１４Ｍに保持すると、
その間に主ピークが溶離した。各画分２５ｍＬを採集
し、ＴＦＰＩ含量についてＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析し、その後プールした。許容できる画分
を撹拌された細胞（アミコン）を用いて２０ｍｇ／ｍＬ
まで濃縮し、そして緩衝液を脱塩用ゲルであるバイオー
ラドＰ６ＤＧを用いて尿素６Ｍ、ＮａＯＡｃ・５０ｍ
Ｍ、ＮａＣｌ・０．５Ｍ、ｐＨ４．５に交換した。これ
らの画分を次に必要になるまで−４０℃において貯蔵し
た。
【００６６】ＴＦＰＩのリフォールド 上記からの凍結画分を融解し、その蛋白質濃度を尿素６
Ｍ、ＮａＯＡｃ・０．０５Ｍ、ＮａＣｌ・０．５Ｍ、Ｎ
ａＰＯ4 ・０．０５Ｍ、ｐＨ１０．５の緩衝液中０．３
ｍｇ／ｍＬの蛋白質に調整した。新しく調製した、尿素
６Ｍ、ＮａＯＡｃ・５０ｍＭ、ＮａＣｌ・０．５Ｍ、ｐ
Ｈ４．５の緩衝液中Ｌ−システイン０．１Ｍを用いてＬ
−システイン［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］を加え、濃度
０．１Ｍとした。１０分間混合した後、その溶液を撹拌
することなく１０〜１５℃において４８〜７２時間イン
キュベートした。その反応をプロトロビン時間（ＰＴ）
活性のために監視し、そしてＰＴ活性が平坦域に到達し
たときｐＨを２．５Ｎ ＨＣｌにより５．０に調整し、
−４０℃で凍結することによってリフォールドを停止さ
せた。
Ｍ、ＮａＯＡｃ・０．０５Ｍ、ＮａＣｌ・０．５Ｍ、Ｎ
ａＰＯ4 ・０．０５Ｍ、ｐＨ１０．５の緩衝液中０．３
ｍｇ／ｍＬの蛋白質に調整した。新しく調製した、尿素
６Ｍ、ＮａＯＡｃ・５０ｍＭ、ＮａＣｌ・０．５Ｍ、ｐ
Ｈ４．５の緩衝液中Ｌ−システイン０．１Ｍを用いてＬ
−システイン［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］を加え、濃度
０．１Ｍとした。１０分間混合した後、その溶液を撹拌
することなく１０〜１５℃において４８〜７２時間イン
キュベートした。その反応をプロトロビン時間（ＰＴ）
活性のために監視し、そしてＰＴ活性が平坦域に到達し
たときｐＨを２．５Ｎ ＨＣｌにより５．０に調整し、
−４０℃で凍結することによってリフォールドを停止さ
せた。
【００６７】粗製リフォールド混合物からの活性ＴＦＰ
Ｉの精製 粗製のリフォールド混合物を撹拌された細胞中でアミコ
ンＹＭ１０膜を用いて５ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで
緩衝液をバイオ−ラドＰ６ＤＧ樹脂を用いて尿素６Ｍ、
ＮａＯＡｃ・０．０５Ｍ、ｐＨ４．５の緩衝液に交換し
た。小規模クロマトグラフィーのために、蛋白質３５ｍ
ｇを尿素２Ｍ、ＮａＯＡｃ・５０ｍＭ、ｐＨ６．０の緩
衝液で平衡にされたファーマシア モノ−Ｓ ＨＲ１０
／１０カラムの上に装填した。それより大規模の調製の
ために、蛋白質５００ｍｇを同じ緩衝液中で平衡にされ
たファーマシア ハイロード２６／１０Ｓセファローズ
の上に装填した。ＮａＣｌ濃度を４６０ｍＭ（３３ｍＭ
／分）まで増加させることによって溶離を行い、１０カ
ラム容量について保持すると、その間に主ピークが溶離
した。イソクラティック工程の始めに画分の採集を開始
すると、主蛋白質ピークのトレーリング側で最高の比活
性を有する画分が溶離した。
Ｉの精製 粗製のリフォールド混合物を撹拌された細胞中でアミコ
ンＹＭ１０膜を用いて５ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで
緩衝液をバイオ−ラドＰ６ＤＧ樹脂を用いて尿素６Ｍ、
ＮａＯＡｃ・０．０５Ｍ、ｐＨ４．５の緩衝液に交換し
た。小規模クロマトグラフィーのために、蛋白質３５ｍ
ｇを尿素２Ｍ、ＮａＯＡｃ・５０ｍＭ、ｐＨ６．０の緩
衝液で平衡にされたファーマシア モノ−Ｓ ＨＲ１０
／１０カラムの上に装填した。それより大規模の調製の
ために、蛋白質５００ｍｇを同じ緩衝液中で平衡にされ
たファーマシア ハイロード２６／１０Ｓセファローズ
の上に装填した。ＮａＣｌ濃度を４６０ｍＭ（３３ｍＭ
／分）まで増加させることによって溶離を行い、１０カ
ラム容量について保持すると、その間に主ピークが溶離
した。イソクラティック工程の始めに画分の採集を開始
すると、主蛋白質ピークのトレーリング側で最高の比活
性を有する画分が溶離した。
