JPH07286953A - イメージングフローサイトメータ - Google Patents

イメージングフローサイトメータ

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JPH07286953A
JPH07286953A JP6080509A JP8050994A JPH07286953A JP H07286953 A JPH07286953 A JP H07286953A JP 6080509 A JP6080509 A JP 6080509A JP 8050994 A JP8050994 A JP 8050994A JP H07286953 A JPH07286953 A JP H07286953A
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imaging
cell
light source
flow
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JP6080509A
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English (en)
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Yasunori Maekawa
泰範 前川
Tokihiro Kosaka
時弘 小坂
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Sysmex Corp
Original Assignee
Sysmex Corp
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
    • G01N15/147—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle the analysis being performed on a sample stream

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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 一つの粒子に対して、異なる複数の蛍光像を
撮像することにより、粒子内に三次元的に分布している
発光点をもれなく撮像する。 【構成】 粒子を含む試料液が内部に流動される光透過
性のフローセルと、フローセルの撮像領域に存在する粒
子の発光像を撮像する撮像手段を備え、撮像手段が、一
つの粒子に対して、異なる像を撮像する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、イメージングフロー
サイトメータに関する。さらに詳しくは、細胞や微生物
内のある特定の物質を検出するために、例えば、蛍光染
色あるいは蛍光標識されたモノクローナル抗体やＤＮＡ
プローブと反応処理させた細胞や微生物の懸濁液（これ
を「試料液」という）を細いガラス管内に導いて、フロ
ー方式で細胞や微生物等の蛍光像を撮像し、分析を行う
イメージングフローサイトメータに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、癌や遺伝病等の診断あるいは細胞
動態の解析のために、分子生物学的な解析、検査がさか
んに行われている。例えば、細胞や血球等に含まれるあ
る特定の物質（ＤＮＡ、増殖抗原、表面抗原、癌遺伝子
産物等）の検出あるいは染色体の数的異常を検査するこ
とを目的として、モノクローナル抗体や染色体特異的Ｄ
ＮＡプローブ等を蛍光標識した特異反応試薬を用いて細
胞を処理し、その細胞の蛍光像を蛍光顕微鏡を用いて鏡
検することが行われている。
【０００３】また、医薬品や食品添加物等の安全性評価
のために、染色体の異常から生じる断片（小核）の有無
を調べるための小核試験が行われている。この小核試験
においては、赤血球内に残留した小核を蛍光染色し、小
核の有無を蛍光顕微鏡等を用いて検査している。さら
に、白血球の貪食能を検査するために蛍光物質で標識し
たビーズを白血球に貪食させ、蛍光像よりビーズの個数
を計算することも行われている。
【０００４】従来、これらの測定は蛍光顕微鏡を用いて
行われており、多数の細胞や血球の測定を行う場合に
は、非常に時間と手間のかかるものであった。このよう
な蛍光顕微鏡を用いて測定を行う際、スライドグラス上
に細胞が伸展している場合は、被写界の焦点深度の浅さ
はそれほど大きな問題とはならない。しかし、スライド
グラスに細胞の浮遊液を封入した試料を測定する場合
は、測定者が顕微鏡のフォーカスを変化させながら細胞
の光軸に沿った方向をまんべんなく観察することによっ
て、被写界の焦点深度の浅さをカバーするようにしてい
た。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】最近、上記のような解
析や検査を、蛍光顕微鏡と画像処理装置とを組み合わせ
た装置で自動化することが試みられている。しかしなが
ら、このような装置で多数個の細胞を解析するには時間
がかかる。また、従来のフローサイトメータ（「ＦＣ
Ｍ」とも記す）による測定も試みられているが、この方
法では、蛍光を発している部位の局在を知ることができ
ない。しかも、検出したい特異物質が存在している所以
外の部位からの背後蛍光（非特異蛍光）が測定精度に影
響を与えるという問題があり、まだ実用化されるに至っ
ていない。
【０００６】このような問題を解決するために、蛍光像
撮像型イメージングフローサイトメーター（「ＩＦＣ
Ｍ」とも記す）という装置が実用化されている。この装
置は、ある特異的な蛍光染色あるいは蛍光標識されたモ
ノクローナル抗体やＤＮＡプローブと反応処理させた細
胞や微生物の懸濁液を細いガラス管内に導いて、フロー
方式でその細胞や微生物の蛍光像を撮像し、分析を行う
装置である。
【０００７】しかしながら、この装置で上記のような測
定を行う場合、細胞内に三次元的に分布している発光点
を精度よく測定するのは、その被写界の焦点深度の浅さ
のために困難である。
【０００８】それゆえ、被写界の焦点深度の浅さを克服
するための種々の方法が試みられている。例えば、光学
的に焦点深度を向上させる（深くさせる）方法がある。
これは、結像系のＮＡをできるだけ小さく設定する方法
である（例えば、ＮＡを“0.25”とした場合は被写界の
焦点深度は12μm 以上である）。しかし、この方法で
は、例えば二個の発光点が光軸方向に並んでいる場合
は、それらが重なってしまうので一つの発光点として観
察され、三次元的な分解能が確保できない。すなわち発
光点の正確な計数ができず、測定精度が低下することに
なる。
【０００９】なお、本発明の関連技術として、1989年発
行のＨＵＭＡＮ ＣＥＬＬ 2(4) の436 頁から438 頁
に、ＦＩＳＨ（FLUORESCENCE in situ HYBRIDIZATION）
による染色体異常検出の検討についての開示がある。こ
れにおいては、「間期の細胞で染色体異常を検出するた
めに染色体特異的プローブを用いてＦＩＳＨを行った。
抹消血リンパ球において１１番染色体特異的プローブで
は２個のspotが多く認められた。一方、Ｘ染色体特異的
プローブでは男性は１個、女性では２個のspotを認め
た。またＨｅＬａ細胞では１１番、Ｘともに３個のspot
を認めた。これらの結果より染色体特異的プローブを用
いたＦＩＳＨは染色体異常検出のためには有用で信頼性
の高い方法であると考えられた。」と記載されている。
【００１０】また、1982年発行のＣｅｌｌ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ Ｖｏｌ．１の306 頁から313 頁には、一つの細
胞に対して、焦点位置の異なる複数の粒子像を時間的に
