ES2688093T3 - Proteínas de unión a calicreína plasmática - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo que se une a la forma activa de calicreína plasmática humana y no se une a precalicreína humana, y en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en (i) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRIGVPRRDEFDIWGQGTMVTVS S y secuencia VL de DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK; (ii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de EVQLLESGGGLVQPGGS LRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGI TVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRTGIPRRDAFDIWG QGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS y una secuencia VL de QDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASTLESG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK; (iii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLV TVSS y una secuencia VL de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK; (iv) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKS y una secuencia VL de QDIQMTQSPG TLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQTPGQAPRLLIYGASSRAT GIPDRFSGTGYGTDFTLTISRLEPEDYGTYYCQQSSRTPWTFGQGTRVEIK; (v) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLV TVSS y una secuencia VL de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK; (vi) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 30 HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIYADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS y una secuencia VL de QDIQMTQSPS FLSASVGDRV TITCRASQGI SSYLAWYQQK PGKAPKLLIYAASTLQSGVP SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QLNSYPLTFG GGTKVEIK; (vii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYSMIWVRQAPGKGLEWVSYIRPSGGRTTY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGLLLWFRELKSNYFDYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS y una secuencia VL de QDIQMTQSPSSLSAFVGDRVTITCRASQPIDNYLNWYHQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPS RLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFGGGTKVEIR; 40 (viii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYSMIWVRQAPGKGLEWVSY IRPSGGRTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGG LLLWNRELKS NYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS y una secuencia VL de QDIQMTQSPSSLSAFVGDRVTITCRASQPIDNYLNWYHQKPGKAPKLLIY AASRLQSGVPSRLSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFGNYYCQQSYTVPYTFGGGTKVEIR; (ix) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYSMIWVRQAPGKGLEWVSYIRPSGGRTTY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGLLLWARELKS NYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS y una secuencia VL de QDIQMTQSPSSLSAFVGDRVTITCRASQPIDNYLNWYHQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPS RLSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFGNYYCQQSYTVPYTFGGGTKVEIR; (x) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMVGQGIRGRSRTSYFAQWGQGTL VTVSS y una secuencia VL de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;