【００６８】複数画分を比活性に基づいてプールし、尿
素６Ｍ、ＮａＯＡｃ・２０ｍＭ、ｐＨ６．０の緩衝液４
容量で希釈し、その後、同じ緩衝液により平衡にされた
ファーマシア モノ−Ｓ ＨＲ１０／１０カラムに適用
した。溶離はＮａＣｌ・０〜６００ｍＭの直線勾配を
３．６ｍＭ／分の速度で使用する、ＮａＣｌを含有する
同じ緩衝液によるものであった。各画分２．５ｍＬを採
集し、ＰＴ比活性及びＳＤＳ ＰＡＧＥに基づいてプー
ルした。同じモノ−Ｓクロマトグラフィーを使用する尿
素６Ｍ中での画分の再処理で、高比活性を持つ追加の蛋
白質が回収された。
素６Ｍ、ＮａＯＡｃ・２０ｍＭ、ｐＨ６．０の緩衝液４
容量で希釈し、その後、同じ緩衝液により平衡にされた
ファーマシア モノ−Ｓ ＨＲ１０／１０カラムに適用
した。溶離はＮａＣｌ・０〜６００ｍＭの直線勾配を
３．６ｍＭ／分の速度で使用する、ＮａＣｌを含有する
同じ緩衝液によるものであった。各画分２．５ｍＬを採
集し、ＰＴ比活性及びＳＤＳ ＰＡＧＥに基づいてプー
ルした。同じモノ−Ｓクロマトグラフィーを使用する尿
素６Ｍ中での画分の再処理で、高比活性を持つ追加の蛋
白質が回収された。
【００６９】上記の実施例１及び２の本発明の方法によ
る態様（Ａ）及び（Ｂ）によって産生されたＴＦＰＩ生
成物を幾つかの方法で更に検定し、次の結果を得た。
る態様（Ａ）及び（Ｂ）によって産生されたＴＦＰＩ生
成物を幾つかの方法で更に検定し、次の結果を得た。
【００７０】１．ポリアクリルアミドゲルによる電気泳
動分析 両方法からのＴＦＰＩの第一バンドは還元ゲル及び元々
のゲルに対して同一であった。しかし、元々のゲルで
は、実施例１からのＴＦＰＩは二量体種の含量がより高
いのに対して、実施例２から産生されたＴＦＰＩはより
低分子量（Ｃ−末端側が一部切断）の種がより高含量で
あった。図９を参照されたい。
動分析 両方法からのＴＦＰＩの第一バンドは還元ゲル及び元々
のゲルに対して同一であった。しかし、元々のゲルで
は、実施例１からのＴＦＰＩは二量体種の含量がより高
いのに対して、実施例２から産生されたＴＦＰＩはより
低分子量（Ｃ−末端側が一部切断）の種がより高含量で
あった。図９を参照されたい。
【００７１】２．逆相分析 実施例１の方法で製造されたＴＦＰＩの逆相分析は単一
のシャープなピーク（高純度であることを示す）を明ら
かにしたが、これに対して実施例２の方法で製造された
ＴＦＰＩの逆相分析は第一ピークと第二ピークを明らか
にした（有意の不均質度であることを示している）。Ｓ
Ｋ Ｈｅｐ哺乳類系から産生されたＴＦＰＩの逆相分析
ははば広い第一ピークと幾つかの第二ピークを明らかに
した（有意の不均質度であることを示す）。
のシャープなピーク（高純度であることを示す）を明ら
かにしたが、これに対して実施例２の方法で製造された
ＴＦＰＩの逆相分析は第一ピークと第二ピークを明らか
にした（有意の不均質度であることを示している）。Ｓ
Ｋ Ｈｅｐ哺乳類系から産生されたＴＦＰＩの逆相分析
ははば広い第一ピークと幾つかの第二ピークを明らかに
した（有意の不均質度であることを示す）。
【００７２】３．カチオン交換分析 カチオン交換分析は実施例１の方法と実施例２の方法に
より製造されたＴＦＰＩ間に何らかの差異があることを
明らかにしなかった。両ケースで共に単一の対称なピー
クが得られた。しかし、同じようにして特徴付けられた
粗製のＳＫ Ｈｅｐ ＴＦＰＩは不均質性を示す第一ピ
ークと第二ピークをもたらした。
より製造されたＴＦＰＩ間に何らかの差異があることを
明らかにしなかった。両ケースで共に単一の対称なピー
クが得られた。しかし、同じようにして特徴付けられた
粗製のＳＫ Ｈｅｐ ＴＦＰＩは不均質性を示す第一ピ
ークと第二ピークをもたらした。
【００７３】４．エレクトロスプレー質量分光分析 ＴＦＰＩのエレクトロスプレー分析は、両方法から製造
されたＴＦＰＩの主成分の質量は同じであることを示し
た。しかし、実施例２の方法から製造された物質は最大
で３０％までの不均質種を含有していたのに対し、実施
例１の方法から製造された物質は明らかに本質的に均質
（＞９５％）であった。ＳＫ ＨｅｐＴＦＰＩのエレク
トロスプレー分析は炭水化物鎖の不均質度が高い故にこ
れを果たすことができなかった。
されたＴＦＰＩの主成分の質量は同じであることを示し
た。しかし、実施例２の方法から製造された物質は最大
で３０％までの不均質種を含有していたのに対し、実施