ずらして撮像することが開示されている。
【００１１】
【課題を解決するための手段およびその作用】この発明
の目的は、染色体の数的異常の検査や、医薬品の安全性
評価のための小核試験等に用いられる検査装置、あるい
は白血球の貪食能の検査装置として応用する場合に必要
となる蛍光像の分解能を確保するために、一つの細胞
（粒子）に対して、異なる複数の発光像（例えば蛍光像
や化学発光像）を撮像し、一枚の画面に複数の発光像を
得て、画像解析を行うことにより、細胞内に三次元的に
分布している微小な発光点を確実に捉えて、正確に計数
できるようにしたイメージングフローサイトメータを提
供することにある。この場合、細胞（粒子）に化学発光
のための処理を施し、化学発光像を撮像してもよい。
【００１２】この発明によれば、粒子を含む試料液が内
部に流動される光透過性のフローセルと、フローセルの
撮像領域に存在する粒子の発光像を撮像する撮像手段を
備え、撮像手段が、一つの粒子に対して、異なる像を撮
像することを特徴とするイメージングフローサイトメー
タが提供される。
【００１３】この発明の最も特徴とする点は、粒子の発
光像を撮像する際に、一つの粒子に対して、異なる像を
撮像することにある。すなわち、異なる方向から、ある
いは異なる焦点位置で一つの粒子に対して複数の像を撮
像し、これにより、細胞内に三次元的（立体的）に分布
している染色体、小核、ビーズなどの発光点をもれなく
撮像する点にある。粒子の発光像とは、蛍光像や化学発
光像のことを意味する。
【００１４】この発明において、フローセルとしては、
フローセルの外側から粒子を撮像することが可能な、例
えば、ガラスやプラスチック製の光透過性の管が適用さ
れる。
【００１５】このフローセルとしては、断面が円形（丸
シース）あるいは矩形、長方形あるいは楕円形（平面シ
ース）などの各種の形状のものを用いることができる
が、粒子を鮮明に撮像するためには、粒子に対して焦点
の位置を安定させて、粒子を重なることなく１つずつ撮
像する必要がある。したがって、このような点から、粒
子を分離状態で、さらに偏平な粒子であればその粒子が
撮像方向に対して正面を向くように配向させて流動させ
ることのできる、断面形状が長方形あるいは楕円形の平
面シースフローセルを用いることが適している。このよ
うな平面シースフローセルとしては、約５０〜３００μ
ｍ程度の幅とその１／１０程度の厚みの偏平な試料液流
を形成することが可能な公知のフローセルを用いること
ができ、これには、例えば、特開平３−１０５２３５号
公報に記載のものなどを適用することができる。
【００１６】フローセル内に導入される試料液として
は、主として、微生物や、血液あるいは尿などを任意に
希釈した試料液が適用される。粒子は、フローセルの内
部に導入可能な大きさのものであればよく、材質、比
重、形状等に特に限定はない。この粒子としては、微生
物や、血液中に含まれる血球、尿中に含まれる細胞など
が適用される。
【００１７】撮像手段としては、フローセルの撮像領域
に存在する粒子の発光像を撮像することができるもので
あればよく、例えば、市販のビデオカメラを利用するこ
とができる。
【００１８】このような構成により、三次元的に分布し
ている染色体、小核、ビーズなどの粒子内の微小な発光
部を見落とすことなく撮像することができ、精度の高い
測定を行うことが可能となる。
【００１９】この発明のイメージングフローサイトメー
タにおいては、撮像手段を、一つの粒子に対して、複数
方向から複数の粒子像を撮像するように構成してもよ
い。また、一つの粒子に対して、焦点位置の異なる複数
の粒子像を同時に撮像するように構成してもよい。ある
いは、一つの粒子に対して、焦点位置の異なる複数の粒
子像を時間的にずらして撮像するように構成してもよ
い。
【００２０】また、この発明のイメージングフローサイ
トメータにおいては、フローセルの撮像領域に蛍光励起
用の光を照射する蛍光励起用光源を設けて、撮像手段
を、フローセルの撮像領域に存在する粒子の蛍光像を撮
像するように構成することができる。
【００２１】この場合の蛍光励起用光源としては、粒子
の蛍光像を得ることができる程度の光をフローセルの撮
像領域に照射することが可能な各種の光源を用いること
ができるが、粒子の存在する狭い撮像領域に光を集めて
照射するという観点からは、光を集束させることが容易
で、かつ高い光強度を得ることのできるレーザ光源を用
いることが適している。
【００２２】この光源は、粒子をブレなく撮像するため
には、パルス発光タイプの光源を用いるのが好ましい。
ただし、連続発光タイプの光源を用いることも可能であ
るが、その場合には、撮像手段に入る光路を開閉するゲ
ート機能を有する光シャッター（電子シャッター）を配
置して、粒子をブレなく撮像する。また、撮像する光像
の強度を増大させる必要のある場合には、ゲート機能を
有するイメージインテンシファイアを撮像手段の手前に
配置する。
【００２３】さらに、この発明のイメージングフローサ
イトメータにおいては、粒子を効率良く撮像するため
に、粒子通過監視系を付加し、粒子が撮像領域に入った
ことを確認した上で粒子を撮像するようにすることが適
している。
【００２４】この粒子通過監視系としては、常時発光す
る監視用光源と、その監視用光源からの光によりフロー
セルの撮像領域を粒子が通過することを検出する検出器
からなる粒子通過監視系が適用される。監視用光源とし
ては、ＬＤ，ＬＥＤ，ＳＬＤ等の連続発光タイプの光源
を用いることができる。
【００２５】この発明のイメージングフローサイトメー
タに、このような粒子通過監視系をさらに設ける場合、
蛍光励起用光源として連続発光タイプの光源を用いてい
る時には、この光源を粒子通過監視系の監視用光源とし
て兼用することができる。
【００２６】この発明のイメージングフローサイトメー
タにおいては、試料液に含まれる粒子を、あらかじめ蛍
光を誘発させるための試薬で処理しておくことが好まし
い。この試薬は、細胞や血球等に含まれる特定の物質
（ＤＮＡ，増殖抗原、表面抗原、癌遺伝子産物等）を検
出するための特異反応試薬である、モノクローナル抗体
や染色体特異的ＤＮＡプローブなどを蛍光染色あるいは
蛍光標識するためのものであり、通常、ＦＩＴＣや、Ｐ
Ｉ（プロピディウムアイオダイド）などが用いられる。
【００２７】この場合、光源は、フローセルの撮像領域
に、蛍光を励起する蛍光励起用の光を照射できるものが
用いられる。この蛍光励起用の光としては通常のレーザ
光を用いることもできる。また、このようにして蛍光を
励起し、撮像手段により、フローセルの撮像領域に存在
する粒子の蛍光像を撮像する。
【００２８】試薬処理なしで光を発する細胞などの粒子
を対象とする場合には、上記試薬処理は不要である。ま
た、光照射なしでみずから光を発する粒子を対象とする
場合には、光の照射は不要である。例えば、試薬として
化学発光を誘発させるための試薬で処理し、粒子の化学
発光像を撮像してもよい。このような化学発光の場合に
は、光源は不要である。
【００２９】この発明のイメージングフローサイトメー
タにおいては、上記したように、フローセル内の試料液
の流れを、偏平なシース流として形成することが好まし
く、その場合には、そのシース流の幅の狭い方向から蛍
光励起用光源の光を照射するように構成することが好ま
しい。
【００３０】つまり、蛍光励起用の光は、撮像領域の縦
方向より十分に大きな長径と、撮像する粒子の厚さより
十分に大きな短径を持った楕円形状の照射領域で、撮像
領域における照射強度が均一になるように照射すること
が望ましい。
【００３１】このようにすることにより、フローセルの
厚み方向に励起光を絞ることができるので、励起光の単
位面積当たりの照射強度を上げることができ、よりＳ／
Ｎ比の良い蛍光像を得ることができる。
【００３２】
【実施例】以下、図面に示す実施例１〜３に基づいてこ