Description

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DESCRIPCIÓN
Proteínas de unión a calicreína plasmática Antecedentes
La calicreína plasmática es una serina proteasa. La precalicreína es el precursor de la calicreína plasmática.
Sumario
La calicreína plasmática es un componente de serina proteasa del sistema de contacto y una posible diana de fármacos para diferentes enfermedades inflamatorias, cardiovasculares, infecciosas (septicemia) y de oncología (Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). El sistema de contacto se activa por cualquier factor XIIa tras la exposición a superficies extrañas o negativamente cargadas o sobre superficies de células endoteliales por prolilcarboxipeptidasas (FIGURA 1) (Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). La activación de la calicreína plasmática amplifica la coagulación intrínseca mediante su activación de factor XII de retroalimentación y potencia la inflamación mediante la producción del nonapéptido proinflamatorio bradiquinina. Como cininogenasa primaria en la circulación, la calicreína plasmática es ampliamente responsable de la generación de bradiquinina en la vasculatura. Una deficiencia genética en la proteína inhibidora de C1 (C1-INH), el principal inhibidor natural de la calicreína plasmática, conduce a angioedema hereditario (AEH). Los pacientes con AEH padecen ataques agudos de edema doloroso, frecuentemente precipitados por desencadenantes desconocidos (Zuraw B.L. et al., N Engl J Med 359, 1027-1036, 2008). Mediante el uso de agentes farmacológicos o estudios genéticos en modelos animales, el sistema calicreína plasmática-cinina (KKS plasmático) participa en diversas enfermedades.
Las proteínas de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos inhibidores) son agentes terapéuticos útiles para una variedad de enfermedades y afecciones, por ejemplo, enfermedades y afecciones que implican la actividad de calicreína plasmática, debido a su alta potencia, especificidad y prolongada residencia en el suero. La alta potencia se puede traducir en eficacia y una baja dosificación de fármaco, y la alta especificidad puede reducir los efectos secundarios debido a la inhibición de serina proteasas inespecíficas relacionadas. En general, las serina proteasas de molécula pequeña no son tan específicas como los inhibidores de anticuerpos. La prolongada residencia en el suero puede permitir dosificación poco frecuente.
La invención es como se describe en las reivindicaciones, en particular la reivindicación 1. La divulgación caracteriza una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón) y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática (por ejemplo, precalicreína plasmática humana y/o precalicreína plasmática de ratón).
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína de unión a calicreína descrita en el presente documento. En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína (por ejemplo, epi-Kal2) y/o una molécula pequeña (por ejemplo, AEBSF) descrita en el presente documento y no se une a precalicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína descrita en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en M162- A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 (también denominadas en el presente documento DX-2922), X81- B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X81-B01 y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X67-D03 y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X101- A01 y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que M162- A04 y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X63-G06 y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
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En ciertos casos, la proteína se une en o cerca del sitio activo del dominio catalítico de calicreína plasmática, o un fragmento de la misma, o se une al epítope que solapa con el sitio activo de calicreína plasmática y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman la triada catalítica de calicreína plasmática: His434, Asp483 y/o Ser578 (numeración basada en la secuencia humana) y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína se une a uno o más aminoácidos de: Ser479, Tyr563 y/o Asp585 (numeración basada en la secuencia humana) y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: Arg551, Gln553, Tyr555, Thr558 y/o Arg560 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana). En otros casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a dos, tres, cuatro o cinco (es decir, todos) los aminoácidos de: Arg551, Gln553, Tyr555, Thr558 y/o Arg560 (numeración basada en la secuencia humana) y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: S478, N481, S525 y K526 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana). En otros casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a dos, tres o cuatro (es decir, todos) los aminoácidos de: S478, N481, S525 y K526 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana).
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene una constante de inhibición aparente (Kiap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 1, 0,5 o 0,2 nM.
En un caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En otro caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser un Fab soluble (sFab).
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
En otros casos, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1::hSa+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA+VH::CH1, HSA::lC+VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorila), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
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En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
La divulgación caracteriza una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína de unión a calicreína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína (por ejemplo, epi- Kal2) y/o una molécula pequeña (por ejemplo, AEBSF) descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína aislada comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera, en la que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en la que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142- H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101- A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
En algunos casos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X81-B01 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X81-B01.
En algunos casos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X67-D03 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X67-D03.
En algunos casos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X63-G06 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X63-G06.
En algunos casos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de M162-A04 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de MJ162-A04.
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
D11, M06-D09 y M35-G04 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142- H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
5 En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X81-B01 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X81-B01.
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X67-D03 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena 10 ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X67-D03.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115- 15 F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
y/o la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115- B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de X81-B01 y/o la cadena ligera de X81-B01.
20 En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de X67-D03 y/o la cadena ligera de X67-D03.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor XIIa y/o 25 bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por 30 ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína.
En algunos casos, la proteína incluye una o más de las siguientes características: (a) una CDR humana o región estructural humana; (b) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (c) la secuencia del dominio variable de 35 inmunoglobulina de LC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92,
93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (d) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93,
94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (e) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC es al
40 menos 85, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de HC descrito en el
presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (f) la proteína se une a un epítope unido por una proteína descrita en el presente documento, o compite por la unión con una proteína descrita en el presente documento; (g) una CDR de primate o región estructural de primate; (h) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR1 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2 45 o 3 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (i) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR2 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (j) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR3 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable de HC 50 descrito en el presente documento; (k) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una CDR1 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (l) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una CDR2 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3 o 4 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (m) la secuencia del dominio variable 55 de inmunoglobulina de LC comprende una CDR3 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (n) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en
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general o en regiones estructurales o CDR); y (o) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable de HC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR).
En algunos casos, la proteína tiene una constante de inhibición aparente (Kiap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 1, 0,5 o 0,2 nM.
En algunos casos, el anticuerpo no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63- G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115- G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81- B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115- E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115- H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115- H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X81-B01.
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En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X81-B01 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X67-D03 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En un caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
En otro caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína puede ser un Fab soluble (sFab).
En otros casos, la proteína incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas
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de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA + VH::CH1, HSA::LC + VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En un caso, la proteína es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
En un caso, la proteína incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En un caso, la proteína es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate.
En un caso, la proteína incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En un caso, la proteína incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertos casos, la proteína no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertos casos, la proteína es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En un caso, la proteína se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
La divulgación caracteriza una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a calicreína descrita en el presente documento, por ejemplo, que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, la composición puede estar al menos 10, 20, 30, 50, 75, 85, 90, 95, 98, 99 o 99,9 % libre de otra especie de proteína. En un caso, la composición farmacéutica puede estar al menos 10, 20, 30, 50, 75, 85, 90, 95, 98, 99 o 99,9 % libre de fragmentos de la proteína de unión que no se unen a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana) o se unen a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana con una Kiap de 5000 nM o mayor.
La divulgación caracteriza un método de tratamiento o prevención de un trastorno asociado a calicreína plasmática en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que se une a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón) y, por ejemplo, no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón) al sujeto,
En algunos casos, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína (por ejemplo, epi- Kal2) y/o una molécula pequeña (por ejemplo, AEBSF) descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína de unión a calicreína descrita en el presente documento.
En algunos casos, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación en dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico y lesión por quemadura. En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT. En otros casos, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable).
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En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se administra en combinación con otro tratamiento para el trastorno.
En algunos casos, la proteína descrita en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en M162- A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X81-B01.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X67-D03.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
En ciertos casos, la proteína se une en o cerca del sitio activo del dominio catalítico de calicreína plasmática, o un fragmento de la misma, o se une al epítope que solapa con el sitio activo de calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman la triada catalítica de calicreína plasmática: His434, Asp483 y/o Ser578 (numeración basada en la secuencia humana).
En algunos casos, la proteína se une a uno o más aminoácidos de Ser479, Tyr563 y/o Asp585 (numeración basada en la secuencia humana).
En otros casos, la proteína se une a uno o más aminoácidos de Arg551, Gln553, Tyr555, Thr558 y/o Arg560 (numeración basada en la secuencia humana). En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: S478, N481, S525 y K526 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana).
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor Xlla y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %,
aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %,
aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 5, 1,0,5 o 0,2 nM.
En un caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
En otro caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser un Fab soluble (sFab).
En otras implementaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA+VH::CH1, HSA::LC+VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
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En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorila), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
Se describe en el presente documento un método de tratamiento o prevención de un trastorno asociado a calicreína plasmática en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
En algunos casos, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación de dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico y lesión por quemadura. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT (por ejemplo, en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %), al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para el trastorno.
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con un segundo agente seleccionado del grupo que consiste en ecallantide, un inhibidor de C1 esterasa, aprotinina, un inhibidor del receptor de bradiquinina B2 (por ejemplo, icatibant).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142- H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101- A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática.
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En algunos casos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X81-B01 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X81-B01.
En algunos casos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X67-D03 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X67-D03.
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08 X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67- G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145- D11, M06-D09 y M35-G04 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X81-B01 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X81-B01.
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X67-D03 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X67-D03.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101- A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 y/o la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115- D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de X81-B01 y/o la cadena ligera de X81-B01.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de X67-D03 y/o la cadena ligera de X67-D03.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %,
aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %,
aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína.
En algunos casos, la proteína incluye una o más de las siguientes características: (a) una CDR humana o región estructural humana; (b) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (c) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92,
93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (d) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93,
94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (e) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de HC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (f) la proteína se une a un epítope unido por una proteína descrita en el presente documento, o compite por la unión con una proteína descrita en el presente documento; y (g) una CDR de primate o región estructural de primate.
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En algunos casos, la proteína tiene una constante de inhibición aparente (Kiap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 5, 1, 0,5 o 0,2 nM.
En algunos casos, el anticuerpo no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana).
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63- G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115- G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81- B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115- E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115- H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115- H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101- A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X81-B01.
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En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X81-B01 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X67-D03 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En un caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
En otro caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína puede ser un Fab soluble (sFab).
En otras implementaciones, la proteína incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA + VH::CH1, HsA::LC + VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En un caso, la proteína es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
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En un caso, la proteína incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En un caso, la proteína es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate.
En un caso, la proteína incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En un caso, la proteína incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertos casos, la proteína no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertos casos, la proteína es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En un caso, la proteína se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
La divulgación caracteriza un método de promoción de la cicatrización en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que se une a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón) y, por ejemplo, no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón) al sujeto.
En algunos casos, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína de unión a calicreína descrita en el presente documento. En algunos casos, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína (por ejemplo, epi-Kal2) y/o una molécula pequeña (por ejemplo, AEBSF) descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se administra en combinación con otro tratamiento para la cicatrización.
En algunos casos, la proteína descrita en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en M162- A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X81-B01.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X67-D03.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana).
En ciertos casos, la proteína se une en o cerca del sitio activo del dominio catalítico de calicreína plasmática, o un fragmento de la misma, o se une al epítope que solapa con el sitio activo de calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman la triada catalítica de calicreína plasmática: His434, Asp483 y/o Ser578 (numeración basada en la secuencia humana). En otros casos, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman una región para el reconocimiento de sustrato: Arg551, Gln553, Tyr555, Thr558 y/o Arg560 (numeración basada en la secuencia humana). En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: S478, N481, S525 y K526 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana).
En algunos casos, la proteína se une a uno o más aminoácidos de Ser479, Tyr563 y/o Asp585 (numeración basada en la secuencia humana).
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor XIIa y/o
bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente
20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %,
aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %,
aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína.
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En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene una constante de inhibición aparente (K¡,ap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 5, 1,0,5 o 0,2 nM.
En un caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
En otro caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser un Fab soluble (sFab).
En otras implementaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA+VH::CH1, HSA::LC+VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertos casos, la proteína es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
La divulgación caracteriza un método de promoción de la cicatrización en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
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En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para la cicatrización.
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142- H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101- A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática.
En algunos casos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X81-B01 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X81-B01.
En algunos casos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X67-D03 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X67-D03.
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, MI 42-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67- G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145- D11, M06-D09 y M35-G04 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X81-B01 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X81-B01.
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X67-D03 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X67-D03.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115- F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 y/o la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142- H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de X81-B01 y/o la cadena ligera de X81-B01.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de X67-D03 y/o la cadena ligera de X67-D03.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor Xlla y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %,
aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %,
aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína.
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En algunos casos, la proteína incluye una o más de las siguientes características: (a) una CDR humana o región estructural humana; (b) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (c) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92,
93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (d) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93,
94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (e) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de HC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (f) la proteína se une a un epítope unido por una proteína descrita en el presente documento, o compite por la unión con una proteína descrita en el presente documento; y (g) una CDR de primate o región estructural de primate.
En algunos casos, la proteína tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 5, 1,0,5 o 0,2 nM.
En algunos casos, el anticuerpo no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana).
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63- G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115- G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81- B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115- E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115- H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115- H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-
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A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X81-B01 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X67-D03 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En un caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
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En otro caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína puede ser un Fab soluble (sFab).
En otras implementaciones, la proteína incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA + VH::CH1, HsA::LC + VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En un caso, la proteína es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
En un caso, la proteína incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En un caso, la proteína es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate.
En un caso, la proteína incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En un caso, la proteína incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertos casos, la proteína no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertos casos, la proteína es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En un caso, la proteína se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
La divulgación caracteriza un método de promoción de la cicatrización en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en la que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para artritis reumatoide.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
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En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La divulgación caracteriza un método de tratamiento o prevención de gota en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para gota.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La divulgación caracteriza un método de tratamiento o prevención de enfermedad intestinal en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para enfermedad intestinal.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
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La divulgación caracteriza un método de tratamiento o prevención de mucositis oral en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para mucositis oral.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La divulgación caracteriza un método de tratamiento o prevención de dolor neuropático en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para dolor neuropático.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
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la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para dolor inflamatorio.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La divulgación caracteriza un método de tratamiento o prevención de enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
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la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para trombosis arterial o venosa.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La divulgación caracteriza un método de tratamiento o prevención de íleo posoperatorio en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para íleo posoperatorio.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
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la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para aneurisma aórtica.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La divulgación caracteriza un método de tratamiento o prevención de osteoartritis en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para osteoartritis.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
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la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para vasculitis.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La divulgación caracteriza un método de tratamiento o prevención de traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
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la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para septicemia.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La divulgación caracteriza un método de tratamiento o prevención de evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular) en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular).
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
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la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia).
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La divulgación caracteriza un método de tratamiento o prevención de nefritis por lupus eritematoso sistémico en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera al sujeto, en el que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para nefritis por lupus eritematoso sistémico.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
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la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para lesión por quemadura.
En algunos casos, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La divulgación caracteriza un método de detección de calicreína plasmática en una muestra, comprendiendo el método: poner en contacto la muestra con una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento); y detectar una interacción entre la proteína y la calicreína plasmática, si está presente.
En algunos casos, la proteína incluye una marca detectable.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina). En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina) y la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La divulgación caracteriza un método de detección de calicreína plasmática en un sujeto, comprendiendo el método: administrar a proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento) a un sujeto; y detectar una interacción entre la proteína y la calicreína plasmática en el sujeto, si está presente. Por ejemplo, la detección comprende la obtención de imágenes el sujeto.
En algunos casos, la proteína adicional incluye una marca detectable.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina). En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina) y la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La divulgación caracteriza un método de modulación de actividad de calicreína plasmática, por ejemplo, en un método de tratamiento o prevención de un trastorno asociado a calicreína plasmática. El método incluye: poner en contacto calicreína plasmática con una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento) (por ejemplo, en un sujeto humano), modulando así la actividad de calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal
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degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico/vasculitis y lesión por quemadura.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT. En otras realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable).
La divulgación caracteriza un método de tratamiento de un trastorno asociado a calicreína plasmática, comprendiendo el método administrar, a un sujeto, una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento) en una cantidad suficiente para tratar un trastorno asociado a calicreína plasmática en el sujeto. El método puede incluir además proporcionar al sujeto una segunda terapia que es terapia para el trastorno asociado a calicreína plasmática, por ejemplo, como se describe en el presente documento.
En algunos casos, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico/vasculitis y lesión por quemadura.
La divulgación caracteriza un método de obtención de imágenes de un sujeto. El método incluye administrar una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento) al sujeto y, por ejemplo, detectar una interacción entre la proteína y la calicreína plasmática en el sujeto, si está presente.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina). En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina) y la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína no inhibe la actividad de calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína inhibe la actividad de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática puede incluir una marca detectable (por ejemplo, un radionúclido o una marca detectable por IRM).
En algunos casos, el sujeto tiene o se sospecha que tiene un trastorno asociado a calicreína plasmática. El método es útil, por ejemplo, para el diagnóstico de un trastorno asociado a calicreína plasmática.
En algunos casos, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico y lesión por quemadura.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT (por ejemplo, en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %), al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable)).
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La divulgación caracteriza un método de obtención de imágenes de calicreína plasmática, por ejemplo, en un sujeto o muestra (por ejemplo, muestra de biopsia). El método incluye administrar una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento), por ejemplo, al sujeto o la muestra, y detectar una interacción entre la proteína y la calicreína plasmática, si está presente.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina). En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina) y la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína no inhibe la actividad de calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína inhibe la actividad de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática puede incluir una marca detectable (por ejemplo, un radionúclido o una marca detectable por IRM).
En algunos casos, el sujeto tiene o se sospecha que tiene un trastorno asociado a calicreína plasmática. El método es útil, por ejemplo, para el diagnóstico de un trastorno asociado a calicreína plasmática.
En algunos casos, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico y lesión por quemadura.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT (por ejemplo, en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %), al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable)).
La divulgación caracteriza el uso de una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento para el tratamiento de un trastorno descrito en el presente documento, por ejemplo, artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico, o lesión por quemadura; o para promover la cicatrización.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina). En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina) y la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La divulgación caracteriza el uso de una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno descrito en el presente documento, por ejemplo, artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico o lesión por quemadura; o para la fabricación de un medicamento para la cicatrización.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT (por ejemplo, en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al
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menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %), al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable)).
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción que sigue.
Breve descripción de dibujos
La FIGURA 1 es una representación esquemática de la función de la calicreína plasmática (pCal) en la vía de coagulación intrínseca e inflamación.
La FIGURA 2 representa el efecto de M162-A04 sobre el edema en pata de rata inducido por carragenina. Se midió la inflamación de la pata por desplazamiento de agua.
La FIGURA 3 representa el efecto de M162-A04 sobre la hiperalgesia térmica inducida por carragenina. Se midió la latencia del dolor por el método de Hargreaves después de la inyección de carragenina.
La FIGURA 4 representa el alineamiento de la secuencia de ADN de la cadena ligera de versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones (X81-B01) retromutadas a la línea germinal del mismo anticuerpo descubierto usando maduración por afinidad ROLIC. Se conservan las posiciones indicadas con un asterisco (*), mientras que los espacios en blanco corresponden a bases cambiadas en X81-B01 debido a cualquier optimización de codones o retromutación a la línea germinal.
La FIGURA 5 representa el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones (X81-B01) retromutadas a la línea germinal del mismo anticuerpo descubierto usando maduración por afinidad ROLIC. Se conservan las posiciones indicadas con un asterisco (*), mientras que los espacios en blanco corresponden a bases cambiadas en X81-B01 debido a retromutación a la línea germinal. Se diferencian un total de 11 entre el anticuerpo no retromutado a la línea germinal (X63-G06) y optimizado en codones (X81-B01) retromutado a la línea germinal.
La FIGURA 6 representa el alineamiento de la secuencia de ADN de la cadena pesada de versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones (X81-B01) retromutadas a la línea germinal del mismo anticuerpo usando maduración por afinidad ROLIC. Se conservan las posiciones indicadas con un asterisco (*), mientras que los espacios en blanco corresponden a bases cambiadas en X81-B01 debido a la optimización de codones.
La FIGURA 7 representa el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones (X81-B01) retromutadas a la línea germinal del mismo anticuerpo usando maduración por afinidad ROLIC. Se conservan las posiciones indicadas con un asterisco (*). Los dos anticuerpos tienen la misma secuencia de aminoácidos en la cadena pesada.
La FIGURA 8A representa la competición de EPI-KAL2 por pCal de unión a X81-B01. Se capturó X81-B01 (IgG) en una superficie específica de fragmento anti-Fc humano de un chip CM5 BIACORE®. Se hizo circular pCal (100 nM) sobre la superficie en presencia (sensograma inferior en la figura) o ausencia de EPI-KAL2 1 pM (sensograma superior en la figura).
La FIGURA 8B representa la competición de EPI-KAL2 por pCal de unión a X67-D03. Se capturó X67-D03 (IgG) en una superficie específica de fragmento anti-Fc humano de un chip CM5 Biacore. Se hizo circular pCal (100 nM) sobre la superficie en presencia (sensograma inferior en la figura) o ausencia de EPI-KAL2 1 pM (sensograma superior en la figura).
La FIGURA 9 representa los resultados del mapeo de epítopes CLIPS para los anticuerpos indicados en la Tabla 12.
Las FIGURAS 10A-10C representan el alineamiento ClustalW de secuencias de pCal de diferentes especies. Las posiciones indicadas por a "*" son posiciones conservadas entre, mientras que las posiciones indicadas indican sustituciones conservativas entre especies. Las posiciones indicadas por a "." tienen sustituciones no conservativas en algunas especies. Se mostró que las extensiones de aminoácidos indicadas por el símbolo "@" estaban altamente expuestas a disolvente por cálculo del área superficial accesible al disolvente. Las extensiones de los aminoácidos indicadas por un "+" se identificaron como posibles epítopes de los anticuerpos enumerados en la Tabla 12. Se encontró por cálculo del área superficial accesible al disolvente que los aminoácidos resaltados en gris estaban enterrados cuando se complejaron con un inhibidor de sitio activo de
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dominio de Kunitz. Las posiciones subrayadas son los aminoácidos que forman la triada catalítica (His434, Asp483 y Ser578, numeración basada en la secuencia humana).
Las FIGURAS 11a y 11B representan un análisis de competición Biacore con epi-kal2, como se describe en el presente documento en el Ejemplo 12, para los anticuerpos (i) DX-2922 y (ii) M6-D09.
La FIGURA 12 representa un análisis de competición Biacore con AEBSF, como se describe en el presente documento en el Ejemplo 12, para los anticuerpos (i) DX-2911 y (ii) M6-D09.
La FIGURA 13 representa un análisis Biocore que muestra que DX-2922 se une a calicreína plasmática que se une a cininógeno de alto peso molecular (HMWK).
La FIGURA 14 representa un gráfico que muestra la inhibición de edema dependiente de la dosis por X101- A01 en el edema en la pata de rata inducido por carragenina (CPE) en ratas.
Descripción detallada
Definiciones
Por comodidad, antes de la descripción adicional de la presente invención, se definen a continuación ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas. Otros términos se definen como aparecen en la memoria descriptiva.
Las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias al plural, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo.
El término "agonista," como se usa en el presente documento, se entiende que se refiere a un agente que imita o regula por incremento (por ejemplo, potencia o complementa) la bioactividad de una proteína. Un agonista puede ser una proteína natural o derivado de la misma que tiene al menos una bioactividad de la proteína natural. Un agonista también puede ser un compuesto que aumenta al menos una bioactividad de una proteína. Un agonista también puede ser un compuesto que aumenta la interacción de un polipéptido con otra molécula, por ejemplo, un péptido o ácido nucleico diana.
"Antagonista", como se usa en el presente documento, se entiende que se refiere a un agente que regula por disminución (por ejemplo, suprime o inhibe) al menos una bioactividad de una proteína. Un antagonista puede ser un compuesto que inhibe o disminuye la interacción entre una proteína y otra molécula, por ejemplo, un péptido o sustrato enzimático diana. Un antagonista también puede ser un compuesto que reduce la cantidad de proteína expresada presente.
El término "anticuerpo" se refiere a una proteína que incluye al menos un dominio variable de inmunoglobulina (región variable) o secuencia de dominio variable de inmunoglobulina (región variable). Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una región variable de la cadena pesada (H) (abreviada en el presente documento VH o HV), y una región variable de la cadena ligera (L) (abreviada en el presente documento VL o LV). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de la cadena pesada (H) y dos regiones variables de la cadena ligera (L). El término "anticuerpo" engloba fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios, Fab y fragmentos sFab, F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, scFv y fragmentos de anticuerpos de dominio (dAb) (de Wildt et al., Eur J Immunol. 1996; 26(3):629-39)), así como anticuerpos completos. Un anticuerpo pueden tener las características estructurales de IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos de las mismas). Los anticuerpos pueden ser de cualquier fuente, pero se prefieren de primate (primate humano y no humano) y primatizados.
Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas "regiones estructurales" ("FR"). Se ha definido el grado de la región estructural y CDR (véanse, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH N° 91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). Las definiciones de Kabat se usan en el presente documento. Cada VH y VL normalmente está compuesto de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Como se usa en el presente documento, una "secuencia de dominio variable de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de aminoácidos que puede formar la estructura de un dominio variable de inmunoglobulina de forma que una o más regiones CDR estén situadas en una conformación adecuada para un sitio de unión al antígeno. Por ejemplo, la secuencia puede incluir toda o parte de la secuencia de aminoácidos de un dominio variable que existe de forma natural. Por ejemplo, la secuencia puede omitir uno, dos o más aminoácidos del extremo N o C, aminoácidos internos, puede incluir una o más inserciones o aminoácidos terminales adicionales, o puede incluir otras alteraciones. En una realización, un polipéptido que incluye la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina se puede asociar con otra secuencia de dominio variable de inmunoglobulina para formar un sitio de unión al antígeno, por ejemplo, una estructura que interacciona preferencialmente con calicreína plasmática.
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La cadena VH o VL del anticuerpo puede incluir además toda o parte de una región constante de la cadena pesada o ligera, para así formar una cadena de inmunoglobulina pesada o ligera, respectivamente. En una realización, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina pesadas y dos cadenas de inmunoglobulina ligeras, en el que las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras están interconectadas por, por ejemplo, enlaces disulfuro. En las IgG, la región constante de la cadena pesada incluye tres dominios de inmunoglobulina, CH1, CH2 y CH3. La región constante de la cadena ligera incluye un dominio CL. La región variable de las cadenas pesadas y ligeras contiene un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos normalmente median en la unión del anticuerpo a tejidos o factores del hospedador, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico. Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipos kappa o lambda. En una realización, el anticuerpo está glucosilado. Un anticuerpo puede ser funcional para la citotoxicidad dependiente de anticuerpo y/o citotoxicidad mediada por el complemento.
Una o más regiones de un anticuerpo pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, una o más de las regiones variables pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, una o más de las CDR pueden ser humanas, por ejemplo, HC-CDR1, HC-CDR2, HC-CDR3, LC-CDR1, LC-CDR2 y/o LC-CDR3. Cada una de las CDR de la cadena ligera (LC) y/o cadena pesada (HC) puede ser humana. HC-CDR3 puede ser humana. Una o más de las regiones estructurales pueden ser humanas, por ejemplo, FR1, FR2, FR3 y/o FR4 de HC y/o LC. Por ejemplo, la región Fc puede ser humana. En una realización, todas las regiones estructurales son humanas, por ejemplo, derivadas de una célula somática humana, por ejemplo, una célula hematopoyética que produce inmunoglobulinas o una célula no hematopoyética. En una realización, las secuencias humanas son secuencias de la línea germinal, por ejemplo, codificadas por un ácido nucleico de la línea germinal. En una realización, los restos de la región estructural (FR) de un Fab seleccionado se pueden convertir en el tipo de aminoácido del resto correspondiente en el gen de la línea germinal de primate más similar, especialmente el gen de la línea germinal humana. Una o más de las regiones constantes pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, al menos 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98 o 100 % de un dominio variable de inmunoglobulina, la región constante, los dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y/o CL1), o el anticuerpo entero, pueden ser humanos o efectivamente humanos.
Todo o parte de un anticuerpo se puede codificar por un gen de inmunoglobulina o un segmento del mismo. Genes de inmunoglobulina humana a modo de ejemplo incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu, así como los muchos genes de la región variable de inmunoglobulina. Las "cadenas ligeras" de la inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 KDa o aproximadamente 214 aminoácidos) están codificadas por un gen de la región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de la región constante kappa o lambda en el extremo COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 KDa o aproximadamente 446 aminoácidos) están similarmente codificadas por un gen de la región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de la región constante anteriormente mencionados, por ejemplo, gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). La longitud de HC humana varía considerablemente debido a que HC-CDR3 varía desde aproximadamente 3 restos de aminoácido hasta más de 35 restos de aminoácido.
El término "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo de longitud completa se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que retienen la capacidad para unirse específicamente a una diana de interés. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo de longitud completa y que retienen la funcionalidad incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de brazo único de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, por un conector sintético que les permite separarse como una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv monocatenario (scFv). Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N2 5.260.203, 4.946.778 y 4.881.175; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.
Se pueden obtener fragmentos de anticuerpos usando cualquier técnica apropiada que incluye técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. El término "anticuerpo monoespecífico" se refiere a un anticuerpo que muestra una única especificidad de unión y afinidad por una diana particular, por ejemplo, epítope. Este término incluye un "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" que, como se usa en el presente documento, se refiere a una preparación de anticuerpos o fragmentos de los mismos de composición molecular única, independientemente de cómo se generó el anticuerpo.
Los anticuerpos "se retromutan a la línea germinal" invirtiendo uno o más aminoácidos no de la línea germinal en regiones estructurales a aminoácidos de la línea germinal correspondientes del anticuerpo, en tanto que retengan sustancialmente las propiedades de unión.
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La constante de inhibición (Ki) proporciona una medida de la potencia del inhibidor; es la concentración de inhibidor requerida para reducir la actividad enzimática a la mitad y no depende de las concentraciones de enzima o sustrato. La Ki aparente (Ki,ap) se obtiene a diferentes concentraciones de sustrato midiendo el efecto inhibidor de diferentes concentraciones de inhibidor (por ejemplo, proteína de unión inhibidora) sobre el grado de la reacción (por ejemplo, actividad enzimática); el ajuste del cambio en la constante de velocidad de pseudo-primer orden en función de la concentración de inhibidor a la ecuación de Morrison (Ecuación 1) da una estimación del valor de Ki aparente. Ki se obtiene a partir de la ordenada en el origen extraída de un análisis de regresión lineal de una representación de Ki,ap frente a la concentración de sustrato.
" (k,,v +1 + í)-#w+/ + -e)2-4-/-£ '
V = Vo~Vo -------------------------------------------------------------
0 0 2-E
v )
Ecuación 1
Donde v = velocidad medida; v0 = velocidad en ausencia de inhibidor; Ki,ap = constante de inhibición aparente; I = concentración de inhibidor total; y E = concentración enzimática total.
Como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la constante de asociación aparente o Ka. KA es el recíproco de la constante de disociación (KD). Una proteína de unión puede tener, por ejemplo, una afinidad de unión de al menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 y 1011 M-1 por una molécula diana particular, por ejemplo, calicreína plasmática. La unión de mayor afinidad de una proteína de unión a una primera diana con respecto a una segunda diana se puede indicar por una mayor KA (o un valor numérico de KD más pequeño) para la unión de la primera diana que la KA (o valor numérico KD) para la unión de la segunda diana. En tales casos, la proteína de unión tiene especificidad por la primera diana (por ejemplo, una proteína en una primera conformación o imitan de la misma) con respecto a la segunda diana (por ejemplo, la misma proteína en una segunda conformación o mimético de la misma; o una segunda proteína). Las diferencias en la afinidad de unión (por ejemplo, para especificidad u otras comparaciones) puede ser al menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10.000 o 105 veces.
La afinidad de unión se puede determinar por una variedad de métodos que incluyen diálisis en equilibrio, unión en equilibrio, filtración en gel, ELISA, resonancia de plasmones superficiales o espectroscopía (por ejemplo, usando un ensayo de fluorescencia). Las condiciones a modo de ejemplo para evaluar la afinidad de unión son en tampón HBS- P (HEPES 10 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,005 % (v/v) de tensioactivo P20). Estas técnicas se pueden usar para medir la concentración de proteína de unión unida y libre en función de la concentración de proteína de unión (o diana). La concentración de proteína de unión unida ([Unida]) se relaciona con la concentración de proteína de unión libre ([Libre]) y la concentración de sitios de unión para la proteína de unión en la diana donde (N) es el número de sitios de unión por molécula diana por la siguiente ecuación:
[Unida] = N ■ [Libre] / ((1/Ka) + [Libre]).
No siempre es necesario hacer una determinación exacta de Ka, aunque, puesto que algunas veces es suficiente obtener una medición de afinidad cuantitativa, por ejemplo, determinada usando un método tal como análisis de ELISA o FACS, es proporcional a Ka, y así se pueden usar para comparaciones, tales como determinar si una mayor afinidad es, por ejemplo, 2 veces mayor, para obtener una medición de afinidad cualitativa, o para obtener una inferencia de la afinidad, por ejemplo, por actividad en un ensayo funcional, por ejemplo, un ensayo in vitro o in vivo.
El término "proteína de unión" se refiere a una proteína que puede interaccionar con una molécula diana. Este término se usa indistintamente con "ligando". Una "proteína de unión a calicreína plasmática" se refiere a una proteína que puede interaccionar con (por ejemplo, se une a) calicreína plasmática, e incluye, en particular, proteínas que interaccionan preferencialmente o específicamente con y/o inhiben la calicreína plasmática. Una proteína inhibe la calicreína plasmática si causa una disminución en la actividad de calicreína plasmática en comparación con la actividad de calicreína plasmática en ausencia de la proteína y en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo.
Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
Es posible que uno o más restos de aminoácidos de la región estructural y/o CDR de una proteína de unión incluyan una o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas o sustituciones de aminoácidos no esenciales), inserciones, o deleciones) con respecto a una proteína de unión descrita en el presente
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documento. Una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener mutaciones (por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas o sustituciones de aminoácidos no esenciales), inserciones, o deleciones) (por ejemplo, al menos una, dos, tres, o cuatro y/o menos de 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 mutaciones) con respecto a una proteína de unión descrita en el presente documento, por ejemplo, mutaciones que no tienen un efecto funcional sobre la función de la proteína. Las mutaciones pueden estar presentes en regiones estructurales, CDR y/o regiones constantes. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una región estructural. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una CDR. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una región constante. Se puede predecir si una sustitución particular será o no tolerada, es decir, no afectará adversamente las propiedades biológicas, tales como la actividad de unión, por ejemplo, evaluando si la mutación es conservativa o por el método de Bowie, et al. (1990) Science 247:1306-1310.
Las secuencias de motivos para los biopolímeros pueden incluir posiciones que pueden ser aminoácidos variados. Por ejemplo, el símbolo "X" en dicho contexto se refiere generalmente a cualquier aminoácido (por ejemplo, cualquiera de los veinte aminoácidos naturales), a menos que se especifique de otro modo, por ejemplo, se refiere a cualquier aminoácido distinto de cisteína. También se puede indicar otros aminoácidos permitidos, por ejemplo, usando paréntesis y barras. Por ejemplo, "(A/W/F/N/Q)" significa que se permiten alanina, triptófano, fenilalanina, asparagina y glutamina en esa posición particular.
Una región variable de inmunoglobulina "eficazmente humana" es una región variable de inmunoglobulina que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácidos de la región estructural humana de forma que la región variable de inmunoglobulina no provoque una respuesta inmunogénica en un humano normal. Un anticuerpo "eficazmente humano" es un anticuerpo que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácidos humanas de forma que el anticuerpo no provoque una respuesta inmunogénica en un humano normal.
Un "epítope" se refiere al sitio en un compuesto diana que es unido por una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo tal como un Fab o anticuerpo de longitud completa). En el caso en el que el compuesto diana sea una proteína, el sitio puede estar completamente compuesto de componentes de aminoácido, completamente compuesto de modificaciones químicas de aminoácidos de la proteína (por ejemplo, restos de glucosilo), o compuesto de combinaciones de los mismos. Los epítopes de solapamiento incluyen al menos un resto de aminoácido común, grupo glucosilo, grupo fosfato, grupo sulfato, u otra molecular característica.
Una primera proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) "se une al mismo epítope" que una segunda proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) si la primera proteína de unión se une al mismo sitio en un compuesto diana al que se une la segunda proteína de unión, o se une a un sitio que solapa (por ejemplo, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 100 % de solapamiento, por ejemplo, en términos de la secuencia de aminoácidos u otra característica molecular (por ejemplo, grupo glucosilo, grupo fosfato o grupo sulfato)) con el sitio al que se une la segunda proteína de unión.
Una primera proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) "compite por la unión" con una segunda proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) si la unión de la primera proteína de unión a su epítope disminuye (por ejemplo, en 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, o más) la cantidad de la segunda proteína de unión que se une a su epítope. La competición puede ser directa (por ejemplo, la primera proteína de unión se une a un epítope que es el mismo que, o solapa con, el epítope unido por la segunda proteína de unión), o indirecta (por ejemplo, la unión de la primera proteína de unión a su epítope causa un cambio estérico en el compuesto diana que disminuye la capacidad de la segunda proteína de unión para unirse a su epítope).
Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" entre dos secuencias (los términos se usan indistintamente en el presente documento) se realizan del siguiente modo. Se alinean las secuencias para fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de un primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo y se pueden ignorar secuencias no homólogas para fines de comparación). El alineamiento óptimo se determina como la mejor puntuación usando el programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por extensión de hueco de 4 y una penalización por hueco con desplazamiento de marco de 5. Entonces se comparan los restos de aminoácidos o nucleótidos en correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en el presente documento, la "identidad" de aminoácidos o ácidos nucleicos es equivalente a la "homología" de aminoácidos o ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias.
En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines de comparación es al menos 30 %, preferentemente al menos 40 %, más preferentemente al menos 50 %, incluso más preferentemente al menos 60 %, e incluso más preferentemente al menos 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 % o 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia de referencia puede ser la longitud de la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina.
Una región variable de inmunoglobulina "humanizada" es una región variable de inmunoglobulina que se modifica para incluir un número suficiente de posiciones de aminoácidos de la región estructural humana de forma que la
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región variable de inmunoglobulina no provoque una respuesta inmunogénica en un humano normal. Las descripciones de inmunoglobulinas "humanizadas" incluyen, por ejemplo, los documentos U.S. 6.407.213 y U.S. 5.693.762.
Como se usa en el presente documento, el término "se hibrida en condiciones de baja rigurosidad, media rigurosidad, alta rigurosidad, o condiciones de muy alta rigurosidad" describe condiciones para la hibridación y el lavado. La orientación para realizar reacciones de hibridación se puede encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y se puede usar cualquiera. Las condiciones de hibridación específicas referidas en el presente documento son las siguientes: (1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en 6X cloruro sódico/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido por dos lavados en 0,2X SSC, 0,1 % de SDS al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados se pueden aumentar hasta 55 °C para las condiciones de baja rigurosidad); (2) condiciones de hibridación de media rigurosidad en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1 % de SDS a 60 °C; (3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1 % de SDS a 65 °C; y (4) condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad son fosfato de sodio 0,5 M, 7 % de SDS a 65 °C, seguido por uno o más lavados a 0,2X SSC, 1 % de SDS a 65 °C. Las condiciones de muy alta rigurosidad (4) son las condiciones preferidas y las que se deben usar, a menos que se especifique de otro modo. La divulgación incluye ácidos nucleicos que se hibridan con baja, media, alta o muy alta rigurosidad con un ácido nucleico descrito en el presente documento o con un complemento del mismo, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican una proteína de unión descrita en el presente documento. Los ácidos nucleicos pueden tener la misma longitud o estar dentro de 30, 20 o 10 % de la longitud del ácido nucleico de referencia. El ácido nucleico puede corresponder a una región que codifica una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina descrita en el presente documento.
Una "composición aislada" se refiere a una composición que se retira de al menos 90 % de al menos un componente de una muestra natural de la que se puede obtener la composición aislada. Las composiciones producidas artificial o naturalmente pueden ser "composiciones de al menos" un cierto grado de pureza si la especie o población de especies de interés es al menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 o 99 % pura en una base en peso-peso.
Una proteína "aislada" se refiere a una proteína que se retira de al menos 90 % de al menos un componente de una muestra natural de la que se puede obtener la proteína aislada. Las proteínas pueden ser "de al menos" un cierto grado de pureza si la especie o población de especies de interés es al menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 o 99 % pura en una base en peso-peso.
El término "modulador" se refiere a un polipéptido, ácido nucleico, macromolécula, complejo, molécula, molécula pequeña, compuesto, especie o similares (que existen de forma natural o que no existen de forma natural), o un extracto preparado a partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos, o células de animales o tejidos, que puede ser capaz de causar modulación. Los moduladores se pueden evaluar para su posible actividad como inhibidores o activadores (directa o indirectamente) de una propiedad funcional, actividad biológica o proceso, o combinación de ellos (por ejemplo, agonista, antagonista parcial, agonista parcial, agonista inverso, antagonista, agentes antimicrobianos, inhibidores de la infección o proliferación microbiana, y similares) por inclusión en ensayos. En dichos ensayos, se pueden cribar de una vez muchos moduladores. La actividad de un modulador puede ser conocida, desconocida o parcialmente conocida.
Un resto de aminoácido "no esencial" es un resto que se puede alterar de la secuencia no mutante del agente de unión, por ejemplo, el anticuerpo, sin suprimir o, más preferentemente, sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que el cambio de un resto de aminoácido "esencial" da como resultado una sustancial pérdida de actividad.
Un "paciente", "sujeto" u "hospedador" (estos términos se usan indistintamente) que se va a ser tratar por el método objeto puede significar cualquiera de un animal humano o no humano.
Los términos "precalicreína" y "precalicreína plasmática" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a la forma de zimógeno de la calicreína plasmática activa, que también se conoce como precalicreína.
El término "previniendo" o "prevenir" una enfermedad en un sujeto se refiere a someter el sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo, la administración de un fármaco, de forma que se prevenga al menos un síntoma de la enfermedad, es decir, se administra antes de la manifestación clínica de la afección no deseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado no deseado del animal hospedador) de manera que proteja al hospedador contra el desarrollo de la afección no deseada. "Prevenir" una enfermedad también se puede denominar "profilaxis" o "tratamiento profiláctico".
Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente idéntica" (o "sustancialmente homóloga") se usa en el presente documento para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos que contiene un número suficiente de restos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservadas) a una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos de forma que la primera y segunda secuencias de aminoácidos o de ácidos
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nucleicos tengan (o codifiquen proteínas que tienen) actividades similares, por ejemplo, una actividad de unión, una preferencia de unión, o una actividad biológica. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene al menos 50 %, al menos 25 %, o al menos 10 % de la afinidad con respecto al mismo antígeno.
Las secuencias similares u homólogas (por ejemplo, al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia) a las secuencias desveladas en el presente documento también son parte de la presente solicitud. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia con una proteína de unión descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %,
97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia en las regiones estructurales HC y/o LC (por ejemplo, FR 1, 2, 3 y/o 4 HC y/o LC) con una proteína de unión descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia en las CDR HC y/o Lc (por ejemplo, cDr1,2 y/o 3 HC y/o LC) con una proteína de unión descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia en la región constante (por ejemplo, CH1, CH2, CH3 y/o CL1) con una proteína de unión descrita en el presente documento.
Además, existe identidad sustancial cuando los segmentos de ácidos nucleicos se hibridan en condiciones de hibridación selectivas (por ejemplo, condiciones de hibridación altamente rigurosas), con el complemento de la hebra. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.
La significación estadística se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica. Las pruebas estadísticas a modo de ejemplo incluyen: la prueba de la t de Student, la prueba no paramétrica de la U de Mann Whitney y la prueba estadística no paramétrica de Wilcoxon. Algunas relaciones estadísticamente significativas tienen un valor de P inferior a 0,05 o 0,02. Las proteínas de unión particulares pueden mostrar una diferencia, por ejemplo, en la especificidad o unión que es estadísticamente significativa (por ejemplo, valor de P < 0,05 o 0,02). Los términos "inducir", "inhibir", "potenciar", "elevar", "aumentar", "disminuir" o similares, por ejemplo, que indican diferencias cualitativas o cuantitativas distinguibles entre dos estados, pueden referirse a una diferencia, por ejemplo, una diferencia estadísticamente significativa, entre los dos estados.
Una "dosificación terapéuticamente eficaz" modula preferentemente un parámetro medible, por ejemplo, actividad de calicreína plasmática, en un grado estadísticamente significativo o al menos aproximadamente 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente 60 %, y todavía más preferentemente en al menos aproximadamente 80 % con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para modular un parámetro medible, por ejemplo, un parámetro asociado a enfermedad, se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en trastornos y afecciones humanas, por ejemplo, artritis reumatoide u mucositis oral. Alternativamente, esta propiedad de una composición se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto para modular un parámetro in vitro.
"Tratar" una enfermedad (o afección) en un sujeto o "tratar" un sujeto que tiene una enfermedad se refiere a someter el sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo, la administración de un fármaco, de forma que se cure, alivie o disminuya al menos un síntoma de la enfermedad.
El término "prevenir" una enfermedad en un sujeto se refiere a someter el sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo, la administración de un fármaco, de forma que al menos un síntoma de la enfermedad se prevenga, es decir, se administra antes de la manifestación clínica de la afección no deseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado no deseado del animal hospedador) de manera que proteja al hospedador contra el desarrollo de la afección no deseada. "Prevenir" una enfermedad también se puede denominar "profilaxis" o "tratamiento profiláctico".
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, debido a que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en una fase más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz.
Como se usa en el presente documento, el término "DX-2922" se usa incambiablemente con el término "X101-A01". Otras variantes de este anticuerpo se describen a continuación.
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Identificación de anticuerpo
Descripción
X63-G06
Fab no retromutado a la línea germinal descubierto usando ROLIC, misma HC pero diferente LC que M160-G12
X81-B01
IgG retromutada a la línea germinal producida en células HEK 293T
X101-A01
IgG retromutada a la línea germinal producida en células CHO, misma secuencia de HC y LC que X81-B01
DX-2922
Nomenclatura alternativa para X101-A01
Proteínas de unión a calicreína plasmática
Las proteínas de unión a calicreína plasmática pueden ser de longitud completa (por ejemplo, una IgG (por ejemplo, una IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (por ejemplo, IgA1, IgA2), IgD, y IgE) o pueden incluir solo un fragmento de unión al antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv. La proteína de unión puede incluir dos inmunoglobulinas de la cadena pesada y dos inmunoglobulinas de la cadena ligera, o puede ser un anticuerpo monocatenario. Las proteínas de unión a calicreína plasmática pueden ser proteínas recombinantes tales como anticuerpos humanizados, injertados en CDR, quiméricos, desinmunizados, o generados in vitro, y pueden incluir opcionalmente regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo monoclonal.
La divulgación caracteriza una proteína (por ejemplo, una proteína aislada) que se une a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína murina) e incluye al menos una región variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, la proteína incluye una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada (HC) y/o una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera (LC). En una realización, la proteína se une a e inhibe calicreína plasmática, por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína murina.
La proteína puede incluir una o más de las siguientes características: (a) una CDR humana o región estructural humana; (b) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (c) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una o más (por ejemplo, 1 , 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (d) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC es al menos 85, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (e) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de HC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (f) la proteína se une a un epítope unido por una proteína descrita en el presente documento, o compite por la unión con una proteína descrita en el presente documento; (g) una CDR de primate o región estructural de primate; (h) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR1 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2 o 3 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (i) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR2 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (j) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR3 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (k) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una CDR1 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (l) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una CDR2 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3 o 4 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (m) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una CDR3 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento ; (n) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); y (o) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable de HC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR).
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La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser una proteína aislada (por ejemplo, al menos 70, 80, 90, 95, o 99 % libre de otras proteínas). En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática, o composición de la misma, se aísla de fragmentos de escisión de anticuerpos (por ejemplo, DX-2922 escindido) que son inactivos o parcialmente activos (por ejemplo, se unen a calicreína plasmática con una Ki,ap de 5000 nM o mayor) en comparación con la proteína de unión a calicreína plasmática. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática está al menos 70 % libre de dichos fragmentos de escisión de anticuerpos; en otras realizaciones, la proteína de unión está al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o incluso 100 % libre de fragmentos de escisión de anticuerpos que son inactivos o parcialmente activos.
La proteína que se une a calicreína plasmática puede además inhibir la calicreína plasmática, por ejemplo, calicreína plasmática humana.
En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína murina).
En ciertos casos, la proteína se une en o cerca del sitio activo del dominio catalítico de calicreína plasmática, o un fragmento de la misma, o se une al epítope que solapa con el sitio activo de calicreína plasmática.
En algunas opciones, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína compite con o se une al mismo epítope que M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63- G06, X101-A01, X81-B01 , X67-D03, X67- G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11 , M06-D09 y M35-G04.
En algunos casos, la proteína se une a (por ejemplo, posiciones en la calicreína plasmática correspondientes a) péptido CLIPS C1, C2, C3, C4, C5, C6, o C7, o más de uno de estos péptidos, por ejemplo, la proteína se une a C5 y C6. Los péptidos CLIPS C1-C7 son péptidos en la calicreína plasmática identificados por el mapeo de epítopes de CLIPS (véanse las FIGURAS 9 y 10A-10C). C1 corresponde a las posiciones 55-67 del dominio catalítico, C2 a las posiciones 81-94, C3 a las posiciones 101-108, C4 a las posiciones 137-151, C5 a las posiciones 162-178, C6 a las posiciones 186-197 y C7 a las posiciones 214-217 de calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína se une a un epítope mostrado en la Figura 9.
En algunos casos, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman la triada catalítica de calicreína plasmática: His434, Asp483 y/o Ser578 (numeración basada en la secuencia humana).
En algunos casos, la proteína se une a uno o más aminoácidos de: Arg551, Gln553, Tyr555, Thr558 y/o Arg560 (numeración basada en la secuencia humana). En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: S478, N481, S525 y K526 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana).
En algunos casos, la proteína se une a uno o más aminoácidos de Ser479, Tyr563 y/o Asp585 (numeración basada en la secuencia humana).
La hendidura de sitio activo de la calicreína plasmática contiene tres aminoácidos que forman la triada catalítica (His434, Asp483 y Ser578) y dan como resultado la hidrólisis enzimática de sustrato unido (los restos de la triada catalítica están subrayados en la Figura 10). Se determinó que los péptidos seleccionados para el análisis por mapeo de epítopes de CLIPS estaban accesibles en la superficie y o bien forman o rodean la proximidad del sitio activo. El péptido C1 contiene el sitio activo histidina 434. El péptido C3 contiene el sitio activo aspartato 483. El péptido C6 contiene el sitio activo serina 578. Es posible que un anticuerpo se una a múltiples aminoácidos expuestos en la superficie que son discontinuos en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, por análisis de CLIP, aparece que X81-B01 se une a los péptidos C2, C3, C5 y C6.
En algunos casos, la proteína se une a un epítope que incluye uno o más aminoácidos del péptido C1, péptido C2, péptido C3, péptido C4, péptido C5, péptido C6 o péptido C7 de CLIPS.
En algunos casos, la proteína se une a un epítope que incluye aminoácidos de al menos 2 péptidos CLIPS diferentes, por ejemplo, de al menos dos de péptido C1, péptido C2, péptido C3, péptido C4, péptido C5, péptido C6, o péptido C7.
La proteína puede unirse a calicreína plasmática, por ejemplo, calicreína plasmática humana, con una afinidad de unión de al menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 y 1011 M-1. En una realización, la proteína se une a calicreína plasmática humana con una Kdis más lenta que 1 x 10-3, 5 x 10-4 s-1 o 1 x 10-4 s-1. En un caso, la proteína se une a calicreína plasmática humana con una Kas más rápida que 1 x 102, 1 x 103 o 5 x 103 M-1s-1. En un caso, la proteína se une a calicreína plasmática, pero no se une a calicreína de tejido y/o precalicreína plasmática (por ejemplo, la proteína se une a calicreína de tejido y/o precalicreína plasmática menos eficazmente (por ejemplo, 5, 10, 50, 100 o
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1000 veces menos o en absoluto, por ejemplo, en comparación con un control negativo) que se une a calicreína plasmática.
En un caso, la proteína inhibe la actividad de calicreína plasmática humana, por ejemplo, con una Ki inferior a 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 y 10-10 M. La proteína puede tener, por ejemplo, una CI50 inferior a 100 nM, 10 nM, 1, 0,5 o 0,2 nM. Por ejemplo, la proteína puede modular la actividad de calicreína plasmática, así como la producción de factor Xlla (por ejemplo, de factor XII) y/o bradiquinina (por ejemplo, de cininógeno de alto peso molecular (HMWK)). La proteína puede inhibir la actividad de calicreína plasmática y/o la producción de factor Xlla (por ejemplo, de factor XII) y/o bradiquinina (por ejemplo, de cininógeno de alto peso molecular (HMWK)). La afinidad de la proteína por la calicreína plasmática humana se puede caracterizar por una Kd inferior a 100 nm, inferior a 10 nM, inferior a 5 nM, inferior a 1 nM, inferior a 0,5 nM. En un caso, la proteína inhibe la calicreína plasmática, pero no inhibe la calicreína de tejido (por ejemplo, la proteína inhibe la calicreína de tejido menos eficazmente (por ejemplo, 5, 10, 50, 100 o 1000 veces menos o en absoluto, por ejemplo, en comparación con un control negativo) que inhibe la calicreína plasmática.
En algunos casos, la proteína tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) inferior a 1000, 500, 100, 5, 1, 0,5 o 0,2 nM.
Las proteínas de unión a calicreína plasmática pueden ser anticuerpos. Los anticuerpos de unión a calicreína plasmática pueden tener sus secuencias del dominio variable de HC y LC incluidas en un único polipéptido (por ejemplo, scFv), o en diferentes polipéptidos (por ejemplo, IgG o Fab).
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08 X63- G06, X101-A01 , X81-B01, X67-D03, X67- G04, DX-2922, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01 , X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115- G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08 X63-G06, X101-A01, X81- B01 , X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29- D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01 , X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01 , X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115- H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01 , X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115- H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por
ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas
pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01 , X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11 , M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01 , X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11 , M06-D09 y M35-G04.
En un caso preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por
ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera
seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12,
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M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01 , X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115- A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un caso, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos. En otro, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína puede ser Fab soluble. En otras implementaciones, la proteína incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA + VH::CH1, HsA::LC + VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En un caso, la proteína es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas, o regiones estructurales al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % idénticas a regiones estructurales humanas. En una realización, la proteína incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En un caso, la proteína es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate, o regiones estructurales al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % idénticas a regiones estructurales de primate. En un caso, la proteína incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En algunos casos, la afinidad del anticuerpo de primate por la calicreína plasmática humana se caracteriza por una KD inferior a 1000, 500, 100, 10, 5, 1, 0,5 nM, por ejemplo, inferior a 10 nM, inferior a 1 nM, o inferior a 0,5 nM.
En ciertos casos, la proteína no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
La divulgación proporciona el uso de proteínas (por ejemplo, proteínas de unión, por ejemplo, anticuerpos) (por ejemplo, las proteínas descritas en el presente documento) que se unen a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana) e incluyen al menos una región variable de inmunoglobulina en métodos de tratamiento (o prevención) de un trastorno o afección asociado a calicreína plasmática. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada (HC) y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera (LC). Se describen en el presente documento varias proteínas de unión a calicreína plasmática a modo de ejemplo.
La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser una proteína aislada (por ejemplo, al menos 70, 80, 90, 95, o 99 % libre de otras proteínas).
La proteína de unión a calicreína plasmática puede inhibir además calicreína plasmática, por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina. En algunas realizaciones, se puede preferir que una proteína de unión a calicreína plasmática se una a tanto calicreína plasmática humana como a murina, ya que estos anticuerpos se pueden probar para eficacia en un modelo de ratón.
Calicreína plasmática
Las secuencias de calicreína plasmática a modo de ejemplo contra las que se pueden desarrollar proteínas de unión a calicreína plasmática pueden incluir secuencias de aminoácidos de calicreína plasmática humana, de ratón o rata, una secuencia que es 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una de estas secuencias, o un fragmento de la misma, por ejemplo, de una secuencia proporcionada a continuación.
Se usó la secuencia de calicreína plasmática humana en selecciones y el cribado posterior se muestra a continuación (número de acceso NP_000883.2). La calicreína plasmática humana (86 kDa) que se usó se purificó de plasma humano y se activó con el factor XIIa por un proveedor comercial. El factor XIIa activa la precalicreína por escisión de la secuencia de polipéptidos en un único sitio (entre Arg371-Ile372, sitio de escisión marcado por "/" en la secuencia a continuación) para generar calicreína plasmática activa, que entonces consiste en dos polipéptidos unidos por disulfuro; una cadena pesada de aproximadamente 52 kDa y un dominio catalítico de aproximadamente 34 kDa [Colman and Schmaier, (1997) "Contact System: A Vascular Biology Modulator With Anticoagulant, Profibrinolytic, Antiadhesive, and Proinflammatory Attributes" Blood, 90, 3819-3843]
GCLIQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYCQMRCTFHPRCLLFSFLPASSINDMEKRFGCFLKDSVTGTLPKV
KRrGAVSGHSLKQCGHQISAC-HR-DIYKGVDMRGVNFNVSKVSSVEECQKRCTSNIRCQFFSYATQTFHKAE