例１の方法から製造された物質は明らかに本質的に均質
（＞９５％）であった。ＳＫ ＨｅｐＴＦＰＩのエレク
トロスプレー分析は炭水化物鎖の不均質度が高い故にこ
れを果たすことができなかった。
【００７４】実施例３ 本実施例はＴＦＰＩをコードするｃＤＮＡを含有する別
の発現ベクター、即ちプラスミドｐＭＯＮ６８９０の構
築を例証するものである。ｐＭＯＮ６８９０は変化した
ｒｅｃＡプロモーターより成る雑種プロモーターをｌａ
ｃオペレーターと共に含有する。ｒｅｃＡプロモーター
の−３５領域を最適化し、かつｌｅｘＡ（リプレッサ
ー）結合を排除すべく次の配列を組み立てた。
の発現ベクター、即ちプラスミドｐＭＯＮ６８９０の構
築を例証するものである。ｐＭＯＮ６８９０は変化した
ｒｅｃＡプロモーターより成る雑種プロモーターをｌａ
ｃオペレーターと共に含有する。ｒｅｃＡプロモーター
の−３５領域を最適化し、かつｌｅｘＡ（リプレッサ
ー）結合を排除すべく次の配列を組み立てた。
【化２】
【００７５】ＰｒｅｃＡの−３５領域に示された塩基の
変化はそれをして−３５のコンセンサス配列と同一にし
た。ｌｅｘボックス（ｌｅｘＡリプレッサーが結合する
部位）に示された塩基置換は構成ｒｅｃＡの発現をもた
らすことが示された。ｌａｃオペレーター配列の付加は
ｌａｃリプレッサーの制御下でｒｅｃＡプロモーターを
配置した。この配列は消化されたＢａｍＨ１／ＸｂａＩ
であったｐＭＯＮ６８７０（前記実施例１に記載）にＢ
ａｍＨ１／ＸｂａＩ断片としてクローンされた。このＴ
ＦＰＩ発現ベクター６８９０はｐＢＲ３２７に基づく、
ｒｅｃｌａｃプロモーター、バクテリオファージＴ７遺
伝子１０リーダー、及びＭ１３複製起源を含有するプラ
スミドである。
変化はそれをして−３５のコンセンサス配列と同一にし
た。ｌｅｘボックス（ｌｅｘＡリプレッサーが結合する
部位）に示された塩基置換は構成ｒｅｃＡの発現をもた
らすことが示された。ｌａｃオペレーター配列の付加は
ｌａｃリプレッサーの制御下でｒｅｃＡプロモーターを
配置した。この配列は消化されたＢａｍＨ１／ＸｂａＩ
であったｐＭＯＮ６８７０（前記実施例１に記載）にＢ
ａｍＨ１／ＸｂａＩ断片としてクローンされた。このＴ
ＦＰＩ発現ベクター６８９０はｐＢＲ３２７に基づく、
ｒｅｃｌａｃプロモーター、バクテリオファージＴ７遺
伝子１０リーダー、及びＭ１３複製起源を含有するプラ
スミドである。
【００７６】当業者には、本発明の開示を読めば、本発
明の精神と範囲から逸脱しない範囲で他の色々な実施例
は明らかであろう。そのような他の実施例も全て添付特
許請求の範囲に含まれるものである。
明の精神と範囲から逸脱しない範囲で他の色々な実施例
は明らかであろう。そのような他の実施例も全て添付特
許請求の範囲に含まれるものである。
【００７７】
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：アミノ酸２７７個 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：蛋白質 （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
【化３】
【化４】
【化５】
【００７８】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２についての
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対３５個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対３５個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
【化６】
【００７９】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３についての
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対３９個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対３９個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
【化７】
【００８０】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４についての