の発明を詳述する。なお、これによってこの発明が限定
されるものではない。
【００３３】実施例１ 図１はこの発明によるイメージングフローサイトメータ
の実施例１の構成を示す説明図である。
【００３４】このイメージングフローサイトメータは、
微生物や、血液あるいは尿などを希釈した試料液（サン
プル液ともいう）をフローセルと呼ばれる透明なガラス
管中に導いて試料流（サンプル流ともいう）を形成し、
この試料流に対し、ストロボ光やパルスレーザ光のよう
なパルス光か、又は連続光を照射して、血液中に含まれ
る血球や尿中に含まれる細胞のような粒子（被検粒子と
称すこともある）の蛍光像や、あるいは透過光像などを
ビデオカメラで撮像する装置である。
【００３５】以下、被検粒子をその代表例である細胞と
して表現するが、細胞だけに限定されるものではなく、
微生物や、血液中に含まれる血球なども含むものとす
る。本実施例では、一つの細胞に対して異なる二方向か
ら２つの蛍光像を同時に撮像することを特徴としてい
る。
【００３６】図１において、１はガラスやプラスチック
などの透明で偏平な管からなるフローセルである。この
フローセル１中に試料液２が導入されるときには、同時
に、その試料液２の周囲を覆うようにしてシース（鞘）
液が供給され、試料液２とシース液とが層流となったも
の（これを「シースフロー」と称する）がフローセル１
内を流れるようになっている。
【００３７】このように、フローセル１中に導入された
試料液２は、シース液で包み込まれ、流体力学的効果に
よって試料流が細く絞られ、細胞が１列に並んで流れ
る。単位時間当たりの試料分析量を上げるためには、流
路の縦横比の大きいフローセルを用いる。すなわち、フ
ローセル１としては、粒子を分離状態で、さらに偏平な
粒子であればその粒子が撮像方向に対して正面を向くよ
うに配向させて流動させることのできる、断面形状が長
方形あるいは楕円形の平面シースフローセルを用いて、
偏平な試料流を形成するようにしている。フローセル１
中の試料流の長手方向の幅は５０〜３００μｍで、短手
方向、すなわち撮像方向の厚みはその約１／１０の５〜
３０μｍである。
【００３８】フローセル１中の細胞は、細胞中に含まれ
るある特定の物質（ＤＮＡ、増殖抗原、表面抗原、癌遺
伝子産物等）の検出あるいは染色体の数的異常を検査す
ることを目的として、モノクローナル抗体や染色体特異
的ＤＮＡプローブ等を蛍光標識した特異反応試薬であら
かじめ処理されている。
【００３９】３はフローセル１の撮像領域（「撮像エリ
ア」ともいう）に光を照射するための光源である。この
光源３からはレーザ光が照射される。フローセル１中の
細胞は、上記した細胞中に含まれるある特定の物質や、
染色体に結合した蛍光物質が、この光により励起され
て、短時間であるが自ら蛍光を発生する（以下、細胞中
のこのような特定の物質や染色体を「発光点」あるいは
「蛍光発光部」という）。
【００４０】なお、光源３から照射される光は蛍光を励
起させる光であるのでこの光を「励起光」とも呼ぶ。ま
た、光源３は蛍光を励起させる光を照射するので「励起
用光源」とも呼ぶ。
【００４１】励起用光源３は、連続発光タイプの光源で
あり、ＣＷレーザ光（連続発振レーザ光）を照射可能な
レーザ発光装置などから構成されている。励起光は落射
方式で照射している。図中、矢印は光の進行方向を示し
ている。
【００４２】４はレンズ、５は第１対物レンズ、６は第
２対物レンズ、７は第１ミラー、８は第２ミラー、９は
第３ミラーである。１０はビデオカメラからなる撮像部
であり、フローセル１の撮像エリアに存在する細胞の蛍
光像を撮像する。すなわち、励起用光源３から照射され
た励起光によって励起された細胞の蛍光像を撮像する。
この撮像部１０は、細胞の蛍光像を結像するための、Ｃ
ＣＤからなる受光面を有している。そして、二つの撮像
系から得られた二つの蛍光像を一つのビデオカメラで撮
像する。
【００４３】１１は撮像部１０で得られた蛍光像に対し
て各種の画像処理を行う画像処理部である。この画像処
理部１１では、例えば、蛍光発光部の数の計測、蛍光発
光部の大きさや位置の計測、蛍光発光部の形状（円形度
等）の計測、蛍光発光量の算出等を行う。
【００４４】１２は撮像部１０に入る光路を開閉するゲ
ート機能（光シャッター機能）を有するイメージインテ
ンシファイア（以下、Ｉ．Ｉ．とも記す）である。この
イメージインテンシファイア１２は、光の強さを数万倍
程度に増幅する光増幅器としての機能を有しており、細
胞をブレなく撮像するために、撮像部１０の手前に配置
され、外部トリガによりゲートを短時間だけ開くように
なっている。１３はリレーレンズである。このリレーレ
ンズ１３には光ファイバーを用いることもできる。
【００４５】１４はフローセル１の撮像エリアを細胞が
通過することを検出する細胞通過監視用の検出器であ
る。この検出器１４は、一次元イメージセンサ（ライン
センサ）またはフォトダイオードから構成されており、
細胞の散乱光を検出する。細胞通過監視用の光源は特に
設けておらず、励起用光源３の光によって細胞の通過を
監視する。すなわち、励起用光源３が細胞通過監視用の
光源としても機能するようになっている。
【００４６】１５は検出器１４によって細胞の通過が検
出されたときにイメージインテンシファイア１２のゲー
トを開くためのトリガ信号を出力する信号処理部であ
る。この信号処理部１５は、検出器１４で検出した散乱
光によって細胞が撮像エリアに入ったことを確認する。
すなわち、信号処理部１５は、検出器１４で検出された
散乱光の強度やパルス幅などをあらかじめ記憶した値と
比較し、その細胞を撮像するべきか否かを判定する。そ
して、その細胞が撮像するべき細胞である場合には、イ
メージインテンシファイア１２に対してゲートを開ける
ための信号を送出する。なお、細胞の選別撮像について
は、特開平５−１１９０３５号公報に記載の方法を参考
にすることができる。
【００４７】細胞がフローセル１の撮像エリアを通過す
ることを検出するための細胞通過監視系は、常時発光光
源（この実施例においては励起用光源３が兼用されてい
る）と、細胞通過監視用の検出器１４から構成される。
【００４８】このような構成において、細胞の撮像は一
つの細胞に対して、異なる二方向から行う。第１対物レ
ンズ５と第２対物レンズ６で得られた蛍光像は、第１ミ
ラー７と第２ミラー８でそれぞれ反射され、さらに第３
ミラー９で反射されて、イメージインテンシファイア１
２の光電面の片側に結像する。微弱な２つの蛍光像は、
イメージインテンシファイア１２で数万倍程度に増幅さ
れて、リレーレンズ１３を介して撮像部１０で撮像され
る。
【００４９】実際には、細胞通過監視用の検出器１４
で、撮像したい細胞が撮像エリアに入ったことが検出さ
れると、イメージインテンシファイア１２のゲート（光
シャッター）が開けられ、ある短い一定時間だけ動作し
てブレのない蛍光像が撮像される。撮像部１０によって
撮像された蛍光像は、ビデオ信号として画像処理部１１
に渡されて処理される。
【００５０】本例では、二つの蛍光像を、一つのイメー
ジインテンシファイア１２及びビデオカメラで撮像する
ようにしているので、コストアップを抑制することがで
きる。
【００５１】本実施例では、一つの細胞に対して異なる
二方向から２つの蛍光像を同時に撮像することを特徴と
している。このようにすることで、撮像系の光軸の奥行
き方向に二つの蛍光発光点が重なって位置する細胞で
も、二つの発光点の識別が可能になり、正確な発光点の
計数ができるようになる。
【００５２】撮像系の二つの方向の間の角度は特に限定
はなく、測定する対象によって最も適したものを選択す
ればよい。また、細胞の流れの方向に対して撮像系の角
度をどのように設定するかということについても特に限
定はない。しかし、測定精度を向上させるために、流れ
てくるどの細胞に対しても、二つの撮像系で得られる細
胞像が常に同じ角度から撮像したものである必要がある
