JPH072899A - 白血球機能を調節する細胞外マトリックスレセプターリガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 白血球機能を調節する方法であって、可溶性
リンパ球リガンドタンパク質を患者に投与することによ
り白血球レセプターと細胞外マトリックス会合タンパク
質との間の相互作用を阻害して該リンパ球リガンドタン
パク質が該細胞外マトリックス会合タンパク質に結合し
該白血球との相互作用を阻止することを含む方法。 【効果】 細胞外マトリックス会合タンパク質に結合す
ることができる白血球レセプターの細胞外結合領域を含
む可溶性融合タンパク質の投与により白血球と標的組織
の細胞外マトリックス会合タンパク質との相互作用を阻
害して白血球活性を効果的に変化させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野及び従来の技術】白血球表面分子の
アミノ酸配列は、たいてい、その分子内あるいは他のタ
ンパク質内のモチーフに対して約２０−３０％のアミノ
酸が同一であるモチーフを含む。これらのモチーフは、
進化的に関連をもつことが予想され、同じ折りたたみパ
ターンを有し、同種類の相互作用を仲介する。免疫グロ
ブリンスーパーファミリーのＩｇ様ドメイン、フィブロ
ネクチン III型ドメイン及びサイトカインのレセプター
に多く見られる保存モチーフのような保存配列モチーフ
を含む多数のスーパーファミリーが記載されている。ド
メインという用語は、モチーフが不連続な構造を形成し
てもよいことを示す構造データがある場合に用いられ、
モチーフという用語は、配列データが利用できる場合に
のみ用いられる。

【０００２】新規なスーパーファミリー、神経成長因子
レセプター（ＮＧＦＲ）スーパーファミリーの種類とし
ては、神経細胞に見られるＮＧＦＲ；Ｂ−細胞抗原ＣＤ
４０；ＣＤ４表現型の活性Ｔ細胞のマーカーであるＭＲ
Ｃ ＯＸ−４０抗原；種々の細胞に見られるＴＮＦＲ−
Ｉ及びＴＮＦＲ−IIと呼ばれる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）
の２つレセプター；Ｔ−細胞クローンから得られるｃＤ
ＮＡ（４−１ＢＢ）；及びＳＦＶ−Ｔ２、ショープ線維
腫ウイルスのオープンリーディングフレーム；ＦＡＳ、
骨髄細胞、Ｔリンパ芽球細胞及び二倍体線維芽細胞のよ
うな種々のヒト細胞で発現されるポリペプチド；ＣＤ２
７、Ｔ細胞活性化抗原；及びＣＤ３０、ホジキン病に特
徴的なマーカーであるＴ及びＢ細胞の表面の抗原が挙げ
られる。細胞外部分の分子のファミリーの種類は酸であ
る。これらは細胞外領域の他のモチーフ型と関連がない
が、ＭＲＣ ＯＸ−４０、ＮＧＦＲ及びＴＮＦＲ−IIに
おいては、Ｃys残基がなくＳer、Ｔhr及びＰroの割合が
高いことを特徴とするヒンジ様領域がある。このセグメ
ントはＯ−連鎖糖とグリコシル化されるようであり、延
長構造をもつことができる。全モチーフ線列は、４又は
６個のシステイン残基を特徴的な保存パターンで含むこ
とを示している。残りの配列にはかなりの変動がある
が、他の残基はほとんどモチーフに保存される。４−１
ＢＢタンパク質におけるモチーフは相同性が少ないが、
切断型モチーフで分けられた２つのモチーフが見られ
る。これらのモチーフは、非保存位置に見られる種々の
残基を含む。Ｃys残基間の残基数に多少差異があるが、
モチーフの長さは著しく類似している。ＮＧＦＲスーパ
ーファミリーのシステインを多く含んだモチーフは、低
密度リポタンパク質（ＬＤＬ）反復のような他のタンパ
ク質に見られるシステインを多く含んだ反復とははっき
りと異なる。ＮＧＦＲファミリーの配列類似性の統計的
評価及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）反復のような
他のシステインを多く含んだ反復との比較は、Mallett,
S.等(1990)EMBO.J.9:1063-1068に論じられている。