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対４０個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対４０個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
【化８】
【００８１】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５についての
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対２８個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対２８個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：
【化９】
【００８２】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６についての
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対２１個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対２１個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：
【化１０】
【００８３】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７についての
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対２０個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対２０個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：
【化１１】
【００８４】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８についての
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対６４個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対６４個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：
【化１２】
【００８５】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９についての
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対２１個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：
情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：塩基対２１個 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の形態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（合成） （xi）配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：
【化１３】
【図１】図１はスルホン化された大腸菌細胞封入体のア
ニオン交換クロマトグラフィーの結果を示すグラフであ
る。Ａは鎖線で示される溶離剤中のＮａＣｌの指定濃度
勾配における各採集画分の吸光度を示すグラフである。
Ｂは各採集画分の分子量を示すグラフである。
ニオン交換クロマトグラフィーの結果を示すグラフであ
る。Ａは鎖線で示される溶離剤中のＮａＣｌの指定濃度
勾配における各採集画分の吸光度を示すグラフである。
Ｂは各採集画分の分子量を示すグラフである。
【図２】図２はスルホン化された大腸菌細胞封入体のア
ニオン交換クロマトグラフィーにおける、鎖線で示され
る溶離剤中のＮａＣｌの指定濃度勾配における各採集画
分の吸光度と分子量を示すグラフである。
ニオン交換クロマトグラフィーにおける、鎖線で示され
る溶離剤中のＮａＣｌの指定濃度勾配における各採集画