場合には、以下のように設定する。
【００５３】すなわち、試料流の断面が円形または正方
形である通常のシースフローの場合、細胞通過監視系が
あるときには、細胞が撮像される位置がほぼ一定なの
で、どのように設定しても問題はない。一方、細胞通過
監視系がないときには、試料流の軸に対して、二つの撮
像系の軸がなす平面が垂直になるようにする。
【００５４】平面シースフローの場合、試料流を横切る
直線状の細胞通過監視系があるとき（細胞が撮像される
位置はその直線上である）には、光軸及び試料流の流れ
軸を含む平面上に二つの撮像系を設定する（図１参
照）。測定精度や分析細胞数の観点からは、平面シース
フローセルを用いて細胞通過監視系を付加したものが最
も現実的である。
【００５５】図２は撮像画面の例を示す説明図であり、
染色体の数的異常を検査する目的で、ＦＩＳＨ処理、す
なわち蛍光標識したＤＮＡプローブを染色体にハイブリ
ダイズさせた時に得られる蛍光の撮像画面の例を示すも
のである。図２の（ａ）は本実施例のように二方向から
撮像した蛍光像の例を示し、図２の（ｂ）は図２の
（ａ）と同じ細胞を従来のＩＦＣＭによって一方向から
のみ撮像した蛍光像の例を示す。
【００５６】図２（ａ）において、上側の像は図１の第
１対物レンズ５によるもので、下側のものは第２対物レ
ンズ６で撮像したものである。この例では、発光点が３
箇所ある。上側の像ではちょうど光軸の方向に左側の発
光点が重なってしまっているために、この像からは発光
点は２箇所しか観察されない。しかし、角度の異なる方
向から観察した像（下側）では３箇所の発光点が観察で
きるので、その細胞は３箇所の発光点があることが分か
る。図２（ｂ）では、（ａ）の上側の像と同じものが得
られ、この像からは発光点が３箇所であることが認識で
きない。
【００５７】本例では細胞通過監視系を付加している
が、細胞通過監視系がなくても実施は可能である。ただ
し、撮像効率や、測定精度（上記の撮像の角度の記載を
参照）の点からはあまり現実的ではない。また、細胞通
過監視用の光源を励起用光源３と共用しているが、細胞
通過監視用の光源を別に設置してもよい。
【００５８】細胞通過監視用の光源を別に設置する場合
には、励起用光源３に、例えばパルスレーザ、Xeフラッ
シュランプ等のパルス発光光源を使用することにより、
ゲート付きでない通常のイメージインテンシファイア１
２を使用することができる。発する蛍光が非常に強い場
合には、イメージインテンシファイア１２なしで、通常
のビデオカメラだけで撮像することもできる。
【００５９】本例では、前記したように、励起光を落射
方式で照射している。この場合、励起光は撮像エリア全
体を均一に照射する必要があり、照射強度の密度を上げ
るには限界がある。そこで、図３に示すように、励起光
をフローセル１の側面から照射するようにしてもよい。
図３においては、紙面表裏方向が試料液２の流れ方向で
ある。
【００６０】図４の（ａ）及び（ｂ）は、このように、
励起光をフローセル１の側面から照射するようにした場
合（以降、この方式を側射方式と呼ぶ）の撮像エリア付
近の励起光の照射状態を示す説明図である。図４の
（ａ）は励起光照射領域を示す説明図、（ｂ）は励起光
照射領域の中央部の断面を示す説明図である。これらの
図において、４１は細胞、４２は励起光照射領域、４３
は撮像エリア、４４は細胞通過監視領域である。矢印４
５は励起光の照射方向を示している。
【００６１】励起光は、撮像エリア４３の縦方向より十
分に大きな長径と、撮像する細胞の厚さより十分に大き
い短径をもった楕円形状で、撮像エリア４３中では照射
強度が均一になるように照射される。このようにするこ
とで、フローセル１の厚み方向に励起光を絞ることがで
きるので、励起光の単位面積当たりの照射強度を上げる
ことができ、よりＳ／Ｎのよい蛍光像が得られるように
なる。さらに、撮像エリア４３をある領域、例えば細胞
通過監視領域４４の近傍に限定すれば、より励起光を絞
り込んで照射できるので、さらに有利になる。
【００６２】なお、図３では、試料流の軸と二方向の軸
からなる平面が垂直になるようになっているが、これは
作図上の問題で、この向きをどのように設定するかは上
述したとおりである。また、細胞通過監視は、細胞の側
方散乱光で行っているが、これに限定されるものではな
い。
【００６３】上述の図１及び図３の例では、蛍光像の撮
像を行うようにしていた。しかし、光源およびフィルタ
ー（図示していない）の選択と照明の強度およびイメー
ジインテンシファイア１２のゲインを適切に設定するこ
とで、散乱光像を撮像することができる。散乱光の強度
が十分に強い場合、イメージインテンシファイア１２を
使用しなくても、明るい散乱光像を撮像することができ
る。
【００６４】図５に透過光像を撮像する場合の例を示
す。図中、３ａは透過光像撮像用の光源、１６は細胞通
過監視用の常時発光光源である。本例では細胞通過監視
用の光源１６は、透過光像撮像用の光源３ａとは別にな
っている。１７はダイクロイックミラーである。
【００６５】検出器１４は、例えばフォトダイオードや
一次元イメージセンサ（ラインセンサ）等である。この
例では、検出器１４で透過光または前方散乱光を検出し
ているが、側方散乱光を検出するようにしてもよい。
【００６６】光源１６は、例えばＬＤ、ＬＥＤ、ＳＬＤ
などの連続発光タイプの光源である。この光源１６の波
長は可視域でない方が望ましいが、とくに限定はない。
透過光像撮像用の光源３ａは、例えばパルスレーザや、
Xeフラッシュランプなどのパルス発光タイプの光源であ
り、ランダムトリガー動作が可能なものである。
【００６７】このような構成において、細胞通過監視用
の光源１６からの光は、ダイクロイックミラー１７で反
射されて、フローセル１における試料流の細胞通過監視
領域３４を照射する。検出器１４と信号処理部１５によ
り、目的とする細胞が撮像エリア３３に入ったことが検
出されると、透過光像撮像用の光源３ａにトリガーがか
けられ、光源３ａが発光する。照明光はダイクロイック
ミラー１７を透過してフローセル１中の細胞を照明す
る。
【００６８】細胞の透過光像は図１で述べたのと同様の
経路で撮像部１０に至る。つまり、異なる角度の二方向
の透過光像が撮像部１０の受光面上に結像され、一つの
細胞に対して、二つの透過光像が撮像される。図５では
試料流の軸と撮像系の二方向の軸からなる平面が垂直に
なるようになっているが、これは作図上の問題で、この
向きをどのように設定するかは上述したとおりである。
【００６９】この装置を用いると、例えば、白血球を測
定した場合に、従来のＩＦＣＭでは好中球が分葉核球で
あるのか桿状核球であるのかを区別することが困難であ
ったが、それらが区別できるようになる。
【００７０】なお、図１、図３及び図５で説明した例に
おいて、変更可能な構成は以下の通りである。フローセ
ル１は、断面形状が長方形あるいは楕円形の平面シース
フローセルを用いてもよいし、断面形状が円形の通常の
丸シースフローセルを用いてもよい。また、透過光像撮
像用の光源３ａは、パルス発光タイプのものを用いても
よいし、連続発光タイプのものを用いてもよい。
【００７１】連続発光タイプの光源を用いる場合には、
撮像部１０の手前にゲート機能付きのイメージインテン
シファイア１２を配置する。光源３ａに連続発光タイプ
のレーザを用い、高速ゲート機能付きのイメージインテ
ンシファイア１２を使用した場合は、非常に高価なパル
スレーザを使用しないのでコストアップを抑制できる。
励起方式は、落射方式を採用することもできるし、側射
方式を採用することもできる。
【００７２】細胞通過監視系は、設けても、設けなくて
もよい。細胞通過監視系を設ける場合には、この細胞通
過監視用の光源は、励起用光源あるいは透過光像撮像用
の光源と共用であってもよいし、別に設置してもよい。
【００７３】実施例２ 本発明の実施例２の構成を図６に示す。この実施例にお