【０００３】ヒト細胞表面抗原ＦＡＳに対してｃＤＮＡ
でコードされるＦＡＳポリペプチドが産生されており、
このポリペプチドはアポプトシスを仲介することができ
ることが知られている(Itoh,N.等 (1991) Cell 66:233-
243)。ＦＡＳ抗原内の欠損は、マウスにおいてリンパ増
殖症候群と関連があり、狼瘡様症状を生じる (Watanabe
-Fukunaga,R.等(1992) Nature 356:314-317)。ＴＮＦの
細胞表面ＦＡＳ抗原への結合は、細胞溶解活性を仲介す
ることが知られており、ＦＡＳ抗原がＴＮＦの細胞溶解
作用のレセプターとして働くことを示している(Yonehar
a,S.等,Tumor Necrosis Factor:Structure-Function Re
lationships and Clinical Applications.,Basel(1992)
pp.58-65)。ＣＤ３０は、ホジキン病のマーカーであ
り、同じ意味でＫi-１抗原とも呼ばれる。ＣＤ３０は、
ＮＧＦＲスーパーファミリーと相同であるシステインを
多く含んだ５反復領域を有する。ホジキン病におけるＣ
Ｄ３０の機能は知られていないが、Ｔ細胞及びＢ細胞活
性化のマーカーである(Durkop,H.等(1992)Cell 68:421-
427)。Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ２７は、ＮＧＦＲ遺伝子フ
ァミリーの１種であり、活性化に伴うＴ細胞増殖及び生
存に関与するものである(Camerini,D.等(1991)J.Immuno
l.147:3165-3169)。ＣＤ２７は二量体膜糖タンパク質で
あり、ほとんどのヒトＴリンパ球の表面に見られる。Ｃ
Ｄ２７の構造上の類似性は、ＣＤ４０、ＭＲＣＯＸ４０
及び４−１ＢＢと共にＮＧＦＲファミリーのリンパ球特
異的亜群に属することを示している。

【０００４】ＮＧＦＲスーパーファミリーの４種の機能
が既知であり、ＮＧＦＲ、ＦＡＳ及び２種のＴＮＦＲは
成長因子レセプターである。ポリペプチドサイトカイン
のこれらのレセプターへの結合は、種々の機能上の作用
を生じる。ＮＧＦの高親和性レセプター（２つのペプチ
ド鎖を含む）への結合は、ニューロン分化及び生存に著
しく影響する(Barde,Y-A.(1989)Neuron 2:1525-1534)。
ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βの双方は２種のＴＮＦＲに結
合し、炎症及び腫瘍細胞死滅のような異種領域の作用を
生じる (Beutler,B.等(1989)Annu.Rev.Immunol.7:625-6
55; Sprang,S.R.(1990)Trend Biochem.Sci.15:366-36
8)。ＯＸ−４０及びＣＤ４０抗原に関しては試験管内機
能データに限定されている。ＯＸ４０に対する抗体は混
合リンパ球反応においてＴ−細胞応答を増加し(Paterso
n,D.J.等(1987) Mol.Immunol.24:1281-1290)、ＣＤ４０
に対する抗体はテトラデカノイルホルボールアセテート
（ＴＰＡ）又はＣＤ２０抗体のような補助活性化因子の
存在下でＢ−細胞増殖を促進し (Ledbetter,J.A.等(198
7)J.Immunol.138:788-794)、ＩＬ−４と試験管内で相乗
作用してＢ−細胞分化とＩｇＥ産生を誘導する(Jabara,
H.H.等(1990)J.Exp.Med.172:1861-1864)。４−１ＢＢ
は、活性化Ｔ−細胞クローンに見られるｃＤＮＡクロー
ンとしてのみ確認されており、生産物についてのデータ
はないが細胞表面タンパク質をコードすると思われてい
る(Kwon,B.S.,(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1963
-1967)。ワクシニア及びショープウイルス配列は、配列
としてのみ確認されており、タンパク質が発現されるか
どうかは知られていない (Upton,C.等(1987)Virology16
0:20-30; Howard,S.T.等(1991)Virology180:633-647)。