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Se ilustran a continuación las secuencias de aminoácidos de precalicreína humana, de ratón y rata, y las secuencias de ARNm que codifican las mismas. Las secuencias de precalicreína son las mismas que la calicreína plasmática, excepto que la calicreína plasmática activa (pCal) tiene la cadena de polipéptidos individual escindida en una única 5 posición (indicada por "/") para generar dos cadenas. Las secuencias proporcionadas a continuación son las secuencias completas que incluyen las secuencias señal. Tras la secreción de las célula que la expresa, se espera que se retiren las secuencias señal.
Calicreína plasmática humana (ACCESO: NP_000883.2)
> gi|78191798|ref|NP_000883.2| precursor B1 de calicreína plasmática [Homo sapiens]
MXLFKQATYFISLFATVSCGCLTQLYENAFFRGGDVASJIYrPNAQYCQMRCrFHPRCLLFSFIPASSIWD MEKRFGCFLKDSVTGTLPKVHRrGAVSGHSLKQCGHQlSACHRDIYKGVDMRGVNFNVSKVSSVEECQKR CTSNIRCQFFSYATQTFHKAEYRNNCLLKYSPGGTPTAIKVLSNVESGFSLKPCALSEIGCHMHIFQHLA FSDVDVARVLTPDAFVCRTlCTYHPWCLFFTFYTNVWKIESQRNVCLLKTSESGTPSSSrPQENTISGYS LLTCKRTLPEPCHSKIYPGVDFGGEELNVTFVKGVNVCQErCTKMIRCQFFTYSLLPEDCKEEKCKCFLR LSMDGSPrRIAYGTQGSSGYSLRLCNTGDNSVCTTKrSrRIVGGTOSSWGEWPWQVSLQVKLTAQRHLCG GSLIGHQWVLTAAHCFDGLPLQDVWRIYSGILNLSDirKDrPFSQIKEIIIHQNYKVSEGNHDIALIKLQ APLNYTEFQKPICLPSKGDTSTIYTNCWVTGWGFSKEKGEIQNILQKVNIPLVrNEECQKRYQDYKITQR MVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKHNGMWRLVGITSMGEGCARREQPGVYTKVAEYMDWTLEKTQSSDG 10 KAQMQSPA. ■
ARNm de calicreína plasmática humana (ACCESO: NM_000892)
> gi|78191797|ref|NM_000892.3| calicreína B de Homo sapiens, plasma (factor de Fletcher) 1 (KLKB1), ARNm
AGAACAGCTTGAAGACCGTTCATITTTAñGrGACAAGAGACTCACCTCCAAGAAGCAATrGTGTTrrCAG
AATGATTTTATT’CñAGCAAGCAACTTATTTCATTTCCT’TGTTrGCTACAGrTTCCTGTGGATGTCTCACT
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GCCAGATGAGGTGCACATT’CCACCCAAGGTGT'TTGCTATTCAG'rTTTCTrCCAGCAAGTTCAATCAATGA
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GGTGCAGTTTCrGGACATrCCrTGAAGCAAPGTGGTCATCAAATAAGTGCrTGCCATCGAGACATTTATA
AAGGAGTTGArATGAGAGGAGrCAArTTTAATGTGrCTAAGGTTAGCAGTGTrGAAGñArGCCñAAAAAG
GTGCACCAGTAACATTCGCTGCCAGrXTTTTTCATATGCCACGCAAACAirrCACAAGGCAGAGTACCGG
AACAATTGCCrATTAAAGrACAGTCCCGGAGGAACACCrACCGCTATAAAGGrGCTGAGTAACGTGGAAT
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GTTCrCAGATGTGGATGTrGCCAGGGTTCTCACTCCAGATGCTTTTGTGTGrCGGACCATCTGCACCTAr
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CCTTTTAACCTGCAAAAGAACTTTACCTGAACCCTGCCATTCTAAAATTTACCCGGGAGTTGACTTTGGA
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GCTGT’CAGTTrTTCACrTATTCTTrACTCCCAGAAGACTGTAAGGAAGAGAAG'rGTAAGTGTTTCTTAAG
ATTATCTATGGATGGTXCrCCAACrAGGATTGCGrATGGGACACAAGGGAGCTCTGGTTACTCTrTGAGA
TTGrGTAACACTGGGGACAACXCTGrCTGCACAACAAAAACAAGCACACGCAT'rGrxGGAGGAACAAACT
CTTCrTGGGGAGAGTGGCCCTGGCAGGXGAGCCTGCAGGrGAAGCTGACAGCTCAGAGGCACCTGTGTGG
AGGGTCACTCATAGGACACCAGTGGGTCCrCAC'TGCTGCCCACTGCTTTGArGGGCrTCCCCrGCAGGAT
GTTrGGCGCATCTATAGTGGCATTTrAAATCTGrCAGACATTACAAAAGATACACCrTTCTCACAAATAA
AAGAGAXrATTATTCACCAAAACTATAAAGTCTCAGAñGGGAATCATGrATATCGCCTTGATAAAACrCCA
GGCTCCTTTGAATTACACTGAATrCCAAAAACCAATATGCCTACCXXCCAAAGGTGACACAAGCACAATT
TATACCAACTGTTGGGrAACCGGArGGGGCrTCTCGAAGGAGAAAGGrGAAATCCAAAATATTCrACAAA
AGG’TAAATATrCCTTTGGTAACAAATGAAGAATGCCAGAAAAGArATCAAGArXATAAAATAACCCAACG
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XGCAAACACAATGGAATGTGGCGTrrGGrGGGCATCACCAGCTGGGGTGAAGGCTGTGCCCGCAGGGAGC
AACCrGGTGTCrACACCAAAGTCGCTGAGTACArGGACTGGATTrrAGAGAAAACACAGAGCAGTGArGG
AAAAGCTCAGATGCAGTCACCAGCATGAGAAGCAGTCCAGAGTCTAGGCAATTTTTACAACCTGAGTTCA
AGTCAAArTCTGAGCCTGGGGGGXCCTCATCXGCAAAGCATGGAGAGX'GGCATCTTCTTTGCATCCrAAG
GACGAAAAACACAGTGCACTCAGAGCTGCTGAGGACAATGTCTGGCTGAAGCCCGCTTTCAGCACGCCGT
aaccaggggctgacaatgcgaggtcgcaactgagatctccatgactgtgtgttgxgaaataaaatggtga
AAGAT CAAAAAA
Calicreína plasmática de ratón (ACCESO: NP_032481.1)
> gi|6680584|ref|NP_032481.11 calicreína B, plasma 1 [Mus musculus]
MILFNRVGYFVSLFATVSCGCMTQLYKNTFFRGGDLAAIYTPDAQYCQKMCTFHPRCLLFSFLAVTPPKE TNKRFGCFMKESIT GTLPRI HRTGAISGH SLKQCGHQISACHRDIYKGLEMRGSNFNISKTDNIEECQKL CTNNFECQFFTXATSAFYRPEYRKKCLLKHSASGTPTSIKSADKLVSGFSLKSCALSEIGCPMDIFQHSA FADLNVSQVITPDAFVCRTICTFHFNCLFFTFYTNEKETESQRNVCFLKTSKSGRPSFPIPQENAISGYS LLrCRKTRPEPCHSKIYSGVDFEGEELNVTFVQGADVCQETCTKTIRCQFFIYSLLPQDCKEEGCKCSLR LSTDGSPrRITYGMQGSSGYSLRLCKLVDSPDCrTKIMARIVGGTNASLGEWPWQVSLQVKLVSQTHPCG gsiigrqwvltaahcfdgipypdwriyggilslseitketpssrikeliihqeykvsegmydialiklq
TPLNYrEFQKPICLPSKADTHTIYTNCWTGWGYTKEQGETQNILQKATIPLVFNEECQKKYRDYVIMKQ
micagykeggtdackgdsggplvckhsgrwqlvgitswgegcgrkdopgvytkvseymdwilektqssdv
RALETSSA '
ARNm de calicreína plasmática de ratón (ACCESO: NM_008455.2)
5 > gi|236465804|ref|NM_008455.2| calicreína B de Mus musculus, plasma 1 (Klkbl), ARNm
agaccgccctcggtgccatattcagagggcttgaagaccatcttcatgtgaagactccctctcctccaga
ACCACAACGTGACCATCCTTCCAGGArGATTTTATTCAACCGAGrGGGTTATTTTGT'TTCCTTGTTTGCT
accgtctcctgtgggtgtatgactcaactgtataaaaataccttcttcagaggtggggatctagctgcca
tctacaccccagatgcccagtactgtcagaagatgtgcacttttcaccccaggtgcctgctgttcagctt
rCTCGCCGTGACTCCACCCAAAGAGACAAATAAACGGTTTGGTTGCTTCATGAAAGAGAGCATrACAGGG
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GTGCTTGCCACCGAGACATATACAAAGGACTTGATATGAGAGGGTCCAACTTTAATATCTCTAAGACCGA
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CAGAATCACAGAGAAATGTTrGTTTTCTrAAGACGTCTAAAAGTGGAAGACCAAGTCCCCCTATTCCTCA
agaaaacgctatatctggatatagtctcctcacctgcagaaaaactcgccctgaaccctgccattccaaa
ArTTACTCTGGAGTTGACTTTGAAGGGGAAGAACTGAATGTGACCTTCGTGCAAGGAGCAGATGTCTGCC
AAGAGACTTGTACAAAGACAATCCGCrGCCAGrTTTTrATTTACTCCTTACTCCCCCAAGACTGCAAGGA
GGAGGGGTGTAAATGTTCCTTAAGGTrATCCACAGATGGCTCCCCAACTAGGATCACCTATGGCATGCAG
GGGAGCTCCGGTTATTCTCTGAGATTGTGTAAACrTGTGGACAGCCCTGACTGTACAACAAAAATAAATG
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GGTATCTCAGACCCATTTGTGTGGAGGGTCCATCATrGGTCGCCAATGGGTACrGACAGCTGCCCATTGC
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AAGAAACGCCxrCCTCGAGAATAAAGGAGCTTATTATTCATCAGGAATACAAAGTCTCAGAAGGCAATTA
TGATATTGCCTTAATAAAGCTrCAGACGCCCCTGAArrATACTGAATTCCAAAAACCAATATGCCTGCCT
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GGAGATTCCGGTGGCCCCTTAGTCrGTAAACACAGTGGACGGTGGCAGrTGGTGGGTATCACCAGCTGGG
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GGAGAAGACACAGAGCAGTGATGTAAGAGCTCTGGAGACATCTTCAGCCTGAGGAGGCTGGGTACCAAGG
AGGAAGAñCCCAGCTGGCXTTACCACCTGCCCTCAAGGCAAACTAGAGCTCCAGGATTCTCGGCTGTAAA
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AAGACAGCGTTTTGCrCAAGTGTGTTrCCTGCCTrGAGTCACAGGAGCTCCAArGGGAGCArTACAAAGA TCACCAAGCTTGTTAGGAAAGAGAATGATCAAAGGGTrTTATTAGGTAATGAAATGTCTAGATGTGATGC AATTGAAAAAAAGACCCCAGATTCTAGCACAGTCCTTGGGACCATTCTCATGTAACTGTTGACTCTGGAC CTCAGCAGATCTCAGAGTTACCTGTCCACTrCTGACATTTGTTTArTAGAGCCTGATGCTATTCTTTCAA GTGGAGCAAAAAAAAAAAAAAA1 '
Calicreína plasmática de rata (ACCESO: NP_036857,2)
> gi|162138905|ref|NP_036857.2| calicreína B, plasma 1 [Rattus norvegicus]
milfkqvgyfvslfatvscgclsqlyantffrggdlaaiytpdaqhcqecmctfhprcllfsflavsptke
TDKRFGCFMKESITGTLPRI HRTGAI SGHSLKQCGHQLSACHQdIYEGLDMRGSNFNISKTDSIEECQKL CTNNIHCQFFTYATKAFHRPEYRKSCLLKRSSSGTPrSIKPVDNLVSGFSLKSCALSEIGCPMDIFGHFA FADLNVSHWTPDAFVCRTVCTFHPNCLFFTFYTNEWETESQRNVCFIjKTSKSGRPSPPIIQENAVSGYS LFrCRKARPEPCHFKIYSGVAFEGEELNATFVQGADACQETCTKTIRCQFFTYSLLPQDCKAEGCKCSLR LSTDGSPTRITYEAQGSSGYSLR1CKWESSDCTTKIKARIVGGTNSSLGEWPHQVSLQVKI.VSQNHMCG GSIIGRQWILTAAHCFDGIPYPDVWRIYGGILNLSEITNKTPFSSIKELIIHQKYKMSEGSYDIALIKLQ TPLNYTEFQKPICLPSKADTNTIYTNCWVTGWGYTKERGETQNILQKATIPLVPHEECQKKYRDYVITKQ MICAGYKEGGIDACKGDSGGPLVCKHSGRWQLVGITSWGEGCARKEQPGVYTKVAEYIDWILEKIQSSKE 10 RALETSPA ■ ■
5
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25
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ARNm de calicreína plasmática de rata (ACCESO: NM_012725)
> gi|162138904|ref|NM_012725.2| calicreína B de Rattus norvegicus, plasma 1 (Klkbl), ARNm
rGAAGACTAGCTTCflrGrGAAGACTCCTTCTCCTCCAGCAGCACAAñGCAACCATCCTTCCAGGATGATT TTATTCAAACAAGrGGGTTATTTTGTTTCCTTGrTCGCTACAGTTTCCrGTGGG TGTCTGTCACAACTGT ATGCAAATACCTTCTTCAGAGGTGGGGATCTGGCTGCCATCrACACCCCGGATGCCCAGCACTGTCAGAA GATGTGCACGTTTCACCCCAGGTGCCTGCTCTTCAGCTrCCTTGCCGTGAGTCCAACCAAGGAGACAGAT AAAAGGrTTGGGTGCTTCATGAAAGAGAGCATTACAGGGACTTTGCCAAGAATACACCGGACAGGGGCCA TTTCTGG rCATTCTTTAAAACAGTGTGGCCATCAATTAAGTGCTrGCCACCAAG ACATA TACGAAGGACT GGArATGAGAGGGTCCAACrrTAATATArCTAAGACCGACAGTATTGAAGAATGCCAGAAACTGTGCACA AATAATATTCACTGCCAATrTTTCACATATGCTACAAAAGCATrTCACAGACCAGAGTACAGGAAGAGTT GCCTGCrGAAGCGCAGTTCAAGTGGAACGCCCACCAGTATAAAGCCAGTGGACAACCrGGTGTCTGGATT CTCACTGAAGTCCTGTGCTCrCTCAGAGATCGGTTGCCCCATGGATATTTTCCAGCACrTTGCCTTTGCA GACCrGAATGTAAGCCATGTCGTCACCCCCGATGCCTTCGTGTGTCGCACCGTTTGCACCTTCCATCCCA ACTGCCTCTTCTTCACATrCTACACGAñrGAGTGGGAGACGGAATCACAGAGGAATGrTTGTTTTCTTAA GACATCTAAAAGTGGAAGACCAAGTCCCCCTATTATTCAAGAAAATGCrGTATCrGGATACAGTCTCTTC ACCTGCAGAAAAGCTCGCCCTGAACCCTGCCATTrCAAGATTTACTCTGGAGTTGCCTTCGAAGGGGAAG AACTGAACGCGACCrrCGTGCAGGGAGCAGATGCGrGCCAAGAGACTTGTACAAAGACCArCCGCTGTCA GTTTTTTACTrACTCATTGCTTCCCCAAGACTGCAAGGCñGAGGGGTGTAAñrGTTCCTTAAGGTTATCC
acggatggctctccaactaggatcacctatgaggcacaggggagctctggttattctctgagactgtgta
AAGrrGTGGñGAGCTCrGACTGTACGACAAAAATAAATGCACGTATTGrGGGñGGAACAAACTCTTCTTT
AGGAGAGTGGCCATGGCAGGTCAGCCTGCAAGTAAAGTTGGTTTCTCAGAATCATATGTGTGGAGGGTCC
ATCATTGGACGCCAATGGATACTGACGGCTGCCCATTGCTTTGATGGGATTCCCTñTCCAGACGrGTGGC
GTATATATGGCGGGArrCTTAArCTGTCAGAGATTACAAACAññACGCCTTTCTCAAGTATAAAGGAGCT
TArTATTCATCAGAAArACAAAArGTCAGAAGGCAGTTACGATATTGCCTTAATAAAGCTrCAGACACCG
TTGAATTATACrGAATTCCAAAAACCAATATGCCTGCCTTCCAAAGCTGACACAAATACAATTTATACCA
ACTGCTGGGTGACTGGATGGGGCTACACAAAGGAACGAGGTGAGACCCAAAATATTCTACAAAAGGCAAC
TATTCCCTTGGTACCAAATGAAGAATGCCAGAAAAAArATAGAGATTArGTTATAACCAAGCAGATGATC
TGTGCTGGCTñCAAAGAAGGrGGAATAGArGCTTGTAAGGGAGATTCCGGTGGCCCCTTAGTTTGCAAAC
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AGTCTACACCAAAGrTGCTGAGTñCATTGACTGGATATTGGAGAAGATACAGAGCAGCAAGGAAAGAGCT
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CCTGCCCTCAAGTCCrACTAGAGCTCCAGAGTTCTCTrCTGCAAAATGTCGATAGTGGrGTCTACCTCGC
ATCCrTACCATAGGATTAAAAGTCCAñATGTAGACACAGTTGCTAAAGACAGCGCCATGCTCAAGCGTGC
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gttcttccacttggagcaaagaactgagaaacctggttctatccattgggaaaaagagatctttgtaaca
tttcctttacaataaaaagatgttctacttggacttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
Bibliotecas de presentación
Una biblioteca de presentación es un conjunto de entidades; cada entidad incluye un componente de polipéptido accesible y un componente recuperable que codifica o identifica el componente de polipéptido. El componente de polipéptido varía de manera que se representen diferentes secuencias de aminoácidos. El componente de polipéptido puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, desde tres aminoácidos hasta más de 300 aminoácidos. Una entidad de biblioteca de presentación puede incluir más de un componente de polipéptido, por ejemplo, las dos cadenas de polipéptidos de un sFab. En una implementación a modo de ejemplo, se puede usar una biblioteca de presentación para identificar proteínas que se unen a calicreína plasmática. En una selección, el componente de polipéptido de cada miembro de la biblioteca se sonda con calicreína plasmática (o fragmento de la misma) y si el componente de polipéptido se une a la calicreína plasmática, se identifica el miembro de la biblioteca de presentación, normalmente por retención sobre un soporte.
Se recuperan del soporte los miembros retenidos de la biblioteca de presentación y se analizan. El análisis puede incluir la amplificación y una selección posterior en condiciones similares o diferentes. Por ejemplo, se pueden alternar selecciones positivas y negativas. El análisis también puede incluir determinar la secuencia de aminoácidos del componente de polipéptido y la purificación del componente de polipéptido para caracterización detallada.
Se pueden usar una variedad de formatos para las bibliotecas de presentación. Ejemplos incluyen los siguientes.
Presentación en fagos: El componente de proteína normalmente se une covalentemente a una proteína de la cubierta del bacteriófago. El enlace resulta de la traducción de un ácido nucleico que codifica el componente de proteína fusionado con la proteína de la cubierta. El enlace puede incluir un conector peptídico flexible, un sitio de proteasa, o un aminoácido incorporado como resultado de la supresión de un codón de terminación. La presentación en fagos se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; documentos WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8 y Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3)344-8. Se puede cultivar y recoger el bacteriófago que presente el componente de proteína usando métodos estándares de preparación de fagos, por ejemplo, precipitación con PEG de medios de crecimiento. Después de la selección de fagos de presentación individuales, el ácido nucleico que codifica los componentes de proteína
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seleccionados se puede aislar de células infectadas con los fagos seleccionados o de los propios fagos, después de la amplificación. Se pueden recoger colonias o placas individuales, aislar el ácido nucleico y secuenciar.
Otros formatos de presentación. Otros formatos de presentación incluyen presentación basada en células (véase, por ejemplo, el documento WO 03/029456), fusiones de proteína-ácido nucleico (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 6.207.446), presentación de ribosomas (véase, por ejemplo, Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 y Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404- 30; y Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231 (1 -2):119-35), y presentación periplásmica en E. coli (J Immunol Methods. 2005 Nov 22; PMID: 16337958).
Armazones. Los armazones útiles para la presentación incluyen: anticuerpos (por ejemplo, fragmentos Fab, moléculas Fv monocatenarias (scFv), anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de camélido y anticuerpos camelizados); receptores de linfocitos T; proteínas de MHC; dominios extracelulares (por ejemplo, repeticiones de fibronectina tipo III, repeticiones de EGF); inhibidores de la proteasa (por ejemplo, dominios de Kunitz, ecotina, BPTI, etc.); repeticiones de TPR; estructuras tri-lámina; dominios de dedos de cinc; proteínas de unión a ADN; particularmente proteínas de unión a ADN monomérico; proteínas de unión a ARN; enzimas, por ejemplo, proteasas (particularmente proteasas inactivadas), RNasa; chaperonas, por ejemplo, tiorredoxina y proteínas de choque térmico; dominios de señalización intracelular (tales como dominios SH2 y SH3); péptidos lineales y restringidos; y sustratos peptídicos lineales. Las bibliotecas de presentación pueden incluir diversidad sintética y/o natural. Véase, por ejemplo, el documento US 2004-0005709.
También se puede usar tecnología de presentación para obtener proteínas de unión (por ejemplo, anticuerpos) que se unen a epítopes particulares de una diana. Esto se puede hacer, por ejemplo, usando moléculas no diana de competición que carecen del epítope particular o se mutan dentro del epítope, por ejemplo, con alanina. Dichas moléculas no diana se pueden usar en un procedimiento de selección negativa como se describe a continuación, como moléculas de competición cuando se unen a una biblioteca de presentación a la diana, o como un agente de pre-elución, por ejemplo, para capturar en una disolución de lavado miembros de biblioteca de presentación de disociación que no son específicos para la diana.
Selección iterativa. En un caso preferido, se usa tecnología de bibliotecas de presentación en un modo iterativo. Se usa una primera biblioteca de presentación para identificar una o más proteínas de unión para una diana. Estas proteínas de unión identificadas se varían entonces usando un método de mutagénesis para formar una segunda biblioteca de presentación. Las proteínas de unión de mayor afinidad se seleccionan entonces de la segunda biblioteca, por ejemplo, usando condiciones de mayor rigurosidad o de unión y de lavado más competitivas.
En algunas implementaciones, la mutagénesis se dirige a regiones en la interfase de unión. Si, por ejemplo, las proteínas de unión identificadas son anticuerpos, entonces la mutagénesis se puede dirigir a las regiones CDR de las cadenas pesadas o ligeras como se describe en el presente documento. Además, la mutagénesis se puede dirigir a regiones estructurales cerca de o adyacentes a las CDR. En el caso de anticuerpos, la mutagénesis también se puede limitar a una o algunas de las CDR, por ejemplo, para hacer mejoras escalonadas precisas. Las técnicas de mutagénesis a modo de ejemplo incluyen: PCR propensa a error, recombinación, barajado de ADN, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis en casete.
En un ejemplo de selección iterativa, se usan los métodos descritos en el presente documento para identificar en primer lugar una proteína de una biblioteca de presentación que se une a calicreína plasmática, con al menos una especificidad de unión mínima por una diana o una actividad mínima, por ejemplo, una constante de disociación en equilibrio por la unión de menos de 0,5 nM, 1 nM, 10 nM o 100 nM. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas identificadas iniciales se usan como ácido nucleico molde para la introducción de variaciones, por ejemplo, para identificar una segunda proteína que tiene propiedades potenciadas (por ejemplo, afinidad de unión, cinética o estabilidad) con respecto a la proteína inicial.
Selección de disociación. Puesto que una velocidad de disociación lenta puede ser predictiva de alta afinidad, particularmente con respecto a interacciones entre polipéptidos y sus dianas, se pueden usar los métodos descritos en el presente documento para aislar proteínas de unión con una velocidad de disociación cinética deseada (por ejemplo, reducida) para una interacción de unión con una diana.
Para seleccionar proteínas de unión de disociación lenta de una biblioteca de presentación, la biblioteca se pone en contacto con una diana inmovilizada. La diana inmovilizada se lava entonces con una primera disolución que elimina las biomoléculas no específicamente o débilmente unidas. Entonces, las proteínas de unión unidas se eluyen con una segunda disolución que incluye una cantidad de saturación de diana libre o un anticuerpo monoclonal de competición de alta afinidad específico de diana, es decir, duplicados de la diana que no se unen a la partícula. La diana libre se une a biomoléculas que se disocian de la diana. La re-unión se previene eficazmente por la cantidad de saturación de diana libre con respecto a la concentración mucho más baja de diana inmovilizada.
La segunda disolución puede tener condiciones de disolución que son sustancialmente fisiológicas o que son rigurosas. Normalmente, las condiciones de disolución de la segunda disolución son idénticas a las condiciones de disolución de la primera disolución. Se recogen fracciones de la segunda disolución en orden temporal para
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distinguir fracciones tempranas de tardías. Las fracciones tardías incluyen biomoléculas que se disocian a una tasa más lenta de la diana que las biomoléculas en las fracciones tempranas.
Además, también es posible recuperar miembros de la biblioteca de presentación que siguen unidos a la diana, incluso después de la prolongada incubación. Éstos se pueden o bien disociar usando condiciones caotrópicas o bien se pueden amplificar mientras están unidos a la diana. Por ejemplo, se puede poner en contacto el fago unido a la diana con células bacterianas.
Selección o cribado de especificidad. Los métodos de cribado de bibliotecas de presentación descritos en el presente documento pueden incluir un proceso de selección o cribado que descarta miembros de bibliotecas de presentación que se unen a una molécula no diana. Ejemplos de molécula no diana incluyen estreptavidina en perlas magnéticas, agentes de bloqueo tales como albúmina de suero bovino, leche bovina no grasa, proteína de soja, cualquier anticuerpo monoclonal de captura o de inmovilización diana, o células no transfectadas que no expresan la diana.
En una implementación, se usa una denominada etapa de "selección negativa" para discriminar entre la diana y la molécula no diana relacionada y una molécula no diana relacionada, pero distinta. La biblioteca de presentación o un conjunto de la misma se pone en contacto con la molécula no diana. Se recogen los miembros de la muestra que no se unen a la no diana y se usan en selecciones posteriores para unirse a la molécula diana o incluso para selecciones negativas posteriores. La etapa de selección negativa puede ser antes o después de la selección de los miembros de biblioteca que se unen a la molécula diana.
En otra implementación, se usa una etapa de cribado. Después de que se aíslen los miembros de la biblioteca de presentación para la unión a la molécula diana, se prueba cada miembro de la biblioteca aislado para su capacidad para unirse a una molécula no diana (por ejemplo, una no diana enumerada anteriormente). Por ejemplo, se puede usar un cribado de ELISA de alto rendimiento para obtener estos datos. El cribado de ELISA también se puede usar para obtener datos cuantitativos por la unión de cada miembro de la biblioteca a la diana, así como para la reactividad de especies cruzadas con dianas relacionadas o subunidades de la diana (por ejemplo, calicreína plasmática) y también en condiciones diferentes tales como pH 6 o pH 7,5. Se comparan los datos de unión de no diana y diana (por ejemplo, usando un ordenador y software) para identificar miembros de la biblioteca que se unen específicamente a la diana.
Otras bibliotecas de expresión a modo de ejemplo
Se pueden usar otros tipos de colecciones de proteínas (por ejemplo, bibliotecas de expresión) para identificar proteínas con una propiedad particular (por ejemplo, capacidad para unirse a calicreína plasmática), que incluyen, por ejemplo, matrices de anticuerpos de proteína (véase, por ejemplo, De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989- 994), bibliotecas lambda gt11, bibliotecas de dos híbridos, etc.
Bibliotecas a modo de ejemplo
Es posible inmunizar un primate no humano y recuperar los genes de anticuerpo de primate que se pueden presentar en fago (véase más adelante). A partir de dicha biblioteca, se pueden seleccionar anticuerpos que se unen al antígeno usado en la inmunización. Véanse, por ejemplo, Vaccine. (2003) 22(2):257-67 o Immunogenetics. (2005) 57(10):730-8. Así, se podrían obtener anticuerpos de primate que se unen e inhiben la calicreína plasmática inmunizando un chimpancé o macaco y usando una variedad de medios para seleccionar o cribar los anticuerpos de primate que se unen e inhiben la calicreína plasmática. También se pueden preparar quimeras de Fab primatizados con regiones constantes humanas, véase Curr Opin Mol Ther. (2004) 6(6):675-83. "Los anticuerpos PRIMATIZADOS, genéticamente manipulados de mono macaco cinomolgo y componentes humanos son estructuralmente indistinguibles de los anticuerpos humanos. Por tanto, es menos probable que causen reacciones adversas en seres humanos, haciéndolos posiblemente aptos para el tratamiento crónico a largo plazo" Curr Opin Investig Drugs. (2001) 2(5):635-8.
Un tipo a modo de ejemplo de biblioteca presenta un conjunto diverso de polipéptidos, cada uno de los cuales incluye un dominio de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio variable de inmunoglobulina. Son de interés las bibliotecas de presentación donde los miembros de la biblioteca incluyen dominios de inmunoglobina de primate o "primatizados" (por ejemplo, tales como de humano, primate no humano o "humanizados") (por ejemplo, dominios variables de inmunoglobina) o Fabs primatizados quiméricos con regiones constantes humanas. Se pueden usar las bibliotecas de dominios de inmunoglobina humanos o humanizados para identificar anticuerpos humanos o "humanizados" que, por ejemplo, reconocen antígenos humanos. Debido a que las regiones constantes y las regiones estructurales del anticuerpo son humanas, estos anticuerpos pueden evitar ellos mismos ser reconocidos y dirigidos como antígenos cuando se administran a seres humanos. Las regiones constantes también se pueden optimizar para reclutar funciones efectoras del sistema inmunitario humano. El proceso de selección por presentación in vitro supera la incapacidad de un sistema inmunitario humano normal de generar anticuerpos contra antígenos propios.
Una biblioteca de presentación de anticuerpos típica muestra un polipéptido que incluye un dominio VH y un dominio VL. Un "dominio de inmunoglobulina" se refiere a un dominio del dominio variable o constante de moléculas de
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inmunoglobulina. Los dominios de inmunoglobulina normalmente contienen dos hojas p formadas de aproximadamente siete cadenas p y un enlace disulfuro conservado (véase, por ejemplo, A. F. Williams and A. N. Barclay, 1988, Ann. Rev. Immunol. 6:381 -405). La biblioteca de presentación puede presentar el anticuerpo como un fragmento Fab (por ejemplo, usando dos cadenas de polipéptidos) o un Fv monocatenario (por ejemplo, usando un única cadena de polipéptidos). También se pueden usar otros formatos.
Como en el caso de Fab y otros formatos, el anticuerpo presentado puede incluir una o más regiones constantes como parte de una cadena ligera y/o pesada. En una realización, cada cadena incluye una región constante, por ejemplo, como en el caso de un Fab. En otras realizaciones, se presentan regiones constantes adicionales.
Las bibliotecas de anticuerpos se pueden construir por varios procesos (véanse, por ejemplo, de Haard et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-30; Hoogenboom et al., 1998, Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al., 2000, Immunol. Today 21:371-378, y Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3):344-8. Además, los elementos de cada proceso se pueden combinar con los de otros procesos. Los procesos se pueden usar de forma que se introduzca variación en un único dominio de la inmunoglobulina (por ejemplo, VH o VL) o en múltiples dominios de la inmunoglobulina (por ejemplo, VH y VL). La variación se puede introducir en un dominio variable de inmunoglobulina, por ejemplo, en la región de una o más de CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 y/o FR4, con referencia a dichas regiones de cualquiera y ambos de los dominios pesados y variables de la cadena ligera. Por ejemplo, la(s) variación (variaciones) se pueden introducir en las tres CDR de un dominio variable dado, o en CDR1 y CDR2, por ejemplo, de un dominio variable de la cadena pesada. Es factible cualquier combinación. En un proceso, se construyen bibliotecas de anticuerpos insertando diversos oligonucleótidos que codifican CDR en las regiones correspondientes del ácido nucleico. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar usando nucleótidos o trinucleótidos monoméricos. Por ejemplo, Knappik et al., 2000, J. Mol. Biol. 296:57-86 describen un método de construcción de CDR que codifican oligonucleótidos usando síntesis de trinucleótidos y un molde con sitios de restricción manipulados para aceptar los oligonucleótidos.
En otro proceso, se inmuniza un animal (por ejemplo, un roedor) con calicreína plasmática. El animal se refuerza opcionalmente con el antígeno para estimular adicionalmente la respuesta. Entonces se aíslan células del bazo del animal, y se amplifica ácido nucleico que codifica los dominios VH y/o VL y se clona para la expresión en la biblioteca de presentación.
En otro proceso más, se construyen bibliotecas de anticuerpo a partir de ácido nucleico amplificado de genes de inmunoglobulina intactos de la línea germinal. El ácido nucleico amplificado incluye ácido nucleico que codifica el dominio VH y/o dominio VL. Las fuentes de ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulina se describen más adelante. La amplificación puede incluir PCR, por ejemplo, con cebadores que se hibridan con la región constante, u otro método de amplificación.
Se pueden obtener dominios de inmunoglobulina que codifican ácido nucleico de las células inmunitarias de, por ejemplo, un primate (por ejemplo, un humano), ratón, conejo, camello o roedor. En un ejemplo, las células se seleccionan para una propiedad particular. Se pueden seleccionar linfocitos B en diversas etapas de madurez. En otro ejemplo, los linfocitos B son intactos.
En un caso, se usa citometría activada por fluorescencia (FACS) para clasificar linfocitos B que expresan moléculas de IgM, IgD o IgG unidas a la superficie. Además, se pueden aislar linfocitos B que expresan diferentes isotipos de IgG. En otra realización preferida, los linfocitos B o T se cultivan in vitro. Las células se pueden estimular in vitro, por ejemplo, cultivando con células nodrizas o añadiendo mitógenos u otros reactivos inmunomoduladores, tales como anticuerpos contra CD40, ligando de CD40 o CD20, miristato-acetato de forbol, lipopolisacárido bacteriano, concanavalina A, fitohemaglutinina o mitógeno de fitolaca.
En otro caso, las células se aíslan de un sujeto que tiene una enfermedad o afección descrita en el presente documento, por ejemplo, una enfermedad o afección asociada a calicreína plasmática.
En un caso preferido, las células han activado un programa de hipermutación somática. Las células se pueden estimular para experimentar mutagénesis somática de genes de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante tratamiento con anticuerpos anti-inmunoglobulina, anti-CD40 y anti-CD38 (véase, por ejemplo, Bergthorsdottir et al., 2001, J. Immunol. 166:2228). En otra realización, las células son intactas.
Se puede aislar el ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina de un repertorio natural siguiendo un método a modo de ejemplo. En primer lugar, se aísla ARN de la célula inmunitaria. Se separan ARNm de longitud completa (es decir, tapados) (por ejemplo, degradando ARN sin tapar con fosfatasa intestinal bovina). Entonces se retira la tapa con pirofosfatasa ácida de tabaco y se usa transcripción inversa para producir el ADNc.
La transcripción inversa de la primera cadena (antisentido) se puede hacer en cualquier modo con cualquier cebador adecuado. Véase, por ejemplo, de Haard et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-30. La región de unión del cebador puede ser constante entre diferentes inmunoglobulinas, por ejemplo, con el fin de transcribir de forma inversa diferentes isotipos de inmunoglobulina. La región de unión del cebador también puede ser específica para un isotipo particular de inmunoglobulina. Normalmente, el cebador es específico para una región que está 3' con respecto a
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una secuencia que codifica al menos una CDR. En otra realización, se pueden usar cebadores de poli-dT (y se pueden preferir para los genes de la cadena pesada).
Se puede ligar una secuencia sintética al extremo 3' de la hebra transcrita de forma inversa. Se puede usar la secuencia sintética como sitio de unión a cebador para la unión del cebador directo durante la amplificación por PCR después de la transcripción inversa. El uso de la secuencia sintética puede obviar la necesidad de usar un conjunto de cebadores directos diferentes para capturar completamente la diversidad disponible.
Entonces se amplifica el gen que codifica el dominio variable, por ejemplo, usando una o más rondas. Si se usan múltiples rondas, se pueden usar cebadores anidados para la elevada fidelidad. Entonces se clona el ácido nucleico amplificado en un vector de biblioteca de presentación.
Métodos de cribado secundario
Después de seleccionar miembros de biblioteca candidatos que se unen a una diana, cada miembro de biblioteca candidato se puede analizar adicionalmente, por ejemplo, para caracterizar adicionalmente sus propiedades de unión para la diana, por ejemplo, calicreína plasmática. Cada miembro de biblioteca candidato se puede someter a uno o más ensayos de cribado secundarios. El ensayo puede ser para una propiedad de unión, una propiedad catalítica, una propiedad inhibidora, una propiedad fisiológica (por ejemplo, citotoxicidad, eliminación renal, inmunogenicidad), una propiedad estructural (por ejemplo, estabilidad, conformación, estado de oligomerización) u otra propiedad funcional. Se puede usar repetidamente el mismo ensayo, pero con condiciones variables, por ejemplo, para determinar el pH, sensibilidades iónicas o térmicas.
Según convenga, los ensayos pueden usar directamente un miembro de biblioteca de presentación, un polipéptido recombinante producido a partir del ácido nucleico que codifica el polipéptido seleccionado, o un péptido sintético sintetizado basándose en la secuencia del polipéptido seleccionado. En el caso de Fabs seleccionados, los Fab se pueden evaluar o se puede modificar y producir como proteínas de IgG intactas. Los ensayos a modo de ejemplo para las propiedades de unión incluyen los siguientes.
ELISA. Se pueden evaluar proteínas de unión usando un ensayo de ELISA. Por ejemplo, cada proteína se pone en contacto con una placa de microtitulación cuya superficie inferior se ha recubierto con la diana, por ejemplo, una cantidad limitante de la diana. La placa se lava con tampón para retirar los polipéptidos no específicamente unidos. Entonces, se determina la cantidad de la proteína de unión unida a la diana sobre la placa sondando la placa con un anticuerpo que puede reconocer la proteína de unión, por ejemplo, una marca o porción constante de la proteína de unión. El anticuerpo se asocia con un sistema de detección (por ejemplo, una enzima tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante (HRP) que produce un producto colorimétrico cuando se proporcionan sustratos apropiados).
Ensayos de unión homogénea. Se puede analizar la capacidad de una proteína de unión descrita en el presente documento para unirse a una diana usando un ensayo homogéneo, es decir, después de que se añadan todos los componentes del ensayo, no se requieren manipulaciones adicionales de líquidos. Por ejemplo, se puede usar transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) como ensayo homogéneo (véase, por ejemplo, Lakowicz et al., patente de EE.UU. N° 5.631.169; Stavrianopoulos, et al., patente de EE.UU. N° 4.868.l03). Se selecciona una marca de fluoróforo sobre la primera molécula (por ejemplo, la molécula identificada en la fracción) de forma que su energía fluorescente emitida se pueda absorber por una marca fluorescente sobre una segunda molécula (por ejemplo, la diana) si la segunda molécula está en proximidad a la primera molécula. La marca fluorescente sobre la segunda molécula fluoresce cuando absorbe la energía transferida. Puesto que la eficiencia de transferencia de energía entre las marcas está relacionada con la distancia que separa las moléculas, se puede evaluar la relación espacial entre las moléculas. En una situación en la que la unión ocurre entre las moléculas, la emisión fluorescente de la marca de molécula 'aceptora' en el ensayo debe ser máxima. Se puede medir convenientemente un evento de unión que está configurado para monitorizar por FRET mediante medios de detección fluorométricos estándares, por ejemplo, usando un fluorímetro. Por valoración de la cantidad de la primera o segunda molécula de unión, se puede generar una curva de unión para estimar la constante de unión en equilibrio.
Otro ejemplo de un ensayo homogéneo es ALFASCREEN™ (Packard Bioscience, Meriden CT). ALFASCREEN™ usa dos perlas marcadas. Una perla genera oxígeno singlete cuando se excita por un láser. La otra perla genera una señal de luz cuando el oxígeno singlete difunde desde la primera perla y colisiona con ella. La señal solo se genera cuando las dos perlas están en proximidad. Se puede unir una perla al miembro de la biblioteca de presentación, la otra a la diana. Se miden las señales para determinar el grado de unión.
Resonancia de plasmones superficiales (SPR). Se puede analizar la interacción de proteína de unión y una diana usando SPR. SPR o el análisis de interacción biomolecular (BIA) detecta interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes. Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un evento de unión) del chip de BIA dan como resultado alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia de plasmones superficiales (SPR)). Los cambios en la refractividad generan una señal detectable, que se mide como una indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas. Los métodos para usar SPR se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 5.641.640; Raether, 1988, Surface
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Plasmons Springer Verlag; Sjolander y Urbaniczky, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 y los recursos en línea proporcionados por BIAcore International AB (Uppsala, Suecia).
Se puede usar la información de SPR para proporcionar una medida precisa y cuantitativa de la constante de disociación en equilibrio (Kd), y parámetros cinéticos, que incluyen Kas y Kdis, para la unión de una proteína de unión a una diana. Dichos datos se pueden usar para comparar diferentes biomoléculas. Por ejemplo, se pueden comparar proteínas seleccionadas de una biblioteca de expresión con proteínas identificadas que tienen alta afinidad por la diana o que tienen una Kdis lenta. Esta información también se puede usar para desarrollar relaciones estructura- actividad (SAR). Por ejemplo, se pueden comparar los parámetros cinéticos y de unión en equilibrio de versiones maduras de una proteína original con los parámetros de la proteína original. Se pueden identificar los aminoácidos de variante en posiciones dadas que se correlacionan con parámetros de unión particulares, por ejemplo, alta afinidad y lenta Kdis. Esta información se puede combinar con modelado estructural (por ejemplo, usando modelado de homología, minimización de energía, o determinación de la estructura por cristalografía de rayos X o RMN). Como resultado, se puede formular y usar un entendimiento de la interacción física entre la proteína y su diana para guiar otros procesos de diseño.
Ensayos celulares. Se pueden cribar las proteínas de unión para la capacidad para unirse a células que expresan transitoria o establemente y muestran la diana de interés sobre la superficie celular. Por ejemplo, se pueden marcar fluorescentemente las proteínas de unión a calicreína plasmática y se puede detectar la unión a calicreína plasmática en presencia de ausencia de anticuerpo antagonista por un cambio en la intensidad de fluorescencia usando citometría de flujo, por ejemplo, una máquina de FACS.
Otros métodos a modo de ejemplo para obtener proteínas de unión a calicreína plasmática
Además del uso de las bibliotecas de presentación, se pueden usar otros métodos para obtener una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, anticuerpo). Por ejemplo, se puede usar la proteína de calicreína plasmática o un fragmento de la misma como un antígeno en un animal no humano, por ejemplo, un roedor.
En un caso, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible manipular cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humana. Usando la tecnología de hibridomas, se pueden producir y seleccionar anticuerpos monoclonales (mAb) específicos de antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véase, por ejemplo, XENOMOUSE™, Green et al, 1994, Nat. Gen. 7: 13-21; documentos US 2003-0070185, WO 96/34096, publicado el 31 de octubre de 1996, y la solicitud PCT N° PCT/US96/05928, presentada el 29 de abril de 1996.
En otro caso, se obtiene un anticuerpo monoclonal del animal no humano, y entonces se modifica, por ejemplo, se humaniza o desinmuniza. Winter describe un método de injerto en CDR que se puede usar para preparar los anticuerpos humanizados (solicitud de patente de R.U. GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; la patente de EE.UU. N° 5.225.539. Todas las CDR de un anticuerpo humano particular se pueden sustituir con al menos una porción de una CDR no humana o solo algunas de las CDR se pueden sustituir con CDR no humanas. Solo es necesario sustituir el número de CDR requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.
Se pueden generar anticuerpos humanizados reemplazando secuencias de la región variable Fv que no están directamente implicadas en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de regiones variables Fv humanas. Los métodos generales para generar anticuerpos humanizados se proporcionan por Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207, por Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, y por Queen et al., patentes de EE.UU. N° 5.585.089, 5.693.761 y 5.693.762. Los métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican todas o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Están disponibles numerosas fuentes de tal ácido nucleico. Por ejemplo, se pueden obtener ácidos nucleicos de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada, como se ha descrito anteriormente. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado, o fragmento del mismo, se pueden clonar entonces en un vector de expresión apropiado.
Reducción de la inmunogenicidad de proteínas de unión a calicreína plasmática
Se pueden modificar las proteínas de unión a calicreína plasmática de inmunoglobulina (por ejemplo, proteínas de unión a calicreína plasmática de IgG o Fab) para reducir la inmunogenicidad. Se desea inmunogenicidad reducida en proteínas de unión a calicreína plasmática previstas para su uso como terapéuticos, ya que reduce la probabilidad de que el sujeto desarrolle una respuesta inmunitaria contra la molécula terapéutica. Las técnicas útiles para reducir la inmunogenicidad de proteínas de unión a calicreína plasmática incluyen deleción/modificación de los posibles epítopes de linfocitos T humanos y "retromutación a la línea germinal" de secuencias fuera de las CDR (por ejemplo, región estructural y Fc).
Se puede modificar un anticuerpo de unión a calicreína plasmática por deleción específica de epítopes de linfocitos T humanos o "desinmunización", por ejemplo, por los métodos desvelados en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Brevemente, se analizan las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo para péptidos que se une a la clase II de MHC; estos péptidos representan los posibles epítopes de linfocitos T
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(como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de posibles epítopes de linfocitos T, se puede aplicar un enfoque de modelado informático denominado "reconocimiento del plegamiento de péptidos", y además, se pueden buscar en una base de datos de péptidos de unión de la clase II de MHC humano motivos presentes en las secuencias VH y VL, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos principales de DR de la clase II de MHC, y así constituyen los posibles epítopes de linfocitos T. Los posibles epítopes de linfocitos T detectados se pueden eliminar sustituyendo números pequeños de restos de aminoácidos en las regiones variables, o preferentemente, por sustituciones de un único aminoácido. Se hacen sustituciones conservativas en la medida de lo posible, frecuentemente pero no exclusivamente, se puede usar un aminoácido común en esta posición en las secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana se desvelan en Tomlinson, I.A. et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al., 1995, Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al., 1992, J. Mol. Bio. 227:799-817. El directorio V BASE proporciona un directorio completo de secuencias de la región variable de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, R.U.). Después de la desinmunización se identifican cambios, se pueden construir ácidos nucleicos que codifican Vh y Vl por mutagénesis u otros métodos de síntesis (por ejemplo, síntesis de novo, sustitución de casetes, etc.). Opcionalmente, se puede fusionar la secuencia variable mutagenizada con una región constante humana, por ejemplo, IgG1 humana o regiones constantes k.
En algunos casos, un posible epítope de linfocitos T incluirá restos que se conoce o predice que son importantes para la función del anticuerpo. Por ejemplo, los posibles epítopes de linfocitos T están normalmente inclinados hacia las CDR. Además, los posibles epítopes de linfocitos T pueden ocurrir en restos de la región estructural importantes para la estructura y unión del anticuerpo. Los cambios para eliminar estos posibles epítopes requerirán en algunos casos más escrutinio, por ejemplo, haciendo y probando cadenas con y sin el cambio. Cuando sea posible, los posibles epítopes de linfocitos T que solapan las CDR se eliminaron por sustituciones fuera de las CDR. En algunos casos, una alteración dentro de una CDR es la única opción, y así se deben probar variantes con y sin esta sustitución. En otros casos, la sustitución requerida para retirar un posible epítope de linfocitos T es en una posición de resto dentro de la región estructural que podría ser crítica para la unión del anticuerpo. En estos casos, se deben probar las variantes con y sin esta sustitución. Así, en algunos casos se diseñaron varias regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras desinmunizadas de variante y se probaron diversas combinaciones de cadena pesada / ligera con el fin de identificar el anticuerpo desinmunizado óptimo. La elección del anticuerpo desinmunizado final se puede hacer entonces considerando la afinidad de unión de las diferentes variantes conjuntamente con el grado de desinmunización, es decir, el número de posibles epítopes de linfocitos T que quedan en la región variable. Se puede usar la desinmunización para modificar cualquier anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que incluye una secuencia no humana, por ejemplo, un anticuerpo sintético, un anticuerpo murino, otro anticuerpo monoclonal no humano, o un anticuerpo aislado de una biblioteca de presentación.
Los anticuerpo de unión a calicreína plasmática se "retromutan a la línea germinal" invirtiendo uno o más aminoácidos no de la línea germinal en regiones estructurales a aminoácidos de la línea germinal correspondientes del anticuerpo, mientras que se retienen sustancialmente las propiedades de unión. También se pueden usar métodos similares en la región constante, por ejemplo, en dominios de inmunoglobulina constantes.
Los anticuerpos que se unen a calicreína plasmática, por ejemplo, un anticuerpo descrito en el presente documento, se pueden modificar con el fin de hacer las regiones variables del anticuerpo más similares a una o más secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una, dos, tres o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, en una región estructural, CDR, o región constante, para hacerla más similar a una secuencia de referencia de la línea germinal. Un método de retromutación a la línea germinal a modo de ejemplo puede incluir identificar una o más secuencias de la línea germinal que son similares (por ejemplo, las más similares en una base de datos particular) a la secuencia del anticuerpo aislado. Las mutaciones (al nivel de aminoácidos) se hacen entonces en el anticuerpo aislado, ya sea gradualmente o en combinación con otras mutaciones. Por ejemplo, se hace una biblioteca de ácidos nucleicos que incluye secuencias que codifican algunas o todas las posibles mutaciones de la línea germinal. Entonces se evalúan los anticuerpos mutados, por ejemplo, para identificar un anticuerpo que tiene uno o más restos adicionales de la línea germinal con respecto al anticuerpo aislado y que es todavía útil (por ejemplo, tiene una actividad funcional). En un caso, se introducen tantos restos de la línea germinal en un anticuerpo aislado como sea posible.
En un caso, se usa mutagénesis para sustituir o insertar uno o más restos de la línea germinal en una región estructural y/o región constante. Por ejemplo, un resto de la región estructural y/o región constante de la línea germinal puede ser de una secuencia de la línea germinal que es similar (por ejemplo, el más similar) a la región no variable que se modifica. Después de la mutagénesis, se puede evaluar la actividad (por ejemplo, unión u otra actividad funcional) del anticuerpo para determinar si el resto o restos de la línea germinal son tolerados (es decir, no suprimen la actividad). Se puede realizar mutagénesis similar en las regiones estructurales.
Se puede realizar en diferentes formas la selección de una secuencia de la línea germinal. Por ejemplo, se puede seleccionar una secuencia de la línea germinal si cumple un criterio predeterminado para selectividad o similitud, por ejemplo, al menos un cierto porcentaje de identidad, por ejemplo, al menos 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5 % de identidad. La selección se puede realizar usando al menos 2, 3, 5 o 10 secuencias de la línea germinal. En el caso de CDR1 y CDR2, identificar una secuencia similar de la línea germinal puede incluir
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seleccionar dicha secuencia. En el caso de CDR3, identificar una secuencia similar de la línea germinal puede incluir seleccionar dicha secuencia, pero puede incluir usar dos secuencias de la línea germinal que contribuyen por separado a la porción del extremo amino y la porción del extremo carboxi de la secuencia. En otras implementaciones se usan más de una o dos secuencias de la línea germinal, por ejemplo, para formar una secuencia consenso.
En un caso, con respecto a una secuencia del dominio variable de referencia particular, por ejemplo, una secuencia descrita en el presente documento, una secuencia relacionada del dominio variable tiene al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100 % de las posiciones de aminoácidos de CDR que no son idénticas a restos en las secuencias de CDR de referencia, restos que son idénticos a restos en posiciones correspondientes en una secuencia de la línea germinal humana (es decir, una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico de la línea germinal humana).
En un caso, con respecto a una secuencia del dominio variable de referencia particular, por ejemplo, una secuencia descrita en el presente documento, una secuencia del dominio variable relacionada tiene al menos 30, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % de las regiones FR idénticas a la secuencia de FR de una secuencia de la línea germinal humana, por ejemplo, una secuencia de la línea germinal relacionada con la secuencia del dominio variable de referencia.
Por consiguiente, es posible aislar un anticuerpo que tiene actividad similar a un anticuerpo de interés dado, pero es más similar a una o más secuencias de la línea germinal, particularmente una o más secuencias de la línea germinal humana. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser al menos 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5 % idéntico a una secuencia de la línea germinal en una región fuera de las CDR (por ejemplo, regiones estructurales). Además, un anticuerpo puede incluir al menos 1, 2, 3, 4 o 5 restos de la línea germinal en una región CDR, siendo el resto de la línea germinal de una secuencia de la línea germinal similar (por ejemplo, el más similar) a la región variable que se modifica. Las secuencias de la línea germinal de interés primario son secuencias de la línea germinal humana. La actividad del anticuerpo (por ejemplo, la actividad de unión como se mide por KA) puede estar dentro de un factor o 100, 10, 5, 2, 0,5, 0,1 y 0,001 del anticuerpo original.
Se han determinado las secuencias de la línea germinal de genes de inmunoglobina humana y están disponibles de varias fuentes, que incluye INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM® (IMGT), y el directorio V BASE (compilado por Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, R.U.).
Las secuencias de referencia de la línea germinal a modo de ejemplo para Vkappa incluyen: O12/O2, O18/O8, A20, A30, L14, L1, L15, L4/18a, L5/L19, L8, L23, L9, L24, L11, L12, O11/O1, A17, A1, A18, A2, A19/A3, A23, A27, A11, L2/L16, L6, L20, L25, B3, B2, A26/A10 y A14. Véase, por ejemplo, Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-3.
Una secuencia de referencia de la línea germinal para el dominio variable de HC se puede basar en una secuencia que tiene estructuras canónicas particulares, por ejemplo, 1-3 estructuras en los bucles hipervariables H1 y H2. Las estructuras canónicas de bucles hipervariables de un dominio variable de inmunoglobulina se pueden deducir de su secuencia, como se describe en Chothia et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798); y Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-38. Las secuencias a modo de ejemplo con una estructura 1-3 incluyen: DP-1, DP-8, DP-12, DP-2, DP-25, DP-15, DP-7, DP-4, DP-31, DP-32, DP-33, DP-35, DP-40, 7-2, hv3005, hv3005f3, DP-46, DP-47, DP-58, DP-49, DP-50, DP-51, DP-53 y DP-54.
Producción de proteínas
Se pueden usar métodos estándares de ácido nucleico recombinante para expresar una proteína que se une a calicreína plasmática. Generalmente, se clona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína en un vector de ácido nucleico de expresión. Por supuesto, si la proteína incluye múltiples cadenas de polipéptidos, cada cadena se puede clonar en un vector de expresión, por ejemplo, los mismos vectores o diferentes, que se expresan en las mismas células o diferentes.
Producción de anticuerpos. Se pueden producir algunos anticuerpos, por ejemplo Fabs, en células bacterianas, por ejemplo, células de E. coli (véase por ejemplo, Nadkarni, A. et al., 2007 Protein Expr Purif 52(1 ):219-29). Por ejemplo, si el Fab se codifica por secuencias en un vector de presentación en fagos que incluye un codón de terminación supresible entre la entidad de presentación y una proteína de bacteriófago (o fragmento de la misma), el ácido nucleico del vector se puede transferir a una célula bacteriana que no puede suprimir un codón de terminación. En este caso, el Fab no se fusiona con la proteína del gen III y se secreta en el periplasma y/o medio.
Los anticuerpos también se pueden producir en células eucariotas. En una realización, los anticuerpos (por ejemplo, scFv) se expresan en una célula de levadura tal como Pichia (véanse, por ejemplo, Powers et al., 2001 , J. Immunol. Methods. 251 : 123-35; Schoonooghe S. et al, 2009 BMC Biotechnol. 9:70; Abdel-Salam, HA. et al, 2001 Appl Microbiol Biotechnol 56(1 -2): 157-64; Takahashi K. et al, 2000 Biosci Biotechnol Biochem 64(10):2138-44; Edqvist, J. et al., 1991 J Biotechnol 20(3):291 -300), Hanseula o Saccharomyces. Un experto en la técnica puede optimizar la producción de anticuerpos en levadura optimizando, por ejemplo, las condiciones de oxígeno (véanse, por ejemplo, Baumann K., et al. 2010 BMC Syst. Biol. 4: 141), osmolaridad (véase, por ejemplo, Dragosits, M. et al., 2010 BMC Genomics 11:207), temperatura (véase, por ejemplo, Dragosits, M. et al., 2009 J Proteome Res. 8(3): 1380-92), condiciones de fermentación (véase, por ejemplo, Ning, D. et al. 2005 J. Biochem. and Mol. Biol. 38(3): 294-299),
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cepa de levadura (véase, por ejemplo, Kozyr, AV et al. 2004 Mol Biol (Mosk) 38(6): 1067-75; Horwitz, AH. et al, 1988 Proc Natl Acad Sci U S A 85(22): 8678-82; Bowdish, K. et al. 1991 J Biol Chem 266(18): 11901-8), expresión en exceso de proteínas para potenciar la producción de anticuerpos (véase, por ejemplo, Gasser, B. et al., 2006 Biotechol. Bioeng. 94(2):353-61), nivel de acidez del cultivo (véase, por ejemplo, Kobayashi H., et al, 1997 FEMS Microbiol Lett 152(2):235-42), concentraciones de sustratos y/o iones (véase, por ejemplo, Ko JH. et al., 2996 Appl Biochem Biotechnol 60(1 ):41 - 8). Además, se pueden usar sistemas de levadura para producir anticuerpos con una semivida prolongada (véase, por ejemplo, Smith, BJ. et al. 2001 Bioconjug Chem 12(5):750-756),
En un caso preferido, los anticuerpos se producen en células de mamífero. Las células hospedadoras de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos de clon o fragmentos de unión al antígeno de los mismos incluyen ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador de selección de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601 621), líneas celulares linfocíticas, por ejemplo, células de mieloma NS0 y células SP2, células COS, células HEK 293T (J. Immunol. Methods (2004) 289(1-2):65-80), y una célula de un animal transgénico, por ejemplo, un mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial mamaria.
En algunos casos, se producen proteínas de unión a calicreína plasmática en un sistema de planta o libre de células (véase, por ejemplo, Galeffi, P., et al., 2006 J Transl Med 4:39).
Además de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el dominio de inmunoglobulina diversificado, los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de células hospedadoras en las que el vector se ha introducido (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, normalmente el gen marcador de selección confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospedadoras dhfr- con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para selección con G418).
En un sistema a modo de ejemplo para la expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo se introduce en células CHO dhfr- por transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de la cadena pesada y ligera del anticuerpo se unen cada uno operativamente a elementos reguladores potenciadores / promotores (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un elemento promotor del potenciador de CMV / regulador de AdMLP o un elemento regulador del potenciador de SV40 / promotor de AdMLP) para conducir altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando selección / amplificación con metotrexato. Se cultivan las células hospedadoras transformantes seleccionadas para permitir la expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo y se recupera anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se usan técnicas estándares de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, se pueden aislar algunos anticuerpos por cromatografía de afinidad con una matriz acoplada a proteína A o proteína G.
Para los anticuerpos que incluyen un dominio Fc, el sistema de producción de anticuerpos puede producir anticuerpos en los que está glucosilada la región Fc. Por ejemplo, el dominio Fc de moléculas de IgG está glucosilado en la asparagina 297 en el dominio CH2. Esta asparagina es el sitio para la modificación con oligosacáridos de tipo biantenario. Se ha demostrado que se requiere esta glucosilación para funciones efectoras mediadas por receptores de Fcg y el complemento C1q (Burton y Woof, 1992, Adv. Immunol. 51 : 1-84; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). En una realización, el dominio Fc se produce en un sistema de expresión de mamífero que glucosila apropiadamente el resto correspondiente a la asparagina 297. El dominio Fc también puede incluir otras modificaciones postraduccionales eucariotas.
También se pueden producir anticuerpos por un animal transgénico. Por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 5.849.992 describe un método de expresión de un anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero transgénico. Se construye un transgén que incluye un promotor específico de la leche y ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo de interés y una secuencia señal para la secreción. La leche producida por las hembras de dichos mamíferos transgénicos incluye, secretada en ella, el anticuerpo de interés. El anticuerpo se puede purificar de la leche, o para algunas aplicaciones, se usa directamente.
Caracterización de proteínas de unión a calicreína plasmática
CI50 (concentración inhibidora al 50 %) y CE50 (concentración eficaz al 50 %). Dentro de una serie o grupo de proteínas de unión, las que tienen menores valores de CI50 o CE50 se consideran inhibidores más potentes de calicreína plasmática que las proteínas de unión que tienen mayores valores de CI50 o CE50. Las proteínas de unión a modo de ejemplo tienen un valor de CI50 inferior a 800 nM, 400 nM, 100 nM, 25 nM, 5 nM o 1 nM, por ejemplo,
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como se mide en un ensayo in vitro para la inhibición de la actividad de calicreína plasmática cuando la calicreína plasmática es a 2 pM.
Las proteínas de unión a calicreína plasmática también se pueden caracterizar con referencia a la actividad de los eventos de señalización de factor XII y HMWK (cininógeno de alto peso molecular), por ejemplo, la producción de factor Xlla y/o bradiquinina.
Las proteínas de unión también se pueden evaluar para la selectividad hacia calicreína plasmática. Por ejemplo, se puede ensayar una proteína de unión a calicreína plasmática para su potencia hacia calicreína plasmática y se puede determinar un panel de calicreínas y un valor de CI50 o valor de CE50 para cada calicreína. En un caso, un compuesto que demuestra un bajo valor de CI50 o valor de CE50 para la calicreína plasmática, y un mayor valor de CI50 o valor de CE50, por ejemplo, al menos 2, 5 o 10 veces mayor, para otra calicreína dentro del panel de prueba se considera que es selectivo hacia calicreína plasmática.
Se puede realizar un estudio farmacocinético en rata, ratones o mono con proteínas de unión a calicreína plasmática para determinar la semivida de calicreína plasmática en el suero. Asimismo, el efecto de la proteína de unión se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal para una enfermedad (por ejemplo, edema inducido por carragenina en la pata trasera de la rata (Winter et al. Proc Soc Exp Biol Med. 1962;111:544-7)), para su uso como un terapéutico, por ejemplo, para tratar una enfermedad o afección descrita en el presente documento, por ejemplo, un trastorno asociado a calicreína plasmática.
Composiciones farmacéuticas
Se pueden usar las proteínas (por ejemplo, proteínas de unión) que se unen a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina) y, por ejemplo, incluyen al menos una región variable de inmunoglobulina en los métodos de tratamiento (o prevención) de una enfermedad o afección asociada a calicreína plasmática. Las proteínas de unión pueden estar presentes en una composición, por ejemplo, una composición farmacéuticamente aceptable o composición farmacéutica, que incluye una proteína de unión de calicreína plasmática, por ejemplo, una molécula de anticuerpo u otro polipéptido o péptido identificado que se une a calicreína plasmática, como se describe en el presente documento. La proteína de unión a calicreína plasmática se puede formular junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas incluyen composiciones terapéuticas y composiciones de diagnóstico, por ejemplo, composiciones que incluyen proteínas de unión a calicreína plasmática marcadas para la obtención de imágenes in vivo, y composiciones que incluyen proteínas de unión a calicreína plasmática marcadas para el tratamiento (o prevención) de una enfermedad asociada a calicreína plasmática.
Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión), aunque también se contemplan vehículos adecuados para inhalación y administración intranasal. Dependiendo de la vía de administración, la proteína de unión a calicreína plasmática se puede recubrir en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.
Una sal farmacéuticamente aceptable es una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al., 1977, J. Pharm. Sci. 66:1- 19). Ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso, y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de base incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína, y similares.
Las composiciones pueden estar en una variedad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como disoluciones líquidas (por ejemplo, disoluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma puede depender del modo de administración previsto y aplicación terapéutica. Muchas composiciones están en forma de disoluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las usadas para administración de seres humanos con anticuerpos. Un modo de administración a modo de ejemplo es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, la proteína de unión a calicreína plasmática se administra por inyección intramuscular o subcutánea.
Las expresiones "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", como se usan en el presente documento, significan modos de administración distintos de administración enteral y tópica, normalmente por
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inyección, e incluyen, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intrarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, e infusión.
La composición se puede formular como una disolución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de fármaco. Se pueden preparar disoluciones inyectables estériles incorporando la proteína de unión en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización que da un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración del mismo. La fluidez apropiada de una disolución se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión y usando tensioactivos. Se puede provocar la absorción prolongada de composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Se puede administrar una proteína de unión a calicreína plasmática mediante una variedad de métodos, aunque para muchas aplicaciones, la vía/modo de administración preferido es la inyección intravenosa o infusión. Por ejemplo, para aplicaciones terapéuticas, la proteína de unión a calicreína plasmática se puede administrar por infusión intravenosa a una tasa inferior a 30, 20, 10, 5 o 1 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m<2> o 7 a 25 mg/m<2>. La vía y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo se puede preparar con un vehículo que protegerá el compuesto contra la rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Están disponibles muchos métodos para la preparación de tales formulaciones. Véanse, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., 1978, Marcel Dekker, Inc., New York.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos. Por ejemplo, en un caso, una composición farmacéutica desvelada en el presente documento se puede administrar con un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, una bomba, o implante.
En ciertos casos, se puede formular una proteína de unión a calicreína plasmática para garantizar la apropiada distribución in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos desvelados en el presente documento crucen la BHE (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que son selectivamente transportados en células u órganos específicos, así potencian la administración de fármaco dirigida (véase, por ejemplo, V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685).
Las pautas posológicas se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar con el tiempo varias dosis divididas o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parentales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación puede venir impuesta por y directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la materia del mezclado de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Un intervalo no limitante a modo de ejemplo para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) desvelada en el presente documento es 0,1-20 mg/kg, más preferentemente 1 - 10 mg/kg. Se puede administrar un anticuerpo anti-calicreína plasmática, por ejemplo, por infusión intravenosa, por ejemplo, a una tasa de inferior a 30, 20, 10, 5 o 1 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m<2> o aproximadamente 5 a 30 mg/m<2>. Para proteínas de unión más pequeñas en peso molecular que un anticuerpo, las cantidades apropiadas pueden ser proporcionalmente inferiores. Los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección que va a aliviarse. Para un sujeto particular, se pueden ajustar pautas posológicas específicas con el tiempo según la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de una proteína de unión a calicreína plasmática desvelada en el presente documento. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a
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dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad de la proteína para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición es compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.
Una "dosificación terapéuticamente eficaz" modula preferentemente un parámetro medible, por ejemplo, niveles de anticuerpos IgG circulantes en un grado estadísticamente significativo o al menos aproximadamente 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente 60 %, y todavía más preferentemente en al menos aproximadamente 80 % con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para modular un parámetro medible, por ejemplo, un parámetro asociado a enfermedad, se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en trastornos y condiciones humanas, por ejemplo, una enfermedad asociada a calicreína plasmática. Alternativamente, esta propiedad de una composición se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto para modular un parámetro in vitro.
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, debido a que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en una fase más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz.
Estabilización y retención
En un caso, una proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora su estabilización y/o retención en circulación, por ejemplo, en sangre, suero, linfa, u otros tejidos, por ejemplo, en al menos 1,5, 2, 5, 10 o 50 veces. Por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática se puede asociar a un polímero, por ejemplo, un polímero sustancialmente no antigénico, tal como poli(óxidos de alquileno) o poli(óxidos de etileno). Los polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso. Se pueden usar los polímeros que tienen pesos moleculares promedios en número que varían desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 35.000 (o aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000, y 2.000 a aproximadamente 12.500). Por ejemplo, se puede conjugar una proteína de unión a calicreína plasmática con un polímero soluble en agua, por ejemplo, polímeros de polivinilo hidrófilos, por ejemplo, poli(alcohol vinílico) y polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de dichos polímeros incluye homopolímeros de poli(óxido de alquileno) tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos, y copolímeros de bloque de los mismos, a condición de que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque.
También se puede asociar una proteína de unión a calicreína plasmática a una proteína transportadora, por ejemplo, una albúmina de suero, tal como una albúmina de suero humano (véase, por ejemplo, Smith, BJ. et al., 2001 Bioconjug Chem 12(5): 750-756). Por ejemplo, se puede usar una fusión traduccional para asociar la proteína transportadora con la proteína de unión a calicreína plasmática.
También se puede modificar una proteína de unión a calicreína plasmática como un derivado de HESilación. Los procesos para la HESilación de una proteína de unión a calicreína plasmática utilizan hidroxietilalmidón para modificar la proteína. La HESilación de una proteína puede prolongar la semivida en circulación de la proteína y también reducir la eliminación renal.
Kits
Se puede proporcionar en un kit una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento, por ejemplo, como un componente de un kit. Por ejemplo, el kit incluye (a) una proteína de unión a calicreína plasmática, por ejemplo, una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que incluye una proteína de unión a calicreína plasmática, y, opcionalmente (b) material informativo. El material informativo puede ser material descriptivo, de instrucciones, de comercialización u otro material que se refiere a un método descrito en el presente documento y/o al uso de una proteína de unión a calicreína plasmática, por ejemplo, para un método descrito en el presente documento.
El material informativo del kit no se limita en su forma. En un caso, el material informativo puede incluir información sobre la producción del compuesto, peso molecular del compuesto, concentración, fecha de caducidad, información del lote o sitio de producción, etc. En un caso, el material informativo se refiere al uso de la proteína de unión para tratar, prevenir o diagnosticar trastornos y afecciones, por ejemplo, una enfermedad o afección asociada a calicreína plasmática.
En un caso, el material informativo puede incluir instrucciones para administrar una proteína de unión a calicreína plasmática en un modo adecuado para realizar los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, en una dosis adecuada, forma farmacéutica o modo de administración (por ejemplo, una dosis, forma farmacéutica o modo de administración descrito en el presente documento). En otro caso, el material informativo puede incluir instrucciones para administrar una proteína de unión a calicreína plasmática a un sujeto adecuado, por ejemplo, un humano, por ejemplo, un humano que tiene, o en riesgo de, un trastorno o afección descrito en el presente documento, por ejemplo, una enfermedad o afección asociada a calicreína plasmática. Por ejemplo, el material
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puede incluir instrucciones para administrar una proteína de unión a calicreína plasmática a un paciente con un trastorno o afección descrito en el presente documento, por ejemplo, una enfermedad asociada a calicreína plasmática. El material informativo de los kits no se limita en su forma. En muchos casos, el material informativo, por ejemplo, instrucciones, se proporciona en formato impreso, pero también puede estar en otros formatos, tales como material legible por ordenador.
Se puede proporcionar una proteína de unión a calicreína plasmática en cualquier forma, por ejemplo, forma líquida, seca o liofilizada. Se prefiere que una proteína de unión a calicreína plasmática esté sustancialmente pura y/o estéril. Cuando una proteína de unión a calicreína plasmática se proporciona en una disolución líquida, la disolución líquida es preferentemente una disolución acuosa, prefiriéndose una disolución acuosa estéril. Cuando una proteína de unión a calicreína plasmática se proporciona como forma seca, la reconstitución es generalmente mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente, por ejemplo, agua estéril o tampón, se puede proporcionar opcionalmente en el kit.
El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición que contiene una proteína de unión a calicreína plasmática. En algunos casos, el kit contiene recipientes separados, divisores o compartimentos para la composición y material informativo. Por ejemplo, la composición puede estar contenida en una botella, vial o jeringa, y el material informativo puede estar contenido en asociación con el recipiente. En otras realizaciones, los elementos separados del kit están contenidos dentro de un único recipiente sin dividir. Por ejemplo, la composición está contenida en una botella, vial o jeringa que tiene unida a la misma el material informativo en forma de una etiqueta. En algunos casos, el kit incluye una pluralidad (por ejemplo, un envase) de recipientes individuales, conteniendo cada uno una o más formas farmacéuticas unitarias (por ejemplo, una forma farmacéutica descrita en el presente documento) de una proteína de unión a calicreína plasmática. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de jeringas, ampollas, envases de lámina o envases alveolados, conteniendo cada uno una dosis unitaria única de una proteína de unión a calicreína plasmática. Los recipientes de los kits pueden ser impermeables al aire, resistentes al agua (por ejemplo, impermeables a cambios en la humedad o evaporación) y/u opacos a la luz.
El kit incluye opcionalmente un dispositivo adecuado para administración de la composición, por ejemplo, una jeringa, inhalante, cuentagotas (por ejemplo, cuentagotas para los ojos), hisopo (por ejemplo, un hisopo de algodón o hisopo de madera), o cualquiera de dicho dispositivo de administración. En un caso, el dispositivo es un dispositivo implantable que dispensa dosis medidas de la proteína de unión. La divulgación también caracteriza un método para proporcionar un kit, por ejemplo, combinando los componentes descritos en el presente documento.
Tratamientos
Las proteínas que se unen a calicreína plasmática, por ejemplo, como se describen en el presente documento, tienen utilidades terapéuticas y profilácticas, particularmente en sujetos humanos. Estas proteínas de unión se administran a un sujeto para tratar, prevenir y/o diagnosticar una variedad de trastornos y afecciones, que incluyen, por ejemplo, una enfermedad asociada a calicreína plasmática, o incluso a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo. Por ejemplo, estas proteínas de unión se pueden usar para modificar los efectos de la calicreína plasmática liberada de células en cultivo (Lilla et al., J Biol Chem. 284(20): 13792-13803 (2009)). El tratamiento incluye administrar una cantidad eficaz para aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, corregir o afectar el trastorno, los síntomas del trastorno o la predisposición hacia el trastorno. El tratamiento también puede retardar la aparición, por ejemplo, prevenir la aparición, o prevenir el deterioro de una enfermedad o afección.
Como se usa en el presente documento, una cantidad de un agente de unión diana eficaz para prevenir un trastorno, o una cantidad profilácticamente eficaz del agente de unión, se refiere a una cantidad de un agente de unión diana, por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática, por ejemplo, un anticuerpo anti-calicreína plasmática descrito en el presente documento, que es eficaz, tras la administración de dosis única o múltiple al sujeto, para prevenir o retrasar el hecho de la aparición o reaparición de un trastorno, por ejemplo, un trastorno descrito en el presente documento, por ejemplo, una enfermedad asociada a calicreína plasmática.
Los métodos de administración de proteínas de unión a calicreína plasmática y otros agentes también se describen en "Composiciones farmacéuticas". Las dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas pueden depender de la edad y peso del sujeto y el fármaco particular usado. Las proteínas de unión se pueden usar como agentes competitivos para inhibir, reducir una interacción no deseable, por ejemplo, entre calicreína plasmática y su sustrato (por ejemplo, factor XII o HMWK). La dosis de la proteína de unión a calicreína plasmática puede ser la cantidad suficiente para bloquear 90 %, 95 %, 99 % o 99,9 % de la actividad de calicreína plasmática en el paciente, especialmente en el sitio de enfermedad. Dependiendo de la enfermedad, esto puede requerir 0,1, 1,0, 3,0, 6,0 o 10,0 mg/kg. Para una IgG que tiene una masa molecular de 150.000 g/mol (dos sitios de unión), estas dosis corresponden a aproximadamente 18 nM, 180 nM, 540 nM, 1,08 pM y 1,8 pM de sitios de unión para un volumen de 5 l de sangre.
En una realización, las proteínas de unión a calicreína plasmática se usan para inhibir una actividad (por ejemplo, inhiben al menos una actividad de calicreína plasmática, por ejemplo, reducen la producción de factor XlIa y/o bradiquinina) de calicreína plasmática, por ejemplo, in vivo. Las proteínas de unión se pueden usar por sí mismas o conjugadas a un agente, por ejemplo, un fármaco citotóxico, enzima de citotoxina, o radioisótopo. Este método
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incluye: administrar la proteína de unión sola o unida a un agente (por ejemplo, un fármaco citotóxico), a un sujeto que requiere tal tratamiento. Por ejemplo, se pueden usar las proteínas de unión a calicreína plasmática que no inhiben sustancialmente la calicreína plasmática para administrar nanopartículas que contienen agentes, tales como toxinas, a células o tejidos asociados a calicreína plasmática, por ejemplo, para tratar un trastorno asociado a calicreína plasmática.
Debido a que las proteínas de unión a calicreína plasmática reconocen las células que expresan calicreína plasmática y pueden unirse a células que están asociadas con (por ejemplo, en proximidad de o entremezcladas con) un trastorno o afección asociado a calicreína plasmática, las proteínas de unión a calicreína plasmática se pueden usar para inhibir una actividad (por ejemplo, inhibir al menos una actividad de calicreína plasmática, por ejemplo, reducir la producción de factor XIIa y/o bradiquinina) de cualquiera de dichas células e inhibir la enfermedad asociada a calicreína plasmática. El reducir la actividad de calicreína plasmática puede inhibir indirectamente células que pueden ser dependientes de la actividad de calicreína plasmática para el desarrollo y/o la progresión de un trastorno asociado a calicreína plasmática.
Las proteínas de unión se pueden usar para administrar un agente (por ejemplo, cualquiera de una variedad de fármacos citotóxicos y terapéuticos) a células y tejidos donde está presente la calicreína plasmática. Los agentes a modo de ejemplo incluyen un compuesto que emite radiación, moléculas de plantas, origen fúngico o bacteriano, proteínas biológicas, y sus mezclas. Los fármacos citotóxicos pueden ser fármacos citotóxicos que actúan intracelularmente, tales como toxinas, emisores de radiación de intervalo corto, por ejemplo, emisores a de alta energía de intervalo corto.
Para dirigir células que expresan calicreína plasmática, se puede usar un sistema de profármaco. Por ejemplo, se conjuga una primera proteína de unión con un profármaco que se activa solo cuando está en estrecha proximidad con un activador de profármaco. El activador de profármaco se conjuga con una segunda proteína de unión, preferentemente una que se une a un sitio no competidor en la molécula diana. Si se unen dos proteínas de unión a sitios de unión competidores o no competidores, se puede determinar por ensayos de unión competitiva convencionales. Los pares de fármaco-profármaco a modo de ejemplo se describen en Blakely et al., (1996) Cancer Research, 56:3287 3292.
Las proteínas de unión a calicreína plasmática se pueden usar directamente in vivo para eliminar las células que expresan antígeno mediante citotoxicidad natural dependiente de complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Las proteínas de unión descritas en el presente documento pueden incluir el dominio efector de unión al complemento, tal como las porciones Fc de IgG1, -2, o -3 o correspondientes a las porciones de IgM que se unen al complemente. En un caso, una población de células diana se trata ex vivo con un agente de unión descrito en el presente documento y células efectoras apropiadas. El tratamiento puede ser complementado mediante la adición de complemento o suero que contiene complemento. Además, se puede mejorar la fagocitosis de células diana recubiertas con una proteína de unión descrita en el presente documento uniendo proteínas del complemento. En otro caso, células diana recubiertas con la proteína de unión que incluye un dominio efector de unión al complemento se lisan por el complemento.
Los métodos de administración de proteínas de unión a calicreína plasmática se describen en "Composiciones farmacéuticas". Las dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y peso del sujeto y el fármaco particular usado. Las proteínas de unión se pueden usar como agentes competitivos para inhibir o reducir una interacción no deseable, por ejemplo, entre un agente natural o patológico y la calicreína plasmática.
La proteína de unión a calicreína plasmática se puede usar para administrar macro y micromoléculas, por ejemplo, un gen en la célula para fines de terapia génica en el endotelio o epitelio y dirigir solo los tejidos que expresan la calicreína plasmática. Las proteínas de unión se pueden usar para administrar una variedad de fármacos citotóxicos que incluyen fármacos terapéuticos, un compuesto que emite radiación, moléculas de plantas, origen fúngico o bacteriano, proteínas biológicas y sus mezclas. Los fármacos citotóxicos pueden ser fármacos citotóxicos que actúan intracelularmente, tales como emisores de radiación de intervalo corto, que incluyen, por ejemplo, emisores a de alta energía de corto intervalo, como se describen en el presente documento.
En el caso de toxinas de polipéptido, se pueden usar técnicas de ácido nucleico recombinante para construir un ácido nucleico que codifica la proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo) y la citotoxina (o un componente de polipéptido de la misma) como fusiones traduccionales. El ácido nucleico recombinante se expresa entonces, por ejemplo, en células y se aísla el polipéptido de fusión codificado.
Alternativamente, la proteína de unión a calicreína plasmática se puede acoplar a emisores de radiación de alta energía, por ejemplo, un radioisótopo, tal como 131I, un emisor y que, cuando se localiza en un sitio, da como resultado una destrucción de varios diámetros celulares. Véase, por ejemplo, S.E. Order, "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al. (eds.), pp 303 316 (Academic Press 1985). O radioisótopos adecuados incluyen emisores a, tales como 212Bi, 213Bi y 211At, y emisores b, tales como 186Re y 90Y. Además, también se puede usar 177Lu como tanto un agente de obtención de imágenes como citotóxico.
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La radioinmunoterapia (RIT) usando anticuerpos marcados con 131I, 90Y y 177Lu está en intensa investigación clínica. Existen diferencias significativas en las características físicas de estos tres núclidos y, como resultado, la elección del radionúclido es muy crítica con el fin de administrar la máxima dosis de radiación a un tejido de interés. Las partículas de mayor energía beta de 90Y pueden ser buenas para los tumores de gran masa. Las partículas de energía beta relativamente baja de 131I son ideales, pero in vivo la deshalogenación de moléculas radioyodadas es una desventaja importante para la internalización del anticuerpo. A diferencia, 177Lu tiene partícula beta de baja energía con solo el intervalo de 0,2-0,3 mm y suministra dosis de mucha menos radiación a la médula ósea en comparación con 90Y. Además, debido a la semivida física más larga (en comparación con 90Y), los tiempos de residencia son mayores. Como resultado, se pueden administrar mayores actividades (más cantidades de mCi) de agentes marcados con 177Lu con dosis de comparativamente menos radiación a la médula ósea. Ha habido varios estudios clínicos que investigan el uso de anticuerpos marcados con 177Lu en el tratamiento de diversos cánceres. (Mulligan T et al., 1995, Clin. Canc. Res. 1: 1447-1454; Meredith RF, et al., 1996, J. Nucl. Med. 37:1491-1496; Alvarez RD, et al., 1997, Gynecol. Oncol. 65:94-101).
Enfermedades y afecciones a modo de ejemplo
Una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento es útil para tratar (o prevenir) una enfermedad o afección en la que la actividad de calicreína plasmática participa, por ejemplo, en una enfermedad o afección descrita en el presente documento, o para tratar (o prevenir) uno o más síntomas asociados a la misma. En algunos casos, la proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática que se une a IgG o Fab) inhibe la actividad de calicreína plasmática.
Los ejemplos de tales enfermedades y afecciones que se puede tratar (o prevenir) por una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento incluyen: artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico y lesión por quemadura. Una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento también se puede usar para promover la cicatrización. Una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento también se puede usar como tratamiento de oncología por mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, bloqueo de la producción de bradiquinina pro-angiogénica.
Se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene un trastorno en el que participa la actividad de calicreína plasmática, tratando así (por ejemplo, mejorando o corrigiendo un síntoma o característica de un trastorno, ralentizando, estabilizando y/o deteniendo la progresión de la enfermedad) el trastorno.