いて、先の実施例１と同じ構成要素には同じ参照番号を
付し、その説明を省略する。本実施例では、一つの細胞
に対して焦点位置の異なる２つの蛍光像を同時に撮像す
ることを特徴としている。
【００７４】図中、２１はコンデンサレンズ、２２は第
４ミラー、２３は第５ミラー、２４は第１結像レンズ、
２５は第２結像レンズ、２６はコレクタレンズ、２７は
ピンホール、２８はイメージインテンシファイア１２の
前面に挿入されたフィルタである。ピンホール２７は、
細胞による散乱光だけを受光するために設けており、フ
ローセル１のガラス壁面等で反射、屈折してくる光を極
力受光しないようにするためのものである。フィルタ２
８は、細胞から発せられる蛍光波長にマッチした特性の
ものであり、細胞による側方散乱光やレーザ光による迷
光を除去するためのものである。
【００７５】フローセル１には平面シースフローセルを
用いている。図６においては、紙面表裏方向が試料液２
の流れ方向である。イメージインテンシファイア１２に
はゲート機能（光シャッター機能）付きのものを用いて
いる。
【００７６】本例では、励起用の光源３から発生された
レーザ光の光軸に対して、二つの撮像系が、９０°方向
とマイナス９０°方向に配置され、この二つの撮像系で
二つの蛍光像を同時に撮像するようになっている。それ
ぞれの撮像系の細胞に対する焦点位置（ピント位置）
は、図７に示すように、少しずらすようにしている。
【００７７】図７において、５１は第１対物レンズ５の
ピント位置、５２は第２対物レンズ６のピント位置であ
る。このようにして、一つの細胞に対し、ピント位置の
異なる２つの蛍光像を得ることによって、撮像倍率が大
きく被写界深度が浅い場合でも、細胞内の微小な蛍光発
光部をより確実に捉えることができる。
【００７８】例えば、撮像する細胞を白血球とすると、
この白血球は光軸方向に１０数μｍの厚さを持ってい
る。この大きさの細胞を画面上で観察する場合には、二
次元的に十分な分解能で撮像しようとすると、対物レン
ズ５，６はｘ６０以上のものを使用する必要がある。こ
れは撮像部１０が例えばビデオカメラである場合には、
受光面であるＣＣＤのサイズに依存する。この時の被写
界の焦点深度は約１．５μｍと計算される。
【００７９】したがって、このように大きな白血球を一
つの撮像系で撮像しようとすると、得られる蛍光像は、
焦点面で光軸方向に薄い領域にのみフォーカスが合った
像であり、細胞が光軸方向に複雑な形状を持つ場合に
は、焦点面近傍以外は観察できないか、ぼやけた像とな
る。このことは、蛍光像撮像機能付きイメージングフロ
ーサイトメータをＦＩＳＨのような測定に応用する場合
は大きな問題となる。例えば、ＦＩＳＨの測定では、細
胞の核に発光点が何ケ所あるかを測定する。その時に、
発光点が光軸に垂直な平面内に分布していて、かつその
平面にフォーカスが合えば、全ての発光点を観察するこ
とができる。しかし、光軸方向に発光点が分布していた
場合は、フォーカスの合った面の発光点は観察できる
が、その面以外の位置にある発光点は、ほとんど観察で
きないか、あるいは、ぼやけた大きな発光点として観察
される。そのため、発光点の正確な観察ができず、発光
点の計数ができなくなる。
【００８０】これを解決するために、本例では、二つの
撮像系を、９０°方向とマイナス９０°方向に配置し、
この二つの撮像系で、焦点位置（ピント位置）を少しず
らして、二つの蛍光像を同時に撮像するようにしてい
る。このようにすることで、細胞内に三次元的に分布し
ている発光点をもれなく撮像することができる。
【００８１】この実施例では、フローセル１に平面シー
スフローセルを用いているので、図４の（ａ）及び
（ｂ）に示したように、試料流の幅の狭い方向からレー
ザ光を細く絞って照射することができる。したがって、
蛍光を励起するための照射強度を強くすることができ、
Ｓ／Ｎ比の良い蛍光像を撮像することができる。
【００８２】このような構成において、励起用の光源３
から発生されたレーザ光の光軸方向に対して９０°方向
とマイナス９０°方向に発せられた蛍光は、それぞれ、
第１対物レンズ５と第２対物レンズ６によって集めら
れ、第４ミラー２２と第５ミラー２３によって反射され
る。そして、一方の蛍光は、第１結像レンズ２４から、
第１ミラー７と第３ミラー９を介してイメージインテン
シファイヤ１２の入力面の片側に結像される。また、他
方の蛍光は、第２結像レンズ２５から、第２ミラー８と
第３ミラー９を介してイメージインテンシファイヤ１２
の入力面のもう一方の片側に結像される。
【００８３】イメージインテンシファイア１２の入力面
に結像された微弱な蛍光像は、数千倍から数万倍に増倍
された像として、イメージインテンシファイア１２の出
力面に現れる。この像を、リレーレンズ１３を介して撮
像部１０で撮像することにより、明るい蛍光像が撮像さ
れる。このようにして、細胞内に三次元的に分布してい
る発光点をもれなく撮像する。
【００８４】イメージインテンシファイア１２は、上述
したように、移動している細胞に対してブレの無い蛍光
像を得るために、ゲート機能付きのものを用いており、
細胞がレーザ光照射エリアに移動してきた時の一瞬だけ
このゲートを開くように制御する。
【００８５】なお、本例においては、ゲート機能付きの
イメージインテンシファイア１２を用いているが、後述
するように、パルスレーザやキセノンランプのようなパ
ルス発光タイプの光源を用いることによって、ゲートな
しで、あるいはイメージインテンシファイアなしでブレ
の無い蛍光像を得ることもできる。
【００８６】細胞通過監視系では、励起光照射エリア
（撮像エリア）に移動してきた細胞や微生物を確実に撮
像するために、試料流２に照射された光による細胞や微
生物の散乱光を検出器１４で検出し、その検出信号を基
にして、イメージインテンシファイア１２のゲートを開
く。すなわち、光源３からの励起光照射用のレーザ光に
よる前方散乱光をコレクタレンズ２６で集光し、ピンホ
ール２７を介して検出器１４で受光する。フローセル１
のガラス壁面等で反射、屈折された光はピンホールで除
かれ、細胞による散乱光だけが検出器１４で受光され
る。検出された信号は、信号処理部１５に渡され、イメ
ージインテンシファイア１２のゲートを開くための制御
信号が作られる。
【００８７】図８は検出器１４による散乱光検出信号の
例を示す説明図である。信号処理部１５での処理によ
り、有効な細胞だけを選別して撮像することが可能であ
る。すなわち、対象とする細胞や血球に比較して、微小
なゴミや細胞の小片は小さく、散乱光強度は弱い。この
ことを利用して、散乱光検出信号の大きさから対象とす
る細胞かどうかを判断することができる。
【００８８】具体的には、図８に示すように、散乱光検
出信号の振幅が規定のスレシホールドレベル以上である
かどうかを比較して、２値化信号を得る。一方、細胞や
微生物がちょうど励起光照射エリアにある時にイメージ
インテンシファイア１２のゲートを開く必要があり、そ
のために、散乱光検出信号のピークを検出し、ピーク検
出信号を得る。
【００８９】そのピーク検出信号と上記２値化信号とを
用いて、イメージインテンシファイア１２のゲートを開
くためのＩ．Ｉ．ゲート制御信号を作る。イメージイン
テンシファイア１２のゲートを開いておく時間は、ブレ
の無い蛍光像を得るために短くする必要がある。試料流
の流速が、例えば１００ｍｍ／秒である場合には、数μ
秒だけゲートを開くように制御する。
【００９０】図９は励起用の光源３としてパルス発光タ
イプのものを用いた場合の例を示す説明図である。この
図において、２９は細胞通過監視用の連続発光タイプの
光源、３０はコリメータレンズ、３１はダイクロイック
ミラー、３２はパルス発光タイプの光源３より発する光
をカットするためのフィルタである。
【００９１】パルス発光タイプの光源３としては、例え
ばパルスレーザやキセノンフラッシュランプがある。一
般的にパルスレーザは、数ｎ秒以下の一瞬の間に強力な