分の吸光度と分子量を示すグラフである。
【図３】図３は大腸菌由来の組織因子経路阻害剤（ＴＦ
ＰＩ）のサルファイトリシス／リフォールド中のＴＦＰ
Ｉの血餅形成に対する比活性の増加を示すグラフであ
る。
ＰＩ）のサルファイトリシス／リフォールド中のＴＦＰ
Ｉの血餅形成に対する比活性の増加を示すグラフであ
る。
【図４】図４はスルホン化され、リフォールドされた大
腸菌ＴＦＰＩ混合物のカチオン交換クロマトグラフィー
における、鎖線で示される溶離剤中のＮａＣｌの指定濃
度勾配における各採集画分の吸光度と分子量を示すグラ
フである。
腸菌ＴＦＰＩ混合物のカチオン交換クロマトグラフィー
における、鎖線で示される溶離剤中のＮａＣｌの指定濃
度勾配における各採集画分の吸光度と分子量を示すグラ
フである。
【図５】図５は図４と同様のカチオン交換クロマトグラ
フィーの結果を示すグラフである。Ａは出発緩衝剤とし
てＳ−緩衝剤を使用し、そしてＮａＣｌ勾配剤を２０ｍ
Ｍ／ｍＬを使用した場合の、鎖線で示される溶離剤中Ｎ
ａＣｌの指定濃度勾配における各採集画分の吸光度を示
すグラフである。Ｂは出発緩衝剤としてＳ−緩衝剤を使
用し、そしてＮａＣｌ勾配剤を１０ｍＭ／ｍＬを使用し
た場合の、鎖線で示される溶離剤中ＮａＣｌの指定濃度
勾配における各採集画分の吸光度を示すグラフである。
Ｃは出発緩衝剤としてＮａＣｌ・０．３Ｍが補充された
Ｓ−緩衝剤を使用し、そしてＮａＣｌ勾配剤を１０ｍＭ
／ｍＬを使用した場合の、鎖線で示される溶離剤中Ｎａ
Ｃｌの指定濃度勾配における各採集画分の吸光度を示す
グラフである。各図において、黒塗り円のグラフはブラ
ンク実験の結果を示す。
フィーの結果を示すグラフである。Ａは出発緩衝剤とし
てＳ−緩衝剤を使用し、そしてＮａＣｌ勾配剤を２０ｍ
Ｍ／ｍＬを使用した場合の、鎖線で示される溶離剤中Ｎ
ａＣｌの指定濃度勾配における各採集画分の吸光度を示
すグラフである。Ｂは出発緩衝剤としてＳ−緩衝剤を使
用し、そしてＮａＣｌ勾配剤を１０ｍＭ／ｍＬを使用し
た場合の、鎖線で示される溶離剤中ＮａＣｌの指定濃度
勾配における各採集画分の吸光度を示すグラフである。
Ｃは出発緩衝剤としてＮａＣｌ・０．３Ｍが補充された
Ｓ−緩衝剤を使用し、そしてＮａＣｌ勾配剤を１０ｍＭ
／ｍＬを使用した場合の、鎖線で示される溶離剤中Ｎａ
Ｃｌの指定濃度勾配における各採集画分の吸光度を示す
グラフである。各図において、黒塗り円のグラフはブラ
ンク実験の結果を示す。
【図６】図６は図４と同様のカチオン交換クロマトグラ
フィーの結果を示すグラフである。
フィーの結果を示すグラフである。
【図７】図７は精製されたＳＫヘパトームＴＦＰＩ及び
リフォールドされた大腸菌ＴＦＰＩによるウシ因子Ｘa
に対する阻害活性を示すグラフであって、中抜き円のグ
ラフは大腸菌ＴＦＰＩの結果を、また黒塗り円のグラフ
はＳＫヘパトームＴＦＰＩの結果である。
リフォールドされた大腸菌ＴＦＰＩによるウシ因子Ｘa
に対する阻害活性を示すグラフであって、中抜き円のグ
ラフは大腸菌ＴＦＰＩの結果を、また黒塗り円のグラフ
はＳＫヘパトームＴＦＰＩの結果である。
【図８】図８はフル−レングスのＳＫヘパトームＴＦＰ
Ｉ及びリフォールドされた大腸菌ＴＦＰＩによるヒト血
漿の組織因子誘導凝固の抑制活性を示すグラフであっ
て、中抜き円のグラフは大腸菌ＴＦＰＩの結果を、また
黒塗り円のグラフはＳＫヘパトームＴＦＰＩの結果であ
る。
Ｉ及びリフォールドされた大腸菌ＴＦＰＩによるヒト血
漿の組織因子誘導凝固の抑制活性を示すグラフであっ
て、中抜き円のグラフは大腸菌ＴＦＰＩの結果を、また
黒塗り円のグラフはＳＫヘパトームＴＦＰＩの結果であ
る。
【図９】図９は本発明の精製プロセス（Ａ）及び（Ｂ）
により製造されたＴＦＰＩのドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドの還元ゲル及び非還元ゲルによる電気
泳動分析の結果を示すグラフである。
により製造されたＴＦＰＩのドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドの還元ゲル及び非還元ゲルによる電気
泳動分析の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０はアミノ算残基２７７個のＡｌａ−Ｔ
ＦＰＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の３つのクニッツド