La proteína de unión a calicreína plasmática se puede administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática es la cantidad que es eficaz, tras la administración de dosis únicas o múltiples a un sujeto, en tratar un sujeto, por ejemplo, curar, aliviar, mitigar o mejorar al menos un síntoma de un trastorno en un sujeto a un grado más allá del esperado en ausencia de tal tratamiento. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del compuesto para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición es compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una dosificación terapéuticamente eficaz modula preferentemente un parámetro medible, favorablemente, con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para afectar (por ejemplo, inhibir) un parámetro medible se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en un trastorno humano.
Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se pueden administrar un único bolo, se pueden administrar con el tiempo varias dosis divididas o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parentales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.
Artritis reumatoide
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica autoinmunitaria que causa la inflamación de las articulaciones y dolor y normalmente da como resultado la destrucción de las articulaciones. La AR generalmente sigue una evolución recidivante/remitente, con "crisis" de actividad de la enfermedad intercaladas con remisiones de los síntomas de la enfermedad. La AR se asocia con varios trastornos inflamatorios adicionales, que incluyen
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síndrome de Sjogren (sequedad de los ojos y de la boca causada por inflamación de las glándulas lacrimales y salivares), pleuritis (inflamación de la pleura que causa dolor al respirar profundo y toser), nódulos reumatoides (sitios nodulares de inflamación que se desarrollan dentro de los pulmones), pericarditis (inflamación del pericardio que causa dolor al recostarse o inclinarse hacia adelante), síndrome de Felty (esplenomegalia y leucopenia observadas conjuntamente con AR, que hace que el sujeto sea propenso a infección) y vasculitis (una inflamación de los vasos sanguíneos que puede bloquear la circulación sanguínea). La calicreína plasmática participa en la artritis reumatoide.
Los síntomas de la AR activa incluyen fatiga, falta de apetito, febrícula, dolores musculares y articulares, y rigidez. La rigidez muscular y articular son normalmente más notables por la mañana y después de periodos de inactividad. Durante las crisis, las articulaciones se vuelven frecuentemente rojas, hinchadas, dolorosas y sensibles, generalmente como consecuencia de sinovitis.
El tratamiento para la artritis reumatoide implica una combinación de medicaciones, descanso, ejercicios de estiramiento articular y protección articular. Se usan dos clases de medicaciones en el tratamiento de la artritis reumatoide: "fármacos de primera línea" antiinflamatorios y "fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad" (FARME). Los fármacos de primera línea incluyen AINE (por ejemplo, aspirina, naproxeno, ibuprofeno y etodolaco) y cortisona (corticosteroides). Los FARME, tales como el oro (por ejemplo, sales de oro, tioglucosa de oro, tiomalato de oro, oro oral), metotrexato, sulfasalazina, D-penicilamina, azatioprina, ciclofosfamida, clorambucilo y ciclosporina, leflunomida, etanercept, infliximab, anakinra y adalimumab, e hidroxicloroquina, promueven la remisión de la enfermedad y previenen la destrucción articular progresiva, pero no son agentes antiinflamatorios.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, estabilización o eliminación de uno o más síntomas o mejora o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de AR) de la artritis reumatoide administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene AR. Se proporcionan además métodos de tratamiento de AR administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, con al menos un "fármaco de primera línea" antiinflamatorio (por ejemplo, un AINE y/o cortisona) y/o un FARME. La divulgación también proporciona métodos de prevención de artritis reumatoide o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar AR (por ejemplo, un sujeto que tiene un miembro de su familia con AR o una predisposición genética a la misma).
Se proporcionan además métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, estabilización o eliminación de uno o más síntomas) de los trastornos asociados a la artritis reumatoide (síndrome de Sjogren, pleuritis, nódulos reumatoides pulmonares, pericarditis, síndrome de Felty y vasculitis) administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene AR.
Las escalas útiles para evaluar la AR y los síntomas de la AR incluyen, por ejemplo, la escala de gravedad de la artritis reumatoide (RASS; Bardwell et al., (2002) Rheumatology 41(1):38-45), el índice de salud específico de artritis SF-36 (ASHI; Ware et al., (1999) Med. Care. 37(5 Suppl):MS40-50), las escalas de medición del impacto de la artritis o las escalas de medición del impacto de la artritis 2 (AIMS o AIMS2; Meenan et al. (1992) Arthritis Rheum. 35(1 ):1- 10); el cuestionario de evaluación de la salud de Stanford (HAQ), HAQII, o HAQ modificado (véase, por ejemplo, Pincus et al. (1983) Arthritis Rheum. 26(11):1346-53).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de artritis reumatoide, tales como artritis inducida por colágeno (CIA), que se induce, normalmente en roedores, por inmunización con colágeno de tipo II autólogo o heterólogo en adyuvante (Williams et al. Methods Mol Med. 98:207-16 (2004)).
Gota
La gota es una afección que resulta de cristales de ácido úrico que se depositan en los tejidos del cuerpo. La gota se caracteriza por una sobrecarga de ácido úrico en el cuerpo y ataques recurrentes de inflamación articular (artritis). La gota crónica puede conducir a depósitos de coágulos duros de ácido úrico en y alrededor de las articulaciones, función renal reducida y cálculos renales. La gota se relaciona frecuentemente con una anomalía heredada en la capacidad del cuerpo para procesar el ácido úrico. El ácido úrico es un producto de descomposición de las purinas, que son parte de muchos alimentos. Una anomalía en la manipulación del ácido úrico puede causar ataques de artritis dolorosa (ataque de gota), cálculos renales y bloque de los túbulos filtradores del riñón con cristales de ácido úrico, que conducen a insuficiencia renal. Algunos pacientes pueden solo desarrollar elevados niveles de ácido úrico en sangre (hiperuricemia) sin tener artritis o problemas renales.
Los síntomas de la gota incluyen, por ejemplo, dolor insoportable e inesperado, inflamación, rojez, calor y rigidez en el pie afectado u otras partes del cuerpo, y febrícula.
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Los tratamientos para la gota incluyen, por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), colchicina y glucocorticoides orales, glucocorticoides intrarticulares administrados por una inyección articular, inhibidores de xantina oxidasa (por ejemplo, alopurinol, febuxostat), uricosúricos (por ejemplo, probenecid, EDTA), urato oxidasas (por ejemplo, pegloticasa), bicarbonato sódico y dieta pobre en purinas.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, estabilización o eliminación de uno o más síntomas o el empeoramiento de) de la gota administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene gota. Se proporcionan además métodos de tratamiento de la gota administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, un AINE, una colchicina, un glucocorticoide oral, un glucocorticoide intrarticular administrado mediante una inyección articular, un inhibidor de xantina oxidasa (por ejemplo, alopurinol, febuxostat), un uricosúrico (por ejemplo, probenecid, EDTA), una urato oxidasa (por ejemplo, pegloticasa), bicarbonato sódico y/o dieta pobre en purinas. La divulgación también proporciona métodos de prevención de la gota o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar gota (por ejemplo, un sujeto que tiene un miembro de su familia con gota o una predisposición genética a la misma).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de gota, véase, por ejemplo, Reginato y Olsen, Curr Opin Rheumatol. 19(2): 134-45 (2007) y referencias citadas en su interior.
Enfermedad intestinal (EII)
La enfermedad inflamatoria del intestino (EII) es un grupo de afecciones inflamatorias del intestino grueso y, en algunos casos, el intestino delgado. Las principales formas de la EII son la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (CU). Están otras formas de EII que representan muchos menos casos: colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis por exclusión, síndrome de Behget, colitis infecciosa y colitis indeterminada. La principal diferencia entre la enfermedad de Crohn y la CU es la localización y la naturaleza de los cambios inflamatorios. La enfermedad de Crohn puede afectar cualquier parte del tubo gastrointestinal, desde la boca hasta el ano (lesiones salteadas), aunque la mayoría de los casos empiezan en el íleon terminal. La colitis ulcerosa, a diferencia, está restringida al colon y el recto. Microscópicamente, la colitis ulcerosa está restringida a la mucosa (revestimiento epitelial del intestino), mientras que la enfermedad de Crohn afecta toda la pared intestinal. Finalmente, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa están presentes con manifestaciones extraintestinales (tales como problemas del hígado, artritis, manifestaciones de la piel y problemas oculares) en diferentes proporciones.
Los síntomas de EII incluyen dolor abdominal, vómitos, diarrea, rectorragia, pérdida de peso, aumento de peso y diversas molestias o enfermedades asociadas (artritis, pioderma gangrenosa, colangitis esclerosante primaria). El diagnóstico generalmente es por colonoscopia con biopsia de lesiones patológicas. Raramente se puede hacer un diagnóstico definitivo o de enfermedad de Crohn o de colitis ulcerosa debido a idiosincrasias en la presentación. En este caso, se puede hacer un diagnóstico de colitis indeterminada.
El tratamiento para EII, dependiendo del nivel de gravedad, puede requerir inmunosupresión para controlar los síntomas. Se pueden usar inmunosupresores tales como azatioprina, metotrexato o 6-mercaptopurina. Más comúnmente, el tratamiento de EII requiere una forma de mesalamina. Frecuentemente, se usan esteroides para controlar las crisis de la enfermedad y fueron una vez aceptables como fármaco de mantenimiento. Se han usado biológicos, tales como infliximab, para tratar pacientes con enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. Casos graves pueden requerir cirugía, tal como resección intestinal, estricturoplastia o una colostomía o ileostomía temporal o permanente. Los tratamientos médicos alternativos para EII existen en diversas formas, sin embargo, tales métodos se concentran en controlar la patología subyacente con el fin de evitar exposición esteroidea prolongada o extirpación quirúrgica. Normalmente, el tratamiento empieza administrando fármacos, tales como prednisona, con efectos antiinflamatorios altos. Una vez se controla satisfactoriamente la inflamación, el paciente se cambia normalmente a un fármaco más ligero, tal como asacol -una mesalamina- para mantener la enfermedad en remisión. Si no es satisfactorio, se puede o no puede administrar una combinación de los fármacos inmunosupresores anteriormente mencionados con una mesalamina (que también puede tener un efecto antiinflamatorio), dependiendo del paciente.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, estabilización o eliminación de uno o más síntomas de) de EII administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene EII. Se proporcionan además métodos de tratamiento de EII administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, un inmunosupresor (por ejemplo, azatioprina, metotrexato, 6- mercaptopurina), una mesalamina, un esteroide y/o infliximab. La divulgación también proporciona métodos de prevención de EII o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en
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riesgo de desarrollar EII (por ejemplo, un sujeto que tiene un miembro de su familia con EII o una predisposición genética a la misma).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de EII, véanse, por ejemplo, aquellos descritos en la patente de EE.UU. N° 6.114.382, documento WO 2004/071186, y referencias citadas en su interior.
Mucositis oral
La mucositis oral es la inflamación dolorosa y ulceración de las membranas mucosas en la boca, normalmente como un efecto adverso del tratamiento de quimioterapia y radioterapia para el cáncer.
Los síntomas de la mucositis oral incluyen, por ejemplo, úlceras, eritema periférico, sensación de ardor acompañada por enrojecimiento, dificultad para habla, comer, o incluso abrir la boca, y disgeusia (alteración en la percepción del sabor).
El tratamiento para la mucositis oral incluye higiene bucal (enjuague bucal con sal, GELCLAIR®, CAPHOSOL®, MUGARD®), palifermina (un factor de crecimiento de queratinocitos humano), citocinas y otros modificadores de la inflamación (por ejemplo, IL-1, IL-11, TGF-beta3), complementación de aminoácidos (por ejemplo, glutamina), vitaminas, factores estimulantes de colonias, crioterapia y terapia con láser.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, reducción o eliminación de uno o más síntomas, o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de mucositis) de la mucositis oral administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene mucositis oral. Se proporcionan además métodos de tratamiento de mucositis oral administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, higiene bucal (enjuague bucal con sal, GELCLAIR®, CAPHOSOL®, MUGARD®), palifermina (un factor de crecimiento de queratinocitos humano), una citocina y/o un modificador de la inflamación (por ejemplo, IL-1, IL-11, TGF-beta3), una complementación de aminoácidos (por ejemplo, glutamina), una vitamina, un factor estimulante de colonias, crioterapia y terapia con láser. La divulgación también proporciona métodos de prevención de mucositis oral o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar mucositis oral (por ejemplo, un sujeto que ha recibido o está recibiendo quimioterapia o radioterapia).
Las escalas útiles para evaluar la mucositis oral incluyen la puntuación de toxicidad oral de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Handbook for reporting results of cancer treatment. Geneva, Switzerland: World Health Organization; 1979:15-22), los criterios de toxicidad común del Instituto Nacional del Cáncer (NCI-CTC) para mucositis oral (Criterios de toxicidad común del Instituto Nacional del Cáncer. Versión 2.0, 1 de junio de 1999, Sonis et al., Cancer. 85:2103-2113 (1999)) y la escala de evaluación de mucositis oral (OMAS).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de mucositis oral, tales como un modelo animal de oral mucositis inducida por un régimen de acondicionamiento de trasplante de células madre hematopoyéticas (Chen et al., Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 42(11):672-6 (2007)).
Dolor neuropático
El dolor neuropático es un estado de dolor crónico complejo que normalmente va acompañado por lesión de tejido. Con el dolor neuropático, las propias fibras nerviosas se pueden dañar, ser disfuncionales o lesionar. Estas fibras nerviosas dañadas envían señales incorrectas a otros centros de dolor. El impacto de la lesión de las fibras nerviosas incluye un cambio en la función nerviosa tanto en el sitio de lesión como las áreas alrededor de la lesión.
Los síntomas de dolor neuropático incluyen, por ejemplo, dolor fulgurante y de ardor y hormigueo y entumecimiento.
Los tratamientos para el dolor neuropático incluyen, por ejemplo, medicaciones (por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (por ejemplo, ALEVE®, MOTRIN®, o morfina), fármacos anticonvulsivos y antidepresivos) y dispositivos invasivos o implantables (por ejemplo, estimulación eléctrica).
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, reducción o eliminación de uno o más síntomas o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de dolor) de dolor neuropático administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene dolor neuropático. Se proporcionan además métodos de tratamiento de dolor neuropático administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, un tratamiento no quirúrgico ((por ejemplo, un fármaco
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antiinflamatorio no esteroideo (AINE) (por ejemplo, ALEVE®, MOTRIN®, o morfina), un anticonvulsivo y/o un fármaco antidepresivo) y/o un dispositivo invasivo o implantable (por ejemplo, estimulación eléctrica). La divulgación también proporciona métodos de prevención de dolor neuropático o un síntoma del mismo administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar dolor neuropático (por ejemplo, un sujeto que ha sufrido una lesión de tejido).
Las escalas útiles para la evaluación del dolor neuropático incluyen, por ejemplo, la escala de clasificación del dolor de Wong-Baker FACES (Fundación de la escala de clasificación del dolor Wong-Baker FACES), la escala analógica visual (VAS) (Huskisson, J. Rheumatol. 9 (5): 768-9 (1982)), el cuestionario de dolor de McGill (MPQ) (Melzack, dolor 1 (3): 277-99 (1975)), la escala diferencial del descriptores (DDS) (Gracely y Kwilosz, Pain 35 (3): 279-88 (1988)), la escala de dolor de Faces - revisada (FPS-R) (Hicks et al., Pain 93 (2): 173-83 (2001)), el cuadro numérico de 11 puntos (BS-11) (Jensen et al., Clin J Pain 5 (2): 153-9 (1989)), la escala de clasificación numérica (NRS-11) (Hartrick et al., Pain Pract 3 (4): 310-6 (2003)), el índice de dolor con dolorímetro (DPI) (Hardy et al., (1952). Pain Sensations and Reactions. Baltimore: The Williams & Wilkins Co.) y el inventario breve del dolor (BPI) (Cleeland and Ryan Ann. Acad. Med. Singap. 23 (2): 129-38 (1994)).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de dolor neuropático, véanse, por ejemplo, aquellos descritos en Martin et al., Methods Mol Med. 84:233-42 (2003) y referencias citadas en su interior.
Dolor inflamatorio
El dolor inflamatorio se causa por un ataque tal como heridas por penetración, quemaduras, frío extremo, fracturas, artritis, afecciones autoinmunitarias, estiramiento excesivo, infecciones y vasoconstricción hasta la integridad de tejidos a un nivel celular. Durante la inflamación, una compleja interacción neuro-inmunitaria da como resultado la hiperalgesia primaria, en la que un gran intervalo de moléculas inflamatorias que incluyen prostaglandinas y bradiquinina inducen y mantienen la sensibilidad nociceptora alterada.
Los tratamientos para el dolor inflamatorio incluyen, por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideo (AINE) y corticosteroides.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, reducción o eliminación de uno o más síntomas de) de dolor inflamatorio administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene dolor inflamatorio. Se proporcionan además métodos de tratamiento de dolor inflamatorio administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) y/o un corticosteroide. La divulgación también proporciona métodos de prevención de dolor inflamatorio o un síntoma del mismo administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar dolor inflamatorio (por ejemplo, un sujeto que ha experimentado un ataque, por ejemplo, tal como una herida por penetración, una quemadura, frío extremo, una fractura, artritis, una afección autoinmunitaria, estiramiento excesivo o infección).
Las escalas útiles para la evaluación de dolor inflamatorio incluyen, por ejemplo, la escala de clasificación del dolor de Wong-Baker FACES (Wong-Baker FACES Pain Rating Scale Foundación), la escala analógica visual (VAS) (Huskisson, J. Rheumatol. 9 (5): 768-9 (1982)), el cuestionario de dolor de McGill (MPQ) (Melzack, Pain 1 (3): 27799 (1975)), la escala diferencial del descriptores (DDS) (Gracely y Kwilosz, Pain 35 (3): 279-88 (1988)), la escala de dolor de Faces - revisada (FPS-R) (Hicks et al., Pain 93 (2): 173-83 (2001)), cuadro numérico de 11 puntos (BS-11) (Jensen et al., Clin J Pain 5 (2): 153-9 (1989)), la escala de clasificación numérica (NRS-11) (Hartrick et al., Pain Pract 3 (4): 310-6 (2003)), el índice de dolor con dolorímetro (DPI) (Hardy et al., (1952). Pain Sensations and Reactions. Baltimore: The Williams & Wilkins Co.) y el inventario breve del dolor (BPI) (Cleeland and Ryan Ann. Acad. Med. Singap. 23 (2): 129-38 (1994)).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de dolor inflamatorio tal como un modelo animal de dolor inflamatorio crónico (Wilson et al., Eur J Pain. 10(6):537-49 (2006)) y un modelo de dolor inflamatorio e hiperalgesia (Ren y Dubner, ILAR J. 40(3):111-118 (1999)).
Estenosis del conducto vertebral
La estenosis del conducto vertebral es una afección médica en la que el conducto vertebral estrecha y comprime la médula espinal y los nervios. Esto es normalmente debido a la común manifestación de la degeneración espinal que ocurre con el envejecimiento. También se puede causar algunas veces por hernia de disco espinal, osteoporosis o un tumor. La estenosis del conducto vertebral puede afectar la columna cervical, torácica o lumbar. En algunos casos, puede estar presentes en los tres sitios en el mismo paciente.
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Los síntomas de la estenosis del conducto vertebral incluyen, por ejemplo, dolor o calambre en las piernas, dolor irradiado de espalda y cadera, dolor en el cuello y los hombros, pérdida de equilibrio y pérdida de la función o de la vejiga (síndrome de la cola de caballo).
Los tratamientos para la estenosis del conducto vertebral incluyen, por ejemplo, tratamientos no quirúrgicos (por ejemplo, terapia física, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (por ejemplo, aspirina, ibuprofeno e indometacina), analgésicos (por ejemplo, acetaminofeno), sulfato de condroitina, glucosamina, reposo o actividad restringida, ortesis dorsal o corsé, inyecciones epidurales de esteroides (por ejemplo, corticosteroide)) y cirugía (por ejemplo, laminectomía descompresiva, laminectomía y fusión).
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, reducción o eliminación de uno o más síntomas de) de la estenosis del conducto vertebral administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene estenosis del conducto vertebral. Se proporcionan además métodos de tratamiento de la estenosis del conducto vertebral administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, un tratamiento no quirúrgico (por ejemplo, terapia física y/o un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) (por ejemplo, aspirina, ibuprofeno o indometacina), un analgésico (por ejemplo, acetaminofeno), sulfato de condroitina, glucosamina, reposo o actividad restringida, una ortesis dorsal o corsé, una inyección epidural de esteroides (por ejemplo, corticosteroide) y/o cirugía (por ejemplo, laminectomía descompresiva, laminectomía y/o fusión). La divulgación también proporciona métodos de prevención de la estenosis del conducto vertebral o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar la estenosis del conducto vertebral (por ejemplo, un sujeto que tiene degeneración espinal).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de estenosis del conducto vertebral, tales como un modelo de estenosis lumbar del conducto vertebral (Sekiguchi et al., Spine 29, 1105-1111 (2004)).
Trombosis arterial y venosa
La trombosis arterial es la formación de un trombo dentro de una arteria. En la mayoría de los casos, la trombosis arterial sigue a ruptura del ateroma, y se denomina, por tanto, aterotrombosis.
La trombosis arterial está asociada con varios trastornos, que incluye accidente cerebrovascular e infarto de miocardio. En el accidente cerebrovascular trombótico, se forma un trombo (coágulo de sangre) normalmente alrededor de placas ateroscleróticas. Puesto que el bloqueo de la arteria es gradual, la aparición de accidentes cerebrovasculares trombóticos sintomáticos es más lenta. El accidente cerebrovascular trombótico se puede dividir en dos categorías - enfermedad de vasos grandes y enfermedad de vasos pequeños. La primera afecta vasos tales como las carótidas internas, vertebral y el polígono de Willis. La última puede afectar a vasos más pequeños tales como las ramificaciones del polígono de Willis. El infarto de miocardio (IM) se causa por un infarto (muerte de tejido debido a isquemia), frecuentemente debido a la obstrucción de la arteria coronaria por un trombo. El IM puede llegar rápidamente a ser mortal su no se recibe rápidamente tratamiento médico de urgencias.
La trombosis venosa es un coágulo de sangre que se forma dentro de una vena. Si se rompe un trozo de un coágulo de sangre formado en una vena, se puede transportar al lado derecho del corazón, y desde allí a los pulmones. Un trozo de trombo que es transportado de esta forma es una embolia y el proceso de formación de un trombo que llega a ser embólico se denomina una tromboembolia. Una embolia que se aloja en los pulmones es una embolia pulmonar (EP). Un émbolo pulmonar es una afección muy grave que puede ser mortal si no se reconoce y trata rápidamente.
Las trombosis venosas superficiales pueden causar molestia, pero generalmente no causa consecuencias graves, a diferencia de las trombosis venosas profundas (TVP) que se forman en las venas profundas de las piernas o en las venas pélvicas. Las embolias sistémicas de origen venoso pueden ocurrir en pacientes con un defecto septal auricular o ventricular, a través del cual puede pasar un émbolo al aparato articular. Dicho evento se llama embolia paradójica.
La prevención de trombosis arterial y/o venosa incluye medicaciones (por ejemplo, anticoagulantes (por ejemplo, heparina), aspirina y vitamina E) y métodos mecánicos (por ejemplo, bombas mecánicas para las piernas (medias de compresión neumática)).
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, reducción o eliminación de uno o más síntomas de) de la trombosis arterial y/o venosa administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene trombosis arterial y/o venosa. Se proporcionan además métodos de tratamiento de trombosis arterial y/o venosa administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una
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cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, un anticoagulante (por ejemplo, heparina), aspirina y/o vitamina E y/o un método mecánico (por ejemplo, una bomba mecánica para las piernas (medias de compresión neumática). La divulgación también proporciona métodos de prevención de la trombosis arterial y/o venosa o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar trombosis arterial y/o venosa (por ejemplo, un sujeto que ha sufrido un accidente cerebrovascular o infarto de miocardio).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de trombosis arterial o venosa, tales como un modelo de trombosis arterial de doble inserción (Gomez-Jorge et al., J. Vasc. Inter. Rad. 9(4): 633-638 (1998), un modelo de trombosis venosa en rata con condiciones de flujo bajo en la corriente sanguínea venosa (Fredrich et al., Blood Coagul Fibrinolysis. 5(2):243-8 (1994)), y un modelo canino para trombosis venosa y embolia pulmonar espontánea (Frisbiel, Spinal Cord 43, 635-639 (2005)).
Íleo posoperatorio
El íleo posoperatorio es una parálisis temporal de una porción de los intestinos normalmente después de una cirugía abdominal. El íleo posoperatorio ocurre comúnmente durante 24 a 72 horas después de la cirugía abdominal.
Los síntomas de íleo posoperatorio incluyen, por ejemplo, molestia abdominal moderada y difusa, estreñimiento, distensión abdominal, náuseas o vómitos, falta de defecación y/o flatulencia, y eructos excesivos.
Los tratamientos para el íleo posoperatorio incluyen, por ejemplo, nil por os (NPO o "nada por la boca") hasta que el sonido peristáltico se oiga de la auscultación del área donde se encuentra esta porción, succión nasogástrica, alimentaciones parenterales y medicaciones (por ejemplo, lactulosa y eritromicina).
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, reducción o eliminación de uno o más síntomas de) de íleo posoperatorio administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene íleo posoperatorio. Se proporcionan además métodos de tratamiento de íleo posoperatorio administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, nil por os, succión nasogástrica, alimentaciones parenterales y/o una medicación (por ejemplo, lactulosa y/o eritromicina). La divulgación también proporciona métodos de prevención del íleo posoperatorio o un síntoma del mismo administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar íleo posoperatorio (por ejemplo, un sujeto que ha tenido cirugía abdominal).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de íleo posoperatorio, tales como un modelo para investigar íleo posoperatorio con transductores con extensómetro en ratas despiertas (Huge et al. J Surg Res. 74(2):112-8 (1998)).
Aneurisma aórtica
Una aneurisma aórtica es un término general para cualquier inflamación (dilatación o aneurisma) de la aorta, que normalmente representa una debilidad subyacente en la pared de la aorta en esa localización. Los tipos de aneurismas aórticas incluyen aneurisma de la raíz aórtica, aneurisma aórtica torácica, aneurisma aórtica abdominal y aneurisma aórtica toracoabdominal.
Las aneurismas aórticas más intactas no producen síntomas. A medida que se agrandan, los síntomas de la aneurisma aórtica incluyen, por ejemplo, ansiedad o sensación de estrés, náuseas o vómitos, piel sudorosa, frecuencia cardíaca rápida, dolor abdominal, se puede desarrollar dolor de espalda, dolor de las piernas o entumecimiento, eritema nodoso (lesiones en las piernas normalmente encontradas cerca de la región del tobillo), y una voz ronca a medida que se estira el nervio laríngeo recurrente izquierdo que serpentea alrededor del arco de la aorta. Una vez se rompe una aneurisma, puede causar dolor grave y una fuerte hemorragia interna, y es mortal en ausencia de tratamiento rápido.
Los tratamientos para la aneurisma aórtica incluyen, por ejemplo, medicaciones, tratamiento quirúrgico y tratamiento endovascular. Las aneurismas más pequeñas que no están en alto riesgo de rotura se pueden tratar con fármacos para tratar la hipertensión arterial, tales como beta-bloqueantes; o doxiciclina para la inhibición de la metaloproteinasa-9 de matriz. El tratamiento quirúrgico normalmente implica abrir la porción dilatada de la aorta y la inserción de un tubo de parche sintético (Dacron o Gore-tex). El tratamiento endovascular, como una alternativa mínimamente invasiva a la reparación de cirugía abierta, implica la colocación de una prótesis endovascular mediante una técnica percutánea (normalmente mediante las arterias femorales) en la porción enferma de la aorta.
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La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, estabilización, reducción o eliminación de uno o más síntomas de) de aneurisma aórtica administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene aneurisma aórtica. Se proporcionan además métodos de tratamiento de aneurisma aórtica administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, una medicación (por ejemplo, un fármaco para tratar hipertensión arterial (por ejemplo, un beta-bloqueante) o doxiciclina), cirugía y/o un tratamiento endovascular. La divulgación también proporciona métodos de prevención de la aneurisma aórtica o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar aneurisma aórtica (por ejemplo, un sujeto que tiene hipertensión arterial).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de un modelo animal de aneurisma aórtica, por ejemplo, un modelo de rata de aneurisma aórtica abdominal usando una combinación de infusión intraluminal de elastasa y exposición extraluminal a cloruro de calcio (Tanaka et al. J Vasc Surg. 50(6):1423-32 (2009)).
Osteoartritis
La osteoartritis, también conocida como artritis degenerativa, se caracteriza por la rotura y pérdida eventual del cartílago de una o más articulaciones. La osteoartritis ocurre cuando el cartílago que amortigua los extremos de los huesos en las articulaciones se deteriora con el tiempo. La superficie lisa del cartílago se vuelve áspera, causando irritación. Si el cartílago se desgasta completamente, se dañarán los extremos de los huesos. La osteoartritis comúnmente afecta a las manos, pies, columna vertebral y articulaciones portadoras de gran peso, tales como las caderas y las rodillas.
Los síntomas de la osteoartritis incluyen, por ejemplo, dolor, dolor con la palpación, rigidez, pérdida de flexibilidad, sensación insoportable y espolones óseos.
Los tratamientos para la osteoartritis incluyen, por ejemplo, medidas conservativas (por ejemplo, reposo, reducción de peso, terapia física y ocupacional) y medicaciones (por ejemplo, acetaminofeno, cremas para el alivio del dolor aplicadas a la piel sobre las articulaciones (por ejemplo, capsaicina, salicina, salicilato de metilo y mentol), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, nabumetona y naproxeno) e inhibidores de Cox-2.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, estabilización, reducción o eliminación de uno o más síntomas o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de osteoartritis) de la osteoartritis administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene osteoartritis. Se proporcionan además métodos de tratamiento de osteoartritis administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, una medida conservativa (por ejemplo, reposo, reducción de peso, terapia física y/o ocupacional) y/o una medicación (por ejemplo, acetaminofeno, una crema tópica para el alivio del dolor, un AINE (por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, nabumetona o naproxeno) y/o un inhibidor de Cox-2. La divulgación también proporciona métodos de prevención de la osteoartritis o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar osteoartritis (por ejemplo, un sujeto que ha tenido una lesión articular).
Las escalas útiles para la evaluación de la osteoartritis incluyen, por ejemplo, la puntuación del resultado de lesión de rodilla y osteoartritis (KOOS; Roos et al. (1998) J. Orthop. Sports Phys. Ther. 28(2):88-96), el índice de osteoartritis de las Universidades de Ontario occidental y McMaster (WOMAC; Roos et al. (2003) Health Qual. Life Outcomes 1(1):17), y la escala general de salud del formulario corto de 36 puntos (SF-36 GHS), así como otras herramientas de evaluación conocidas en la técnica.
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de un modelo animal de osteoartritis, por ejemplo, inyección de mono-yodoacetato (MIA) en la articulación femorotibial de roedores que promueve la pérdida de cartílago articular similar al observado en osteoartritis humana (Guzman et al. Toxicol Pathol. 31 (6):619-24 (2003)), y corte transversal del ligamento cruzado anterior (ACL) en caninos para inducir osteoartritis (Fife y Brandt J Clin Invest. 84(5): 1432-1439 (1989)).
Vasculitis
La vasculitis se refiere a un grupo heterogéneo de trastornos que se caracteriza por destrucción inflamatoria de vasos sanguíneos. Se pueden afectar tanto las arterias como las venas. La linfangitis se considera algunas veces un tipo de vasculitis. La vasculitis es principalmente debida a la migración de leucocitos y el daño resultante. La vasculitis se puede clasificar por la causa subyacente, la localización de los vasos afectados, o el tipo o tamaño de
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los vasos sanguíneos. La vasculitis está asociada con varios trastornos y afecciones adicionales, por ejemplo, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Behget, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, crioglobulinemia, arteritis de Takayasu, síndrome de Churg-Strauss, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), púrpura de Henoch-Schonlein, enfermedades reumáticas (por ejemplo, artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico), cáncer (por ejemplo, linfomas), infecciones (por ejemplo, hepatitis C), exposición a productos químicos y fármacos (por ejemplo, anfetaminas, cocaína y vacunas anticarbuncosas que contienen el antígeno protector del carbunco como componente primario).
Los síntomas de la vasculitis incluyen, por ejemplo, fiebre, pérdida de peso, púrpura palpable, livedo reticular, mialgia o miositis, artralgia o artritis, mononeuritis múltiple, cefalea, accidente cerebrovascular, acúfenos, agudeza visual reducida, pérdida visual aguda, infarto de miocardio, hipertensión, gangrena, hemorragias nasales, tos con sangre, infiltrados pulmonares, dolor abdominal, heces con sangre, perforaciones y glomerulonefritis.
Los tratamientos para la vasculitis incluyen, por ejemplo, medicaciones relacionadas con cortisona (por ejemplo, prednisona) y fármacos inmunosupresores (por ejemplo, ciclofosfamida).
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, estabilización, reducción o eliminación de uno o más síntomas o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de vasculitis) de vasculitis administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene vasculitis. Se proporcionan además métodos de tratamiento de vasculitis administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia (por ejemplo, una mediación relacionada con cortisona (por ejemplo, prednisona) y/o un fármaco inmunosupresor (por ejemplo, ciclofosfamida)). La divulgación también proporciona métodos de prevención de la vasculitis o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar vasculitis (por ejemplo, un sujeto que ha tenido enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Behget, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, crioglobulinemia o arteritis de Takayasu, etc.).
La divulgación también proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, estabilización, reducción o eliminación de uno o más síntomas o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de vasculitis) de vasculitis asociada con lupus eritematoso sistémico administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene vasculitis asociada con lupus eritematoso sistémico. Se proporcionan además métodos de tratamiento de la vasculitis asociada con lupus eritematoso sistémico administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, una medicación relacionada con cortisona (por ejemplo, prednisona) y/o un fármaco inmunosupresor (por ejemplo, ciclofosfamida).
Se proporcionan además métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, estabilización o eliminación de uno o más síntomas) de un trastorno asociado a la vasculitis (enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Behget, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, crioglobulinemia, arteritis de Takayasu, síndrome de Churg-Strauss, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), púrpura de Henoch-Schonlein, enfermedades reumáticas (por ejemplo, artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico), cáncer (por ejemplo, linfomas), infecciones (por ejemplo, hepatitis C), exposición a productos químicos y fármacos (por ejemplo, anfetaminas, cocaína y vacunas anticarbuncosas que contienen el antígeno protector del carbunco como componente primario) administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene un trastorno asociado a la vasculitis. La divulgación también proporciona métodos de prevención de un trastorno asociado a la vasculitis o un síntoma del mismo administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar un trastorno asociado a la vasculitis.
Las escalas útiles para la evaluación de la osteoartritis incluyen, por ejemplo, la puntuación de actividad de vasculitis de Birmingham (BvAS) versión 3 (Mukhtyar et al. Ann Rheum Dis. 68(12): 1827-32 (2009)), así como otras herramientas de evaluación conocidas en la técnica.
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de un modelo animal de vasculitis, véanse, por ejemplo, aquellos descritos en Katz et al., Clin Rev Allergy Immunol. 35(1 -2): 11 -8 (2008) y referencias citadas en su interior.
Traumatismo craneoencefálico
El traumatismo craneoencefálico se refiere a traumatismo a la cabeza, que puede o puede no incluir lesión al cerebro. Los tipos de traumatismo craneoencefálico incluyen conmoción, hematoma epidural, hematoma subdural, contusión cerebral y lesión axonal difusa.
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Los síntomas del traumatismo craneoencefálico incluyen, por ejemplo, coma, confusión, somnolencia, cambio de personalidad, convulsiones, náuseas y vómitos, cefalea y un intervalo de lucidez, durante el que un paciente parece consciente solo para deteriorarse después, fuga de líquido cefalorraquídeo, deformidad o depresión visible en la cabeza o cara, un ojo que no se puede mover o se desvía hacia un lado puede indicar que un hueso facial roto está pellizcando un nervio que inerva los músculos del ojo, heridas o cardenales sobre el cuero cabelludo o la cara, fracturas de la base del cráneo, una hemorragia subcutánea sobre el mastoide, hemotímpano, rinorrea y otorrea de líquido cefalorraquídeo .
Los tratamientos para el traumatismo craneoencefálico incluyen, por ejemplo, controlar la elevada presión intracraneal (por ejemplo, sedación, paralizantes, derivación de líquido cefalorraquídeo), craniectomía descompresiva, coma por barbitúricos, solución salina hipertónica e hipotermia.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, estabilización, reducción o eliminación de uno o más síntomas o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de traumatismo craneoencefálico) de traumatismo craneoencefálico administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene traumatismo craneoencefálico. Se proporcionan además métodos de tratamiento de traumatismo craneoencefálico administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, controlar la elevada presión intracranial (por ejemplo, sedación, un paralizante y/o derivación de líquido cefalorraquídeo), craniectomía descompresiva, coma por barbitúricos, solución salina hipertónica y/o hipotermia. La divulgación también proporciona métodos de prevención del traumatismo craneoencefálico o un síntoma del mismo administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar traumatismo craneoencefálico (por ejemplo, un sujeto que participará en una actividad peligrosa o deporte de contacto).
Las escalas útiles para evaluar traumatismo craneoencefálico y síntomas del traumatismo craneoencefálico incluyen, por ejemplo, la escala de coma de Glasgow (Teasdale y Jennett, Lancet 13;2(7872):81-4 (1974)), así como otras herramientas de evaluación conocidas en la técnica.
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de traumatismo craneoencefálico, véanse, por ejemplo, los descritos en Cernak, NeuroRx. 2(3): 410-422 (2005) y referencias citadas en su interior.
Edema cerebral
El edema del cerebro (edema cerebral) es un exceso de acumulación de agua en los espacios intracelulares y/o extracelulares del cerebro. Los tipos de edema cerebral incluyen, por ejemplo, edema cerebral vasogénico, edema cerebral citotóxico, edema cerebral osmótico y edema cerebral intersticial.
El edema cerebral vasogénico es debido a una rotura de las estrechas uniones endoteliales que constituyen la barrera hematoencefálica (BHE). Esto permite normalmente que proteínas intravasculares excluidas y líquido penetren en el espacio extracelular del parénquima cerebral. Una vez los constituyentes del plasma cruzan la BHE, se extiende el edema; esto puede ser bastante rápido y generalizado. A medida que entra agua en la materia blanca, se mueve extracelularmente a lo largo de los fascículos y también puede afectar la materia gris. Este tipo de edema se observa en respuesta a traumatismo, tumores, inflamación focal, estadios tardíos de isquemia cerebral y encefalopatía hipertensiva. Algunos de los mecanismos que contribuyen a una disfunción de la BHE son: rotura física por hipertensión o traumatismo arterial, liberación facilitada por tumor de compuestos destructivos vasoactivos y endoteliales (por ejemplo, ácido araquidónico, neurotransmisores excitadores, eicosanoides, bradiquinina, histamina y radicales libres). Algunas de las subcategorías especiales del edema vasogénico incluyen: edema cerebral hidrostático, edema cerebral de cáncer cerebral, edema cerebral de las alturas.
El edema cerebral citotóxico es debido a la perturbación en el metabolismo celular dando como resultado el inadecuado funcionamiento de la bomba de sodio y potasio en la membrana celular de la glía. Como resultado existe, retención celular de sodio y agua. El edema citotóxico se observa con diversas intoxicaciones (dinitrofenol, trietilestaño, hexaclorofeno, isoniazida), en síndrome de Reye, hipotermia grave, isquemia temprana, encefalopatía, accidente cerebrovascular temprano o hipoxia, paro cardíaco, seudotumor cerebral y toxinas cerebrales.
El edema cerebral osmótico ocurre cuando el plasma se diluye por el excesivo consumo de agua (o hiponatremia), síndrome de la secreción inapropiada de hormona antidiurética (SIADH), hemodiálisis, o la rápida reducción de la glucosa en sangre en el estado hiperglucémico hiperosmolar (HHS), con anterioridad acidosis no cetósica hiperosmolar (HONK) y la osmolalidad cerebral supera la osmolalidad en suero creando una presión anormal.
El edema cerebral intersticial ocurre en hidrocéfalo obstructivo. Esta forma de edema es debida a la rotura de la barrera de líquido cefalorraquídeo cerebral (LCR)-cerebro dando como resultado flujo trans-ependimario de LCR, que permite que el LCR penetre en el cerebro y se extienda en el espacio extracelular de la materia blanca.
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Los síntomas del edema cerebral (por ejemplo, edema cerebral peritumoral) incluyen, por ejemplo, cefalea, pérdida de coordinación (ataxia), debilidad y disminución de los niveles de conocimiento que incluyen desorientación, pérdida de memoria, alucinaciones, comportamiento psicótico y coma.
Los tratamientos para el edema cerebral (por ejemplo, edema cerebral peritumoral) incluyen, por ejemplo, medicaciones (por ejemplo, dexametasona, manitol, diuréticos) y descompresión quirúrgica.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, estabilización, reducción o eliminación de uno o más síntomas de) de edema cerebral (por ejemplo, peritumoral edema cerebral) administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene edema cerebral (por ejemplo, edema cerebral peritumoral). Se proporcionan además métodos de tratamiento de edema cerebral (por ejemplo, edema cerebral peritumoral) administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, una medicación (por ejemplo dexametasona, manitol y/o diuréticos) y/o descompresión quirúrgica. La divulgación también proporciona métodos de prevención del edema cerebral o un síntoma del mismo administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar edema cerebral (por ejemplo, un sujeto al que se le ha diagnosticado un tumor cerebral).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de edema cerebral, por ejemplo, un modelo de rata de embolia cerebral en el que la recirculación se puede introducir en el área isquémica (Koizumi et al., Jpn J Stroke 8: 1-8 (1986)).
Septicemia
La septicemia es una afección médica grave que se caracteriza por un estado inflamatorio de cuerpo entero y la presencia de una infección conocida o presunta. Esta respuesta inmunológica se puede causar por microbios en la sangre, orina, pulmones, piel, u otros tejidos y puede conducir a activación generalizada de proteínas de fase aguda, que afectan el sistema del complemento y las vías de la coagulación, que entonces causan daño a la vasculatura, así como a los órganos. Los diferentes niveles de septicemia incluyen síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), septicemia (SIRS en respuesta a un proceso infeccioso confirmado), septicemia grave (septicemia con disfunción orgánica, hipoperfusión, o hipotensión) y choque séptico (septicemia con hipotensión arterial refractaria o anomalías de la hipoperfusión a pesar de rehidratación adecuada).
Los síntomas de la septicemia incluyen, por ejemplo, síntomas generales relacionados con la infección, inflamación aguda presente en todo el cuerpo, hipotermia o fiebre, taquicardia, taquipnea o hipocapnia debida a hiperventilación, leucopenia, leucocitosis, bandemia y disfunción orgánica (por ejemplo, pulmón, cerebro, hígado, riñón y/o corazón).
Los tratamientos para la septicemia incluyen, por ejemplo, antibióticos, fármacos vasopresores, insulina, corticosteroides, drotrecogina alfa, drenaje quirúrgico de acumulaciones de líquido infectado, sustitución de líquido y soporte apropiado para la disfunción orgánica (por ejemplo, hemodiálisis en insuficiencia renal, ventilación mecánica en disfunción pulmonar, transfusión de hemoderivados, y terapia con fármacos y líquidos para insuficiencia circulatoria). Se puede usar la terapia dirigida a objetivos tempranos (EGDT), un enfoque sistemático a la rehidratación, para tratar septicemia grave y choque séptico.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, estabilización, reducción o eliminación de uno o más síntomas o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de septicemia) de la septicemia administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene septicemia. Se proporcionan además métodos de tratamiento de septicemia administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, un antibiótico, un fármaco vasopresor, insulina, un corticosteroide, drotrecogina alfa, drenaje quirúrgico de acumulaciones de líquido infectado, sustitución de líquido, un soporte apropiado para la disfunción orgánica (por ejemplo, hemodiálisis en insuficiencia renal, ventilación mecánica en disfunción pulmonar, transfusión de hemoderivados y/o terapia con fármacos y líquidos para insuficiencia circulatoria) y/o terapia dirigida a objetivos tempranos (EGDT). La divulgación también proporciona métodos de prevención de la septicemia o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar septicemia (por ejemplo, un sujeto al que se le ha diagnosticado una infección).
Las escalas útiles para evaluar la septicemia y los síntomas de la septicemia incluyen, por ejemplo, la escala de septicemia de Baltimore (Meek et al. J Burn Care Rehabil. 12(6):564-8 (1991)), así como otras herramientas de evaluación conocidas en la técnica.
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de septicemia, véanse, por
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ejemplo, los descritos en la patente de EE.UU. N° 6.964.856, y Buras et al. Nat Rev Drug Discov. 4(10):854-65
(2005) y referencias citadas en su interior.
Evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (Accidente cerebrovascular)
Un evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular) es la pérdida que se desarrolla rápidamente de la(s) función(es) cerebral(es) debido a alteración en el riego sanguíneo al cerebro debido a isquemia (falta de suministro de glucosa y oxígeno) causada por trombosis (por ejemplo, trombosis venosa), embolia o hipoperfusión sistémica. Como resultado, el área del cerebro afectada es incapaz de funcionar, que conduce a incapacidad para mover una o más extremidades en un lado del cuerpo, incapacidad para entender o plantear una conversación, o incapacidad para ver un lado del campo visual. Un accidente cerebrovascular es una urgencia médica y puede causar daño neurológico permanente, complicaciones y/o muerte.
Los síntomas del evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular) incluyen, por ejemplo, hemiplejia, sensación reducida y debilidad muscular de la cara, entumecimiento, reducción en la sensación sensorial o vibratoria, olor, sabor, audición o visión alterados (total o parcial), caída del párpado (ptosis) y debilidad de los músculos oculares, disminución de los reflejos, problemas de equilibrio y nistagmo, alteración de la respiración y la frecuencia cardíaca, debilidad en el músculo esternocleidomastoideo con incapacidad para girar la cabeza hacia un lado, debilidad en la lengua (incapacidad para sacar y/o moverla de lado a lado), afasia, apraxia, defecto del campo visual, déficits de memoria, heminatención, pensamiento desorganizado, confusión, gestos hipersexuales, anosognosia, problemas para caminar, alteración de la coordinación del movimiento, y vértigo y/o desequilibrio.
El tratamiento para el evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular) incluye, por ejemplo, trombólisis (por ejemplo, activador tisular del plasminógeno (tPA)), trombectomía, angioplastia e implantación de prótesis endovascular, hipotermia terapéutica y medicaciones (por ejemplo, aspirina, clopidogrel y dipiridamol).
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, estabilización, reducción o eliminación de uno o más síntomas o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de accidente cerebrovascular) del evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular) administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular). Se proporcionan además métodos de tratamiento de evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular) administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, trombólisis (por ejemplo, activador tisular del plasminógeno (tPA)), trombectomía, angioplastia e implantación de prótesis endovascular, hipotermia terapéutica y/o una medicación (por ejemplo, aspirina, clopidogrel y dipiridamol). La divulgación también proporciona métodos de prevención del evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular) o un síntoma del mismo administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular) (por ejemplo, un sujeto que ha sufrido hipoperfusión sistémica).
Las escalas útiles para evaluar el evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular) y los síntomas del evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular) incluyen, por ejemplo, la clasificación del proyecto de accidente cerebrovascular de la comunidad de Oxford (OCSP, también conocidos como la clasificación de Bamford u Oxford) (Bamford et al., Lancet 337 (8756): 1521-6 (1991)), y TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) (Adams et al., Stroke 24 (1): 35-41 (1993)).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), véanse, por ejemplo, los descritos en Beech et al., Brain Res 895: 18-24 (2001), Buchan et al., Stroke 23 (2): 273-9 (1992), Carmichael, NeuroRx 2: 396-409 (2005), Chen et al., Stroke 17 (4): 738-43 (1986), Dittmar et al., Stroke 34: 2252-7 (2003), Dittmar et al., J Neurosci Methods 156: 50
(2006) , Gerriets et al., J Neurosci Methods 122: 201-11 (2003), Gerriets et al., Stroke 35: 2372-2377 (2004), Graham et al., Comp Med 54: 486-496 (2004), Koizumi et al., Jpn J Stroke 8: 1-8 (2004), Longa et al., Stroke 20 (1): 84-91 (1989), Mayzel-Oreg, Magn Reson Med 51: 1232-8 (2004), Schmid-Elsaesser et al., Stroke 29 (10): 2162-70 (1989), Tamura et al., J Cereb Blood Flow Metab 1: 53-60 (1981), Watson et al., Ann Neurol 17: 497-504 (1985) y Zhang et al., J Cereb Blood Flow Metab 17: 123-35 (1997).
Reestenosis
La reestenosis es la remanifestación de la estenosis, un estrechamiento de un vaso sanguíneo, que conduce a circulación sanguínea restringida. La reestenosis normalmente se refiere a una arteria u otro vaso sanguíneo grande que se ha estrechado, recibido tratamiento para limpiar el bloqueo tal como angioplastia, y posteriormente se ha
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vuelto a reestrechar. Se puede definir como una reducción en la circunferencia de la luz de 50 % o más, y tuvo una alta tasa de incidencia (25-50 %) en pacientes que se habían sometido a angioplastia con globo, necesitando la mayoría de los pacientes angioplastia adicional en el plazo de 6 meses.
Los tratamientos para la reestenosis incluyen, por ejemplo, angioplastia adicional si la reestenosis ocurre sin una prótesis endovascular o en cualquier extremo de una prótesis endovascular, angioplastia repetida e inserción de otra prótesis endovascular dentro de la original si la reestenosis ocurre dentro de una prótesis endovascular, prótesis endovasculares que eluyen fármaco, braquiterapia y radiación intracoronaria.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, estabilización, reducción o eliminación de uno o más síntomas de) de reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia) administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia). Se proporcionan además métodos de tratamiento de reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia) administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, angioplastia si la reestenosis ocurre sin una prótesis endovascular o en cualquier extremo de una prótesis endovascular, angioplastia repetida e inserción de otra prótesis endovascular dentro de la original si la reestenosis ocurre dentro de una prótesis endovascular, una prótesis endovascular eluye fármaco, braquiterapia y/o radiación intracoronaria. La divulgación también proporciona métodos de prevención de la reestenosis o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar reestenosis (por ejemplo, un sujeto que ha tenido estenosis).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de reestenosis, véanse, por ejemplo, los descritos en las patentes de EE.UU. N° 5.304.122 y 6.034.053, y Kantor et al., Cardiovasc Radiat Med. 1(1):48-54 (1999), y referencias citadas en su interior.
Nefritis por lupus eritematoso sistémico
La nefritis por lupus eritematoso sistémico es una inflamación del riñón causada por lupus eritematoso sistémico (LES), una enfermedad autoinmunitaria crónica de tejido conjuntivo. El LES se puede asociar a vasculitis que son trastornos caracterizados por la destrucción inflamatoria de los vasos sanguíneos.
Los síntomas de la nefritis por lupus eritematoso sistémico incluyen, por ejemplo, síntomas generales de enfermedad renal, aumento de peso, hipertensión arterial, orina espumosa más oscura e inflamación alrededor de los ojos, piernas, tobillos o dedos.
Los tratamientos para la nefritis por lupus eritematoso sistémico incluyen, por ejemplo, terapia con esteroides (por ejemplo, corticosteroides), quimioterapia (por ejemplo, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato mofetilo, o ciclosporina) y agentes inmunosupresores (por ejemplo, micofenolato mofetilo y ciclofosfamida intravenosa).
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, estabilización, reducción o eliminación de uno o más síntomas o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de lupus) de la nefritis por lupus eritematoso sistémico administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene nefritis por lupus eritematoso sistémico. Se proporcionan además métodos de tratamiento de nefritis por lupus eritematoso sistémico administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, terapia con esteroides (por ejemplo, un corticosteroide), quimioterapia (por ejemplo, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato mofetilo y/o ciclosporina) y/o un agente inmunosupresor (por ejemplo, micofenolato mofetilo y/o ciclofosfamida intravenosa). La divulgación también proporciona métodos de prevención de la nefritis por lupus eritematoso sistémico o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar nefritis por lupus eritematoso sistémico (por ejemplo, un sujeto al que se le ha diagnosticado lupus o un sujeto que tiene un miembro de su familia con lupus o una predisposición genética al mismo).
Las escalas útiles para evaluar la nefritis por lupus eritematoso sistémico y los síntomas de la nefritis por lupus eritematoso sistémico incluyen, por ejemplo, la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS) basada en la biopsia (Weening et al., J. Am. Soc. Nephrol. 15 (2): 241-50 (2004)), así como otras herramientas de evaluación conocidas en la técnica.
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de nefritis por lupus eritematoso sistémico, véanse, por ejemplo, los descritos en la patente de EE.UU. N° 7.26.5261, Peng, Methods Mol Med. 102:227-72 (2004), y referencias citadas en su interior.
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Lesión por quemadura y cicatrización
Una lesión por quemadura es un tipo de lesión que se puede causar por calor, electricidad, productos químicos, luz, radiación o fricción. Se pueden dañar músculo, hueso, vaso sanguíneo, tejido dérmico y epidérmico con dolor posterior debido a una profunda lesión a los nervios. Dependiendo de la localización afectada y el grado de gravedad, una víctima de una quemadura puede experimentar un amplio número de complicaciones posiblemente mortales que incluyen choque, infección, desequilibrio de electrolitos y disnea. En las lesiones por quemadura, el daño a la epidermis y los elementos dérmicos es el resultado de varios ataques clave que se pueden dividir en ataques iniciales (por ejemplo, lesión por calor, lesión inflamatoria por mediadores, lesión inducida por isquemia) y diferidos. El exceso de calor causa la rápida desnaturalización de las proteínas y daño célula. Gran parte del daño al tejido, por ejemplo, en la quemadura de subsuperficie perfundida, se puede causar por mediadores tóxicos de la inflamación (por ejemplo, oxidantes y/o proteasas) que se activan con la quemadura. El consumo de oxígeno de la herida por los neutrófilos puede conducir a hipoxia de tejido. Ocurre trombosis vascular superficial instantánea junto con muerte celular del ataque por calor y causa isquemia y además daño de tejido. La lesión diferida después del daño inicial por calor y por mediadores incluye, por ejemplo, inflamación causada por tejido neurótico, bacterias sobre la superficie, agentes tópicos caústicos y exudado superficial; y daño continuado a células viables y nuevo crecimiento de tejido por exceso de actividad proteolítica de la herida y la liberación de oxidantes.
Los tratamientos de la lesión por quemadura incluyen, por ejemplo, líquidos intravenosos, apósitos, abordaje del dolor (por ejemplo, analgésicos (por ejemplo, ibuprofeno y acetaminofeno), narcóticos y anestésicos locales), inhibidores de los mediadores inflamatorios, y antibióticos.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, estabilización, reducción o eliminación de uno o más síntomas o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de quemadura) de una lesión por quemadura y/o promoción de la cicatrización administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene una lesión por quemadura. Se proporcionan además métodos de tratamiento de una lesión por quemadura administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, líquido intravenoso, un apósito, abordaje del dolor (por ejemplo, un analgésico (por ejemplo, ibuprofeno y acetaminofeno), un narcótico y un anestésico local), un inhibidor de los mediadores inflamatorios y un antibiótico. La divulgación también proporciona métodos de prevención de las lesiones por quemadura o un síntoma de las mismas administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar lesiones por quemadura (por ejemplo, un sujeto cuya ocupación crea un riesgo de una lesión por quemadura, por ejemplo, bombero o cocinero).
Las escalas útiles para evaluar las quemaduras y los síntomas de las quemaduras incluyen, por ejemplo, escalas de quemaduras por grados, por espesor y por área superficial del cuerpo total (TBSA) (Meek et al. J Burn Care Rehabil. 12(6):564-8 (1991)), así como otras herramientas de evaluación conocidas en la técnica.
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de quemadura, tales como un modelo de quemadura porcina (Singer y McClain, Methods Mol Med. 78:107-19 (2003), una modelo de oveja de lesión térmica (Jonkam et al., Shock, 28:704-709 (2007)), un modelo de conejo de lesión térmica (Nwariaku et al., Burns, 22:324-327 (1996)) y un modelo de ratón de herida por quemadura (Stevenson et al., Methods Mol Med. 78:95-105 (2003)).
Terapias de combinación
Se puede administrar una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo contra anticalicreína plasmática, por ejemplo, un Fab o IgG anti-calicreína plasmática, en combinación con una o más de las otras terapias para tratar una enfermedad o afección asociada a una actividad de calicreína plasmática, por ejemplo, una enfermedad o afección descrita en el presente documento. Por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática se puede usar terapéutica o profilácticamente con cirugía, otro Fab o IgG anticalicreína plasmática (por ejemplo, otro Fab o IgG descrita en el presente documento), otro inhibidor de calicreína plasmática, un inhibidor de péptido, o inhibidor de molécula pequeña. Ejemplos de inhibidores de calicreína plasmática que se pueden usar en la terapia de combinación con una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento incluyen los inhibidores de calicreína plasmática descritos en, por ejemplo, los documentos WO 95/21601 o WO 2003/103475.
Se pueden usar uno o más inhibidores de calicreína plasmática en combinación con una o más proteínas de unión a calicreína plasmática descritas en el presente documento. Por ejemplo, la combinación puede dar como resultado una dosis más baja del inhibidor que se necesita, de forma que se reduzcan los efectos secundarios.
Se puede administrar una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento en combinación con una o más terapias actuales para tratar una enfermedad o afección asociada a calicreína
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plasmática, que incluyen, pero no se limitan a, las actuales terapias para tratar el trastorno, por ejemplo, una terapia actual para artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico, lesión por quemadura, o cicatrización. Por ejemplo, la inhibición de pCal es un novedoso mecanismo para tratar la enfermedad y, por tanto, podría proporcionar efectos que son sinérgicos o aditivos con otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, una proteína descrita en el presente documento que inhibe la calicreína plasmática o que inhibe un evento aguas abajo de la actividad de calicreína plasmática también se puede usar en combinación con otro tratamiento para una enfermedad asociada a calicreína plasmática, tal como cirugía o administración de un segundo agente, por ejemplo, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el segundo agente puede incluir ecallantide, un inhibidor de C1 esterasa (por ejemplo, CINRYZE™), aprotinina (TRASYLOL®), un inhibidor del receptor de bradiquinina B2 (por ejemplo, icatibant (FiRAZYR®)).
El término "combinación" se refiere al uso de los dos o más agentes o terapias para tratar al mismo paciente, en el que el uso o la acción de los agentes o terapias se solapan en el tiempo. Los agentes o terapias se pueden administrar al mismo tiempo (por ejemplo, como una única formulación que se administra a un paciente o como dos formulaciones separadas administradas simultáneamente) o secuencialmente en cualquier orden. Las administraciones secuenciales son administraciones que se administran en tiempos diferentes. El tiempo entre la administración de un agente y otro agente puede ser minutos, horas, días o semanas. El uso de una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento también se puede usar para reducir la dosificación de otra terapia, por ejemplo, para reducir los efectos secundarios asociados a otro agente que se administra. Por consiguiente, una combinación puede incluir administrar un segundo agente a una dosificación al menos 10, 20, 30 o 50 % más baja que la que se usaría en ausencia de la proteína de unión a calicreína plasmática.
El segundo agente o terapia también puede ser otro agente para una terapia asociada a calicreína plasmática. Ejemplos no limitantes de otro tratamiento para una enfermedad o afección asociada a calicreína plasmática incluyen, por ejemplo, ecallantide, un inhibidor de C1 esterasa (por ejemplo, CINRYZE™), aprotinina (TRASYLOL®), un inhibidor del receptor de bradiquinina B2 (por ejemplo, icatibant (FIRAZYR®)) o una segunda proteína de unión descrita en el presente documento.
Una terapia de combinación puede incluir administrar un agente que reduce los efectos secundarios de otras terapias. El agente puede ser un agente que reduce los efectos secundarios de un tratamiento de enfermedad asociada a calicreína plasmática. Por ejemplo, para enfermedades inflamatorias, un inhibidor de pCal podría ser el ahorro de esteroides. Por tanto, podría haber sinergia con un inhibidor de TNF-alfa para tratar inflamación o un bloqueante de VEGF para tratar cáncer y/o angiogénesis.
Usos de diagnóstico
Una proteína que se une a calicreína plasmática descrita en el presente documento puede tener utilidades de diagnóstico in vitro e in vivo. Se puede usar una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento (por ejemplo, una proteína que se une o se une e inhibe calicreína plasmática), por ejemplo, para la obtención de imágenes in vivo, por ejemplo, durante el transcurso de un tratamiento para una enfermedad o afección en la que la calicreína plasmática es activa, por ejemplo, una enfermedad o afección descrita en el presente documento, o en el diagnóstico de una enfermedad o afección descrita en el presente documento.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método de diagnóstico para la detección de la presencia de calicreína plasmática, in vitro o in vivo (por ejemplo, obtención de imágenes in vivo en un sujeto). El método puede incluir localizar calicreína plasmática dentro de un sujeto o dentro de una muestra de un sujeto. Con respecto a la evaluación de muestras, el método puede incluir, por ejemplo: (i) poner en contacto una muestra con proteína de unión a calicreína plasmática; y (ii) detectar la localización de la proteína de unión a calicreína plasmática en la muestra.
También se puede usar una proteína de unión a calicreína plasmática para determinar el nivel cualitativo o cuantitativo de expresión de calicreína plasmática en una muestra. El método también puede incluir poner en contacto una muestra de referencia (por ejemplo, una muestra de control, por ejemplo, un control negativo) con la proteína de unión, y determinar una evaluación correspondiente de la muestra de referencia. Una diferencia (por ejemplo, aumento), por ejemplo, una diferencia estadísticamente significativa, en la formación del complejo en la muestra o sujeto con respecto a la muestra de control o sujeto puede ser indicativa de la presencia de calicreína plasmática en la muestra. En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática no reacciona de forma cruzada con otra proteína de calicreína, tal como calicreína de tejido y/o con precalicreína plasmática. Por ejemplo, la proteína de unión se une a otra proteína de calicreína o a precalicreína 5 a 10 veces menos bien (o incluso menos bien) que se une a calicreína plasmática. Por ejemplo, la proteína de unión puede unirse a calicreína plasmática con una kD de ~10-50 pM, mientras que se une a calicreína de tejido y/o precalicreína a ~10 nM.
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La proteína de unión a calicreína plasmática se puede marcar directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o sin unir. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos.
Se puede detectar la formación de complejos entre la proteína de unión a calicreína plasmática y la calicreína plasmática evaluando la proteína de unión unida a la calicreína plasmática o la proteína de unión no unida. Se pueden usar ensayos de detección convencionales, por ejemplo, un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica de tejido. Además de marcar la proteína de unión a calicreína plasmática, la presencia de calicreína plasmática se puede ensayar en una muestra por un inmunoensayo de competición que utiliza patrones marcados con una sustancia detectable y una proteína de unión a calicreína plasmática no marcada. En un ejemplo de este ensayo, se combinan la muestra biológica, los patrones marcados y la proteína de unión a calicreína plasmática y se determina la cantidad de patrón marcado unido a la proteína de unión no marcada. La cantidad de calicreína plasmática en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de patrón marcado unido a la proteína de unión a calicreína plasmática.
Se pueden preparar proteínas marcadas con fluoróforos y cromóforos. Debido a que los anticuerpos y otras proteínas absorben luz que tiene longitudes de onda de hasta aproximadamente 310 nm, se deben seleccionar restos fluorescentes que tengan absorción sustancial a longitudes de onda superiores a 310 nm y preferentemente superiores a 400 nm. Se describen una variedad de agentes fluorescentes y cromóforos adecuados por Stryer, 1968, Science 162:526 y Brand, L. et al., 1972, Annu. Rev. Biochem. 41:843-868. Las proteínas se pueden marcar con grupos cromóforos fluorescentes mediante procedimientos convencionales, tales como los desvelados en las patentes de EE.UU. N° 3.940.475, 4.289.747 y 4.376.110. Un grupo de agentes fluorescentes que tiene varias de las propiedades deseables descritas anteriormente es los colorantes de xanteno, que incluyen las fluoresceínas y las rodaminas. Otro grupo de compuestos fluorescentes son las naftilaminas. Una vez marcada con un fluoróforo o cromóforo, la proteína se puede usar para detectar la presencia o localización de la calicreína plasmática en una muestra, por ejemplo, usando microscopía fluorescente (tal como microscopía confocal o con deconvolución).
Análisis histológico. Se puede realizar inmunohistoquímica usando las proteínas descritas en el presente documento. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, el anticuerpo se puede sintetizar con una marca (tal como una marca de purificación o de epítope), o se puede marcar detectablemente, por ejemplo, conjugando una marca o grupo de unión a marca. Por ejemplo, se puede unir un quelante al anticuerpo. El anticuerpo se pone entonces en contacto con su preparación histológica, por ejemplo, una sección fijada de tejido que está sobre un portaobjetos de microscopio. Después de una incubación para la unión, la preparación se lava para retirar el anticuerpo sin unir. Entonces se analiza la preparación, por ejemplo, usando microscopía, para identificar si el anticuerpo se une o no a la preparación.
Por supuesto, el anticuerpo (u otro polipéptido o péptido) puede estar sin marcar en el momento de la unión. Después de la unión y el lavado, el anticuerpo se marca con el fin de hacerlo detectable.
Matrices de proteína. La proteína de unión a calicreína plasmática también se puede inmovilizar sobre una matriz de proteína. La matriz de proteína se puede usar como una herramienta de diagnóstico, por ejemplo, para cribar muestras médicas (tales como células aisladas, sangre, sueros, biopsias, y similares). Por supuesto, la matriz de proteína también puede incluir otras proteínas de unión, por ejemplo, que se une a calicreína plasmática o a otras moléculas diana.
Los métodos de producción de matrices de polipéptidos se describen, por ejemplo, en De Wildt et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al., 1999, Anal. Biochem. 270:103-111; Ge, 2000, Nucleic Acids Res. 28, e3, I- VII; MacBeath y Schreiber, 2000, Science 289:1760-1763; documentos WO 01/40803 y WO 99/51773A1. Los polipéptidos para la matriz pueden ser aplicados a alta velocidad, por ejemplo, usando aparatos robóticos comercialmente disponibles, por ejemplo, de Genetic MicroSystems o BioRobotics. El sustrato de la matriz puede ser, por ejemplo, nitrocelulosa, plástico, vidrio, por ejemplo, vidrio modificado en la superficie. La matriz también puede incluir una matriz porosa, por ejemplo, acrilamida, agarosa, u otro polímero.
Por ejemplo, la matriz puede ser una matriz de anticuerpos, por ejemplo, como se describe en De Wildt, arriba. Las células que producen las proteínas se pueden cultivar sobre un filtro en un formato de matriz. Se induce la producción de polipéptidos, y los polipéptidos expresados se inmovilizan en el filtro en la localización de la célula. Se puede poner en contacto una matriz de proteínas con una diana marcada para determinar el grado de unión de la diana a cada polipéptido inmovilizado. La información sobre el grado de unido en cada dirección de la matriz se puede almacenar como un perfil, por ejemplo, en una base de datos informática. La matriz de proteína se puede producir por duplicado y usar para la comparación de perfiles de unión, por ejemplo, de una diana y una no diana.
FACS (Citometría de flujo activada por fluorescencia). Se puede usar la proteína de unión a calicreína plasmática para marcar células, por ejemplo, células en una muestra (por ejemplo, una muestra de paciente). La proteína de unión también se une (o se puede unir) a un compuesto fluorescente. Entonces, las células se pueden clasificar usando citometría activada por fluorescencia (por ejemplo, usando un citómetro disponible de Becton Dickinson Immunocitometry Systems, San Jose CA; véanse también las patentes de EE.UU. N° 5.627.037; 5.030.002; y 5.137.809). A medida que las células pasan a través del citómetro, un haz de láser excita el compuesto fluorescente
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mientras que un detector cuenta las células que pasan a través y determina si un compuesto fluorescente está unido o no a la célula detectando la fluorescencia. Se puede cuantificar y analizar la cantidad de marca unid a cada célula para caracterizar la muestra.
El citómetro también puede desviar la célula y separar células unidas por la proteína de unión de las células no unidas por la proteína de unión. Se pueden cultivar y/o caracterizar las células separadas.
Obtención de imágenes in vivo. También se caracteriza un método de detección de la presencia de calicreína plasmática que expresa tejidos in vivo. El método incluye (i) administrar a un sujeto (por ejemplo, un paciente que tiene, por ejemplo, una enfermedad o afección asociada a calicreína plasmática) un anticuerpo anti-calicreína plasmática, conjugado con un marcador detectable; (ii) exponer el sujeto a un medio para detectar dicho marcador detectable a la calicreína plasmática que expresa tejidos o células. Por ejemplo, se obtienen imágenes del sujeto, por ejemplo, por RMN u otros medios tomográficos.
Los ejemplos de marcas útiles para la obtención de imágenes de diagnóstico incluyen radiomarcas tales como 131I, 111In, 123I, 99mTc, 32P, 125I, 3H, 14C y 188Rh, marcas fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, marcas activas de resonancia magnética nuclear, isótopos emisores de positrones detectables por un equipo de tomografía de emisión de positrones ("PET"), agentes quimioluminiscentes tales como luciferina, y marcadores enzimáticos tales como peroxidasa o fosfatasa. También se pueden emplear los emisores de radiación de intervalo corto, tales como los isótopos detectables por sondas de detector de intervalo corto. La proteína se puede marcar con dichos reactivos; por ejemplo, véase Wensel and Meares, 1983, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York, para técnicas referentes al radiomarcado de anticuerpos y D. Colcher et al., 1986, Meth. Enzymol. 121: 802-816.
La proteína de unión se puede marcar con un isótopo radiactivo (tal como 14C, 3H, 35S, 125I, 32P, 131I). Se puede usar una proteína de unión radiomarcada para pruebas de diagnóstico, por ejemplo, un ensayo in vitro. La actividad específica de una proteína de unión isotópicamente marcada depende de la semivida, la pureza isotópica de la marca radiactiva, y cómo la marca se incorpora en el anticuerpo.
En el caso de una proteína de unión radiomarcada, la proteína de unión se administra al paciente, se localiza en las células que llevan el antígeno con el que reacciona la proteína de unión, y se detecta o "se obtienen imágenes" in vivo usando técnicas conocidas tales como escaneo radionuclear usando, por ejemplo, una gammacámara o tomografía de emisión. Véase, por ejemplo, A.R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al., (eds.), pp 65 85 (Academic Press 1985). Alternativamente, se puede usar un escáner de tomografía transaxial de emisión de positrones, tal como el designado Pet VI localizado en el Laboratorio Nacional de Brookhaven, donde la radiomarca emite positrones (por ejemplo, 11C, 18F, 15O y 13N).
Agentes de contraste de IRM. La imagen por resonancia magnética (IRM) usa RMN para visualizar características internas del sujeto vivo, y es útil para el pronóstico, diagnóstico, tratamiento y cirugía. Se puede usar IRM sin compuestos trazadores radiactivos por el obvio beneficio. Algunas técnicas de IRM se resumen en el documento EPA-0 502 814. Generalmente, se usan las diferencias relacionadas con las constantes del tiempo de relajación T1 y T2 de los protones de agua en diferentes entornos para generar una imagen. Sin embargo, estas diferencias pueden ser insuficientes para proporcionar imágenes nítidas de alta resolución.
Las diferencias en estas constantes del tiempo de relajación se pueden potenciar por agentes de contraste. Los ejemplos de dichos agentes de contraste incluyen varios agentes magnéticos, agentes paramagnéticos (que principalmente alteran T1) y ferromagnéticos o superparamagnéticos (que principalmente alteran la respuesta T2). Se pueden usar quelatos (por ejemplo, quelatos de EDTA, DTPA y NTA) para unir (y reducir la toxicidad) de algunas sustancias paramagnéticas (por ejemplo, Fe+3, Mn+2, Gd+3). Otros agentes pueden estar en forma de partículas, por ejemplo, menos de 10 mm a aproximadamente 10 nM de diámetro). Las partículas pueden tener propiedades ferromagnéticas, antiferromagnéticas o superparamagnéticas. Las partículas pueden incluir, por ejemplo, magnetita (Fe3OC4), Y-Fe2O3, ferritas, y otros compuestos minerales magnéticos de elementos de transición. Las partículas magnéticas pueden incluir: uno o más cristales magnéticos con y sin material no magnético. El material no magnético puede incluir polímeros sintéticos o naturales (tales como Sepharose, dextrano, dextrina, almidón y similares.
La proteína de unión a calicreína plasmática también se puede marcar con un grupo indicador que contiene el átomo de 19F activo para RMN, o una pluralidad de dichos átomos en la medida en que (i) sustancialmente todos los átomos de flúor naturalmente abundantes sean el isótopo de 19F y, así, sustancialmente todos los compuestos que contienen flúor sean activos para RMN; (ii) muchos compuestos polifluorados químicamente activos tales como anhídrido trifluoroacético están comercialmente disponibles a coste relativamente bajo; y (iii) se han encontrado médicamente aceptables muchos compuestos fluorados para su uso en seres humanos tales como los poliéteres perfluorados utilizados para llevar oxígeno como sustituciones de hemoglobina. Después de dejar dicho tiempo para la incubación, se lleva a cabo una IRM de cuerpo entero usando un aparato tal como uno de los descritos por Pykett, 1982, Sci. Am. 246:78 88 para localizar y obtener imágenes de tejidos que expresan calicreína plasmática.
Los siguientes ejemplos proporcionan ilustración adicional y no son limitantes.
Ejemplos EJEMPLO 1:
Los presentes inventores han descubierto varios inhibidores de anticuerpo y agentes de unión de calicreína 5 plasmática (pCal). Los más potentes de éstos se han caracterizado adicionalmente y se muestra que tienen constantes de inhibición aparente (Ki,ap) < 10 nM, son inhibidores de pCal específicos con respecto otras serina proteasas probadas y no se unen a precalicreína. Las secuencias de aminoácidos de las CDR para los inhibidores y los agentes de unión se muestran en las Tablas 1 y 2, respectivamente.
Tabla 1 Secuencias de aminoácidos de CDR, señal de ELISA y constante de inhibición aparente de inhibidores de anticuerpos de pCal
Nombre ¡nidal
ELISA de pCal humana (T/B) pCal humana (Ki,ap nM) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M6-D09
39,9 5,9 RASQSIRNYLN AASTLQS QQLSGYPHT FYYMV VIYPSGGITVYADSVKG DKWAVMPPYYYYAMDV
M7-B04
4,1 54 TGTNSDVGNYNLVS EVNKRPS CSYAGNRNFYV WYSMV SISPSGGLTNYADSVKG HTAARPFYYYYMDV
M7-E07
45,7 36 SGDKLGDKYAC QDSKRPS QAWDSSTGV WYLMI YIYPSGGFTYYADSVKG TEGPLSWGYGMDV
M8-A09
5,4 105 SGDKLGNKYAY QDNNRPS QAWDSRTW TYFML SIYPSGGNTVYADSVKG AASPVRNYYYYGMDV
M10-F10
39,2 <100 nM RASQSISVYLN GASNLQF QQTFSLFT FYNMN SISPSGGETNYADSVKG GGGAYRNNWWGGFDI
M10-H05
42,2 18 RASQSVSSSYLA GASSRAT QQYGSSPFT PYNMY SI RPSGGGTVYADSVKG GFIAARWYYFDY
M12-D05
48,5 5,2 SGDQLGDKYVG QDTKRPS QAWDTSTAG WYTMV RIYPSGGWTKYADSVKG EGLLWFGENAFDI
M27-E05
41,3 16 SGDKLGDKYAC QDSKRPS QAWDSSTGV WYLMI YIYPSGGFTYYADSVKG TEGPLSWGYGMDV
M28-B11
33,3 5,5 SGDQLGDKYVG QDTKRPS QAWDTSTAG WYTMV RIYPSGGWTKYADSVKG EGLLWFGENAFDI
M29-D09
47,5 0,7 SGNKLGDKYVA QDTKRPS QAWDSSIVI WYTMV YIYPSGGATFYADSVKG GSYDYIWGFYSDH
M29-E09
28,8 11 SGDNLGNKYNS QDTKRPS QAWDGNVV WYEMG SIYSSGGGTMYADSVKG NPQYSGYDRSLSDGAFDI
M35-G04
11,1 2,9 RASQSVSSYLA DASNRAT QQRSNWPRGFT YYHMS VISPSGGSTKYADSVKG GGSSDYAWGSYRRPYYFDY
M38-F02
33,5 14 SGEKLGDKYVS EDSRRPS QAWDSSTAI YYMMV YIYSSGGHTVYADSVKG DLFLYDFWSKGAFDI
M41-A11
28,0 13 SGDKLGDKYTS QDIKRPS QAWDSPNARV HYRMS SIYPSGGRTVYADSVKG DKFEWRLLFRGIGNDAFDI
M73-D06
4,0 <100 nM SGSSSNIGSNTVS NDHRRPS SAWDDSLNGW RYEMY SISSSGGPTAYADSVKG GTPKWELLLRSIYIENAFDI
M76-D01
11,2 <100 nM RSSQSLSDDGNTYLD TLSYRAS MQGTHWPPT FYAMH GIVPSGGRTHYADSVKG DSSGSPNPLFDY
M110-C12
2,4 <100 nM RSSLSLLHSNGYNYLD LSSTRAS MQPLETPPT YYEMD GISSSGGHTAYADSVKG ERRSSSRARYYYGMDV
M137-E12
4,5 79 SGNNSNFGSNTVT SDSRRPS AAWDDSLNGV DYRMQ VIVPSGGNTMYADSVKG GGPGSSIAARRAPTGYYGMDV
M142-H08
29,9 0,2 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWFRELKSNYFDY
M145-D01
6,2 1,1 RASQSVSSYLA DASNRAT QQRSNWPRGFT YYHMS VISPSGGSTKYADSVKG GGSSDYAWGSYRRPYYFDY
M145-D11
40,0 0,79 SGDKLGDKYTS QDIKRPS QAWDSPNARV HYRMS SIYPSGGRTVYADSVKG DKFEWRLLFRGIGNDAFDI
M146-E12
49,6 2,2 RASGDIGNALG DASTLQS LQGYNYPRT RYIMH SISPSGGLTSYADSVKG EFENAYHYYYYGMDV
Nombre inicial
ELISA de pCal humana (T/B) pCal humana (Ki,ap nM) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M152-A12
19, <100 nM RASQSISSYLS AASSLQS QQSISIPRT PYFMG GIGPSGGSTTYADSVKG EGPPYSSGWYRGLRQYHFDY
M160-G12
38,3 17 RASQGISSYLA AASTLQS QQLNSYPLT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M161-C11
41,8 0,3 SGDKLGDKYVS QDTKRPS QAWDSSTYV DYAMK SISSSGGVTQYADSVKG EEDYSSSWYSRRFDYYYGMDV
M162-A04
11,4 4,8 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
X67-B03
nd 2,1 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWSRELKSNYFDY
X67-C03
nd 0,7 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWFMELKSNYFDY
X67-C09
nd 8,6 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWGRELKSNYFDY
X67-D03
nd 0,1 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWNRELKSNYFDY
X67-E04
nd 1,3 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWDRELKSNYFDY
X67-F01
nd 0,9 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWQRELKSNYFDY
X67-F10
nd 1,3 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWTRELKSNYFDY
X67-G04
nd 0,35 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWARELKSNYFDY
X67-H04
nd 3,6 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWERELKSNYFDY
X81-E01
nd 0,2 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
Abreviaturas usadas: "T/B" es la señal de ELISA obtenida usando la "diana" (calicreína plasmática biotinilada) dividida entre la señal de ELISA del "fondo" (estreptavidina); ambas de las cuales se recubrieron sobre placas de microtitulación. "nd" es no determinado. El símbolo "q" se refiere al codón de terminación supresible ámbar (TAG), que se traduce como glutamina (Q) en cepas de E. colitales como las células TG1 que se usaron para expresar los fragmentos Fab.
Se muestran a continuación las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) de inhibidores de anticuerpos pCal