光を発することができるので、試料流の流速が数ｍ／秒
と速くても、ブレのない像を得ることができ、この場合
には、試料流を偏平な流れにしなくても、単位時間当た
りの分析量をかせぐことができる。また、蛍光を倍増す
るためのイメージインテンシファイア１２を用いなくて
も、普通のビデオカメラで蛍光像が得られる場合もあ
る。
【００９２】本例では、細胞通過監視系を設けている。
そして、励起用の光源３がパルス発光タイプのものであ
るため、細胞通過監視用として、連続発光タイプの光源
２９を別に設け、この連続発光タイプの光源２９によっ
て細胞の散乱光を検出するようにしている。この連続発
光タイプの光源２９としては、例えば近赤外線を照射す
る半導体レーザを使用することができる。
【００９３】このような構成において、細胞通過監視用
の光源２９から照射された光は、コリメータレンズ３０
によって平行光にされた後、ダイクロイックミラー３１
で反射され、コンデンサレンズ２１で絞られて、フロー
セル１内を流れる試料流に照射される。
【００９４】細胞による散乱光は、コレクタレンズ２６
で集光され、フィルタ３２を透過し、ピンホール２７を
介して検出器１４で受光される。検出器１４から出力さ
れた散乱光信号は、図６で示した例の場合と同様に信号
処理部１５によって信号処理され、対象とする細胞がち
ょうど撮像エリアに来た時に、信号処理部１５からパル
ス発光タイプの光源３に対し、光源３を発光させるため
のトリガ信号が供給される。
【００９５】パルス発光タイプの光源３から光が照射さ
れると、光源３の光軸に対して９０°の方向とマイナス
９０°の方向に配置された二つの撮像系によって、二つ
蛍光像が１台の撮像部１０の受光面に結像される。撮像
部１０によって撮像された蛍光像は、ビデオ信号として
画像処理部１１に渡され、得られた蛍光像に対して各種
の画像処理が行われる。
【００９６】本例においては、イメージインテンシファ
イア１２を用いているが、細胞から発せられる蛍光が強
い場合には、イメージインテンシファイア１２を用いな
くても蛍光像を撮像することができる場合がある。ただ
し、パルス発光タイプの光源３を用いている場合には、
イメージインテンシファイア１２としてゲート機能を有
していないものでも使用可能である。
【００９７】図１０は蛍光の撮像画面の例を示す説明図
であり、染色体の数的異常を検査する目的で、蛍光標識
したＤＮＡプローブを染色体にハイブリダイズさせた時
に得られる蛍光の撮像画面の例を示すものである。
【００９８】この撮像画面の例は、左半分は対物レンズ
５によって光軸の９０°方向から見た蛍光像であり、右
半分は対物レンズ６によって光軸のマイナス９０°方向
から見た蛍光像であり、１台の撮像デバイス（イメージ
インテンシファイア１２と撮像部１０の組み合わせ）で
同時に撮像された例である。
【００９９】左側の像では、核の右上と左上に蛍光発光
部が確認されるが、右側の像では、核の左上の発光部は
確認されず、核の下部に蛍光発光部が確認される。この
例では、左側あるいは右側の蛍光像だけでは、２個所の
蛍光発光部しか認識することができないが、左右２つの
蛍光像を処理することによって、左の像の左上の発光部
と右の像の右上の発光部とは同一の発光部とみなし、合
計３個所の蛍光発光部か核内に存在すると認識すること
ができる。
【０１００】実施例３ 本発明の実施例３の構成を図１１に示す。この実施例に
おいて、先の実施例１及び実施例２と同じ構成要素には
同じ参照番号を付し、その説明を省略する。本実施例で
は、一つの細胞に対して、焦点位置の異なる複数の蛍光
像を時間的にずらして撮像することを特徴としている。
【０１０１】図中、３３は対物レンズであり、３４はダ
イクロイックミラーである。図１１においては、紙面表
裏方向が試料液２の流れ方向である。励起用の光源３と
しては、Ａｒレーザのような連続発光タイプのレーザ光
源を用いており、この光源３からの光は、ダイクロイッ
クミラー３４で反射させて、落射方式で試料流を照射す
るようになっている。
【０１０２】イメージインテンシファイア１２にはゲー
ト機能付きのものを使用し、周期的にイメージインテン
シファイア１２のゲートを動作させる。イメージインテ
ンシファイア１２のゲートの動作時間は、試料流の流速
によって変化するが、得られる蛍光像にブレがなく、か
つ、できるだけ明るい蛍光像が得られる時間である。例
えば、試料流が１００ｍｍ／ｓｅｃである場合には、３
μｓｅｃ程度の露光時間となる。
【０１０３】イメージインテンシファイア１２が動作し
ている時に、蛍光染色された細胞がフローセル１の撮像
エリアに存在した場合は、細胞に含まれる蛍光物質が励
起され、それより発した非常に微弱な蛍光は、イメージ
インテンシファイア１２で数万倍に増幅されて、リレー
レンズ１３を介して撮像部１０で撮像される。通常、イ
メージインテンシファイア１２の動作は、撮像部１０が
例えばビデオカメラである場合には、カメラのビデオレ
ートに同期させて行うので、３０回／ｓｅｃである。
【０１０４】図１２はフローセル１周辺を横からみた場
合の構成を示す説明図である。なお、この図において
は、試料流は紙面上下方向に流れるようになっている。
通常のイメージングフローサイトメータでは、平面フロ
ーセルを用いており、試料液２の流路は光軸に対して垂
直に設定されている。これは細胞が撮像エリアのどの部
分を通過しても細胞の同じ部分にフォーカスを合わせる
ためである。
【０１０５】本例では試料流（試料液２の流れ）と光軸
とを含む平面内で、試料流が傾斜するように、すなわち
試料流が対物レンズ３３の焦点面に対して傾斜するよう
に設定する。この場合、図１２（ａ）に示すように、フ
ローセル１そのものを傾斜させて取り付けてもよいし、
図１２（ｂ）に示すように、フローセル１に対して試料
流が斜めになるように作製されたフローセルを用いても
よい。
【０１０６】このような構成により、フローセル１中を
細胞が試料流に沿って移動していくに従い、対物レンズ
３３の焦点面に対する相対位置（すなわち、対物レンズ
３３との距離）が変化する。したがって、対物レンズ３
３の焦点面を斜めに横切るように移動していく細胞に対
して、時間をずらして複数回撮像することによって、一
つの細胞に対して、フォーカスの合う位置のずれた像が
得られる。
【０１０７】この状態をイメージインテンシファイア１
２のゲートを開けている時間を長くして撮像すれば流れ
た像になってしまうので、撮像部１０にビデオカメラを
用いているのであれば、高速ゲート機能付きイメージイ
ンテンシファイアを使用して、ビデオカメラの１フレー
ムの間にゲートを何度か開くようにする。そうすること
で、１フレーム中にフォーカス位置のずれた細胞像をい
くつか得ることができる。この構成の場合、フォーカス
位置のずれの量は、フローセル１の取り付け角度を変更
するだけで比較的簡単に変更することができる。
【０１０８】図１３は細胞が撮像される部分の拡大図を
示す説明図である。この図において、６１は試料流の方
向、６２は対物レンズ３３の焦点面であり、この図に示
すように、一つの細胞に対して、フォーカス位置の異な
る複数の蛍光像を得る。
【０１０９】図１４は撮像画面の例を示す説明図であ
り、染色体の数的異常を検査する目的で、ＦＩＳＨ処
理、すなわち蛍光標識したＤＮＡプローブを染色体にハ
イブリダイズさせた時に得られる蛍光の撮像画面の例を
示すものであり、３箇所が発光する白血球を測定した場
合に得られた画像の例を示したものである。
【０１１０】この図において、（ａ）は撮像エリア内で
イメージインテンシファイア１２を３回動作させて得ら
れた画像の例である。（ｂ）は従来のイメージングフロ
ーサイトメータで得られる画像の例を示したものであ
る。
【０１１１】図１４（ｂ）の従来例では、３箇所ある発
光点の内、２つの発光点（右上）が光軸方向に重なって
いる。従来のイメージングフローサイトメータを用いて
測定を行った場合は、フォーカスの合っている面にある