メインについてのスルホヒドリル結合を示している二次
構造の模式図である。
ＦＰＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の３つのクニッツド
メインについてのスルホヒドリル結合を示している二次
構造の模式図である。
【図１１】図１１はＴＦＰＩ ｃＤＮＡの挿入に適し
た、３８５７ｂｐの発現ベクターであるプラスミドｐＭ
ＯＮ５５５７のマップを示す略図である。
た、３８５７ｂｐの発現ベクターであるプラスミドｐＭ
ＯＮ５５５７のマップを示す略図である。
【図１２】図１２はＴＦＰＩ ｃＤＮＡの挿入に適し
た、３６５２ｂｐの発現ベクターであるプラスミドｐＭ
ＯＮ５７６６のマップを示す略図である。
た、３６５２ｂｐの発現ベクターであるプラスミドｐＭ
ＯＮ５７６６のマップを示す略図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＣＢ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ツェ − チェイン ウン アメリカ合衆国ミズーリ州セント ルイ ス，ハントリィ ハイツ ドライブ 613
Claims (6)
- 【請求項１】 組織因子経路阻害剤の非グリコシル化体
の製造法にして、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）をコ
ードするｃＤＮＡを含有する複製可能な発現ベクターに
より形質転換されている大腸菌宿主細胞を該ＴＦＰＩを
産生させるのに十分な発酵条件下で培養し、該大腸菌細
胞を収穫し、収穫された該大腸菌細胞から細胞封入体を
単離し、そして該細胞封入体を次の： （Ａ）（１）該細胞封入体をサルファイトリシスに付し
てＴＦＰＩ−Ｓ−スルフォネートを形成し、（２）該Ｔ
ＦＰＩ−Ｓ−スルフォネートをアニオン交換クロマトグ
ラフィーで精製し、（３）該ＴＦＰＩ−Ｓ−スルフォネ
ートをジスルフィド交換反応でリフォールドし、そして
（４）リフォールドされた活性なＴＦＰＩをカチオン交
換クロマトグラフィーで精製するシリーズ（Ａ）か、又
は次の： （Ｂ）（１）該細胞封入体を尿素中でのβ−メルカプト
エタノールによる還元に付して還元されたＴＦＰＩを形
成し、（２）該還元ＴＦＰＩをカチオン交換クロマトグ
ラフィーで精製し、（３）該還元ＴＦＰＩを尿素中での
ジスルフィド交換反応でリフォールドし、そして（４）
リフォールドされた活性なＴＦＰＩをカチオン交換クロ
マトグラフィーで精製するシリーズ（Ｂ）のいずれかか
ら成る段階的精製に付す工程を含んで成る前記方法。 - 【請求項２】 サルファイトリシスを細胞封入体と亜硫
酸ナトリウム及びジチオン酸ナトリウムとの反応により
行う、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 アニオン交換クロマトグラフィーを、Ｔ
ＦＰＩ−Ｓ−スルフォネートをモノＱアニオン交換樹脂
のカラムでクロマトグラフすることによって実施する、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 ＴＦＰＩ−Ｓ−スルフォネートのリフォ
ールド処理を該ＴＦＰＩ−Ｓ−スルフォネートとＬ−シ
ステインとの反応により行う、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 カチオン交換クロマトグラフィーを、リ
フォールドされたＴＦＰＩをモノＳカチオン交換樹脂の
カラムでクロマトグラフすることによって実施する、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 サルファイトリシスを細胞封入体と亜硫
酸ナトリウム及びジチオン酸ナトリウムとの反応により
行い、アニオン交換クロマトグラフィーを、ＴＦＰＩ−
Ｓ−スルフォネートをモノＱアニオン交換樹脂のカラム
でクロマトグラフすることによって実施し、リフォール
ド処理を該ＴＦＰＩ−Ｓ−スルフォネートとＬ−システ
インとの反応により行い、そしてカチオン交換クロマト
グラフィーを、リフォールドされたＴＦＰＩをモノＳカ
チオン交換樹脂のカラムでクロマトグラフすることによ
って実施する、請求項１に記載の方法。
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