M6-D09 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI RNYLNWYQQK PGKAPNLLIY AASTLQSGVP 60

arfsgsgsgt dftltisslq pedfatyycq qlsgyphtfg qgtkleik ios

M6-D09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL scaasgftfs FYYMVWVRQA PGKGLEWVSV IYP3GGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDK WAVMPPYYYY AMDVWGQGTT 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M7-B04 LC

QSALTQPASV SGSPGQSITI SCTGTNSDVG NYNLVSWYQQ HPGEAPKLLI YEVNKRPSGV 60

SNRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDEADYLC CSYAGNRNFY VFGAGTKVTV L 111

M7-B04 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYSMVWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGLTNY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARKT AARPFYYYYM DVWGKGTTVT 120

VSSASTKGPS VFPLAPSSKS 140

M7-E07 LC

QSELTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YACWYQQKPG QSPVLVIYQD SKRPSGIPER 60

fsgsnsgnta tltisgtqam deadyycqaw DSSTGVFGGG TKLTVL 106

M7-E07 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WY1MIWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGFTYY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARTE GPLSWGYGMD VWGQGTTVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M8-A09 LC

QCELTQPPSE SVSPGQTANI TCSGDKLGNK YAYWYQQKPG QSPVLVIYQD NNRPSG1PER 60

fsgsnsgnta tltisgtqai DEANYYCQAW DSRTWFGGG TKLTVL 106

K8-A0 9 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYFMLWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGNTVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARAA SPVRNYYYYG MDVWGQGTTV 120

TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S 141

M10-F10 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SVYLNWYQHK PGKAPKLLIY GASNLQFGVP 60

SRFSGSGYGT DFTLTISSLQ PEDFATYHCQ QTFSLFTFGG GTKVEIK 107

MIO-FIO HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS FYNMNWVRQA PGKGLEWVSS TSPSGGETNY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG GAYRNNWWGG FDIWGLGTMV 120

TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S 141

M10-H05 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRASQSV SSSYLAWYQQ KPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGSGSG TDFTLTESRL EPEDFAVYYC QQYGSSPFTF GPGTKVDIK 109
M10-H05
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYNMYWRQA PGKGLEWVSS IRPSGGGTVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGF IAARWYYFDY WGQGTLVTVS 120
SASTKGPSVF
PLAPSSKS 138
M12-D05
LC
QSVLTQPPSV
SVSPGQTATI TCSGDQLGDK YVGWYQQKPG QSPILVIYQD TKRPSGIPER 60
FSGSNSGNTA
TLTISGTHTV DEAHYYCQAW DTSTAGFGGG TKLTVL 106
MI2-DO 5
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMVWVRQA PGKGLEWVSR IYPSGGWTKY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCAREG LLWFGENAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M27-E05
LC
QSELTQPPSV
SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YACWYQQKPG QSPVLVIYQD SKRPSGIPER 60
FSGSNSGNTA
TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSSTGVFGGG TKLTVL 106
M27-E05
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYLMIWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGFTYY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARTE GPLSWGYGMD VWGQGTTVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M28-B11
LC
QSVLTQPPSV
SVSPGQTATI TCSGDQLGDK YVGWYQQKPG QSPILVIYQD TKRPSGIPER 60
FSGSNSGNTA
TLTISGTHTV DEAHYYCQAW DTSTAGFGGG TKLTVL 106
M28-B11
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMVWVRQA PGKGLEWVSR IYPSGGWTKY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCAREG LLWFGENAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M29-D09
LC
QSALTQPPTV
SVSPGQTARI TCSGNKLGDK YVAWYQQKPG QSPMLVIYQD TKRPSRVSER 60
FSGSNSANTA
TLSISGTQAL DEADYYCQAW DSSIVIFGGG TRLTVL 106
M29-D09
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WY TMVWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGATFY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TñVYYCAMGS YDYIWGFYSD HWGQGTLVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M29-E09
LC
QYELTQPPSV
SVSPGQTATI TCSGDNLGNK YNSWYQQKPG QSPLLVIYQD TKRPSAIPER 60
FSGSNSGNTA
TLTISGTQAM DEADYYCQAW DGWWFGGGT KLTVL 105
M29-E09
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYEMGWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGGTMY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARNP QYSGYDRSLS DGAFDIWGQG 120
TMVTVSSAST
KGPSVFPLAP SSKS 144
M35-G04
LC
QDIQMTQSPA
TLSLSPGERA TLSCRASQSV SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY DASNRATGIP 60
ARFSGSGSGT
DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ QRSNWPRGFT FGPGTKVDIK 110
M35-G04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYHMSWVRQA PGKGLEWVSV ISPSGGSTKY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG SSDYAWGSYR RPYYFDYWGQ 120
GTLVTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKS 145
M38-F02
LC
QSVLTQPPSV
SVSPGQTASI TCSGEKLGDK YVSWY QQKPG QSPSLVICED SRRPSGIPER 60
FSGSNSGNTA
TLTISGAQPM DEADYYCQAW DSSTAIFGPG TKVTVL 106
M38-F02
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYMMVWRQA PGKGLEWVSY IYSSGGHTVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKWTLY LQMNSLRAED TñVYYCARDL FLYDFWSKGA FDIWGQGTMV 120
TVSSASTKGP
SVFPLAPSSK S 141
M41-A11
LC
QSVLTQPPSV
SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YTSWYQQRPG QSPVLVIYQD IKRPSGIPER 60
FSGSNSGNTA
TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSPNARVFGS GTKVTVL 107
M41-A11
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYRMSWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGRTVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDK FEWRLLFRGI GNDAFDIWGQ 120
GTMVTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKS 145
M73-D06
LC
QSELTQPPSA
SETPGQRVTI SCSGSSSNIG SNTVSWFQQL PGSAPRLLIY NDHRRPSGVP 60
DRFSGSKSGT
SASLVISGLQ SQDEADYYCS AWDDSLNGVV FGGGTKLTVL 110
M73-D06
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYEMYWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGPTAY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCAKGT PKWELLLRSI YIENAFDIWG 120
QGTMVTVSSA
STKGPSVFPL APSSKS 146
M76-D01
LC
QDIVMTQTPP
SLPVNPGEPA SISCRSSQSL SDDGNTYLDW YLQRPGQSPQ LLIHTLSYRA 60
SGVPDRFSGS
GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQGTHWP PTFGQGTKVE IK 112
M76-D01
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS FYAMHWVRQA PGKGLEWVSG IVPSGGRTHY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCATDS SGSPNPLFDY WGQGTLVTVS 120
SASTKGPSVF
PLAPSPKS 138
M110-C12
LC
QDIQMTQSPL
SLSVTPGEPA SISCRSSLSL LHSNGYNYLD WYVQRPGQSP QLLMYLSSTR 60
ASGVPDRFSG
SGSGTDFTLE ISRVEAE DVG VYYCMQPLET PPTFGGGTKV EIK 113
M110-C12
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS Y Y EMDWVRQA PGKGLEWVSG ISSSGGHTAY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCARER RSSSRARYYY GMDVWGQGTT 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M137-E12
LC
QSVLIQPPSV
SGIPGQRVTI SCSGNNSNFG sntvtwyqql PGTAPKLLIY SDSRRPSGVP 60
DRFSGSRSDT
SASLAISGLQ SEDEAEYHCA AWDDSLNGVF GGGTKLTVL 109
M137-E12
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYRMQWVRQA PGKGLEWVSV IVPSGGNTMY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG PGSSIAARRA PTGYYGMDVW 120
GQGTTVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKS 147
M142-H08
LC

QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60

SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCG QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108

M142-H08 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRELKS NYFDYWGQGT 120

LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143

M145-D01 LC

QDIQMTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASQSV SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY DASNRATGIP 60

ARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ QRSNWPRGFT FGPGTKVDIK 110

M145-D01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYHMSMVRQA PGKGLEWVSV ISPSGGSTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG SSDYAWGSYR RPYYFDYWGQ 120 GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKS 14 5

M145-D11 LC

QSVLTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YTSWYQQRPG QSPVLVIYQD IKRPSGIPER 60

FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSPNARVFGS GTKVTVL 107

M145-D11 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYRMSWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGRTVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDK FEWRLLFRGI GNDAFDIWGQ 120

GTMVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKS 14 5

M146-E12 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASGDI GNALGWYQQK PGKAPRLLIS DASTLQSGVP 60

LRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PEDFATYYCL QGYNYPRTFG QGTKLEIR 108

M146-E12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYIMHWRQA PGKGLEWVSS ISPSGGLTSY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREF ENAYHYYYYG MDVWGQGTTV 120

TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S 141

M152-A12 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLSWYQQR PGKAPNLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSISIPRTFG QGTKVEVK 108

M152-A12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYFMGWRQA PGKGLEWVSG IGPSGGSTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREG PPYSSGWYRG LRQYHFDYWG 120

QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKS 146

M160-G12 LC

QDIQMTQSPS FLSASVGDRV TITCRASQGI SSYLAWYQQK PGKAPKLLIY AASTLQSGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QLNSYPLTFG GGTKVEIK 108

M160-G12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M161-C11 LC

QSALTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YVSWYQQRPG QSPVLVIYQD TKRPSGIPER 60 FSGSNSGNTA TLTISGTQAV DEADYYCQAW DSSTYVFGGG TKVTVL 106
M161-C11
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYAMKWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGVTQY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE DYSSSWYSRR FDYYYGMDVW 120
GQGTTVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKS 147
M162-A04
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M162-A04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAYYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
X67-B03 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-B03 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWSRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X67-C03 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-CQ3 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWMRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X67-C09 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-C09 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWGRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X67-D03 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-D03 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWNRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X67-E04 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-E04 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWDRELKS NYFDYWGQGT 120

LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X67-F01 LC

QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60

SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-F01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWQRELKS NYFDYWGQGT 120

LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X67-F10 LC

QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60

SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-F10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWTRELKS NYFDYWGQGT 120

LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X67-G04 LC

QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60

SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-G04 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWARELKS NYFDYWGQGT 120

LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X67-H04 LC

QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60

SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-H04 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWERELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
Nota: X81-B01 es una IgG retromutadas a la línea germinal derivada de X63-G06 que se muestra en la Tabla 7.
Tabla 2. Secuencias de aminoácidos de CDR y señal de ELISA de agentes de unión de anticuerpos de pCal
Nombre inicial
ELISA de pCal humana (T/B) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M6-A06
11,7 RASQSISMYLN GTSSLQS QQSYSAPWT LYQMT GIWPSGGFTDYADSVKG VSTAVADNDY
M6-A08
23,4 RASQRISFYLN GASSLQS QQTFSTPNT PYPMQ SISSSGGMTEYADSVKG DDYGGKGGAFDI
M6-D03
15,5 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTLWT KYFMG VIGSSGGWTSYADSVKG VSTAVADNDY
M6-D08
16 RASQSISSYLN GASSLQS QQSYTRWT RYHMV SISPSGGWTNYADSVKG EMATIAGQFDP
M6-G05
18,5 RASQSISTYLN NAFSMER QQSYTTPTT RYRMV SIYPSGGMTAYADSVKG DAVGIGDAFDI
M8-C04
44,7 SGDKLGDKYTS QDSKRPS QAWDSSTV YYPMQ YIYPSGGLTSYADSVKG LFYGSGSVGFEY
M8-D05
11,9 RASQDISSWLV DASNLQS QQADGFPLT LYNMN SISPSGGFTDYADSVKG DLDLGILDY
M8-E06
8,8 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTLMYT HYFMT SIVPSGGMTQYADSVKG DSYSSSWFDI
M8-G09
28,2 RASQGVSYYLA GASSLQS QQYNTYPPT LYEML VIYPSGGYTDYADSVKG SFSGFGEIDY
M8-H04
3,3 RASQYISTYLN GTSSLQS QQSFTTPFT GYWMG SISSSGGWTQYADSVKG DDEIAAGGAFDI
M9-A03
14,4 RASQNIDIYLN GAYNLQS QQSYGTPV GYFMM SIYSSGGYTDYADSVKG EVAGTYAFDI
M9-A08
5,5 RASQRISTYLN GASSLQS QQSYNTPRT AYEMW YIGSSGGSTSYADSVKG GNSSSFDAFDI
M9-C08
10,9 RASQSISIYVN AASSLQR QQSFSTPLT HYGMV YIVPSGGLTYYADSVKG VDYTGDGLGY
M9-C10
7,8 RASQGISSYLN GASSLQS QESYSTLFT LYPMQ SIGSSGGMTFYADSVKG EVGAAGFAFDI
M9-D08
35,9 RASRTISFYLN GGSSLHS QQSFSSPWT WYKMM SIYPSGGWTNYADSVKG GSPWGDDAFDI
M9-E04
18,8 RASQSISGYLN AASNLQT QQSHTPPKT EYDMM SIGSSGGMTYYADSVKG DQVAAAAIDY
M9-F08
10,9 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTPPYT PYAMT VIYPSGGFTDYADSVKG ASGSYLDAFDI
M9-F09
7 RASQSISSYLN AASSLQS QQTYTTPWT SYPMG RISSSGGMTIYADSVKG DDWNVGMDV
M9-F10
8,4 RASQSINTYLN AASTLES QQSYSTPYT DYDME SISPSGGSTIYADSVKG QGLLTAFDI
M9-G08
4,8 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTPIT YYTML SIYPSGGFTMYADSVKG VDTAMAMIDY
Nombre inicial
ELISA de pCal humana (T/B) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M9-H02
3,5 RASRSIATYLN GASTLQS QQSFSDPYT AYMMI VIYPSGGVTMYADSVKG GTVGASDAFDI
M9-H03
4,4 SGDKLGNRYTS QDNKRPS QALDSNTYV WYSMG YIVPSGGYTMYADSVKG DPGVSYYYYGMDV
M9-H04
16,1 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTPPT AYTMW SIWPSGGSTFYADSVKG TYDSSAGEVDY
M10-A03
33,7 RASQRISFYLN GASSLQS QQTFSTPNT PYPMQ SISSSGGMTEYADSVKG DDYGGKGGAFDI
M10-A12
20,8 RASRDISVYLN GASSLQS QQSYSIPFT LYLMH SIYSSGGFTTYADSVKG DTDYGMDV
M10-B09
14,1 RASQSISTYLN GASSLQS QQSFSTPWT WYEMS RIWPSGGVTMYADSVKG TSITTVGMDV
M10-C11
5,3 RASQSISIYLN AASTLQS QQSHSIPPT MYPMM YISPSGGMTDYADSVKG VAGSSDAFDI
M10-D11
6,4 RSSQSLLHSNGYNYLD LGSNRAS MQALQTPLT AYPMN RISSSGGNTSYADSVKG GYLGY
M10-E06
32,8 RASQSISTYLN GASSLQS QQSYSDPYT LYRMF SIWSSGGPTMYADSVKG EYPSTYYFDY
M10-F09
4,8 RASQTIDDDLI AASSLQS QQSYNIPRT NYDMM YISPSGGFTRYADSVKG DIYYYNWGPSHYFDS
M10-G09
7,1 RASQSISGYIN AASSLQS QQYVSYPFT QYGMQ SIRSSGGATRYADSVKG DGYYDSSGYPDY
M11-A10
25 RASQSIDTYLN DASNL QHYLYAPYS NYWMM GIGSSGGFTSYADSVKG GSYSDYGVFES
M11-E01
11,7 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTPPT TYEMY GIGSSGGMTMYADSVKG EQPGIAALQF
M11-E04
43,2 RASQSISIYLT GAATLQT QQTFSLPRT MYHMN GIVSSGGVTFYADSVKG ITTVTTGGAFDI
M11-E05
41,4 RTSQTINNYLN ATHTLES QQSFAFPYT WYTMG WIYFGGLTTYADSVKG LGGPLDAFDI
M11-E06
12,6 RASRGIGTYLN AASSLET QESFTNVYN QYAMH SIYPSGGFTLYADSVKG GGWLAGGELLN
M11-G09
23,6 RTSQGINHYLN AASELQT QQTYTSPYT LYNMT YIYPSGGGTHYADSVKG DTGFWSADAFDI
M11-G12
4,9 RASQTISVYVN GASSLQS QQSYSIPFT QYPMN SISSSGGFTTYADSVKG EEQQGGFDY
M12-A08
40,4 RASQSISRYLN AASTLET QQSYSTPYT WYYMG WIVSSGGLTLYADSVKG TTVTTGDAFDI
M12-B04
18 RASQGIRNDLG AASILQS LQDYEYPLT LYSMY RIRPSGGGTVYADSVKG DPLYSSGDV
M12-C09
7 RASQSIGIYLN GASSLQS QHSYSTPFT SYAMV SIGSSGGFTLYADSVKG MNLGGGDAFDI
Nombre inicial
ELISA de pCal humana (T/B) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M12-C10
8,3 SGDKLGEKYVS QDNKRPS QAWDSYTW DYEMH GISPSGGKTQYADSVKG DLKWGGRGSPDWYFDL
M12-D10
9,9 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTPPT NYPMD SISSSGGWTNYADSVKG DTSGSYLGFDY
M12-E06
48 RASQSISTYLN GAFSLQS QQSHSTPPT QYKML GIGPSGGLTAYADSVKG APWFGELGMDV
M27-A10
3,2 RASQSISAYLN YGVGSLQS QQGYTTPVT WYRMD SIWPSGGLTSYADSVKG GWAPGGDAFDI
M27-B01
33,1 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTPYT DYTMW SISSSGGITFYADSVKG SADTAMGGAFDI
M27-B12
2,3 SGDKLGDEYAA QDRKRPS QAWGKRNW WYQMM SISPSGGITEYADSVKG DRSSGWYYYGMDV
M27-E03
35,9 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTPRT SYMMH GIYPSGGWTDYADSVKG LVAGLDAFDI
M27-F04
10,5 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTPPT WYPMT SIGPSGGQTIYADSVKG EYGDYGGGFDP
M27-F11
10 RASQGISSYLA AASSLQS QQSYNTLRT SYHMM SIYPSGGATMYADSVKG DGYHYGDYTYFQH
M27-G01
31,4 RASQSISTYLN GASSLQS QQSYSDPYT LYRMF SIWSSGGPTMYADSVKG EYPSTYYFDY
M27-G04
4,1 RASQRISYYLT AASSLES QQAFSTPFT AYYMV YISPSGGQTQYADSVKG EAISSSSFDY
M27-G09
2,2 RTRQSISNYLN AASSLQS QQSYDIPFT EYDMA YIVSSGGFTSYADSVKG WAGWIAAADY
M27-H10
12,4 RASQSISNYLN AASSLQS QQSYSTPQT AYQMA VIYSSGGYTDYADSVKG HNWNDGAFDI
M28-A01
19 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTLT WYAMH GIYSSGGYTKYADSVKG DLSNGDDVFDI
M28-C03
2,2 RASQSINFYLN VASSLES LQSYSAPYT YYQMG SIYPSGGMTDYADSVKG GSPWGDDAFDI
M28-D02
3,7 RTSRRIGTYLN GASSLQS QQSFSSPWT WYPMQ YIYPSGGGTDYADSVKG SSGWLGDAFDI
M28-D12
41,6 RASQSIATYLN AASSLQS QQSYSTRET WYTMH VIYPSGGPTSYADSVKG DGSGSYLGFDY
M28-E01
41 RASQSISSYLN AASSLQS QQTYTTPWT SYPMG RISSSGGMTIYADSVKG DDWNVGMDV
M28-E11
29,3 RASQDISNWLA AASSLQT QQSYSLPWT LYDMT GISSSGGVTIYADSVKG TYYYDSSGYADAFDI
M28-F01
1,5 RASQSINTYLN AASTLES QQSYSTPPT VYLMH GISPSGGYTQYADSVKG PGGLDAFDI
M28-F05
31,4 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTPLT RYIMW GIYSSGGYTQYADSVKG ELEGLGGFDY
Nombre inicial
ELISA de pCal humana (T/B) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M28-F07
33 RASQGISSWLA ATSGLQS QQAKSFPLT DYTMY SIVPSGGHTLYADSVKG DHLSSWYGGFFDY
M29-C07
5,2 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTRYT GYDMM VISSSGGNTAYADSVKG ESSGLYYFDY
M29-D10
23,6 RASQSITIYLN GASNLHS QQSYDTPLT WYPMY SIGSSGGPTPYADSVKG WADYGGSLDY
M29-E02
2 SGSSSNIGNNAVS YDDLLPS AAWDDSLNGFV RYPMM VIYPSGGDTFYADSVKG GDDYLWEAAVY
M29-G08
40,4 RASQNIGNDVA HASTRAY QQFYDWPAHT YYHMW GISPSGGFTFYADSVKG DYYYDSSGYSPLGY
M29-G10
16,4 RASQSISIYLN GASQLES QQSYNVPYT FYKMI SISSSGGSTQYADSVKG DRVDLGYLDY
M74-A07
8,6 RTSQNINTYLN GVSSLHR QQSYSSPWT QYLMM SIYPSGGYTSYADSVKG VSTAVADNDY
M76-F02
6,4 RASQTIDNYLH DASSLQS QQSYDTPQYT LYDMN GISPSGGQTMYADSVKG QPMISAFDI
M76-G02
10,3 RASQSISSYLN AASSLQS QQSYSTPPWT LYAMW YISSSGGFTSYADSVKG YRVGVAATDY
M76-G06
11,8 RASQSISTYLN AASSLQS QQSYSTPHT GYIMH WIYPSGGWTEYADSVKG DAPGVGAIDY
M76-H02
13,4 RASQDISVYLN GGASLQS QQSYSLPFT MYWMQ YIYPSGGPTKYADSVKG PSGSYGDAFDI
M77-C07
16,1 RASQNISSYLN AASSLQS QQSYSTPRT LYIMG GIYPSGGFTMYADSVKG ESSGVAAPDY
M77-H04
7,6 RSSQSLLHSRGYNYLD LGSNRAS MQALQRRT YYTMI GIRSSGGGTRYADSVKG DGSRYSYGSIYYYYGMDA
Abreviaturas usadas: "T/B" es la señal de ELISA obtenida usando la "diana" (calicreína plasmática biotinilada) dividida entre la señal de ELISA del "fondo" (estreptavidina); ambas de las cuales se recubrieron sobre placas de microtitulación. "nd" es no determinado. El símbolo "q" se refiere al codón de terminación supresible ámbar (TAG), que se traduce como glutamina (Q) en cepas de E. colitales como las células TG1 que se usaron para expresar los fragmentos Fab.
Se muestran a continuación las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) de agentes de unión de anticuerpos pCal.

M6-A06 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDSV TISCRASQSI SRFSGSGPGG TDFTLTISSL QPEDFATYYC

M6-A06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED STKGPSVFPL APSSKS

M6-A08 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQRI SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PKDFGTYYCQ

M6-A08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED SASTKGPSVF PLAPSSKS

M6-D03 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ

M6-D03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED STKGPSVFPL APSSKS

M6-D08 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDSATYYCQ

M6-D08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED ASTKGPSVFP LAPSSKS

M6-G05 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI STISGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ

M6-G05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED ASTKGPSVFP LAPSSKS

M8-C04 LC
QSALTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW
SMYLNWYQHK
PGKAPKLLIY GTSSLQSGVP SO
QQSYSAPWTF
GQGTKVEIK 10 9
LYQlylTitíVRQA
PGKGLEWVSG IWPSGGFTDY 60
TAVYYCARVS
TAVADNDYWG QGTLVTVSSA 120
136
SFYLNWFQQK
PGKAPNLLIY GASSLQSGVP 60
QTFSTFKTFG
QGTKLEIK 108
PYPMQWVRQA
PGKGLEWVSS ISSSGGMTEY 60
TAVYYCARDD
yggkggafdi WGQGTMVTVS 120
138
SSYltKMYQQK
PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
qsystlhtfG
QGTKVEIK 108
KYFMGWVRQA
PGKGLEWVSV IGSSGGWTSY 60
TAVYYCARVS
TAVADNDYWG QGTLVTVSSA 120
136
SSYLNWYqQK
PGKAPKLLIY GASSLQSGVP 60
QSYTRWTFGQ
GTKVEIK 107
RYHMVWVRQA
PGKGLEWVSS ISPSGGWTNY 60
TAMYYCAREM
ATIAGQFDPW GQGTLVTVSS 120
137
STYLNWYQLK
PGKAPKLLIY NAFSMERGVP 60
QSYTXFTTFG
QGTKVEIK 108
RYRMVjtfVRQA
PGKGLEWVSS IYPSGGMTAY 60
TAVYYCARDA
VGIGDAFDIW GQGTMVTVSS 120
137
YTSWHQQKPG
QSPVLVIYQD SKRPSGIPER 60
DSSTVFGGGT
RLTVL 105
M8-C04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YY PMQWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGLTSY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARLF YGSGSVGFEY WGQGTLVTVS 120
SASTKGPSVE
PLAPSSKS 138
M8-D05
LC
QDIQMTQSPS
FVSASVGDRV TITCRASQDI SSWLVWYQQK PGKGPKLLIY DASNLQSGVP 60
SRFSGGGSGT
HFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QADGFPLTFG GGTKVEMK 108
M8-D05
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYNMNWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGFTDY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL DLGILDYV7GQ GTLVTVS SAS 120
TKGPSVFPLA
PSSKS 135
M8-E06
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTLMYTF GQGTKLEIK 109
M8-E06
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYFMTWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGMTQY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDS YSSSWFDIWG QGTMVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M8-G09
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDTV TITCRASQGV SYYLAWFQQK PGKAPKSLIY GASSLQSGVP 60
SKFSGSGSGT
VFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYPPTFG QGTRLDIK 108
M8-G09
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYEMLWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGYTDY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARSF SGFGEIDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M8-H04
LC
QDIQMTQSPS
SLSASIGDRV TITCRASQYI STYLNWYEQK PGKAPKLLIY GTSSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
EFSLTISSLQ PEDFATYYCQ QSFTTPFTFG QGTKLEIK 108
M8-H04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYWMGWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGWTQY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCARDD EIAAGGAFDI W GQGAMV TV S 120
SASTKGPSVE
PLAPSSKS 138
M9-A03
LC
QDIQMTQSPS
SLSASLGDRV TITCRASQNI DIYLNWYQQT PGKAPKLLIY GAYNLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTLSSLQ PEDFGTYYCQ QSYGTPVFGQ GTKLEIK 107
M9-A03
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GY FMMWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGYTDY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREV AGTYAFDIWG QGTMVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M9-A08
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TVTCRASQRI STYLNWYQQK PGKAPKLLIS GASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QSYNTPRTFG QGTKVEIR 108
M9-A08
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYEMWWVRQA PGKGLEWVSY IGSSGGSTSY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTGGN SSSFDAFDIW GQGTMVTVSS 120
ASTKGPSVFP
LAPSSKS 137
M9-C08
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI SIYVNWYQQK PGKAPNLLIF AASSLQRGVP 60
SRFSGSGSGA
DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSFSTPLTFG GGTKVEIK 108
M9-C08
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HY GMVWVRQA PGKGLEWVSY IVPSGGLTYY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKWTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVD YTGDGLGYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M9-C10
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQGI SSYLNWYQQK PGNAPNLLIY GASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ ESYSTLFTFG PGTTVETK 108
M9-C10
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LY PMQWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGMTFY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTREV GAAGFAFDIW GQGTMVTVSS 120
ASTKGPSVFP
LAPSSKS 137
M9-D08
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TLTCRASRTI SFYLNWYQQK AGKAPELLIY GGSSLHSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFSLTISNLQ PEDIAVYYCQ QSFSSPWTFG QGTKVEIK 108
M9-D08
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYKMMWRQA PGKGLEWVSS IYPSGGWTNY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTRGS PWGDDAFDIW GQGTMVTVSS 120
ASTKGPSVFP
LAPSSKS 137
M9-E04
LC
QDIQMIQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI SGYLNWYQQR SGKAPKLLIF AASNLQTGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTINNLQ PEDFATYYCQ QSHTPPKTFG PGTKVDIK 108
M9-E04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS EY DMMWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGMTYY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDQ VAAAAIDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M9-F08
LC
QDIQMTqSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPYTF GQGTKLEIK 109
M9-F08
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYAMTWVRQA PGKGLEWYSV IYPSGGFTDY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCARAS GSYLDAFDIW GQGTMVTVSS 120
ASTKGPSVFP
LAPSSKS 137
M9-F09
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DYTLTISSLQ PEDFATYYCQ QTYTTPWTFG QGTKVEIK 108
M9-F09
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS S Y FMGWVRQA PGKGLEWVSR ISSSGGMTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDD WNVGMDVWGQ GTTVTVSSAS 120
TKGPSVFPLA
PSSKS 135
M9-F10
LC

M9-F10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYDMEWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGSTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG LLTAFDIWGQ GTMVTVSSAS 120

TKGPSVFPLA PSSKS 135

M9-G08 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPITFG GGTKVEIK 108

M9-G08 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYTMLMVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGFTMY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVD TAMAMIDYWG QGTLVTVSSA 120

STKGPSVFPL APSSKS 136

M9-H02 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV IITCRASRSI ATYLNWYQQK PGKAPNLLIF GASTLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISDLQ PEDFATYYCQ QSFSDPYTFG QGTNLEMK 108

M9-H02 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYMMIWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGVTMY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGT VGASDAFDIW GQGTMVTVSS 120

ASTKGPSVFP LA.PSSKS 137

M9-H03 LC

QYELTQAPSV SVAPGQTASI TCSGDKLGMR YTSWYQQKPG QSPVLVIFQD NKRPSGIPER 60

FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAL DSNTYVFGTG TKVTVL 106

M9-H03 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYSMGWVRQA PGKGLEWVSY IVPSGGYTMY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDP GVSYYYYGMD VWGQGTTVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M9-H04 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPTFG QGTRLEIK 108

M9-H04 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYTMWWVRQA PGKGLEWVSS IWPSGGSTFY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARTY DSSAGEVDYW GQGTLVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKS 137

M10-A03 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQRI SFYLNWFQQK PGKAPNLLIY GASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PKDFGTYYCQ QTFSTPNTFG QGTKLEIK 108

M10-A03 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYPMQWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGMTEY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDD YGGKGGAFDI WGQGTMVTVS 120

SASTKGPSVF PLAPSSKS 138

M10-A12 LC

QDIQMTQSPL SLSAFVGDRV TITCRASRDI SVYLNWYQLK SGKAPKLLIY GASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTITSLQ PEDFATYYCQ QSYSIPFTFG GGTKVETK 108

MIO-Al 2 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYLMHWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGFTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDT DYGMDVWGQG TTVTVSSAST 120

KGPSVFPLAP SSKS 134

M10-E09 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDGV TITCRASQSI STYLNWYQQR PGKAPKLLIY GASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ REDFATYYCQ QSFSTPWTFG QGTRVEIK 108

M10-B09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYEMSWVRQA PGKGLEWVSR IWPSGGVTMY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LqMNSLRAED TAVYYCTRTS ITTVGMDVWG QGTTVTVSSA 120

STKGPSVFPL APSSKS 136

M10-C11 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SIYLNWYQQK PEKAPKLLIF AASTLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISNLQ PEDFATYYCQ QSHSIPPTFG LGTKVEVK 108

M10-C11 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS MYPMMWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGMTDY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARVA GSSDAFDIWG QGTMVTVSSA 120

STKGPSVFPL APSSKS 136

MIO-Di1 LC

QDIQMTQSPL SLPVTPGEPA SISCRSSQSL LHSNGYNYLD WYLQKPGQSP QLLIYLGSNR 60

ASGVPDRFSG SGSGTDFTLK ISRVEAEDVG VYYCMQALQT PLTFGPGTKV HIK 113

MIO-DI1 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYPMNWVRQA PGKGLEWVSR ISSSGGNTSY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCALGY LGYWGQGTLV TVSSASTKGP 120

SVFPLAPSSK S 131

M10-E06 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI STYLNWYQQK PGKAPKLLIY GASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFTIYYCQ QSYSDPYTFG QGTKLDIK 108

M10-E06 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYRMFWVRQA PGKGLEWVSS IWSSGGPTMY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TñVYYCAREY PSTYYFDYWG QGTLVTVSSA 120

STKGPSVFPL APSSKS 136

M10-F09 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQTI DDDLIWYQQK PGRAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTITSLQ PEDFATYYCQ QSYNIPRTFG QGTKLESK 108

M10-F09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYDMMWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGFTRY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCAKDI YYYNWGPSHY FDSWGQGTLV 120

TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S 141

M10-G09 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDSV TITCRASQSI SGYINWYQQK AGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT HFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QYVSYPFTFG PGTKVDIK 108

M10-G09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYGMQWVRQA PGKGLEWVSS IRSSGGATRY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDG YYDSSGYPDY WGQGTLVTVS 120
SASTKGPSVF
PLAPSSKS 138
Mil-Al 0
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV AITCRASQSI DTYLNWYQQK PGKAPKLLIY DASNLEIGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTFIINSLQ PEDVATYYCQ HYLYAPYSFG QGTKLEIK 108
Mil-Al 0
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYWMMWVRQA PGKGLEWVSG IGSSGGFTSY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKWTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKGS YSDYGVFESW GQGTLVTVSS 120
ASTKGPSVFP
LAPSSKS 137
M11-E01
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPTFG QGTKVEIK 108
Mll-EOl
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYEMYWVRQA PGKGLEWVSG IGSSGGMTMY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKWTLY LQMNSLRAED TAMYYCAREQ PGIAALQFWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M11-E04
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI SIYLTWYQHR PGKAPNLLIY GAATLQTGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTIRGLQ PEDFATYYCQ QTFSLPRTFG QGTKLEIK 108
M11-E04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS MYHMNWRQA PGKGLEWVSG IVSSGGVTFY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARIT TVTTGGAFDI WGQGTMVTVS 120
SASTKGPSVF
PLAPSSKS 138
M11-E05
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDTV TITCRTSQTI NNYLNWYQQR PGEAPKVLIY ATHTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTIGSLQ PEDFATYYCQ QSFAFPYTFG QGTKVEIT 108
M11-E05
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WY TMGWVRQA PGKGLEWVSW IYFGGLTTYA 60
DSVKGRFTIS
RDKSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARLGG PLDAFDIWGQ GTMVTVS SAS 120
TKGPSVFPLA
PSSKS 135
M11-E06
LC
QDIQMTQSPS
SLSASIGDRV TISCRASRGI GTYLNWYQQH AGKAPKLLIR AASSLETGVP 60
PRFSGSGSGT
DFTLTISSLQ SDDFATYYCQ ESFTNVYNFG QGTKLEIK 108
M11-E06
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYAMHWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGFTLY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCARGG WLAGGELLNW GQGTLVTVSS 120
ASTKGPSVFP
LAPSSKS 137
M11-G09
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRTSQGI NHYLNWYQQK PGKAPKILVF AASELQTGVP 60
SRFSGTGSGT
SYTLTITSLQ PEDVATYYCQ QTYTSPYTFG QGTKLEVK 108
M11-G09
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYNMTWVRQA FGKGLEWVSY IYFSGGGTHY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDT GFWSADAFDI WGQGTMVTVS 120
SASTKGPSVF
PLAPSSKS 138
M11-G12
LC

M11-G12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYPMNWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGFTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE QQGGFDYWGQ GTLVTVSSAS 120

TKGPSVFPLA PSSKS 135

M12-A08 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SRYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASTLETGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTITTLQ PEDFVIYYCQ QSYSTPYTFG QGTKLEIK 108

M12-A08 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYYMGWVRQA PGKGLEWVSW IVSSGGLTLY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCARTT VTTGDAFDIW GQGTMVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKS 137

M12-B04 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQGI RNDLGWYQHK PGKAPKLLIY AASILQSGVP 60

SRFSGTASGT DFTLTISSLQ PEDFATYFCL QDYEYPLTFG GGTKLDIK 108

M12-B04 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYSMYWVRQA PGKGLEWVSR IRPSGGGTVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDP LYSSGDVWGQ GTTVTVSSAS 120

TKGPSVFPLA PSSKS 135

M12-C09 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI GIYLNWYHQK PGKAPNLLIY GASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PGDFATYYCQ HSYSTPFTFG GGTKVEIK 108

M12-C09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMVWRQA PGKGLEWVSS IGSSGGFTLY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASMN LGGGDAFDIW GQGTMVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKS 137

M12-C10 LC

QSALTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGEK YVSWYQQKPG QSPWVIYQD NKRPSGIPER 60

FSGSNSGNTA TLTISGTQAV DEADYYCQAW DSYTWFGGG SKLTVLGQPK 110

M12-C10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYEMHWVRQA PGKGLEWVSG ISPSGGKTQY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL KWGGRGSPDW YFDLWGRGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M12-D10 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPTFG GGTKVEIK 108

M12-D10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYPMDWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGWTNY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCATDT SGSYLGFDYW GQGTLVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKS 137

M12-E06 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV SITCRASQSI STYLNWYQHK PGKAPTLLIY GAFSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT DFALTISSLQ PEDFATYYCQ QSHSTPPTFG QGTRVEIK 108

M12-E06 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYKMLWVRQA PGKGLEWVSG IGPSGGLTAY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARAP WFGELGMDVW GQGTTVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKS 137

M27-A10 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SAYLNWYQQK PGKAPQLLMY GVGSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYFCQ QGYTTPVTFG GGTKVEIK 108

M27-A10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYRMDWRQA PGKGLEWVSS IWPSGGLTSY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGW APGGDAFDIM GQGTMVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKS 137

M27-E01 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPYTFG QGTKLEIK 108

M27-B01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYTMWWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGITFY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARSA DTAMGGAFDI WGQGTMVTVS 120

SASTKGPSVF PLAPSSKS 138

M27-B12 LC

QYELTQPPAV SVSPGQTATI TCSGDKLGDE YAAWYQQKPG QSPVLVIYQD RKRPSGIPER 60

FSGSNFGNTA TLTITGTQVM DEADYYCQAW GKRNWFGGG TKLTVL 106

M27-B12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYQMMWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGITEY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDR SSGWYYYGMD VWGQGTTVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M27-E03 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPRTFG QGTKVEIK 108

M27-E03 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYMMHWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGWTDY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TñTYYCARLV AGLDAFDIWG QGTMVTVSSA 120

STKGPSVFPL APSSKS 136

M27-F04 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPTFG QGTKVEIK 108

M27-F04 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYPMTWVRQA PGKGLEWVSS IGPSGGQTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTTEY GDYGGGFDPW GQGTLVTVSS 120

ASTKGPSVFP LA.PSSKS 137

M27-F11 LC

QDIQMTQSPS FLSASVGDRV TITCRASQGI SSYLAWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYNTLRTFG PGTKVDLK 108

M27-F11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYHMMWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGATMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCARDG YHYGDYTYFQ HWGQGTLVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M27-G01
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI STYLNWYQQK PGKAPKLLIY GASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTISSLQ PEDFTIYYCQ QSYSDPYTFG QGTKLDIK 108
M27-G01
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYRMFWVRQA PGKGLEWVSS IWSSGGPTMY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKWTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREY PSTYYFDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M27-G04
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQRI SYYLTWYQQK PGKVPKLLIY AASSLESGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTISNLQ PEDFATYYCQ QAFSTPFTFG GGTKVEIK 108
M27-G04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYYMVWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGQTQY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREA ISSSSFDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M27-G09
LC
QDIQMTQSPS
SVSASVGDRI TITCRTRQSI SNYLNWYQQK PGEPPKLLIF AASSLQSGVP 60
SRFSGSGTGT
EFTLTISSLQ PEDLAIYYCQ QSYDIPFTFG QGTKLEIK 108
M27-G09
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS E Y DMA WR QA PGKGLEWVSY IVSSGGFTSY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTTWA GWIAAADYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M27-H10
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI SNYLNWYQQK PGKAPKFLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLSISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPQTFG QGTKVEMK 108
M27-H10
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYQMAWVRQA PGKGLEWVSV IYSSGGYTDY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARHN WNDGAFDIWG QGTMVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M28-A01
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTLTFGG GTKVEIK 107
M28-A01
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMHWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGYTKY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL SNGDDVFDIW GQGTMVTVSS 120
ASTKGPSVFP
LAPSSKS 137
M28-C03
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI NFYLNWYQQK PGKAPKLLIY VASSLESGVP 60
SRFSGSASGT
EFTLTISSLQ PEDFATYYCL QSYSAPYTFG QGTKVEIT 108
M28-C03
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YY QMGWVRQA PGKGLEWVSS IYFSGGMTDY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTRGS PWGDDAFDIW GQGTMVTVSS 120
ASTKGPSVFP
LAPSSKS 137
M28-D02
LC

M28-D02 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYPMQWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGGTDY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCATSS GWLGDAFDIW GQGTMVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKS 137

M28-D12 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI ATYLNWYQQK PGRAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFVGGGSGS GTHFTLTISS LQPEDFATYY CQQSYSTRET FGQGTKVEIK 110

M28-D12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMHWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGPTSY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCARDG SGSYLGFDYW GQGTLVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKS 137

M28-E01 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SKFSGSGSGT DYTLTISSLQ PEDFATYYCQ QTYTTPWTFG QGTKVEIK 108

M28-E01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYPMGWVRQA PGKGLEWVSR ISSSGGMTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDD WNVGMDVWGQ GTTVTVSSAS 120

TKGPSVFPLA PSSKS 135

M28-E11 LC

QDIQMTQSPS SVSASVGDRV TINCRASQDI SNWLAWYQQK PGKAPNLLIY AASSLQTGAP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFGTYVCQ QSYSLPWTFG LGTKVEVR 108

M28-E11 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYDMTWRQA PGKGLEWVSG ISSSGGVTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARTY YYDSSGYADA FDIWGQGTMV 120

TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S 141

M28-F01 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI NTYLNWYQQK PGKAPKVLIH AASILESGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPTFG QGTKVEIK 108

M28-F01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYLMHWRQA PGKGLEWVSG ISPSGGYTQY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARPG GLDAFDIWGQ GTMVTVSSAS 120

TKGPSVFPLA PSSKS 135

M28-F05 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPLTFG GGTKVEIK 108

M28-F05 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYIMWWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGYTQY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCAREL EGLGGFDYWG QGTLVTVSSA 120

STKGPSVFPL APSSKS 136

M28-F07 LC

QDIQMTQSPS SVSASVGDRV TITCRASQGI SSWLAWYQQK PGKAPKLLIY ATSGLQSGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QAKSFPLTFG GGTRVEIK 108

M28-F0V HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYTMYWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGHTLY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDH LSSWYGGFFD YWGQGTLVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M29-C07 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTRYTFG QGTKLEIK 108

M29-C07 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYDMMWVRQA PGKGLEWVSV ISSSGGNTAY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARES SGLYYFDYVíG QGTLVTVSSA 120

STKGPSVFPL APSSKS 136

M29-D10 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDTV SITCRASQSI TIYLNWYQHK PGKAPNLLIY GASNLHSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYDTPLTFG GGTKVEIK 108

M29-D10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYPMYWRQA PGKGLEWVSS IGSSGGPTPY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARWA DYGGSLDYWG QGTLVTVSSA 120

STKGPSVFPL APSSKS 136

M29-E02 LC

QSVLTQPPSV SEAPRQRVTI SCSGSSSNIG NNAVSWYQQL PGKAPKLLIY YDDLLPSGVS 60

DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCA AWDDSLNGFV FGTGTKVTVL 110

M29-E02 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYPMMWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGDTFY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASGD DYLWEAAVYW GQGTLVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKS 137

M29-G08 LC

QDIQMTQSPA TLSASPGETV TLSCRASQNI GNDVAWYRQR PGQAPRLLIH HASTRAYGIP 60

ARLRGSGSAT EFTLTITSLE PEDFAIYYCQ QFYDWPAHTF ALGTRLEIKR 110

M29-G08 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYHMWWVRQA PGKGLEWVSG ISPSGGFTFY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDY YYDSSGYSPL GYWGQGTLVT 120

VSSASTKGPS VFPLAPSSKS 140

M29-G10 LC

QDIQMTQSPS SLSSSVGDSA TITCRASQSI SIYLNWYQQK PGKAPKILIY GASQLESGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTVSGLQ PEDFATYWCQ QSYNVPYTFG QGTKLEIK 108

M29-G10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS FYKMIWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGSTQY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDR VDLGYLDYWG QGTLVTVSSA 120

STKGPSVFPL APSSKS 136

M74-A07 LC

QDIQMTQSPS SLSASVRDRV TITCRTSQNI NTYLNWYYQA PGRAPKLLIF GVSSLHRGVS 60

SRFSGSGDGT EFTLTISSLQ PEDIGTYFCQ QSYSSPWTFG QGTKVEIK 108

M74-A07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYLMMWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGYTSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVS TAVADNDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M76-F02
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQTI DNYLHWYQQK PGKAPKVLIH DASSLQSGVP 60
PRFSGSGSGT
DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYDTPQYTF GQGTKLEIK 109
M76-F02
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYDMNWRQA PGKGLEWVSG ISPSGGQTMY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARQP MISAFDDWGQ GTMVTVSSAS 120
TKGPSVFPLA
PSSKS 135
M76-G02
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPWTF GQGTKVEIK 109
M76-G02
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYAMWWVRQA PGKGLEWVSY ISSSGGFTSY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARYR VGVAATDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M76-G06
LC
QDIQMTQSPS
SLSASVRDRV TITCRASQSI STYLNWYQQK PGEAPKLLVF AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLSISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPHTFG QGAKVEIK 108
M76-G06
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYIMHWVRQA PGKGLEWVSW IYPSGGWTEY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVY Y CARDA PGVGAIDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M76-H02
LC
QDIQMTQSPS
SLSASEGDRV TITCRASQDI SVYLNWYQMK SGKAPKLLIY GGASLQSGVP 60
ARFSGSGYGT
DFTLTITDLR PEDFATYYCQ QSYSLPFTFG GGTKVEIK 108
M76-H02
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS MYWMQWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGPTKY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARPS GSYGDAFDIW GQGTMVTVSS 120
ASTKGPSVFP
LAPSSKS 137
M77-C07
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQNI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT
DFTLTISSLQ PEDFATYSCQ QSYSTPRTFG QGTKVEIK 108
M77-C07
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYIMGWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGFTMY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARES SGVAAPDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL
APSSKS 136
M77-H04
LC
QDIQMTQS PL
SLPVTPGEPA SISCRSSQSL LHSRGYNYLD WYLQKPGQSP QLLIYLGSNR 60
ASGVPDRFSG
SGSGTDFTLK ISRVEAEDVG VYYCMQALQR RTFGQGTKLE IK 112
M77-H04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYTMIWVRQA PGKGLEWVSG IRSSGGGTRY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDG SRYSYGSIYY YYGMDAWGQG 120
TTVTVSSAST
KGPSVFPLAP SSKS 144
EJEMPLO 2: Inhibidores de partida de anticuerpos
Se seleccionaron anticuerpos como inhibidores de partida de calicreína plasmática basándose en la constante de inhibición aparente (Ki,ap), especificidad con respecto a la ausencia de inhibición de otras serina proteasas, inhibición 5 de la generación de bradiquinina y ausencia de unión a precalicreína plasmática (Tabla 3). La calicreína plasmática circula en el plasma como un zimógeno inactivo (precalicreína) a una concentración de aproximadamente 500 nM. Los anticuerpos que se unieron a precalicreína se pueden volver inaccesibles hacia la inhibición de calicreína plasmática activa y podrían aumentar sustancialmente la dosis in vivo requerida para la eficacia. Por tanto, se usó un ensayo de resonancia de plasmones superficiales (SPR) para identificar anticuerpos que no se unen a precalicreína 10 (datos no mostrados). Específicamente, se capturaron IgG humanas (X81-B01, M162-A04 (R84-H05); M160-G12 (R84-D02); y M142-H08) en un chip CM5 usando una superficie anti-Fc humana y 100 nM de calicreína plasmática o precalicreína 100 nM o 500 nM. La precalicreína se trató con aprotinina-Sepharose para retirar la calicreína plasmática activa. La precalicreína usada para X81-B01 se cambió de tampón en la preparación exacta de tampón de electroforesis SPR (solución salina tamponada con HEPES) para evitar el desplazamiento del índice de refracción
5
10
15
20
25
30
que se observó con los otros tres anticuerpos que se probaron: M162-A04 (R84-H05); M160-G12 (R84-D02); y M142-H08.
De los anticuerpos enumerados en la Tabla 3, solo M142-H08 inhibe la calicreína plasmática humana con una Ki,ap subnanomolar. Sin embargo, cuando M142-H08 se produjo como una IgG, se encontró que se escindió en la CDR3 de la cadena pesada. Por consiguiente, los presentes inventores decidieron realizar dos enfoques para mejorar la afinidad: 1) maduración por afinidad de M162-A04 y M160-G12 usando una novedosa forma de barajado de cadenas ligeras denominado ROLIC (optimización rápida de cadenas ligeras, por la expresión inglesa Rapid Optimización of Light Chains) (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2009/102927 y US 2009-0215119); y 2) optimización de secuencias de M142-H08 con el fin de prevenir la escisión de la IgG que ocurre mientras que se retiene las propiedades de unión e inhibidoras de M142-H08.
Tabla 3. Inhibidores de anticuerpos de alto rango de pCal antes de la maduración por afinidad u optimización
de secuencias
Criterios
M162-A04 M160-G12 M142-H08a
Ki,ap de pCal humana
2 nM (como una IgG) 5,6 nM (como una IgG) 0,6 nM (como un Fab)
Ki,ap de pCal de roedor
2 nM (ratón y rata) <1 nM (ratón) ~ 1 nM (ratón y rata)
¿Se une a precalicreína?
No No No
Inhibidor específico con respecto a fXIa, plasmina y tripsina
Sí Sí Sí
Inhibe la generación de bradiquinina
Sí Sí Sí
aCuando M142-H08 se produjo como una IgG, se determinó que se escindía en la CDR3 de su cadena pesada (GGLLLWFR-ELKSNYFDY
EJEMPLO 3: Secuencia Optimización de M142-H08
De los anticuerpos enumerados en la Tabla 3, solo M142-H08 inhibe pCal humana con una Ki,ap subnanomolar. Sin embargo, cuando M142-H08 se produjo como una IgG, se encontró que se escindía en la CDR3 de la cadena pesada. Se encontró por espectrometría de masas que M142-H08 se escindía después de la arginina en la secuencia "WFR" de la secuencia de HC-CDR3 (GGLLLWFRELKSNYFDY). Esta escisión sugiere que una proteasa de las células usadas para expresar el anticuerpo (tanto células CHO como 293T de riñón humano) escinde enzimáticamente el anticuerpo en un único sitio específico. Los presentes inventores mutaron la secuencia de HC- CDR3 de M142-H08 con el fin de identificar sustituciones de aminoácidos que previnieran la escisión de la IgG que ocurre mientras se retiene las propiedades de unión e inhibidoras de M142-H08. Experiencia previa con anticuerpos similarmente "acortados" sugirieron que centrarse simplemente en la posición P1 original (subsitio 1 de proteasa, véase la Tabla 4) puede no ser suficiente para identificar anticuerpos que retienen potente inhibición de la enzima diana mientras que no se acortan por una proteasa de la célula hospedadora. Por tanto, los presentes inventores crearon una pequeña biblioteca de mutaciones puntuales individuales en la región alrededor del sitio de escisión con el fin de identificar variantes de M142-H08 que no son acortadas, pero son todavía potentes inhibidores de pCal. Los presentes inventores se refieren a esta biblioteca como la biblioteca "CDR3 por diseño". La pequeña biblioteca se construyó usando un cebador de PCR que contiene el codón aleatorizado NNK en cualquiera del sitio P3, P2, P1 o P1'. Esto da como resultado una pequeña biblioteca donde cada una de las 4 posiciones puede contener cualquiera de los 20 aminoácidos (20 + 20 + 20 + 20 = 80 miembros). Usando PCR, esta biblioteca se clonó en la secuencia de Fab de M142-H08 en el vector pMid21, que es un vector de fagémido patrón.
Tabla 4. Secuencias de cebadores
Nombre del cebador
Secuencia N
P3 P2 P1 Pl' P2' GGLLLWFR3LK S N Y
559A.P1 .top
GGC GGT CTA TTA CTA TGG TTC NNK GAG CTG AAG TCT AAC TAC 20
5
10
15
20
25
30
Nombre del cebador
Secuencia N
559A.P2.top
GGC GGT CTA TTA CTA TGG NNK AGG GAG CTG AAG TCT AAC TAC 20
559A.P3.top
GGC GGT CTA TTA CTA NNK TTC AGG GAG CTG 20
AAG TCT AAC TAC
559A.P1p.top
GGC GGT CTA TTA CTA TGG TTC AGG NNK CTG 20
AAG TCT AAC TAC
Por secuenciación de ADN, los presentes inventores recuperaron 61 de los posibles 80 anticuerpos (Tabla 5). Estos anticuerpos se produjeron como fragmentos Fab en pequeña escala (~20 pg) y se probaron para la inhibición contra pCal humana en un ensayo de escisión por proteasa in vitro usando Pro-Phe-Arg-aminometilcumarina como el sustrato de péptido sintético. Los Fab que se encontró que eran inhibidores de pCal humana se subclonaron en el vector pBRHlf de los presentes inventores (un vector para la expresión transitoria de IgG en células 293T) para la conversión en anticuerpos IgG1 humana de longitud completa. Entonces se expresaron cinco anticuerpos en células 293T y se purificaron por cromatografía en proteína A Sepharose. Los anticuerpos se analizaron por SDS-PAGE para determinar que los mutantes inhibidores no se escinden por la(s) proteasa(s) de la célula hospedadora (datos no mostrados). Los anticuerpos escindidos (559A-X67-G05, 559A-X67-H01, 559A-X67-G09) tuvieron una banda adicional que migró entre el marcador de 38 y 49 kDa de peso molecular. Esta banda está ausente en los anticuerpos 559A-X67-H04 y 559A-X67-D03, que indica que estos anticuerpos están intactos.
Se determinaron valores de Ki,ap por cinética enzimática de estado estacionario para aquellos que se mostró por SDS-PAGE que no se habían escindido (Tabla 5). De forma interesante, la posición P2 fue la única posición donde las sustituciones de aminoácidos dieron inhibidores de anticuerpos intactos de pCal. De las 14 mutaciones diferentes que se recuperaron en la posición P3 (Tabla 5), solo se encontró que un mutante (W a L) era un inhibidor de pCal como un Fab, pero posteriormente se mostró que estaba acortado como una IgG. Ninguna de las 16 mutaciones diferentes en la posición P1 (Tabla 5) se encontró que fuera inhibidores de pCal. Se encontró que ocho de las 15 mutaciones diferentes en la posición P1' eran inhibidores de pCal como un Fab, pero todas se acortaron como una IgG. Por consiguiente, solo las mutaciones en la posición P2 condujeron a inhibidores de anticuerpo, que no se acortaron durante expresión. De las 16 mutaciones diferentes que se recuperaron en la posición P2 (Tabla 5), se encontró que ocho mutantes eran un inhibidor de pCal como un Fab, pero se mostró posteriormente que se acortaron como una IgG. Se encontró que cuatro mutantes en la posición P2 tenían valores de Ki,ap subnanomolares: X67-G04 (F a A), X67-C03 (F a M), X67-F01 (F a Q) y X67-D03 (F a N). El anticuerpo con la mayor potencia es X67- D03 (Ki,ap = 0,1 nM). Los dos anticuerpos mostrados en la Tabla 6 no se escindieron cuando se expresaron como IgG y se encontró que inhibieron pCal con una Ki,ap subnanomolar.
Se muestran en las FIGURAS 4 y 5, respectivamente, el ADN y el alineamiento de secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras de las versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones retromutadas a la línea germinal (X81-B01) del mismo anticuerpo usando maduración por afinidad ROLIC. Se muestran en las FIGURAS 6 y 7, respectivamente, el ADN y el alineamiento de secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de las versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones retromutadas a la línea germinal (X81-B01) del mismo anticuerpo usando maduración por afinidad ROLIC.
Tabla 5. Secuencias de HV-CDR3 obtenidas de la biblioteca "CDR3 por diseño" *
Sitio de mutación
I.D. de anticuerpo HV-CDR3 ¿Inhiben como un Fab? ¿Intactas como una IgG? Ki,ap como una IgG (nM)
Parental
X69-C09 GGLLLWFRELKSNYFDY Sí No 0,2
P3
X68-E07 GGLLLAFRELKSNYFDY No n/a n/a
P3
X68-E12 GGLLLCFRELKSNYFDY No n/a n/a
P3
X68-A03 GGLLLDFRELKSNYFDY No n/a n/a
P3
X68-E03 GGLLLEFRELKSNYFDY No n/a n/a
P3
X68-A12 GGLLLGFRELKSNYFDY No n/a n/a
P3
X68-D11 GGLLLKFRELKSNYFDY No n/a n/a
Sitio de mutación
I.D. de anticuerpo HV-CDR3 ¿Inhiben como un Fab? ¿Intactas como una IgG? Ki,ap como una IgG (nM)
P3
X68-E01 GGLLLLFRELKSNYFDY Sí No n/a
P3
X68-F05 GGLLLMFRELKSNYFDY No n/a n/a
P3
X68-D10 GGLLLPFRELKSNYFDY No n/a n/a
P3
X68-F10 GGLLLQFRELKSNYFDY No n/a n/a
P3
X68-G01 GGLLLRFRELKSNYFDY No n/a n/a
P3
X68-G05 GGLLLSFRELKSNYFDY No n/a n/a
P3
X68-F12 GGLLLTFRELKSNYFDY No n/a n/a
P3
X68-H04 GGLLLVFRELKSNYFDY No n/a n/a
P2
X67-G04 GGLLLWARELKSNYFDY Sí Sí 0,35
P2
X67-G01 GGLLLWCRELKSNYFDY No n/a n/a
P2
X67-E04 GGLLLWDRELKSNYFDY Sí Sí 1,3
P2
X67-H04 GGLLLWERELKSNYFDY Sí Sí 3,6
P2
X67-C09 GGLLLWGRELKSNYFDY Sí Sí 8,6
P2
X67-B04 GGLLLWKRELKSNYFDY Sí No n/a
P2
X67-G09 GGLLLWLRELKSNYFDY Sí No n/a
P2
X67-C03 GGLLLWMRELKSNYFDY Sí Sí 0,7
P2
X67-D03 GGLLLWNRELKSNYFDY Sí Sí 0,1
P2
X67-B05 GGLLLWPRELKSNYFDY No n/a n/a
P2
X67-F01 GGLLLWQRELKSNYFDY Sí Sí 0,9
P2
X67-G05 GGLLLWRRELKSNYFDY Sí No n/a
P2
X67-B03 GGLLLWSRELKSNYFDY Sí Sí 2,1
P2
X67-F10 GGLLLWTRELKSNYFDY Sí Sí 1,3
P2
X67-H01 GGLLLWWRELKSNYFDY Sí No n/a
P2
X67-F08 GGLLLWYRELKSNYFDY Sí No n/a
P1
X66-E09 GGLLLWFAELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-B05 GGLLLWFCELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-D03 GGLLLWFEELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-H04 GGLLLWFFELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-H02 GGLLLWFGELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-C11 GGLLLWFHELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-A07 GGLLLWFKELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-C03 GGLLLWFLELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-G05 GGLLLWFMELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-F10 GGLLLWFPELKSNYFDY No n/a n/a
Sitio de mutación
I.D. de anticuerpo HV-CDR3 ¿Inhiben como un Fab? ¿Intactas como una IgG? Ki,ap como una IgG (nM)
P1
X66-E04 GGLLLWFQELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-F01 GGLLLWFSELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-H11 GGLLLWFTELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-C02 GGLLLWFVELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-F09 GGLLLWFWELKSNYFDY No n/a n/a
P1
X66-G08 GGLLLWFYELKSNYFDY No n/a n/a
P1'
X69-D08 GGLLLWFRALKSNYFDY No n/a n/a
P1'
X69-B02 GGLLLWFRCLKSNYFDY No n/a n/a
P1'
X69-D09 GGLLLWFRGLKSNYFDY Sí No n/a
P1'
X69-D02 GGLLLWFRHLKSNYFDY No n/a n/a
P1'
X69-A12 GGLLLWFRKLKSNYFDY No n/a n/a
P1'
X69-F05 GGLLLWFRLLKSNYFDY Sí No n/a
P1'
X69-B08 GGLLLWFRNLKSNYFDY Sí No n/a
P1'
X69-A10 GGLLLWFRPLKSNYFDY No n/a n/a
P1'
X69-A09 GGLLLWFRQLKSNYFDY Sí No n/a
P1'
X69-E05 GGLLLWFRRLKSNYFDY No n/a n/a
P1'
X69-F09 GGLLLWFRSLKSNYFDY Sí No n/a
P1'
X69-F01 GGLLLWFRTLKSNYFDY Sí No n/a
P1'
X69-C12 GGLLLWFRVLKSNYFDY Sí No n/a
P1'
X69-E01 GGLLLWFRWLKSNYFDY Sí No n/a
P1'
X69-H10 GGLLLWFRILKSNYFDY No n/a n/a
*Todos estos anticuerpos son mutaciones puntuales únicas o la secuencia de M142-H08.
Se muestran a continuación las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (LC) y
cadena pesada (HC) de anticuerpos pCal con HC-CDR3 diseñadas.
X63-E07 LC QDIQKTQSPS
SLSAFVGDRV riTCRASQPI DWYLNHYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-E07 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
srdnskntly LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLAFRFLKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS 5KS 14 3
X68-E12 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DWY LNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-E12 HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLCFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X68-A03 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-A03 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLDFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X68-E03 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-E03 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLEFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X68-A12 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-A12 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLGFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
XS8-D11 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-D11 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTL
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLKFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X68-E01 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-E01 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLLFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X68-F05 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-F05 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLMFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X68-D10 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-D10 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLPFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X68-F10 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-F10 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLQFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X68-G01 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-G01 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLRFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X68-G05 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-G05 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNILY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLSFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X68-F12 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-F12 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLTFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X68-H04 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X68-H04 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLVFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X67-G04 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
X67-G04 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTI LVTVSSASTK
X67-G01 LC QDIQMTQSPS SRLSGSGFGT
X67-G01 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTI LVTVSSASTK
X67-EQ4 LC QDIQMTQSPS SRLSGSGFGT
X67-E04 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTI LVTVSSASTK
X67-H04 LC QDIQMTQSPS SRLSGSGFGT
XS7-H04 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTI LVTVSSASTK
X66-E09 LC QDIQMTQSPS SRLSGSGFGT
X66-E09 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTL LVTVSSASTK
X66-B05 LC QDIQMTQSPS
SRLSGSGFGT
X66-B05 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTI LVTVSSASTK
X66-D03 LC QDIQMTQSPS SRLSGSGFGT
X66-D03 HC
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
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SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
AY SMIWVRQA TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA
TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA
TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
PGKGLEWVSY
LLLWARELKS
PGKAPKLLIY GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWCRELKS
PGKAPKLLIY GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWDRELKS
PGKAPKLLIY GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWERELKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWFAELKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWFCELKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFEELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-H04 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-H04 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFFELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-H02 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-H02 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMHSLRAED TAVYYCARGG LLLWFGELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-C11 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-C11 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFHELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-A07 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-A07 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTL
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFKELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-C03 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-C03 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFLELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-G05 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-G05 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFMELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-F10 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-F10 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFPELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-E04 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-E04 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFQELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X69-D08 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X69-D08 HC EVQLLESGGG
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ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRALKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X69-B02 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X69-E02 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRCLKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X69-C09 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X69-C09 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X69-D09 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
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DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X69-D09 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRGLKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X69-D02 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
X69-D02 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTI LVTVSSASTK
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X69-A12 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTI LVTVSSASTK
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X69-A09 LC QDIQMTQSPS
SRLSGSGFGT
X69-A09 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTI LVTVSSASTK
X69-E05 LC QDIQMTQSPS SRLSGSGFGT
X69-E05 HC
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
AY SMIWVRQA TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA
TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA
TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
PGKGLEWVSY
LLLWFRHLKS
PGKAPKLLIY GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWFRKLKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWFRLLKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWFRNLKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWFRPLKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWFRQLKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRRLKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X69-F09 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X69-F09 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRSLKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X69-F01 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X69-F01 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRTLKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X69-C12 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X69-C12 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRVLKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
XS9-E01 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X69-E01 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTL
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRWLKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X69-H10 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X6S-H10 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRYLKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-F01 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-F01 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFSELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-H11 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-H11 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFTELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-C02 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-C02 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFVELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-F09 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-F09 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFWELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X66-G08 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X66-G08 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFYELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X67-C09 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-C09 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWGRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X67-B04 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT
DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-B04 HC EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWRQA PGKGLEWSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWKRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK
GPSVFPLAPS SKS 143
X67-G09 LC QDIQMTQSPS
SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
X67-G09 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTI LVTVSSASTK
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X67-D03 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTI LVTVSSASTK
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X67-F01 LC QDIQMTQSPS SRLSGSGFGT
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X67-G05 LC QDIQMTQSPS
SRLSGSGFGT
X67-G05 HC EVQLLESGGG ADSVKGRFTI LVTVSSASTK
X67-B03 LC QDIQMTQSPS SRLSGSGFGT
X67-B03 HC
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
LVQPGGSLRL
SRDNSKNTLY
GPSVFPLAPS
SLSAFVGDRV
DFTLTISSLQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
SCAASGFTFS
LQMNSLRAED
SKS
TITCRASQPI
PEDFGNYYCQ
AY SMIWVRQA TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA
TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA
TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
AYSMIWVRQA
TAVYYCARGG
DNYLNWYHQK
QSYTVPYTFG
PGKGLEWVSY
LLLWLRELKS
PGKAPKLLIY GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWMRELKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWNRELKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWPRELKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWQRELKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
PGKGLEWVSY
LLLWRRELKS
PGKAPKLLIY
GGTKVEIR
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
IRPSGGRTTY
NYFDYWGQGT
AASRLQSGVP
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108
60
120
143
60
108