発光点は鮮明に観察されるが、焦点面にない発光点は非
常にぼやけて発光強度の弱い像として観察される。そし
て、上下方向に重なっている二つの発光点は一つの発光
点として観察される。すなわち、この例では、ぼやけた
一つの発光点として観察される。
【０１１２】それに対して、図１４（ａ）の本例の画像
では、全ての発光点が鮮明で、かつ、光軸方向に重なっ
ている発光点も異なる焦点面で鮮明に観察できることか
ら、別の発光点として認識できる。すなわち、本例で
は、一つの細胞に対して、異なる焦点面で数枚の像を撮
像して、一枚の画像として画像処理部１１に出力する。
画像処理部１１では、得られた蛍光像に対して各種の画
像処理を行う。
【０１１３】試料流の傾斜角は被写界の焦点深度、細胞
の大きさ等によって決定される。イメージインテンシフ
ァイア１２のゲートを動作させる間隔は、流速等によっ
て決定される。また、励起用の光源３の照射領域は撮像
エリア全体を均一に照射しなければならない。
【０１１４】この例では蛍光画像の撮像を行ったが、蛍
光像の撮像だけに限らず、図１１のダイクロイックミラ
ー３４をビームスプリッタに変更することによって、散
乱光像を撮像できるようになる。この場合、散乱光は蛍
光に比較して強度が強いので、イメージインテンシファ
イア１２の動作時間を短くして、蓄積時間を短くするこ
とができる。したがって、試料流の流速を速くすること
ができるので、単位時間当たりの分析量を増加させるこ
とができる。
【０１１５】また、この例では、励起用の光源３に連続
発光タイプの光源を用い、イメージインテンシファイア
１２に高速ゲート付きのものを使用しているが、励起用
の光源３に繰り返し周波数が数千ｐｐｓ（パルス／秒）
以上の、例えば半導体励起固体パルスレーザなどのパル
ス発光タイプの光源と、高速ゲートでない通常のゲート
機能付きのイメージインテンシファイア１２を使用して
もよい。また、非常に出力エネルギーの高いパルス発光
タイプの光源を用いた場合には、イメージインテンシフ
ァイア１２を使用しなくても蛍光像の撮像が可能であ
る。
【０１１６】図１５は細胞通過監視系を付加した場合の
例を示す説明図である。図１１ではイメージインテンシ
ファイア１２のゲートを周期的に動作させていたが、細
胞濃度が低い場合は、イメージインテンシファイア１２
を動作させた時に、細胞がちょうど撮像エリアに存在し
ている確率は低く、撮像効率が低い。また、例えばイメ
ージインテンシファイア１２を３回動作させたとして
も、撮像される位置が一定でなく、本来３つあるはずの
像が２つ又はそれ以下の場合も有り得る。そこでこの例
のように細胞通過監視機能を付加する。
【０１１７】この場合、細胞通過監視用の光源と励起用
の光源３は共用している。そして、細胞通過監視は前方
散乱光または透過光で行っている。なお、細胞通過監視
は側方散乱で行うようにしてもよい。細胞通過監視用の
検出器１４はフォトダイオードまたはラインセンサ等を
用いる。
【０１１８】図１６は細胞通過監視領域と撮像エリアの
関係を示す説明図である。この図に示すように、細胞通
過監視領域４４は細長い矩形とし、試料流２の流れに対
して垂直で、かつ撮像エリア４３の幅とほぼ同じか、そ
れ以上で、撮像エリア４３内の試料流の上流の側に設置
する。なお、この位置は中央でもよいが、この方が実際
的である。
【０１１９】検出器１４にフォトダイオードを使用した
場合は、スリットを使用して、細胞通過監視領域４４を
監視するようにし、ラインセンサを使用する場合は、ラ
インセンサの監視領域が細胞通過監視領域４４となるよ
うにラインセンサを配置する。
【０１２０】検出器１４からの信号は信号処理部１５に
送られる。信号処理部１５によって、イメージインテン
シファイア１２をわずかの時間差で複数回動作させるた
めのトリガ信号が作り出される。この信号処理部１５で
は、検出器１４から出力される散乱光の強度によって、
細胞の大きさを判定することもでき、撮像エリア４３に
入った細胞がごみ等であれば撮像しないように制御する
ことができる。
【０１２１】細胞通過監視系と信号処理部１５によっ
て、細胞が撮像エリアに入ったことが検出されれば、イ
メージインテンシファイア１２のゲートが開かれてイメ
ージインテンシファイア１２はわずかの時間差で数回動
作し、図１４（ａ）で示したような同一細胞に対して複
数の蛍光像の写った画面が得られる。
【０１２２】この例においては、撮像するためにイメー
ジインテンシファイア１２を数回動作させるようにして
いる。したがって、細胞濃度が低い場合には、確率はか
なり低いと考えられるが、一連の撮像の最後の方の撮影
のためにイメージインテンシファイア１２を動作させた
時に、次の細胞が撮像エリア４３に入ってきてしまい、
そのため、最初の方で撮像した像と重なって撮像されて
しまう場合が考えられる。
【０１２３】細胞通過監視系がない場合には、得られた
画像より細胞の重なりを判断するしかないが、細胞通過
監視系がある場合には、その細胞通過監視系で細胞の重
なりを判定することができる。具体的な例を以下に示
す。
【０１２４】まず、細胞通過監視系の検出器１４にフォ
トダイオードを用いた場合を説明する。試料流の流速を
１００ｍｍ／ｓｅｃとし、一つの細胞に対してイメージ
インテンシファイア１２の動作回数を３回とする。そし
て、イメージインテンシファイア１２の動作時間は５μ
ｓｅｃとし、動作間隔は２５０μｓｅｃとする。
【０１２５】検出器１４はフォトダイオードであるの
で、スリットを設けて細胞通過監視領域４４を撮像エリ
ア４３の一部に限定している。検出器１４により細胞の
通過の信号が信号処理部１５に入力されると、信号処理
部１５はイメージインテンシファイアを動作させるため
にトリガ信号を出力する。
【０１２６】ある撮像フレームで撮像が行われたとする
と、そのフレーム期間中でイメージインテンシファイア
１２の３回目（最終）動作が終わるまでに、次の細胞の
通過が検出された場合は、最初に撮像された像に後で検
出された細胞の像が重なる可能性があるので、このフレ
ームで撮像された像は無効にする。すなわち、フォトダ
イオードで細胞通過監視を行う場合は、前の細胞の撮像
中に次の細胞が撮像エリアに入ったことが検出できるの
で、そのようになった場合は、どちらの細胞像も無効に
する。
【０１２７】図１７はフォトダイオードを用いた場合の
細胞の重なりの検出例を示すものであり、フォトダイオ
ードの検出信号とその時に得られる画面の例を示す説明
図である。図１７の（ａ）はフォトダイオードの検出信
号とイメージインテンシファイア１２の動作信号を示
し、（ｂ）は撮像した画面の例を示している。
【０１２８】図１７（ａ）において、フォトダイオード
の検出信号によって細胞の通過が検出されると、イメー
ジインテンシファイア１２に動作信号が送られ、イメー
ジインテンシファイア１２は、例えば３回動作する。図
に示す禁止領域Ｋの間に細胞の通過が検出されなければ
撮像された三つの蛍光像は有効である。例えば、禁止領
域Ｋではないタイミングで細胞の通過が検出された場合
は、たとえ細胞が前の細胞と同じ位置を流れても重なる
ことはないので、三つの細胞だけを画像処理で切り出し
て有効とすればよい。
【０１２９】図１７（ｂ）において、Ｌ1は、Ｌ1＝ｖ・
ｔ1（ｖ：細胞の流速）で表される。この例ではできる
だけ有効になる細胞が多くなるように禁止領域を狭くし
たが、細胞通過の監視位置や禁止領域の広さを変更する
ことで常に画面には有効になる細胞だけが表示されるよ
うにすることもできる。禁止領域の幅は細胞の流速、及
びイメージインテンシファイア１２の動作タイミング等
によって決定される。
【０１３０】次に、細胞通過監視系の検出器１４にライ
ンセンサを用いた場合を説明する。撮像の条件は上記と
同じとする。検出器１４としてラインセンサを用いた場
合は、細胞の大きさとともに撮像エリア４３における細
胞の通過位置を検出することができる。