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWSRELKS NYFDYWGQGT 120

LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X67-F10 LC

QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60

SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-F10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWTRELKS NYFDYWGQGT 120

LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X67-H01 LC

QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60

SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-H01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWWRELKS NYFDYWGQGT 120

LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X67-F08 LC

QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60

SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X67-F08 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWYRELKS NYFDYWGQGT 120

LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
114
Nombre inicial
Ki,ap (nM) de IgG LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR33
X67-D03
0,1 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWNRELKSNYFDY
X67-G04
0,35 RASQPIDNYLN AASRLQS QQSYTVPYT AYSMI YIRPSGGRTTYADSVKG GGLLLWARELKSNYFDY
aLa sustitución de F a N (en negrita) en la CDR3 de M142-H08 da X67-D03, una IgG que no Similarmente, la sustitución de F a A da X67-G04, que tampoco se escinde.
se escinde durante la expresión y es un potente inhibidor de humano.
Tabla 7. CDR Secuencias de aminoácidos de inhibidores de anticuerpo madurado por afinidad de pCal descubiertos usando ROLIC
Nombre inicial
Ki,ap (nM) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
X59-C07
6,1 RAGRSISTYVN AASSLQS QQSQSTPYT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
X60-D01
2,0 RASQIVSSRYLA GAASRAT QQTYSSPFT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
X63-G10
9,0 RASQSISNYLN AASSLQS QQSYTSPYT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
X64-F04
1,9 RASQIVSSNYLA GASNRAT QQSFNIPYT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
X63-G06
0,4 (Fab) RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
X81-B013
0,2 (IgG) RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
aX81 -B01 es la versión optimizada en codones y retromutada a la línea germinal de X63-G06 como una IgG humana de longitud completa producida en células HEK 293T.
5
10
15
20
25
Se muestran a continuación las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) de inhibidores de anticuerpos madurados por afinidad de pCal descubiertos usando ROLIC
X59-C07 LC

QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TVTCRAGRSI STYVNWYQQK FGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSRSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSQSTPYTFG QGTKLEVK 108
X59-C07 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDKSKKTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
X60-D01 LC

QDIQMTQSPG tlslspgera tiscrasqiv ssrylawycq RPGQAPRLLI YGAASRATGI 60

PDRFSGSGSG TDFTLTISSL QAEDFATYYC QQTYSSPFTF GQGTKMEIK 109
X60-D01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
X63-G06 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISSL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
X63-G06 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
X63-G10 LC

QDIQMTQSPD SLSASVGDRV TITCRASQSI SNYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60

SRFSGSGSGT DFTLTISGLQ PEDFASYYCQ QSYTSPYTFV QGTKLEIKRT 110
X63-G10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
X64-F04 LC

QDIQMTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASQIV SSNYLAWYQQ KPGQAPRLLI YGASNRA.TGI 60 PDRFSGSGSG TEFTLTISSL QSEDFAIYYC QQSFNIFYTF GQGTRVDIK 109
X64-F04 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 14 2
X81-B01 es la IgG retromutada a la línea germinal producida en la versión de células HEK 293T del Fab X63-G06, como se indica anteriormente.
X101-A01 (también denominado DX-2922) es la IgG retromutada a la línea germinal producida en la versión de células ChO del Fab X63-G06
EJEMPLO 4: Maduración por afinidad
Además de optimizar la secuencia del anticuerpo acortado (M142-H08), los presentes inventores también realizaron maduración por afinidad en dos de los anticuerpos identificados por presentación en fagos (M162-A04 y M160-G12). Ambos de estos anticuerpos inhiben pCal humana con potencia nanomolar de un solo dígito, parecen específicos para pCal y no se unen a precalicreína (Tabla 3). Los presentes inventores realizaron en primer lugar una novedosa forma de barajado de cadenas ligeras denominado ROLIC (optimización rápida de cadenas ligeras, por la expresión inglesa Rapid Optimización of Light Chains) en M162-A04 y M160-G12 (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2009/102927 y US 2009-0215119). A partir del cribado de los anticuerpos descubierto por ROLIC, los presentes inventores identificaron un anticuerpo con potencia subnamolar (X63-G06) que compartió la misma cadena pesada que M160-G12. Los presentes inventores construyeron entonces bibliotecas de maduración por afinidad enriquecidas en HV-CDR3 basadas en las secuencias de CDR3 en M162-A04 y X63-G06 (descritas a continuación).
Maduración por afinidad por ROLIC. Los presentes inventores usaron ROLIC para madurar por afinidad los dos ejemplos de la Tabla 3 que no se escindieron (M162-A04 y M160-G12). Este proceso identificó un anticuerpo que inhibe pCal con una Ki,ap subnanomolar (Tabla 7). X63-G06 inhibe pCal con una Ki,ap de aproximadamente 0,4 nM como un fragmento Fab. Cuando este anticuerpo se convirtió en una IgG que se retromuta a la línea germinal y se optimizó en la secuencia para la expresión de células CHO (X81-B01), se encontró que inhibía pCal con una Ki,ap de aproximadamente 0,2 nM.
EJEMPLO 5: Maduración por afinidad de CDR1/2 y CDR3 de la cadena pesada
Los presentes inventores usaron dos estrategias adicionales de maduración por afinidad para identificar anticuerpos altamente potentes basándose en dos ejemplos de inhibidores parentales de anticuerpos diferentes: M162-A04 y X63-G06. Un enfoque era generar bibliotecas que barajaron las CDR1/2 de HC de dos ejemplos de inhibidores 5 parentales de anticuerpo diferentes (M162-A04 y X63-G06) contra la diversidad adicional de CDR1/2. Otro enfoque fue crear bibliotecas enriquecidas en CDR3 de la cadena pesada basándose en estos ejemplos.
Los 82 anticuerpos que se descubrieron basándose en mejoras en M162-A04 debido a modificaciones en cualquiera de la región CDR1/2 y CDR3 se muestran en la Tabla 8. El cribado de inhibición con anticuerpo 10 nM (como fragmentos Fab) reveló que hubo 33 anticuerpos que inhibieron la actividad de pCal más de 90 %. Se mostró que 10 varios anticuerpos eran inhibidores subnanomolares de pCal humana.
Los 62 anticuerpos que se descubrieron basados en mejoras en X63-G06 debido a modificaciones en cualquiera de la región CDR1/2 y CDR3 se muestran en la Tabla 9. El cribado de inhibición con anticuerpo 10 nM (como fragmentos Fab) reveló que hubo 24 anticuerpos que inhibieron la actividad de pCal más de 90 %. Se mostró que varios anticuerpos eran inhibidores subnanomolares de pCal humana.
117
I.D. de anticuerpo
% de inhibición a 10 nM Ki,ap de pCal humana (nM) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M202-A12
97,5 0,2 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG QRTGVPRRDSFNI
M196-C06
97,2 0,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYSMH SIYPSRGMTWYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-F09
96,9 0,2 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT VYNMH SIYPSGGMTYYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M199-A08
96,4 0,06 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRIGVPRRDEFDI
M202-C01
96,3 0,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRWDDFDI
M198-A06
96,1 0,4 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYSMH SIYSSGGPTKYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M200-D03
95,9 0,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRIGVPRRDSFDM
M202-H03
95,7 0,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRWDDFDI
M201-A07
95,7 0,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRRDEFDI
M197-A01
95,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYDMI SIYPSGGNTSYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M202-D09
95,0 0,4 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRIGVPRRDSFDI
M197-A09
94,9 0,6 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT VYNMH SIYPSGGMTTYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-G07
94,9 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYDMT SIYPSGGQTIYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M200-A10
94,3 0,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRRDSFDI
M197-H10
94,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT SYNMH SIVPSGGKTNYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M196-D12
94,1 0,2 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT RYSMR VIYPSGGQTYYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M197-A08
93,7 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYSMQ SIGSSGGKTLYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-B09
93,5 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT VYSMT SIGSSGGSTTYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-E09
93,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYDMN SIYPSGGRTRYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M202-B03
93,1 0,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRRDDFDI
M198-C10
93,0 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYMGMN SIVPSGGWTQYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
118
I.D. de anticuerpo
% de inhibición a 10 nM Ki,ap de pCal humana (nM) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M197-E12
93,0 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT TYTMR SIYPSGGKTQYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-F04
92,9 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYDMW SIRPSGGITKYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M197-H11
92,9 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYNMI SIYPSGGWTTYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M197-F01
92,6 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYHMY SIGPSGGPTGYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-E11
92,5 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT TYSMY SIYPSGGLTWYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M202-C09
92,3 0,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRIGVPRRDDFDI
M198-H08
92,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYDMY SIGPSGGPTAYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-F08
91,8 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT VYSMW SISSSGGMTEYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M202-E06
91,5 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRRGVPRRDDFDI
M195-D12
90,8 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYGMF GIGPSGGPTKYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M197-F03
90,7 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYSMF SIGPSGGVTHYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-E02
90,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYSMY YIRPSGGNTKYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-A02
89,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT RYSMI SIWSSGGATEYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M202-A01
88,9 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRIGVPRRDAFDI
M202-G03
88,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRRDSFEI
M195-B12
87,7 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT KYWMY YIRPSGGQTYYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-A07
86,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT RYQMH WISPSGGITGYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-H02
85,8 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT PYNMY WIVPGGVTKYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M200-H07
85,4 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRRNAFDN
M201-H06
84,6 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRRDAFDI
M202-F06
84,2 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRWDAFDI
M195-C12
84,2 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT MYQMF SISPGGGTQYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
119
I.D. de anticuerpo
% de inhibición a 10 nM Ki,ap de pCal humana (nM) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M202-H05
84,0 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRRDVFDI
M198-C05
83,9 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT RYKMY VIGPSGGATFYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M196-H03
83,9 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT RYVMW SISPSGDTHYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M200-E11
83,2 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRRDAFDN
M202-B04
81,9 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRSGVPRRDDFDI
M202-A04
81,2 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRKGIPRRDDFDI
M198-B12
80,7 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT KYSMA GIYPSGGRTLYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-A09
77,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYFMS SIRSSGGPTWYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-C06
76,5 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT QYFMH YIYPSGGMTEYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-C09
75,4 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYTMY SISPSGGWTYYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M195-B02
75,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT PYLMW YIGPSGGPTHYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-F12
74,6 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYTMM SIWSSGGQTKYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M201-H08
74,5 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGVPRRDALDN
M202-C02
74,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRPGVPRRDAFDI
M198-C03
72,4 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT RYSMS GISPSGGETSYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-A08
72,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT WYMMQ RISPSGGTTYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M195-A02
71,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT QYMMM GISSSGGHTDYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M197-G10
67,6 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT VYAMR SIYPSGGKTWYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M195-G02
67,5 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT PYNMM SIWPSGGTTDYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M196-D02
66,2 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT VYSMH VIGPSGGITLYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M199-A11
65,4 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRRGIPRRDAFDI
M200-F01
65,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRMGIPRRNAFDI
120
I.D. de anticuerpo
% de inhibición a 10 nM Ki,ap de pCal humana (nM) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M198-D12
63,5 0,7 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT LYVMY YIVPSGGPTAYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M197-C12
56,4 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT PYDML YIVSSGGLTKYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M198-G03
53,8 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT QYTMV WIYSSRANYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M199-B01
53,4 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGIPRRDAFDN
M202-A08
52,9 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGIPRWDAFDI
M195-A12
51,7 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT PYMMM GIYPSGGYTVYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M202-E03
51,4 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGIPRRDAFEI
M196-G12
51,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT NYSMD RIYSSGGGTIYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M195-F12
45,5 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYVMM YIVPSGGVTAYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M200-B01
42,6 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGIPRRDAFDS
M198-H09
41,1 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYLMI YIGPSGGPTEYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M195-E12
38,0 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT YYIMF YISPSGGYTHYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M201-A06
36,8 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGIPRRDVFDI
M202-A10
36,3 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGIPRRDSFDI
M197-G11
19,2 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT TYAMV SIYPSGGITTYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
M201-F11
15,7 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRSGIPRRDAFDI
M198-A01
13,8 RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT PYTMI SISSSGGMTPYADSVKG RRTGIPRRDAFDI
Secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) de anticuerpos pCal obtenidos de bibliotecas de maduración por afinidad enriquecidas en CDR1/2 y CDR3 basadas en M162-A04

M195-A02 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M195-A02 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYMMHWVRQA PGKGLEWVSG ISSSGGHTDY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M195-A12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

MI 95-Al2 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYMMMWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGYTVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M195-B02 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M195-B02 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYLMWWVRQA PGKGLEWVSY IGPSGGPTHY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M195-B12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M195-B12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS KYWMYWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGQTYY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M195-C12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M195-C12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS MYQMFWVRQA PGKGLEWVSS ISPGGGTQYA 60

DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120

SASTKGPSVF PLAPSSKS I3S

M195-D12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M195-D12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYGMFWVRQA PGKGLEWVSG IGPSGGPTKY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M195-E12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPWLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M195-E12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYIMFWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGYTHY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M195-F12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M195-F12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYVMMWVRQA PGKGLEWVSY IVPSGGVTAY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M0195-G02 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M195-G02 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYNMMWVRQA PGKGLEWVSS IWPSGGTTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M196-C06 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M196-C06 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMHWVRQA PGKGLEWVSS IYPSRGMTWY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M196-D02 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M196-D02 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYSMHWVRQA PGKGLEWVSV IGPSGGITLY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M196-D12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M196-D12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYSMRWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGQTYY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M196-G12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M196-G12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYSMDWVRQA PGKGLEWVSR IYSSGGGTIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M196-H03 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M196-H03 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYVMWWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGDTHYA 60 DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSSKS 138

M197-A01 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

MI 9 7-A01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMIWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGNTSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M197-A08 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M197-A08 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMQWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGKTLY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M197-A09 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M197-A09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYNMHWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGMTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M197-C12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M197-C12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYDMLWVRQA PGKGLEWVSY IVSSGGLTKY 60

ADSVKGRFTI SRDWSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M197-E12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M197-E12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYTMRWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGKTQY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M197-F01 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M197-F01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYHMYWVRQA PGKGLEWVSS IGPSGGPTGY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M197-F03 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M197-F03 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMFWVRQA PGKGLEWVSS IGPSGGVTHY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M197-G10 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M197-G10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYAMRWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGKTWY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M197-G11 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M197-G11 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMVWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGITTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M197-H10 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M197-H10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYNMHWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGKTNY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M197-H11
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M197-H11
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYNMIWRQA PGKGLEWVSS IYPSGGWTTY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKWTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M198-A01
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M198-A01
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYTMIWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGMTPY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M1S8-A02
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M198-A02
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYSMIWVRQA PGKGLEWVSS IWSSGGATEY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M198-A06
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M198-A06
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IY SMHWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGPTKY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M198-A07
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M198-A07
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RY QMHWVRQA PGKGLEWYSW ISPSGGITGY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M198-A08
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M198-A08
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYMMQWVRQA PGKGLEWVSR ISFSGGTTYA 60
DSVKGRFTIS
RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120
SASTKGPSVF
PLAPSSKS 138
M198-A09
LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCG QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-A09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYFMSWVRQA PGKGLEWVSS IRSSGGPTWY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-B09 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-B09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYSMTWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGSTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-B12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-B12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS KYSMAWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGRTLY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-C03 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-C03 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYSMSWVRQA PGKGLEWVSG ISPSGGETSY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-C05 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-C05 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYKMYWVRQA PGKGLEWVSV IGPSGGATFY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-C06 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-C06 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYFMHWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGMTEY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-C09 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-C09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYTMYWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGWTYY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-C10 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-C10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYMGMNWVRQ APGKGLEWVS SIVPSGGWTQ 60

YADSVKGRFT ISRDNSKNTL YLQMNSLRAE DTAVYYCAYR RTGIPRRDAF DIWGQGTMVT 120

VSSASTKGPS VFPLAPSSKS 140

M198-D12 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPWLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-D12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYVMYWVRQA PGKGLEWVSY IVPSGGPTAY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-E02 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-E02 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMYWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGNTKY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-E09 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-E09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMNWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGRTRY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-E11 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-E11 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYSMYWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGLTWY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-F04 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-F04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMWWVRQA PGKGLEWVSS IRPSGGITKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M198-F08 QDIQMTQSPS SRFSGSGSGT
TLSASVGDRV EFTLTISSLQ LC TITCRASQSI PDDFATYYCQ SSWLAWYQQK QYNTYWTFGQ PGKAPNLLIY KASTLESGVP GTKVEIK 60 107
M198-F08
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VY SMWWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGMTEY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M198-F09
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M198-F09
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYNMHWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGMTYY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M198-F12
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M198-F12
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYTMMWVRQA PGKGLEWVSS IWSSGGQTKY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M198-G03
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M198-G03
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYTMVWVRQA PGKGLEWVSW IYSSRANYAD 60
SVKGRFTISR
DNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCAYRRTG IPRRDAFDIW GQGTMVTVSS 120
ASTKGPSVFP
LAPSSKS 137
M198-G07
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M198-G07
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMTWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGQTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M198-H02
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M1S8-H02
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYNMYWVRQA PGKGLEWVSW IVPGGVTKYA 60
DSVKGRFTIS
RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120
SASTKGPSVF
PLAPSSKS 138

M198-H08 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-H08 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMYWVRQA PGKGLEWVSS IGPSGGPTAY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M198-H09 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M198-H09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYLMIWVRQA PGKGLEWVSY IGPSGGPTEY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M199-A08 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M199-A08 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDEFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

MI 99-Al1 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

MI 99-Al1 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR RGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M199-B01 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M199-B01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGIPRRDAFD NWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M200-A10 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M200-A10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDSFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M200-B01 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M200-B01 EVQLLESGGG ADSVKGRFTI SSASTKGPSV
LVQPGGSLRL SRDNSKNTLY FPLAPSSKS HC SCAASGFTFS LQMNSLRAED HYIMMWVRQA TAVYYCAYRR PGKGLEWVSG TGIPRRDAFD IYSSGGITVY SWGQGTMVTV
M200-D03 QDIQMTQSPS SRFSGSGSGT
TLSASVGDRV EFTLTISSLQ LC TITCRASQSI PDDFATYYCQ SSWLAWYQQK QYNTYWTFGQ PGKAPNLLIY GTKVEIK KASTLESGVP
M200-D03 EVQLLESGGG ADSVKGRFTI SSASTKGPSV
LVQPGGSLRL SRDNSKNTLY FPLAPSSKS HC SCAASGFTFS LQMNSLRAED HYIMMWVRQA TAVYYCAWRR PGKGLEWVSG IGVPRRDSFD IYSSGGITVY MWGQGTMVTV
M200-E11 QDIQMTQSPS SRFSGSGSGT
TLSASVGDRV EFTLTISSLQ LC TITCRASQSI PDDFATYYCQ SSWLAWYQQK QYNTYWTFGQ PGKAPNLLIY GTKVEIK KASTLESGVP
M200-E11 EVQLLESGGG ADSVKGRFTI SSASTKGPSV
LVQPGGSLRL SRDNSKNTLY FPLAPSSKS HC SCAASGFTFS LQMNSLRAED HYIMMWVRQA TAVYYCAYRR PGKGLEWVSG TGVPRRDAFD IYSSGGITVY NWGQGTMVTV
M200-F01 QDIQMTQSPS SRFSGSGSGT
TLSASVGDRV EFTLTISSLQ LC TITCRASQSI PDDFATYYCQ SSWLAWYQQK QYNTYWTFGQ PGKAPNLLIY GTKVEIK KASTLESGVP
M200-F01 EVQLLESGGG ADSVKGRFTI SSASTKGPSV
LVQPGGSLRL SRDNSKNTLY FPLAPSSKS HC SCAASGFTFS LQMNSLRAED HYIMMWVRQA TAVYYCAYRR PGKGLEWVSG MGIPRRNAFD IYSSGGITVY IWGQGTMVTV
M200-H07 QDIQMTQSPS SRFSGSGSGT
TLSASVGDRV EFTLTISSLQ LC TITCRASQSI PDDFATYYCQ SSWLAWYQQK QYNTYWTFGQ PGKAPNLLIY GTKVEIK KASTLESGVP
M200-H07 EVQLLESGGG ADSVKGRFTI SSASTKGPSV
LVQPGGSLRL SRDNSKNTLY FPLAPSSKS HC SCAASGFTFS LQMNSLRAED HYIMMWVRQA TAVYYCAYRR PGKGLEWVSG TGVPRRNAFD IYSSGGITVY NWGQGTMVTV
M201-A06 QDIQMTQSPS SRFSGSGSGT
TLSASVGDRV EFTLTISSLQ LC TITCRASQSI PDDFATYYCQ SSWLAWYQQK QYNTYWTFGQ PGKAPNLLIY GTKVEIK KASTLESGVP
M201-A06 EVQLLESGGG ADSVKGRFTI SSASTKGPSV
LVQPGGSLRL SRDNSKNTLY FPLAPSSKS HC SCAASGFTFS LQMNSLRAED HYIMMWVRQA TAVYYCAYRR PGKGLEWVSG TGIPRRDVFD IYSSGGITVY IWGQGTMVTV
M201-A07 QDIQMTQSPS SRFSGSGSGT
TLSASVGDRV EFTLTISSLQ LC TITCRASQSI PDDFATYYCQ SSWLAWYQQK QYNTYWTFGQ PGKAPNLLIY GTKVEIK KASTLESGVP
M201-A07
HC
60
120
139
60
107
60
120
139
60
107
60
120
139
60
107
60
120
139
60
107
60
120
139
60
107
60
120
139
60
107
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDEFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M201-F11
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M201-F11
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR SGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M201-H06
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M201-H06
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M201-H08
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M201-H08
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDALD NWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M202-A01
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M202-A01
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M202-A04
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M202-A04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR KGIPRRDDFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M202-A08
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M202-A08
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRWDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M202-A10
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M202-A10
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGIPRRDSFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M202-A12
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M202-A12
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYQR TGVPRRDSFN IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M202-B03
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M202-B03
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M202-B04
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M202-B04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR SGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M202-C01
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M202-C01
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRWDDFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M202-C02
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT
EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M202-C02
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR PGVPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV
FPLAPSSKS 139
M202-C09
LC
QDIQMTQSPS
TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

M202-C09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M202-D09 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M202-D09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDSFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M202-E03 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M202-E03 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFE IWGQGTMVTV L20

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M202-E06 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M202-E06 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR RGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M202-F06 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M202-F06 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRWDAFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M202-G03 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M202-G03 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGVPRRDSFE IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M202-H03 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M202-H03 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGVPRWDDFD IWGQGTMVTV 120

SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139

M202-H05 LC

QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60

SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107

M202-H05 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGVPRRDVFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
134
Tabla 9. Secuencias de anticuerpos obtenidos de bibliotecas de maduración por afinidad enriquecidas en CDR1/2 y CDR3 basadas en X63-G06
I.D. de anticuerpo
% de inhibición a 10 nM Ki,ap de pCal humana (nM) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M209-F04
97,6 0,09 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYLDq
M209-C11
96,2 0,14 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VGQGIRGRSRTSYFAq
M206-H08
96,0 0,17 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT DYMMA SIVPSGGHTHYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M210-C12
95,6 0,16 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VAQGlAARSRTSSVDq
M208-F04
95,4 0,2 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSFFDY
M206-B10
94,7 0,3 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT qYLMA SIYPSGGWTKYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M208-H02
94,4 0,2 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIASRSRTRYCDY
M210-G04
94,2 0,3 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VATGIVARSRTRYFDq
M210-H06
93,8 0,2 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTRYFDY
M208-E10
93,7 0,09 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VAQGISARSRTSYFDY
M209-B09
93,5 0,2 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VAQGIVARSRTSYLHq
M209-C12
93,4 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VGRGIAARSRTSqLDY
M208-G03
93,4 0,3 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYLDY
M206-A06
93,0 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT NYMMG SISPSGGLTKYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M210-H07
92,8 0,4 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTRYFDq
M206-F01
92,6 0,2 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT GYMMV RISPSGGPTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M208-F10
92,5 0,2 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDq
M209-E02
92,4 0,3 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTILLDq
M208-C06
91,7 0,4 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSFIDY
M205-D04
91,5 0,4 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT TYKMq SISPSGGPTNYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M210-G10
91,2 0,4 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYLDF
135
I.D. de anticuerpo
% de inhibición a 10 nM Ki,ap de pCal humana (nM) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M207-A04
90,9 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTRSFDY
M210-B02
90,9 0,2 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFNq
M208-B01
90,1 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSFFDq
M209-G07
89,8 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDT
M204-A02
89,5 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT DYMMT YISPSGGLTSYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M206-H01
87,6 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT EYMMV RISPSGGTTEYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M209-B11
87,3 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTRYIDq
M206-F09
86,8 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT VYMMS SIVPSGGSTTYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M209-C02
86,8 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAYRRRTSYFDY
M208-G02
86,7 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIADRSRTSYSDY
M205-C11
86,5 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT QYMMM RISPSGGSTLYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M205-H08
85,9 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT DYMMM SIVPSGGHTqYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M210-H01
85,5 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRNSqQDY
M209-D12
85,4 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDq
M209-H09
85,3 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTVYFDH
M204-E12
84,1 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT TYMMq YIGPSGGKTDYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M209-H03
82,6 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VAQGlAARSRTTqFDY
M206-H05
82,5 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT GYKMq SISPSGGITMYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M209-D03
80,4 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VGRGIAARSRTSFFDq
M205-A02
80,3 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT TYLMA GIVSSGGRTLYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M208-A10
78,5 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSqFDH
M205-E11
78,2 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT NYTMG SISPSGGKTDYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
136
I.D. de anticuerpo
% de inhibición a 10 nM Ki,ap de pCal humana (nM) LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3
M206-E02
77,6 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT EYMMM VISPSGGQTHYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M205-H01
77,1 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT NYTMQ YISPSGGYTGYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M207-A02
76,6 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTINLDY
M209-H07
76,1 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARqRTSYYDY
M209-G01
74,8 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VAqGISGRSRLSYVDY
M210-A06
74,8 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSqFDY
M209-D02
74,7 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGITARSRTSYFDD
M205-B04
71,1 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT NYDMI SISSSGGTTKYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M203-A03
69,1 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT VYMMI SISPSGGQTTYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M209-E03
68,8 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG qARGIAARSRTSYFDY
M207-A01
67,2 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGISARSRTSCFDY
M206-C03
65,5 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT qYMMV SIYSSGGNTPYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M207-C05
61,4 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VGRGIAARSRTSYFDK
M205-A12
58,8 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT QYDMI YISSSGGFTRYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M205-F03
58,6 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT SqQMV YISPSGGNTYYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M203-A01
51,4 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT NYLMA WIVPSGGYTEYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
M209-B01
47,0 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIVARSRTSNFDq
M208-D12
43,7 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG LARGIAARSRTSYqDI
M206-H04
19,0 RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT SYMMV SISPSGGYTIqADSVKG VARGIAARSRTSYFDY
Secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) de anticuerpos pCal obtenidos de bibliotecas de maduración por afinidad enriquecidas en CDR1/2 y CDR3 basadas en X63-G06.

M203-AO1 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M203-A01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYLMAWVRQA PGKGLEWVSW IVPSGGYTEY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M203-A03 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRT3QFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M203-A03 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYMMIWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGQTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS K3 142

M204-A02 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M204-AQ2 HC

. EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYMMTWVRQA PGKGLqWVSY ISPSGGLTSY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M204-E12 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M2Q4-E12 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYMMqWVRQA PGKGLEWVSY IGPSGGKTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 14 2

M205-AQ2 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M205-A02 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYLMAWVRQA FGKGLEWVSG IVSSGGRTLY SO ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 14 2

M205-A12 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M205-A12
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS
M205-B04
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC
M205-B04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS
M205-C11
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC
M205-C11
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS
M205-D04
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC
M205-D04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS
M205-E11
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC
M205-E11
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS
M205-F03
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC
M205-F03
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS
M205-H01
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC
M205-H01
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
QYDMIWVRQA TAVYYCARVA
PGKGLEWVSY RGIAARSRTS ISSSGGFTRY YFDYWGQGTL
NSNYLAWYQQ QQSSRTPWTF
TPGQAPRLLI GQGTRVEIK YGASSRATGI
NYDMIWVRQA TAVYYCARVA
PGKGLEWVSS RGIAARSRTS ISSSGGTTKY YFDYWGQGTL
NSNYLAWYQQ QQSSRTPWTF
TPGQAPRLLI GQGTRVEIK YGASSRATGI
QYMMMWVRQA TAVYYCARVA
PGKGLEWVSR RGIAARSRTS ISPSGGSTLY YFDYWGQGTL
NSNYLAWYQQ QQSSRTPWTF
TPGQAPRLLI GQGTRVEIK YGASSRATGI
TYKMqWVRQA TAVYYCARVA
PGKGLEWVSS RGIAARSRTS ISPSGGPTNY YFDYWGQGTL
NSNYLAWYQQ QQSSRTPWTF
TPGQAPRLLI GQGTRVEIK YGASSRATGI
NYTMGWVRQA TAVYYCARVA
PGKGLEWVSS RGIAARSRTS ISPSGGKTDY YFDYWGQGTL
NSNYLAWYQQ QQSSRTPWTF
TPGQAPRLLI GQGTRVEIK YGASSRATGI
SqQMVWVRQA TAVYYCARVA
PGKGLEWVSY RGIAARSRTS ISPSGGNTYY YFDYWGQGTL
NSNYLAWYQQ QQSSRTPWTF
TPGQAPRLLI GQGTRVEIK YGASSRATGI
NYTMQWVRQA TAVYYCARVA
PGKGLqWVSY RGIAARSRTS ISPSGGYTGY YFDYWGQGTL
60
120
142
60
109
60
120
142
60
109
60
120
142
60
109
60
120
142
60
109
60
120
142
60
109
60
120
142
60
109
60
120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M205-H08
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M205-H08
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYMMMWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGHTqY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKWTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M206-A06
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M206-A06
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYMMGWVRQA PGKGLqWVSS ISPSGGLTKY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M206-B10
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M206-B10
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS qYLMAWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGWTKY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M206-C03
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M206-C03
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS qYMMVWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGNTPY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M206-E02
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M206-E02
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS EYMMMWVRQA PGKGLEWVSV ISPSGGQTHY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M206-F01
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M206-F01
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYMMVWVRQA PGKGLEWVSR ISFSGGPTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M206-F09
LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA. TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M206-F09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYMMSWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGSTTY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M206-H01 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M206-H01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS EYMMVWVRQA PGKGLEWVSR ISPSGGTTEY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M206-H04 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M206-H04 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYMMVWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGYTIq 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M206-H05 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M206-H05 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYKMqWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGITMY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M2Q6-H08 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M206-H08 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYMMAWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGHTHY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M207-A01 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M207-A01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGISARSRTS CFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M207-A02 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M207-A02 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAL Y Y CARVA RGIAARSRTI NLDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M207-A04 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSWYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M207-A04 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYY CARVA. RGIAARSRTR SFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M207-C05 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

R0121-D02 = M0207-C05 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVG RGIAARSRTS YFDKWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M208-A10 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M208-A10 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS qFDHWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M208-B01 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M208-B01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYY CARVA RGIAARSRTS FFDqWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M208-C06 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M208-C06 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYY CARVA RGIAARSRTS FIDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M208-D12 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M208-D12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYY CARLA RGIAARSRTS YqDIWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M208-E10
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M208-E10
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA QGISARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M208-F04
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M208-F04
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS FFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M208-F10
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M208-F10
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M208-G02
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M208-G02
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIADRSRTS YSDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M208-G03
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M208-G03
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YLDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M208-H02
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M208-H02
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIASRSRTR YCDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M209-B01
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M209-B01
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIVARSRTS NFDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M209-B09
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M209-B09
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA QGIVARSRTS YLHqWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M209-B11
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M209-B11
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTR YIDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M209-C02
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M209-C02
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAYRRRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M209-C11
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M209-C11
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAMVG QGIRGRSRTS YFAqWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142
M209-C12
LC
QDIQMTQSPG
TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG
TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M209-C12
HC
EVQLLESGGG
LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60
ADSVKGRFTI
SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVG RGIAARSRTS qLDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KS 142

M0209-D02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M209-D02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGITARSRTS YFDDWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS

M209-D03 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M209-D03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVG RGIAARSRTS FFDqWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS

M209-D12 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M209-D12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCATVA RGIAARSRTS YFDqWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS

M209-E02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M209-E02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTI LLDqWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS

M209-E03 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M209-E03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARqA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS

M209-F04 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M209-F04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YLDqWSQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS
M209-G01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK
60
109
60
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142
60
109
60
120
142
60
109
60
120
142
60
109
60
120
142
60
109
60
120
142
60
109
60
120
142
60
109

M209-G01 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA qGISGRSRLS YVDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M209-G07 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M209-G07 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TñVYY CARVA RGIAARSRTS YFDTWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M209-H03 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M209-H03 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA QGIAARSRTT qFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M209-H07 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M209-H07 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARqRTS YYDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M209-H09 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M209-H09 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTV YFDHWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M210-A06 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60

PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M210-A06 HC

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS qFDYWGQGTL 120

VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142

M210-B02 LC

QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109

M210-B02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASVA RGIAARSRTS YFNqWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS

M210-C12 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M210-C12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA QGIAARSRTS SVDqWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS

M210-G04 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M210-G04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA TGIVARSRTR YFDqWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS

M210-G10 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M210-G10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YLDFWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS

M210-H01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M210-H01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRNS qQDYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS

M210-H06 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M210-H06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTR YFDYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS

M210-H07 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK

M210-H07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTR YFDqWGQGTL
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS
EJEMPLO 6: Prueba in vivo de M162-A04 (IgG) y X101-A01
60
120
142
60
109
60
120
142
60
109
60
120
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109
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142
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60
109
60
120
142
60
109
60
120
142
Se han implicado previamente bradiquinina y otras cininas bioactivas en edema inducido por carragenina y dolor 5 inflamatorio (Sharma J.N. et al. (1998) Inflammopharmacology 6, 9-17; Asano M. et al. (1997) Br J Pharmacol 122, 1436-1440; De Campos R.O. et al. (1996) Eur J Pharmacol 316, 277-286). La calicreína plasmática y la calicreína 1 de tejido son las dos cininogenasas primarias en mamíferos (Schmaier A.H. (2008) Int Immunopharmacol 8, 161165). Se probó M162-A04 (M162-A4) (IgG), un inhibidor específico de calicreína plasmática, para determinar si sería eficaz en el edema inducido por carragenina. El diseño del estudio se expone brevemente en la Tabla 10. La vía de 10 administración (ROA) para el vehículo (PBS), el anticuerpo y el control positivo (indometacina) era intraperitoneal (IP) y se administró 30 minutos antes de la inyección de carragenina (0,1 ml de una disolución al 2 % de carragenina). Es evidente de la FIGURA 2 que las dosis de anticuerpo a 10 mg/kg y superiores fueron igualmente de
eficaces en reducir el edema inducido por carragenina que el control positivo (indometacina). Sin embargo, el anticuerpo no fue eficaz en reducir la hiperalgesia térmica inducida por carragenina (FIGURA 3). El motivo para la disociación entre la eficacia en el edema y la hiperalgesia no son obvios, pero puede ser debido a diferencias en la bioactividad de diferentes metabolitos de cinina. Lys-desArg9-bradiquinina es el agonista más potente del receptor 5 de B1, que se cree que está principalmente implicado en la hipersensibilidad al dolor (Leeb-Lundberg L.M et al. (2005) Pharmacol Rev 57, 27-77). Este metabolito de cinina se genera por la calicreína 1 de tejido, no la calicreína plasmática (Schmaier A.H. (2008) Int Immunopharmacol 8,161-165). Esta diferencia en la generación de cinina y la activación del receptor de bradiquinina resultante puede explicar el inesperado desacoplamiento de edema e hiperalgesia en este modelo.
10 También se probó otro inhibidor del anticuerpo pCal X101-A01 en el modelo de CPE usando el diseño del estudio mostrado en la Tabla 10B. Los datos obtenidos en la Figura 14 muestran que X101-A01 inhibió el edema de un modo dependiente de la dosis hasta un grado que es comparable al del control positivo (indometacina).
Tabla 10A. Diseño de edema en la pata inducido por carragenina del estudio para probar M162-A04
Grupo N2
Número de ratas Tratamiento Dosis (mg/kg) ROA Cronometraje con respecto a carragenina Volumen de dosis (ml/kg)
1
6 Vehículo N/A IP T -30 minutos 20
2
6 559A-M162-A4 3 IP T -30 minutos 20
3
6 559A-M162-A4 10 IP T -30 minutos 20
4
6 559A-M162-A4 30 IP T -30 minutos 20
5
6 Indometacina 5 IP T -30 minutos 20
15 Tabla 10B. Diseño de edema en la pata inducido por carragenina del estudio para probar X101-
Grupo
Tratamiento n Dosis (mg/Kg) ROA Cronometraje* Vol (ml/kg)
1
Vehículo 10 N/A IP -30 min 20
2
X101-A01 10 1 IP -30 min 20
3
X101-A01 10 3 IP -30 min 20
4
X101-A01 10 10 IP -30 min 20
5
X101-A01 10 30 IP -30 min 20
6
Indometacina 10 5 IP -30 min 20
EJEMPLO 7: Evaluación de inhibidores de anticuerpos seleccionados de calicreína plasmática
La evaluación de anticuerpos optimizados seleccionados (X81-B01 y X67-D03) se muestra en la Tabla 11. Ningún anticuerpo tiene posible desamidación, isomerización o supuestos sitios de oxidación.
20 Tabla 11
Criterios
X81-B01 (IgG) X67-D03 (IgG)
< nM Ki,ap contra pCal humana
0,2 nM 0,1 nM
< nM Ki,ap contra pCal de roedor
ratón - 11 pM ratón - 0,7 nM
rata - 0,14 nM rata - 0,34 nM
union a precalicreína
no no
Inhibidor específico con respecto a fXIa, plasmina y tripsina
Sí Sí
Inhibe la generación de bradiquinina
Sí Sí
5
10
15
20
25
30
35
Criterios
X81-B01 (IgG) X67-D03 (IgG)
Inhibe pCal en presencia de precalicreína
Sí Sí
Competición por la unión con aprotinina
Sí Sí
Estabilidad en suero humano
Sí nd*
* no hecho; se mostró que una forma parental de este anticuerpo era estable en suero
EJEMPLO 8: Mapeo de epítopes
Se investigó la región de pCal unida por anticuerpos anti-pCal seleccionados usando varios métodos. En primer lugar, se usaron ensayos de competición para determinar si los anticuerpos compitieron para unirse a pCal con inhibidores dirigidos al sitio activo conocidos. En segundo lugar, los anticuerpos se agruparon según si eran inhibidores o solo agentes de unión a pCal. En tercer lugar, se investigaron epítopes usando péptidos sintéticos y estructuras peptídicas basadas en la secuencia y estructura tridimensional de pCal. Estas estructuras peptídicas se denominan "CLIPS" (péptidos químicamente unidos en armazones) y la prueba se realizó por una empresa de servicios por honorario llamada Pepscan.
En cuarto lugar, se probaron anticuerpos para su capacidad para inhibir pCal de otras especies, además de la humana, donde se ha determinado la secuencia de aminoácidos de pCal con el fin de identificar aminoácidos que pueden explicar las diferencias en inhibición.
Ensayos de competición
Usando un ensayo BIACORE® SPR, se probaron los anticuerpos de interés para la competición con un inhibidor de sitio activo conocido de pCal. EPI-KAL2 es un potente inhibidor de sitios activos (Ki,ap = 0,1 nM) de pCal y un inhibidor de dominios de Kunitz basado en el primer dominio del inhibidor de la vía de factor tisular (Markland (1996) Iterative optimization of high-affinity protease inhibitors using phage display. 2. Plasma kallikrein and thrombin. Biochemistry. 35(24):8058-67). Los dominios de Kunitz son inhibidores de sitios activos conocidos de serina proteasas, tales como pCal.
La secuencia de EPI-KAL2 es:
r.AMHSPCAFKADDGPCülA^///’RífTFNIFTROCEEF¿YGGCG'GNONRFESL
EECKKMCTRD
(los aminoácidos en cursiva son los que se diferencian de TFPI)
Como se muestra en las FIGURAS 8A-8B, los anticuerpos X81-B01 y X67-D03 compitieron para unirse a pCal en presencia o EPI-KAL2. Este resultado indica que estos anticuerpos o bien se unen en la proximidad del sitio activo o cambios alostéricos en la conformación del complejo pCal-EPI-KAL2 previenen la unión del anticuerpo.
Agentes de unión de anticuerpos frente a inhibidores
Como se muestra en las Tablas 1 y 2, todos los anticuerpos únicos descubiertos por la presentación en fagos se caracterizaron como o bien inhibidores de pCal o agentes de unión, pero no inhibidores. Los anticuerpos que inhiben la actividad de pCal o bien se unen cerca del sitio activo e impiden las interacciones de sustratos (inhibidores competitivos), o bien se unen lejos del sitio activo e inducen cambios alostéricos en la estructura del sitio activo (inhibidores no competitivos). Es poco probable que los anticuerpos que se unen, pero no inhiben pCal, se unan cerca del sitio activo y puedan unirse al dominio no catalítico (es decir, el dominio de manzana). La Tabla 12 clasifica anticuerpos seleccionados como o bien inhibidores o agentes de unión de pCal. También se muestra en la Tabla 12 para los anticuerpos enumerados, es una demonstración de si reaccionan o no de forma cruzada con pCal de ratón como inhibidores y si se unen o no a precalicreína.
Tabla 12. Propiedades de unión de anticuerpos anti-pCal seleccionados
Número
Anticuerpo Categoría de unión Ki,ap humana (nM) Ki,ap de ratón (nM) Péptido(s) identificados CLIPS
1
M6-A06 1) Agente de unión solo no no C4
2
M6-D09 2) inhibidor, agente de unión de precalicreína, inhibe pCal de ratón y 5,9 3,9 C1,C5
Número
Anticuerpo Categoría de unión Ki,ap humana (nM) Ki,ap de ratón (nM) Péptido(s) identificados CLIPS
humana
3
M8-C04 1) Agente de unión solo no no
4
M8-G09 1) Agente de unión solo no no C1, C4, C6, C7
5
M29-D09 3) inhibidor, no se une a precalicreína, no inhibe la pCal de ratón 0,7 no C1, C4, C7
6
M35-G04 2) inhibidor, agente de unión de precalicreína, inhibe pCal de ratón y humana 2,9 8 C1, C4
7
M145-D11 3) inhibidor, no se une a precalicreína, inhibidor débil de ratón pCal 0,79 800 C1, C4
8
M160-G12 4) inhibidor de tanto pCal de ratón como humana, no se une a precalicreína 5 0,2 C2
9
X55-F01 4) inhibidor de tanto pCal de ratón como humana, no se une a precalicreína 0,4 2 C2, C3
10
X73-H09 4) inhibidor, no se une a precalicreína, inhibidor débil de pCal humana y de ratón 20 70 C6
11
X81-B01 4) inhibidor de tanto pCal de ratón como humana, no se une a precalicreína 0,1 0,011 C2, C3, C5, C6
12
A2 5) Control negativo, no se une a pCal, se une a estreptavidina No se une No se une No se une
C1-C7: péptidos en pCal identificados por el mapeo de epítopes de CLIPS (véanse las FIGURAS 9 y 10A-10C). C1 corresponde a las posiciones 55-67 del dominio catalítico, C2 a las posiciones 81-94, C3 a las posiciones 101-108, C4 a las posiciones 137-151, C5 a las posiciones 162-178, C6 a las posiciones 186-197 y C7 a las posiciones 214217.
5 Mapeo de epítopes usando CLIPS
Se probaron los 11 anticuerpos anti-pCal enumerados en la Tabla 12, más un control negativo (A2) para la unión a 5000 CLIPS (péptidos químicamente unidos sobre armazones) sintéticos diferentes por Pepscan como se describe más adelante en las secciones MÉTODOS DE CLIP. Este análisis condujo a la identificación de regiones de péptido en pCal que es probable que sean una parte del epítope de anticuerpo para cada uno de los anticuerpos probados 10 (FIGURA 9).
MÉTODOS DE CLIPS
Se sintetizaron péptidos lineales y CLIPS basándose en la secuencia de aminoácidos de la proteína diana usando química estándar de Fmoc y se desprotegieron usando ácido trifluórico como eliminadores. Los péptidos restringidos se sintetizaron sobre armazones químicos con el fin de la reconstrucción de epítopes conformacionales, usando 15 tecnología de péptidos químicamente unidos sobre armazones (CLIPS) (Timmerman et al. (2007). Por ejemplo, se sintetizaron los péptidos de un solo bucle que contenían una dicisteína, que se cicló tratando con alfa, alfa'- dibromoxileno y se varió el tamaño del bucle introduciendo restos de cisteína a separación variable. Si estaban presentes otras cisteínas aparte de las cisteínas recién introducidas, se sustituyeron por alanina. Las cadenas laterales de las múltiples cisteínas en los péptidos se acoplaron a moldes de CLIPS reaccionando sobre tarjetas de 20 PEPSCAN de polipropileno con formato de tarjeta de crédito (455 formatos de péptido/tarjeta) con una disolución 0,5 mM de molde de CLIPS tal como 1,3-bis(bromometil)benceno en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7,9)/acetonitrilo (1:1(v/v)). Las tarjetas se agitaron suavemente en la disolución durante 30 a 60 minutos mientras que se cubrieron completamente en disolución. Finalmente, las tarjetas se lavaron ampliamente con exceso de H2O y se sonicaron en tampón de rotura que contenía 1 por ciento de SDS/0,1 por ciento de beta-mercaptoetanol en PBS 25 (pH 7,2) a 70 °C durante 30 minutos, seguido por sonicación en H2O durante otros 45 minutos. Se probó la unión de anticuerpo a cada péptido en un ELISA basado en PEPSCAN. Las tarjetas de polipropileno de formato de tarjeta de crédito de 455 pocillos que contenían los péptidos covalentemente unidos se incubaron con disolución de anticuerpo primario, por ejemplo, que consistía en 1 microgramo/ml diluida en disolución de bloqueo llamada SQ (4 % de suero
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de caballo, 5 % de ovoalbúmina (p/v) en PBS/1 % de Tween o diluida en PBS por ejemplo, 20 % de SQ) durante la noche. Después de lavar, los péptidos se incubaron con una dilución 1/1000 de peroxidasa de conejo anti-anticuerpo humano o peroxidasa de cabra-anti-Fab humano durante una hora a 25 °C. Después de lavar, se añadieron el sustrato de peroxidasa sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) y 2 microlitros de 3 por ciento de H2O2. Después de una hora, se midió el desarrollo de color. El desarrollo de color se cuantificó con una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD) y un sistema de procesamiento de imágenes (como se describió en primer lugar en Slootstra et al., 1996).
Cálculo de datos
Datos sin procesar: Densidad óptica (unidades arbitrarias de DO)
Los datos sin procesar son valores ópticos obtenidos por una cámara de CCD. Los valores varían principalmente desde 0 hasta 3000, una escala logarítmica similar a 1 a 3 de un lector de ELISA estándar de placas de 96 pocillos. Primero, la cámara de CCD hace una foto de la tarjeta antes de la coloración de la peroxidasa y luego otra vez una foto después de la coloración de peroxidasa. Estas dos fotos se restan entre sí dando como resultado los datos que se denominan datos sin procesar. Éstos se copian en la base de datos Peplabtm. Entonces se copian los valores en excel y este archivo se marca como archivo de datos sin procesar. Se permite una manipulación de seguimiento. Algunas veces un pocillo contiene una burbuja de aire dando como resultado un valor positivo falso, las tarjetas se inspeccionan manualmente y cualquier valor causado por una burbuja de aire se puntúa como 0.
Normalmente, los ensayos no se hacen por duplicado (solo tras petición del cliente). Las pruebas por duplicado son normalmente muy similares. Además, el conjunto de datos de miles de péptidos contiene muchos péptidos que son similares, así los resultados nunca se basan en el reconocimiento de un péptido, sino en familias de péptidos similares. Si uno o algunos péptidos no se unen, o presentan unión más baja, en un experimento duplicado, normalmente no se atribuye a una mapeo de epítopes diferente.
Timmerman et al. (2007). Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPS™ technology. J. Mol. Recognit. 20:283-99
Slootstra et al. (1996). Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries, Molecular Diversity, 1,87-96.
EJEMPLO 9: Análisis de secuencias de pCal de diferentes especies
Toda las secuencias disponibles de pCal se obtuvieron de bases de datos públicas y se alinearon usando ClustalW y las regiones se resaltaron basándose en la accesibilidad del disolvente, el contacto con un inhibidor de Kunitz de sitio activo y los péptidos identificados por análisis de CLIPS (FIGURAS 10A-10C). Se obtuvo plasma citrado de cada una de estas especies y se activó usando un activador de precalicreína comercialmente disponible (de Enzyme Research Laboratories) según las instrucciones del fabricante. Entonces se midió la actividad de la calicreína en cada una de las muestras en presencia o ausencia de X81-B01.
Se encontró que X81-B01 inhibió pCal de todas las especies, excepto pCal de cerdo. Puesto que el análisis de CLIPS identifica cuatro péptidos de pCal a los que se une X81-B01 - C2 (posiciones 81-94), C3 (posiciones 101108), C5 (posiciones 162-178) y C6 (posiciones 186-197) - se examinaron las diferencias en la secuencia de pCal de cerdo que corresponden a estos péptidos para identificar posibles cambios de aminoácidos que explican la falta de inhibición de pCal de cerdo por X81-B01. Los péptidos C2 y C3 están próximos en la secuencia y ambos son altamente similares en secuencia entre las diferentes especies. Sin embargo, existe una diferencia en la posición 479. Todas las especies, excepto cerdo, rana y perro, tienen una serina en la posición 479. La secuencia de pCal de rana y perro tiene una alanina y una treonina en la posición 479, respectivamente; ambas de las cuales se consideran sustituciones conservativas para una serina. A diferencia, la secuencia de pCal de cerdo tiene una leucina en la posición 479, que es una sustitución considerablemente menos conservativa para una serina. El péptido C5 en pCal de cerdo es altamente similar a las secuencias de las otras especies. Sin embargo, en la posición 563, solo en la pCal de cerdo está presente una histidina (negrita en la FIGURA 10C). Esta posición en todas las otras especies, excepto rana, es una tirosina. En la pCal de rana, que se inhibe por X81-B01, esta posición es una treonina. El péptido C6 en pCal de cerdo es otra vez altamente similar a las otras secuencias. Sin embargo, solo en la secuencia de pCal de cerdo es la posición 585 un glutamato (en negrita en la FIGURA 10C). En todas las otras especies, esta posición es un aspartato. Este análisis puede indicar restos posiblemente críticos en pCal que interaccionan con X81-B01.
EJEMPLO 10: Ensayos in vitro e in vivo para evaluar la eficacia de una proteína de unión a calicreína plasmática.
Unión a precalicreína frente a calicreína: Se puede demostrar experimentalmente la ventaja de un anticuerpo inhibidor de pCal que no se une a precalicreína con respecto a un anticuerpo que se une a precalicreína. Por ejemplo, se puede diseñar un experimento in vitro para comparar la potencia de un inhibidor de anticuerpo contra pCal que no se une a precalicreína (por ejemplo, DX-2922) con uno que se une a precalicreína (por ejemplo, M6- D09) usando el ensayo del tiempo de coagulación de plasma tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT). El ensayo de APTT induce la coagulación en plasma mediante la adición de un reactivo que activa específicamente el
componente del sistema de contacto de la vía de coagulación intrínseca, de la que participa la actividad de pCal. Se conoce bien en la bibliografía que la inhibición de pCal o que una deficiencia genética en pCal conduce a aPPT prolongada (véase, por ejemplo, Morishita, H., et al., Thromb Res, 1994. 73(3-4): p. 193-204; Wynne Jones, D., et al., Br J Haematol, 2004. 127(2): p. 220-3). Se puede realizar un experimento in vitro para medir el efecto de 5 enriquecer plasma humano citrado con diferentes concentraciones de cualquiera de M6-D09 o DX-2922 sobre los tiempos de coagulación observados inducidos usando reactivos de APTT comercialmente disponibles y un analizador de la coagulación (Tabla 13). Se espera que la CE50 observada para la prolongación de APTT de M6- D09 sea significativamente superior a la de DX-2922 debido a la unión de M6-D09 a la precalicreína de alta concentración (~500 nM) en la muestra de plasma normal. La eficacia del anticuerpo inhibidor de pCal como se 10 demuestra por el prolongado APTT soporta el posible uso terapéutico del anticuerpo en el tratamiento o la prevención de enfermedad cardiovascular asociada a la aberrante formación de coágulos, tal como se puede observar en aterosclerosis, accidente cerebrovascular, vasculitis, aneurisma y pacientes implantados con dispositivos de asistencia ventricular.
Tabla 13: Diseño del estudio para medir el efecto de inhibidores de anticuerpos de pCal sobre APTT
Condición
Efecto observado sobre APPT
Sin tratamiento, solo plasma
Normal
Control de plasma agotado en precalicreína (comercialmente disponible)
Prolongación máxima
M6-D09 a baja concentración
Normal
M6-D09 a media concentración
Normal
M6-D09 a alta concentración
APTT prolongado
DX-2922 a baja concentración
APTT prolongado
DX-2922 a media concentración
APTT prolongado
DX-2922 a alta concentración
Prolongación máxima
15
Eficacia en un modelo de rata de edema: También se puede realizar un experimento in vivo para demostrar el aumento de potencia de un anticuerpo inhibidor de pCal que no se une a precalicreína. El modelo de edema en la pata inducido por carragenina (CPE) de edema en ratas es un modelo de farmacología común. Se tratará un grupo de ratas con dosis crecientes de M6-D09 y DX-2922 por inyección intraperitoneal (IP) antes de inyectar carragenina 20 (por ejemplo 0,1 ml de una disolución al 10 % p/v) en las patas de las ratas (Tabla 14). Se espera que DX-2922 sea más eficaz en reducir la inflamación de la pata observada que M6-D09. La eficacia del anticuerpo respalda el uso terapéutico del anticuerpo en diversas enfermedades inflamatorias que están asociadas con cualquier inflamación (por ejemplo, angioedema hereditario, edema inducido por accidente cerebrovascular, edema cerebral) o inflamación mediada por bradiquinina y dolor (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino).
25 Tabla 14: Diseño del estudio para observar el efecto de inhibidores de anticuerpos sobre CPE
Grupo
Tratamiento Dosis de ejemplo (mg/kg) Efecto esperado
1
Vehículo N/A Máxima inflamación
2
Indometacina (control positivo) 5 Máxima reducción de la inflamación
3
M6-D09 1 Sin efecto sobre la inflamación
4
M6-D09 3 Sin efecto sobre la inflamación
5
M6-D09 10 Reducción intermedia de la inflamación
6
DX-2922 1 Sin efecto sobre la inflamación
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DX-2922 3 Reducción intermedia de la inflamación
8
DX-2922 10 Máxima reducción de la inflamación
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Medición de la semivida: Se determinarán las propiedades farmacocinéticas de DX-2922 en ratas y monos cinomolgos en un diseño del estudio brevemente expuesto en la Tabla 15. El suero se recogerá en los momentos indicados tras la inyección IV de DX-2922. Se determinará la concentración de DX-2922 por ELISA y se representará frente al tiempo con el fin de obtener parámetros farmacocinéticos (eliminación, semivida, volumen de distribución, etc.). Se espera que DX-2922 tenga una semivida superior a 5 días en monos cinomolgos que aumentará a una semivida superior a 7 días en seres humanos.
Tabla 15: Un estudio farmacocinético de inhibidor de calicreína plasmática pCal administrado por las vías
intravenosa y subcutánea a monos cinomolgos.
Grupo
Tratamiento Nivel de dosificación (mg/kg/día) Vía Número de animales (sexo) Recogida de suero
1
pKAL 20 IV 4 (M) Pre-dosis 0,08, 0,25, 0,5, 1, 4, 24 horas Día 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14
2
pKAL 20 IV 4 (M) Pre-dosis 0,08, 0,25, 0,5, 1, 4, 24 horas Día 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14
EJEMPLO 11: Mapeo de epítopes usando mutaciones de aminoácidos de pCal
Basándose en los estudios de mapeo de epítopes descritos en el presente documento en el Ejemplo 8, los presentes inventores inspeccionaron el modelo tridimensional publicado en la base de datos de proteínas RCSB (disponible en internet en rcsb.org; pdb code 2ANY) y se identificó una colección de conjuntos aminoácidos en bucles accesibles a la superficie cerca del sitio activo enzimático que los presentes inventores razonaron que podrían interaccionar con la unión del anticuerpo dando como resultado la inhibición enzimática. Estos aminoácidos se sustituyeron por alanina y el dominio catalítico de cada uno de los mutantes se expresó en Pichia pastoris con una fusión de marca His y se purificó por IMAC. Se sintetizaron cuatro mutantes de pCal mutantes diferentes y se probaron:
Mutante 1: Se mutaron los aminoácidos S478, N481, S525 y K526 de la secuencia de calicreína humana (N° de acceso NP_00883.2) a alanina. Se determinó que estos aminoácidos estaban implicados en el reconocimiento de sustrato (subsitio S3).
Mutante 2: Se mutaron los restos de aminoácidos R551, Q553, Y555, T558 y R560 de la secuencia de calicreína humana (N° de acceso NP_00883.2) a alanina. Se determinó que estos restos participaban en el reconocimiento de sustrato de sitio activo (subsitio S1').
Mutante 3: Se mutaron los aminoácidos D572, K575 y D577 de la secuencia de calicreína humana (N° de acceso NP_00883.2) a alanina. Estos restos de aminoácidos participan en el reconocimiento de sustrato (subsitio S1')
Mutante 4: Se mutaron los aminoácidos N395, S397 y S398 de la secuencia de calicreína humana (N° de acceso NP_00883.2) a alanina. Estos restos están distales del sitio activo de calicreína plasmática.
Tres de los 4 mutantes (Mutante 1, 2 y 4) tienen actividad similar a la del dominio catalítico no mutante de pCal. Las sustituciones de aminoácidos en el Mutante 3 dieron una proteína inactiva que no fue reconocida en los ensayos de unión SPR (Biacore) por ninguno de los anticuerpos anti-pCal probados.
Los anticuerpos probados para la inhibición de los mutantes 1, 2 y 4 se muestran en el presente documento en la Tabla 16. Basándose en los valores de Ki,ap medidos para los anticuerpos en el Grupo 1 (es decir, los anticuerpos que inhiben pCal humana y de ratón, pero no se unen a precalicreína), es evidente que este grupo de anticuerpos se une al epítope en pCal que contiene los aminoácidos que se mutaron en el Mutante 2, pero no dependían de restos mutados en los Mutantes 1 o 4. Además, la interacción de proteínas de unión a calicreína plasmática X81-B01/X101- A01/DX-2922 y el derivado madurado por afinidad X115-B07 con calicreína se afecta adversamente por las sustituciones en el Mutante 1. Para un ejemplo de las diferencias en la capacidad de los anticuerpos para unirse a precalicreína, véanse, por ejemplo, la Figura 11A y 11B, que compara para precalicreína la unión de DX-2922 (Grupo 1) con la de M6-D09 (Grupo 3).
Los anticuerpos en el Grupo 2 (es decir, los que inhiben pCal humana, no pCal de ratón y no se unen a precalicreína) no estuvieron significativamente afectados por los aminoácidos mutados, que indica que hacen
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contacto con aminoácidos alternativos. Es probable que los anticuerpos del Grupo 2 se unan cerca del sitio activo, ya que fueron incapaces de unirse a pCal complejado con un dominio de Kunitz (EPI-KAL2), que se sabe que se unen en el sitio activo de una serina proteasa. Además, uno de los anticuerpos en el Grupo 2 (M145-D11) es similar a aquellos en el Grupo 1 por que es incapaz de unir pCal en un ensayo de Biacore que se inactiva con el inhibidor suicida AEBSF (clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo), que es una inhibidor covalente de molécula pequeña de serina proteasas de tipo tripsina (Figura 12). Sin embargo, el otro anticuerpo (M29-D09) asignado al Grupo 2 fue capaz de unirse a pCal inactivada con AEBSF, que indica que se puede unir a un epítope diferente de M145-D11 a pesar de compartir propiedades de unión similares.
Los anticuerpos en el Grupo 3 inhibieron pCal humana y de ratón, pero se unieron a precalicreína. Uno de estos anticuerpos, M6-D09, fue incapaz de unirse a pCal inactivada por EPI-KAL2 o AEBSF, que indica que este grupo de inhibidores de pCal interacciona con aminoácidos alternativos cerca del sitio activo. La Ki,ap para M6-D09 aumentó aproximadamente 5 veces hacia el Mutante 2 (es decir, disminuyó la potencia de M6-D09).
EJEMPLO 12: Maduración por afinidad
Además de la maduración por afinidad descrita en el presente documento en los Ejemplos 4 y 5, que implicó la optimización de la cadena ligera, los presentes inventores intentaron optimizar además la afinidad con bibliotecas que varían los aminoácidos en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable de dos anticuerpos anti-pCal parentales diferentes. Ambos de los anticuerpos seleccionados para la optimización adicional (X63-G06 y M162-A04) presentan propiedades deseables para el desarrollo adicional como inhibidor de anticuerpo terapéutico de calicreína plasmática; incluyendo las propiedades: a) inhibición completa de calicreína plasmática humana y de roedor y b) ninguna unión a precalicreína. En algunas realizaciones, la inhibición completa de pCal humana es esencial para bloquear la actividad de calicreína plasmática en los usos de enfermedad. La inhibición de pCal de roedor facilita el desarrollo preclínico que incluye evaluación de la toxicidad. La falta de unión a precalicreína es una propiedad altamente deseable para un anticuerpo inhibidor de pCal para maximizar la biodisponibilidad del anticuerpo terapéutico hacia la diana de pCal activa y para reducir posiblemente la dosis requerida para la eficacia.
Se realizó maduración por afinidad usando 4 bibliotecas de presentación en fagos diferentes. Para cada anticuerpo parental (por ejemplo, I62-A04), se construyó una biblioteca que contenía posiciones de aminoácidos variadas en tanto CDR1 como CDR2 de la cadena pesada. Se construyó una biblioteca adicional para cada uno de los dos anticuerpos parentales en los que se variaron las posiciones en la CDR3 de la cadena pesada. Cada una de estos 4 bibliotecas de presentación en fagos se seleccionó (inmunopurificó) con cantidades decrecientes de pCal activa en cada ronda posterior con el fin de obtener anticuerpos de alta afinidad. Para minimizar la aparición de unión a precalicreína en el anticuerpo seleccionado, se agotaron inicialmente las bibliotecas de salida en precalicreína inmovilizada. Después de cribar como fragmentos Fab, los presentes inventores descubrieron los anticuerpos madurados por afinidad mostrados en la Tabla 16 (es decir, los anticuerpos con el número de identificación que empieza con "X115").
Se encontró que cuatro anticuerpos descubiertos (X115-B07, X115-D05, X115-E09 y X115-H06) que derivan del anticuerpo parental DX-2922 (también conocido como X63-G06 como un fragmento Fab, X81-B01 como una IgG producida en células 293T, o X101-A01 como una IgG producida en células CHO) eran potentes inhibidores de pCal. Para la comparación, se muestra la secuencia de aminoácidos de DX-2922. Es evidente que tres de los anticuerpos madurados por afinidad (X115-B07, X115-E09 y X115-H06) contienen mutaciones en Hv-CDR3; mientras que X115- D05 tiene Hv-CDR1/CDR2 diferente. Cuatro otros anticuerpos descubiertos (X115-F02, X115-A03, X115-D01 y X115-G04) derivan del anticuerpo parental M162-A04. Los 8 anticuerpos madurados por afinidad no se unen a precalicreína.
154
Tabla 16: Resumen de las constantes de inhibición de anticuerpos anti-pCal madurados por afinidad (Ki,ap) en el dominio catalítico de pCal no mutante y los Mutantes 1,
y 4a
Población
Ki,ap de dominio cat. WT (nM) Ki,ap de Mutante 1 (nM) Ki,ap de Mutante 2 (nM) Ki,ap de Mutante 4 (nM) Compite con AEBSF Compite por epi- kal2 Características
DX-2922
0,22 14 20 0,25 SÍ SÍ inhibe pCal humana y de ratón; no se une a precalicreína
559A-X115-B07 (mad por af; X101-A01 parental)
0,13 4,7 47 0,14 sí nd inhibe pCal humana y de ratón; no se une a precalicreína
559A-X115-D05 (mad por af;X101-A01 parental)
nd nd nd nd sí nd inhibe pCal humana y de ratón; no se une a precalicreína
559A-X115-E09 (mad por af; X101-A01 parental)
nd nd nd nd sí nd inhibe pCal humana y de ratón; no se une a precalicreína
559A-X115-H06 (mad por af;X101-A01 parental)
nd nd nd nd sí nd inhibe pCal humana y de ratón; no se une a precalicreína
559A-X115-A03 (mad por af; M162-A04 parental)
0,16 0,23 3,7 0,13 sí nd inhibe pCal humana y de ratón; no se une a precalicreína
559A-X115-D01 (mad por af; M162-A04 parental)
0,18 0,26 2,5 0,12 sí nd inhibe pCal humana y de ratón; no se une a precalicreína
559A-X115-F02 (mad por af; M162-A04 parental)
0,09 0,14 5,9 0,1 sí SÍ inhibe pCal humana y de ratón; no se une a precalicreína
559A-X115-G04 (mad por af; M162-A04 parental)
0,3 0,4 2,2 0,3 sí sí inhibe pCal humana y de ratón; no se une a precalicreína
559A-M29-D09 (sFab))
0,24 0,27 0,34 0,39 nd sí inhibe pCal humana y de ratón; no inhibe pCal de ratón; no se une a precalicreína
559A-M145-D11 (sFab)
0,16 0,23 0,1 0,21 sí sí inhibe pCal humana y de ratón; inhibe débilmente pCal de ratón; no se une a precalicreína
559A-M06-D09
2,5 3,4 13,5 2,9 sí sí inhibe pCal humana y de ratón; se une a precalicreína
Población
Ki,ap de dominio cat. WT (nM) Ki,ap de Mutante 1 (nM) Ki,ap de Mutante 2 (nM) Ki,ap de Mutante 4 (nM) Compite con AEBSF Compite por epi- kal2 Características
559A-M35-G04
0,8 0,09 1,1 0,8 nd nd inhibe pCal humana y de ratón; se une a precal icreína
aLos anticuerpos se obtuvieron de maduración por afinidad de HV-CDR1/2 y HV-CDR3, se purificaron y se probaron para la inhibición de cualquier dominio catalítico de pCal no mutante (Nota, los anticuerpos inhibieron pCal no mutante de longitud completa aproximadamente igual que el dominio catalítico no mutante).
156
Tabla 17
Población
LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV- CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3 Ki,ap de pCal de longitud completa (nM) Ki,ap de dominio cat. WT (nM) Ki,ap de Mutante 1 (nM) Ki,ap de Mutante 2 (nM) Ki,ap de Mutante 4 (nM) Compite con AEBSF Compite por epi- kal2 grupo
DX-2922
RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VARGIAARSRTSYFDY 0,2 0,22 14 20 0,25 sí sí 1
X115-B07
RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VGQGIRGRSRTSYFAQ 0,33 4,7 47 0,14 sí nd 1
X115-D05
RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT DYMMA SIVPSGGHTHYADSVKG VARG IAARSRTSYFDY 0,25 nd nd nd nd sí nd 1
X115-E09
RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VAQGIAARSRTSSVDQ 0,34 nd nd nd nd sí nd 1
X115-H06
RTSQFVNSNYLA GASSRAT QQSSRTPWT HYLMT YISPSGGHTIYADSVKG VAQGISARSRTSYFDY 0,35 nd nd nd nd sí nd 1
M162-A04
RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRTGIPRRDAFDI nd nd nd nd sí sí 1
X115-A03
RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM GIYSSGGITVYADSVKG RRIGVPRRDSFDM 0,16 0,16 0,23 3,7 0,13 sí nd 1
X115-D01
RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT IYSMH SIYPSRGMTWYADSVKG RRTGIPRRDAFDI 0,18 0,18 0,26 2,5 0,12 sí nd 1
X115-F02
RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM G IYSSGG ITVYADSVKG RRIGVPRRDEFDI 0,089 0,09 0,14 5,9 0,1 sí sí 1
X115-G04
RASQSISSWLA KASTLES QQYNTYWT HYIMM G IYSSGG ITVYADSVKG RRTGVPRRDEFDI 0,6 0,3 0,4 2,2 0,3 sí sí 1
M29-D09
SGNKLGDKYVA QDTKRPS QAWDSSIVI WYTMV YIYPSGGATFYADSVKG GSYDYIWGFYSDH 0,7 0,24 0,27 0,34 0,39 n sí 2
M145-D11
SGDKLGDKYTS QDIKRPS QAWDSPNARV HYRMS SIYPSGGRTVYADSVKG DKFEWRLLFRGIGNDAF DI 0,79 0,16 0,23 0,1 0,21 sí sí 2
M06-D09
RASQSIRNYLN AASTLQS QQLSGYPHT FYYMV VIYPSGG ITVYADSVKG DKWAVMPPYYYYAMDV 5,9 2,5 3,4 13,5 2,9 sí sí 3
M35-G04
RASQSVSSYLA DASNRAT QQRSNWPRGFT YYHMS VISPSGGSTKYADSVKG GGSSDYAWGSYRRPYY FDY 2,9 0,8 0,09 1,1 0,8 nd nd 3
5
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45
50
Mediciones de K¡,aP en equilibrio. Se midieron las constantes de inhibición aparente (valores de K¡,ap) por preincubación de disoluciones de enzima e inhibidor antes de iniciar las reacciones con sustrato. Se preincubaron la enzima y el inhibidor durante 2 horas a 30 °C en una placa de 96 pocillos añadiendo 10 pl de 10X disolución de enzima y 10 pl de 10X disoluciones de inhibidor a 70 pl de tampón de reacción. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 10 pl de 10X reserva concentrada de sustrato, y se monitorizaron a 30 °C en un lector de placas de fluorescencia con las longitudes de onda de excitación y de emisión establecidas a 360 nm/460 nm, respectivamente. Se adquirieron los datos cinéticos por el aumento en la fluorescencia, y las tasas iniciales para cada condición se representaron contra la concentración de inhibidor total. Los datos se ajustaron a la siguiente ecuación para inhibidores de unión fuertes:
imagen1
Donde A = tasa inicial observada a cada concentración de inhibidor; Ao = tasa inicial observada en ausencia de inhibidor; Ainh = tasa inicial observada para el complejo de inhibidor enzimático; Inh = concentración de inhibidor; E = concentración enzimática total (tratada como un parámetro propuesto); y Ki,ap = constante de inhibición en equilibrio aparente.
Grupos de inhibidores de anticuerpo. Los anticuerpos en el Grupo 1 inhiben pCal humana y de ratón, pero no se unen a precalicreína. Los anticuerpos en el Grupo 2 inhiben pCal humana, pero no de ratón, y no se unen a precalicreína. Los anticuerpos en el Grupo 3 inhiben la pCal humana y de ratón pero se unen a precalicreína.
Análisis de competición Biacore con un anticuerpo contra calicreína a modo de ejemplo, epi-Kal2.
Epi-Kal2 es un inhibidor de anticuerpos de calicreína que actúa uniéndose al sitio activo de calicreína (para la secuencia véase el Ejemplo 8). El análisis de competición Biacore se usa en el presente documento como un ensayo para determinar si un anticuerpo contra calicreína de prueba se une al mismo sitio que epi-Kal2 y se evalúa midiendo la competición (por ejemplo, desplazamiento) entre epi-Kal2 y el anticuerpo de prueba para unirse al sitio activo.
Se inmovilizó IgG específica anti-Fc humano de cabra o IgG anti-Fab humano por acoplamiento de amina en un chip sensor CM5 a densidades de inmovilización de aproximadamente 5000 UR. Se capturaron los anticuerpos anti-pCal o sFab sobre sus superficies respectivas inyectando una disolución 50 nM de IgG/sFab durante 1-2 minutos a 5 a pl/min. Se inyectaron pCal humana (100 nM) o complejo de pCal humana-ep-kal2 (hpKal 100 nM que se había preincubado con epi-kal2 1 pM durante 1 hora a temperatura ambiente) sobre las IgG capturadas o sFab durante 5 minutos a 20-50 pl/min seguido por una fase de disociación de 5-10 minutos. Las respuestas de unión se registraron al final de la fase de asociación. Se consideraron IgG o sFab anti-pCal que competían con epi-kal2 para unirse a pCal humana si la unión del complejo pCal-epi-kal2 a los anticuerpos anti-pCal era significativamente reducida (> 70 %) en comparación con una inyección de hpKal solo. La superficie del chip sensor se regeneró con un pulso de glicina 10 mM a pH 1,5 a un caudal de 100 pl/min. Las mediciones se realizaron a 25 °C usando HBS-P (HEPES 10 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM y 0,005 % de tensioactivo P20) como tampón de electroforesis. Los resultados del análisis de competición Biacore para epi-Kal2 se muestran en el presente documento en las Figuras 11A y 11B.
Análisis de competición Biacore con el inhibidor calicreína de molécula pequeña, AEBSF.
AEBSF (es decir, clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo) es un inhibidor de molécula pequeña de calicreína. Se usa en el presente documento el análisis de competición Biacore para determinar si un anticuerpo de prueba se une al mismo sitio (o un sitio de solapamiento) utilizado por AEBSF para la inhibición de calicreína.
Se inmovilizó IgG específica anti-Fc humano de cabra o IgG anti-Fab humano por acoplamiento de amina en un chip sensor CM5 a densidades de inmovilización de aproximadamente 5000 UR. Se capturaron IgG o sFab anti-pCal sobre sus superficies respectivas inyectando una disolución 50 nM de IgG/sFab durante 1-2 minutos a 5 a pl/min. Se inyectaron pCal humana (100 nM) o complejo de pCal humana-AEBSF (hpKal 100 nM que se había pretratado con AEBSF 1 mM durante 1 hora a temperatura ambiente) sobre las IgG o sFab capturados durante 5 minutos a 2050 pl/min seguido por una fase de disociación de 5-10 minutos. Las respuestas de unión se registraron al final de la fase de asociación. Se consideraron IgG o sFab anti-pCal que competían con AEBSF para unirse a pCal humana si la unión del complejo pCal-AEBSF a los anticuerpos anti-pCal era significativamente reducida (> 70 %) en comparación con una inyección de hpKal solo. La superficie del chip sensor se regeneró con un pulso de glicina 10 mM a pH 1,5 a un caudal de 100 pl/min. Las mediciones se realizaron a 25 °C usando HBS-P (HEPES 10 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM y 0,005 % de tensioactivo P20) como tampón de electroforesis. Los resultados del análisis de competición Biacore para AEBSF se muestran en el presente documento en la Figura 12.
559A-M0029—D09-LV
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559A-M0145-D11-LV
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55 9A-X0I01—A01-LV
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EIVLT'QSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRñTGIPDRFSGSGSGTD
FTLTI SRLEPEDFAVYYCQGSSRTPWTFGQGTKVE TK
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FT LTISRLEPEDFAVYYCQQSS RT PWTFGQGTKVEIK
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TLTlSSLQPEDFATYYCQQLSGYPHTFGQGTKLErK
559A-M0035-G04-LV
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FTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPRGFTFGPGTKVDIK
559A-M0029-D09-HV
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559A-M0029-D09 LV
CAGAGCGCTTTGACTCAGCCACCCACAGTGTCTGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGGATCACCTGCTCTGG AAATAAATTGGGGGATAAATATGTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTATGTTGGTCATCT ATCAAGATACTAAGCGCCCCTCAAGAGTTTCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGCGAATACAGCCACT CTGTCCATCAGCGGGACCCAGGCTCTGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGCATTGT GATCT TCGGCGGAGGGACCAGGCTGACCG TCC TA
559A-M0145-D11 LV
CAGAGCGTCTTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCTCCAGGACAGACAGCCAGCATCñCCTGCTCTGG
AGATAAATTGGGGGATAAATATACTTCCTGGTATCAGCAGAGGCCAGGCCAGTCCCCTGTATTGGTCATCT
ATCAAGATATCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACT
CTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGTCCCAATGC
GAGGGTCTTCGGATCTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA
559A-M0162-A04 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCG
GGCCAGTCAGAGTATCAGTAGTTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGA
TCTATAAGGCGTCTACTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTC
ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATACTTATTG
GACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
559A-X0101-A01 LV
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCCG
GACCTCCCAGTTCGTGAACTCCAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTAGACTGC
TGATCTACGGCGCCTCTTCCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAC
TTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTCCCGGAC
CCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
55 9A-X0115-A03 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCG
GGCCTCCCAGTCCATCTCCAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGA
TCTACAAGGCCAGCACCCTGGAATCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTTC
ACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACACCTACTG
GACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
55 9A-X0115-BÜ7 LV
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCCG
GACCTCCCAGTTCGTGAACTCCAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTAGACTGC
TGATCTACGGCGCCTCTTCCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAC
TTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTCCCGGAC
CCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
55 9A-X0115-DO1 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCG
GGCCTCCCAGTCCATCTCCAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGA
TCTACAAGGCCAGCACCCTGGAATCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTTC
ACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACACCTACTG
GACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
559A-X0115-DO5 LV
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCCG
GACCTCCCAGTTCGTGAACTCCAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTAGACTGC
TGATCTACGGCGCCTCTTCCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAC
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CCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
55 9A-X0115-E09 LV
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCCG
GACCTCCCAGTTCGTGAACTCCAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTAGACTGC
TGATCTACGGCGCCTCTTCCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAC
TTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTCCCGGAC
CCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
55 9A-XQ115-F02 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCG
GGCCTCCCAGTCCATCTCCAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGA
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GACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
55 9A-X0115-G04 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCG
GGCCTCCCAGTCCATCTCCAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGA
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ACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACACCTACTG
GACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
55 9A-X0115-H06 LV
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCCG
GACCTCCCAGTTCGTGAACTCCAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTAGACTGC
TGATCTACGGCGCCTCTTCCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAC
TTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTCCCGGAC
CCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
55SA-M0006-D09 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCG
GGCAAGTCAGAGTATTCGCAñCTñTTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGA
TCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCAGCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC
ACTCTCACTATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAGTGGTTACCC
CCACACTTTTGGCCA.GGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
559A-M0035-G04 LV
CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG
CAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC
TCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC
TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTG
GCCTCGCGGATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
559A-M0029-D09 HV
GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGC
TTCCGGATTCACTTTCTCTTGGTACACTATGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGG
TTTCTTATATCTATCCTTCTGGTGGCGCTACTTTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCT
AGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTA
CTGTGCGATGGGTTCATATGATTACATTTGGGGATTTTATAGTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCA
CCGTCTCAAGC
559A-MQ145-D11 HV
GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGC
TTCCGGATTCACTTTCTCTCATTACCGTATGTCTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGG
TTTCTTCTATCTATCCTTCTGGTGGCCGTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCT
AGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTA
CTGTGCGAAAGATAAGTTCGAGTGGAGGTTATTATTTCGCGGGATTGGAAATGATGCTTTTGATATCTGGG
GCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGC
55 9A-M0162-A04 HV
GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGC
TTCCGGATTCACTTTCTCTCATTACATTATGATGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGG
TTTCTGGTATCTATTCTTCTGGTGGCATTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCT
AGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTA
CTGTGCGTACCGCCGGACTGGGATTCCAAGAAGAGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCA
CCGTCTCAAGC
559A-X0101-A01 hv
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGTCTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC
CTCCGGCTTCACCTTCTCCCACTACCTGATGACCTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGCAAGGGCCTCGAATGGG
TGTCCTACATCTCCCCCTCTGGCGGCCACACCATCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCC
CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA
CTGCGCCAGGGTGGCCAGAGGAATCGCCGCCAGGTCCCGGACCTCCTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCA
CCCTGGTGACCGTGTCCTCC
55 9A-X0115-A03 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC
CTCCGGCTTTACCTTCTCCCACTACATCATGATGIGGGTGCGACAGGCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGG
TGTCCGGCATCTACTCCTCCGGCGGCATCACCGTGTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCC
CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA
CTGTGCCTGGCGGAGAATCGGCGTGCCCAGACGGGACTCCTTCGACATGTGGGGACAGGGCACCATGGTGA
CA.GTGTCCTCC
559A-X0115-B07 hv
GA.GGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC
CTCCGGCTTCACCTTCTCCCACTACCTGATGACCTGGGTGCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGG
TGTCCTACATCTCCCCCTCTGGCGGCCACACCATCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCC
CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTA.CCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA
CTGTGCCATGGTCGGCCAGGGAATCCGGGGCAGATCCCGGACCTCCTACTTCGCCCAGTGGGGCCAGGGCA
CCCTGGTGACAGTGTCCTCT
55 9A-X0115-DO 1 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC
CTCCGGCTTCACCTTCTCCATCTACTCCATGCACTGGGTGCGACAGGCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGG
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CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA
CTGCGCCTACCGGCGGACCGGCATCCCTAGACGGGACGCCTTCGACATCTGGGGGCAGGGCACCATGGTGA
CAGTGTCCTCC
559A-X0115-D05 HV
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CTCCGGCTTCACCTTCTCCGACTACATGATGGCCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGG
TGTCCTCCATCGTGCCCTCTGGCGGCCACñCCCACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCC
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CCCTGGTGACAGTGTCCTCC
559A-X0115-E09 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC
CTCCGGCTTCACCTTCTCCCACTACCTGATGACCTGGGTGCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGG
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CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA
CTGTGCCCGGGTGGCCCAGGGAATCGCCGCCAGATCCCGGACCTCCTCTGTGGATCAGTGGGGCCAGGGCA
CCCTGGTGACAGTGTCCTCT
559A-X0115-F02 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC
CTCCGGCTTCACCTTCTCCCACTACATCATGATGTGGGTGCGACAGGCTCCTGGCAAGGGGCTGGAATGGG
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CAGTGTCCTCC
55 9A-X0115-G04 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC
CTCCGGCTTCACCTTCTCTCACTACATTATGATGTGGGTGCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGG
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CTGCGCCTACAGACGGACCGGCGTGCCCAGACGGGACGAGTTCGATATCTGGGGGCAGGGCACCATGGTGA
CAGTGTCCTCC
55 9A-X0115-H06 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC
CTCCGGCTTCACCTTCTCCCACTACCTGATGACCTGGGTGCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGG
TGTCCTACATCTCCCCCTCTGGCGGCCACACCATCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCC
CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA
CTGTGCCCGGGTGGCCCAGGGAATCTCCGCCAGATCCCGGACCTCCTACTTCGATTACTGGGGCCAGGGCA
CCCTGGTGACAGTGTCCTCT
5 5 SA-MO O O 6-DO 9 HV
GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGC
TTCCGGATTCACTTTCTCTTTTTACTATATGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGG
TTTCTGTTATCTATCCTTCTGGTGGCATTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCT
AGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTA
CTGTGCGAGAGATAAATGGGCGGTGATGCCCCCCTACTACTACTACGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGA
CCACGGTCACCGTCTCAAGC
559A-M0035-G04 HV
GAAGTTCAATTGTTA.GAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGC
TTCCGGATTCACTTTCTCTTATTACCATATGTCTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGG
TTTCTGTTATCTCTCCTTCTGGTGGCTCTACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCT
AGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACTGCAGTCTACTA
TTGTGCGAGAGGCGGTTCGAGCGATTACGCTTGGGGGAGTTATCGTCGACCCTACTACTTTGACTACTGGG
GCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC

Claims (5)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo que se une a la forma activa de calicreína plasmática humana y no se une a precalicreína humana, y en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en
    (i) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
    EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRIGVPRRDEFDIWGQGTMVTVS S y secuencia Vl
    de diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliykastlesgvpsrf
    SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
    (ii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de EVQLLESGGGLVQPGGS
    lrlscaasgftfshyimmwvrqapgkglewvsgiyssggi
    tvyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycayrrtgiprrdafdiwg
    QGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS y una secuencia Vl de
    qdiqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapnlliykastlesg
    VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
    (iii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfshylmtwvrqapgkglewvsyispsgghtiy
    ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLV TVSS y una secuencia Vl de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
    (iv) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAA
    sgftfshylmtwvrqapgkglewvsyispsgghtiyadsvkgrftisrdnskntly
    LQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKS y una secuencia Vl de QDIQMTQSPG TLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQTPGQAPRLLIYGASSRAT
    GIPDRFSGTGYGTDFTLTISRLEPEDYGTYYCQQSSRTPWTFGQGTRVEIK;
    (v) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfshylmtwvrqapgkglewvsyispsgghtiy
    ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLV TVSS y una secuencia Vl de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
    (vi) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
    hylmtwvrqa pgkglewvsy ispsgghtiyadsvkgrfti srdnskntly lqmnslraed tavyycarva
    RGIAARSRTS YFDYWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS y una secuencia Vl de QDIQMTQSPS
    flsasvgdrv titcrasqgi ssylawyqqk pgkapklliyaastlqsgvp srfsgsgsgt eftltisslq
    PEDFATYYCQ QLNSYPLTFG GGTKVEIK;
    (vii) un anticuerpo que comprende una secuencia
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfsaysmiwvrqapgkglewvsyirpsggrtty adsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycargglllwfrelksnyfdywgqgt
    LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS y una secuencia
    qdiqmtqspsslsafvgdrvtitcrasqpidnylnwyhqkpgkapklliyaasrlqsgvps
    DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFGGGTKVEIR;
    (viii) un anticuerpo que comprende una secuencia
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfsaysmiwvrqapgkglewvsy irpsggrttyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycargg
    NYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS y una secuencia
    qdiqmtqspsslsafvgdrvtitcrasqpidnylnwyhqkpgkapklliy aasrlqsgvpsrlsgsgfgtdftltisslqpedfgnyycqqsytvpytfgggtkveir;
    (ix) un anticuerpo que comprende una secuencia
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfsaysmiwvrqapgkglewvsyirpsggrtty adsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycargglllwarelks
    NYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS y una secuencia
    qdiqmtqspsslsafvgdrvtitcrasqpidnylnwyhqkpgkapklliyaasrlqsgvps
    RLSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFGNYYCQQSYTVPYTFGGGTKVEIR;
    (x) un anticuerpo que comprende una secuencia
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfshylmtwvrqapgkglewvsyispsgghtiy
    ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMVGQGIRGRSRTSYFAQWGQGTL VTVSS y una secuencia Vl de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;

    Vh de

    Vl de
    RLSGSGFGT

    Vh de

    LLLWNRELKS Vl de

    Vh de

    Vl de

    Vh de
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    (xi) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
    EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYMMAWVRQAPGKGLEWVSSIVPSGGHTH YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTL VTVSS y una secuencia Vl de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
    (xii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfshylmtwvrqapgkglewvsyispsgghtiy
    ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVAQGIAARSRTSSVDQWGQGTL VTVSS y una secuencia Vl de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
    (xiii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfshylmtwvrqapgkglewvsyispsgghtiy
    ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVAQGISARSRTSYFDYWGQGTL VTVSS y una secuencia Vl de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
    (xiv) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfshyimmwvrqapgkglewvsgiyssggitvy
    ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAWRRIGVPRRDSFDMWGQGTMVT VSS y una secuencia Vl de DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
    (xv) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfsiysmhwvrqapgkglewvssiypsrgmtw
    YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRTGIPRRDAFDIWGQGTMVTV SS y una secuencia Vl de DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
    (xvi) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfshyimmwvrqapgkglewvsgiyssggitvy
    ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRTGVPRRDEFDIWGQGTMVTV SS y una secuencia Vl de DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;

    (xvii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfswytmvwvrqapgkglewvsy
    iypsggatfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycamgsydyiwgfysdh

    WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS y una secuencia Vl
    qsaltqpptvsvspgqtaritcsgnklgdkyvawyqqkpgqspmlviyqdtkrpsrvser
    FSGSNSANTATLSISGTQALDEADYYCQAWDSSIVIFGGGTRLTVL; y

    (xviii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfshyrmswvrqapgkglewvss
    iypsggrtvyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakdkfewrllfrgig

    NDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS y una secuencia Vl
    qsvltqppsvsvspgqtasitcsgdklgdkytswyqqrpgqspvlviyqdikrpsgiperf
    sgsnsgntatltisgtqamdeadyycqawdspnarvfgsgtkvtvl.
    de
    de
    de
    de
  2. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es una IgG o un Fab soluble (sFab).
  3. 3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada (VH) de
    evqllesggglvqpggslrlscaasgftfshyimmwvrqapgkglewvsgiyssggitvy
    ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRIGVPRRDEFDIWGQGTMVTVS S y una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera (VL) de
    diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliykastlesgvpsrf
    sgsgsgteftltisslqpddfatyycqqyntywtfgqgtkveik.
  4. 4. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  5. 5. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición según la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno asociado a calicreína plasmática en un sujeto, en el que el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en edema, artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis,
    vasculitis, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación en dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico y lesión por quemadura.
    5 6. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición según la reivindicación 4 para su
    uso en detectar calicreína plasmática en un sujeto, detectando una interacción entre el anticuerpo y la calicreína plasmática en el sujeto, si está presente.
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