【０１３１】ある撮像フレーム期間中でイメージインテ
ンシファイア１２の３回目（最終）動作が終わるまで
に、次の細胞の通過が検出されても、最初に流れてきた
細胞と次に流れてきた細胞の位置が重なっていないこと
が確認できれば、最初に撮像した像は有効で、次の細胞
を無効にすれば良い。二つの細胞の位置が少しでも重な
っていることがわかれば両方の細胞像を無効にする。
【０１３２】図１８及び図１９はラインセンサを用いた
場合の細胞の重なりの検出例を示すものであり、ライン
センサの検出信号とその時に得られる画面の例を示す説
明図である。図１８の（ａ）はラインセンサの検出信号
とイメージインテンシファイア１２の動作信号を示し、
（ｂ）は撮像した画面の例を示している。同じく、図１
９の（ａ）はラインセンサの検出信号とイメージインテ
ンシファイア１２の動作信号を示し、（ｂ）は撮像した
画面の例を示している。
【０１３３】図１８の（ａ）及び（ｂ）においては、イ
メージインテンシファイア１２の３回目の動作時に次の
細胞４１ｂが撮像エリアに入ってきているが、位置が重
なっていないので、最初の細胞４１ａの像を有効にし
て、次の細胞４１ｂの像を無効にする。
【０１３４】図１９の（ａ）及び（ｂ）においては、次
の細胞４１ｄの流れる位置が前の細胞４１ｃの位置と重
なっているので，両方の細胞４１ｃ，４１ｄの像を無効
にする。
【０１３５】図２０はフローセル１の側面から励起光を
照射する方式（側射方式）を用いた装置の例を示す説明
図である。励起光を落射方式で照射する場合には、撮像
エリア全体に均一に励起光を照射するために励行光の照
射領域を大きく広げる必要がある。そのためレーザービ
ームを小さく絞り込むことができず、単位面積当たりの
照射強度の点で不利である。
【０１３６】本例では、その点を改善するためにフロー
セル１の側面から励起光を照射するようにしている。励
起光は、図４の（ｂ）に示したように、撮像エリア４３
の縦方向よりも十分に大きな長径と、撮像する細胞の厚
さより十分に大きい短径をもった楕円形状で照射され
る。このようにすることで、図１６に示すような形状で
照射するよりも、単位面積当たりの照射光度を上げるこ
とができる。本例では細胞通過監系が付加されており、
側方散乱光で細胞の通過監視を行うようにしている。
【０１３７】
【発明の効果】この発明によれば、一つの粒子に対し
て、異なる複数の像を撮像するようにしたので、例えば
ＦＩＳＨの測定においても、従来では検知できなかった
３次元的に分布した微小な蛍光発光部を見落とすことな
く検知することができ、精度の高い測定を行うことがで
きる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明によるイメージングフローサイトメー
タの実施例１の構成を示す説明図である。
【図２】撮像画面の例を示す説明図である。
【図３】励起光をフローセルの側面から照射する例を示
す説明図である。
【図４】励起光をフローセルの側面から照射するように
した場合の撮像エリア付近の励起光の照射状態を示す説
明図である。
【図５】透過光像を撮像する場合の例を示す説明図であ
る。
【図６】本発明の実施例２の構成を示す説明図である。
【図７】二つの撮像系で二つの蛍光像を同時に撮像する
場合の焦点位置を示す説明図である。
【図８】検出器による散乱光検出信号の例を示す説明図
である。
【図９】励起用の光源としてパルス発光タイプのものを
用いた場合の例を示す説明図である。
【図１０】蛍光の撮像画面の例を示す説明図である。
【図１１】本発明の実施例３の構成を示す説明図であ
る。
【図１２】フローセル周辺を横からみた場合の構成を示
す説明図である。
【図１３】細胞が撮像される部分の拡大図を示す説明図
である。
【図１４】撮像画面の例を示す説明図である。
【図１５】細胞通過監視系を付加した場合の例を示す説
明図である。
【図１６】細胞通過監視領域と撮像エリアの関係を示す
説明図である。
【図１７】フォトダイオードを用いた場合の細胞の重な
りの検出例を示す説明図である。
【図１８】ラインセンサを用いた場合の細胞の重なりの
検出例を示す説明図である。
【図１９】ラインセンサを用いた場合の細胞の重なりの
検出例を示す説明図である。
【図２０】フローセルの側面から励起光を照射する例を
示す説明図である。
【符号の説明】
１ フローセル ２ 試料液 ３ 光源 ４ レンズ ５ 第１対物レンズ ６ 第２対物レンズ ７ 第１ミラー ８ 第２ミラー ９ 第３ミラー １０ 撮像部 １１ 画像処理部 １２ イメージインテンシファイア １３ リレーレンズ １４ 検出器 １５ 信号処理部 １６，２９ 常時発光光源 １７，３１，３４ ダイクロイックミラー ２１ コンデンサレンズ ２２ 第４ミラー ２３ 第５ミラー ２４ 第１結像レンズ ２５ 第２結像レンズ ２６ コレクタレンズ ２７ ピンホール ２８，３２ フィルタ ３０ コリメータレンズ ３３ 対物レンズ ４２ 励起光照射領域 ４３ 撮像エリア ４４ 細胞通過監視領域 ５１ 第１対物レンズのピント位置 ５２ 第２対物レンズのピント位置

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 粒子を含む試料液が内部に流動される光
    透過性のフローセルと、 フローセルの撮像領域に存在する粒子の発光像を撮像す
    る撮像手段を備え、 撮像手段が、一つの粒子に対して、異なる像を撮像する
    ことを特徴とするイメージングフローサイトメータ。
  2. 【請求項２】 撮像手段が、一つの粒子に対して、複数
    方向から複数の粒子像を撮像することを特徴とする請求
    項１記載のイメージングフローサイトメータ。
  3. 【請求項３】 撮像手段が、一つの粒子に対して、焦点
    位置の異なる複数の粒子像を同時に撮像することを特徴
    とする請求項１記載のイメージングフローサイトメー
    タ。
  4. 【請求項４】 撮像手段が、一つの粒子に対して、焦点
    位置の異なる複数の粒子像を時間的にずらして撮像する
    ことを特徴とする請求項１記載のイメージングフローサ
    イトメータ。
  5. 【請求項５】 フローセルの撮像領域に蛍光励起用の光
    を照射する蛍光励起用光源をさらに備え、撮像手段が、
    フローセルの撮像領域に存在する粒子の蛍光像を撮像す
    ることを特徴とする請求項１記載のイメージングフロー
    サイトメータ。
  6. 【請求項６】 蛍光励起用光源が、パルス発光タイプの
    光源からなる請求項５記載のイメージングフローサイト
    メータ。
  7. 【請求項７】 蛍光励起用光源が、連続発光タイプの光
    源からなり、撮像手段が、撮像手段に入る光路を開閉す
    るゲート手段を備えてなる請求項５記載のイメージング
    フローサイトメータ。
  8. 【請求項８】 監視用光源と、その監視用光源からの光
    によりフローセルの撮像領域を粒子が通過することを検
    出する検出器からなる粒子通過監視系をさらに備えてな
    る請求項６または７記載のイメージングフローサイトメ
    ータ。
  9. 【請求項９】 蛍光励起用光源が、監視用光源を兼ねて
    いることを特徴とする請求項８記載のイメージングフロ
    ーサイトメータ。
  10. 【請求項１０】 試料液に含まれる粒子が、蛍光を誘発
    させる試薬で処理されていることを特徴とする請求項５
    記載のイメージングフローサイトメータ。
  11. 【請求項１１】 フローセル内の試料液の流れが、偏平
    なシース流として形成され、蛍光励起用光源の光が、そ
    のシース流の幅の狭い方向から照射されることを特徴と
    する請求項５記載のイメージングフローサイトメータ。
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