【０００５】ＮＧＦＲスーパーファミリー細胞表面タン
パク質がサイトカインのレセプターとして機能すること
を入手可能な証拠が示している。従来の特徴は、１種以
上のリガンドに結合することができ、これらのリガンド
が実際には高分子である点で特異なものである。ＮＧＦ
Ｒスーパーファミリーの種類の細胞外ドメインのサイズ
は、他のスーパーファミリーに比べて相対的に均一であ
る。特徴とされた種類は、３−４つのモチーフ、場合に
よっては、ヒンジ様領域を共有する。新規な種類は依然
として定義されなければならないし、これらの特徴がこ
のスーパーファミリーのすべての種類に共通であるかど
うかを知るために配列分析が必要であることが推測され
る。このスーパーファミリーは、３種類が１種以上のリ
ガンドに結合することを示しており、これらのリガンド
が他の多くのサイトカインと対照的に二量体又は三量体
である点で特異なものである。ＴＮＦＲ-I及びＴＮＦＲ
-II 双方がＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βを高親和性をもっ
て結合する(Schall,T.J.等(1990) Cell 61:361-370; Sm
ith C.A.等(1990) Science 248:1010-1023; Sprang,S.
R.(1990) Trends Biochem.Sci.15:366-368)。これらの
２種のサイトカインのアミノ酸配列は、３０％同一なだ
けである。ＴＮＦ−βは、三量体配列のβシート構造を
含むＴＮＦ−αと類似の構造をもつと考えられている
(Jones,E.Y.等(1989)Nature338:225-228;Eck,M.J.等(19
89)J.Biol.Chem.264:17595-17605)。驚くべきことに、
２種のＴＮＦＲは細胞外ドメインが２７％同一なだけで
あり、このスーパーファミリーの他の機能的に無関係な
種類と同じ程度である。

【０００６】注目すべきことに、２つのレセプター分子
は、リガンド結合ドメインであると推測される１５０残
基のシステインを多く含んだセグメント内でのみ相同で
ある。この配列の類似体は神経成長因子（ＮＧＦＲ）の
レセプターにも見られ、ホルモンはＴＮＦと構造上類似
ではないようである。即ち、このシステインを多く含ん
だ折りたたみで示される結合骨格の表面は、種々のリガ
ンドに相補的である可能性がある。腫瘍壊死因子は、２
種の関連サイトカインホルモン、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ
−βの集合名称である。ＴＮＦ−αは、特定のマウス腫
瘍の出血性壊死の誘発能及びある種腫瘍細胞系に対する
細胞毒性に名付けられている (Beutler,B.等(1988)Ann
u.Rev.Biochem.57:505-518)。カケクチンとしても知ら
れるＴＮＦ−αは炎症、敗血症性ショック及び慢性感染
症と腫瘍性疾患に関連する消耗症候群（悪液質）の媒体
である。多能性サイトカイン、ＴＮＦ−αは免疫調節物
質として作用し、脂肪細胞の脂質生合成経路を抑制し、
上皮細胞のコラゲナーゼ産生を促進し、線維細胞の成長
因子である。ＴＮＦ−βあるいはリンホトキシンはＴＮ
Ｆ−αのリンパ球由来同族体であり、多くの同一機能を
与えると考えられる。

【０００７】ＴＮＦのレセプターが多種類の体細胞によ
り発現されることはその広範囲にわたる活性と一致して
いる。レセプターはＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β双方を結
合する (Stauber,G.B.等(1989)J.Biol.Chem.264:3573-3
576)が、他のサイトカイン又は成長因子を結合せず、ナ
ノモル範囲の解離定数を有する。最近、少なくとも２種
のＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）分子、高親和性（Ｋｄ
＝0.０７nM）７５−８０ｋＤａ骨髄細胞型レセプター及
び親和性定数（Ｋｄ）0.３nMを有する上皮由来の５５−
６０ｋＤａレセプターがあることが明らかになった (Br
ockhaus,M.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3127-3
131)。この２つの分子はグリコシル化のレベルで異な
り、トリプシン消化の際に異種ペプチド断片を生じ、免
疫学的に異なっている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、可溶性リン
パ球リガンドタンパク質及び細胞外マトリックス会合タ
ンパク質とリンパ球との間の相互作用を阻害することに
より白血球機能を調節する方法に関する。本方法におい
ては、可溶性リガンドタンパク質が患者に投与され、こ
れらの細胞外マトリックス会合タンパク質に結合する。
これは、リンパ球が細胞外マトリックスレセプターに結
合する能力を阻止する。本発明の可溶性リンパ球リガン
ドタンパク質は、リンパ球表面レセプターの可溶性細胞
外部分、特に神経成長因子レセプタースーパーファミリ
ーの種類であるリンパ球タンパク質を含む。本発明の特
定のタンパク質としては、４−１ＢＢＲｇのような４−
１ＢＢ融合タンパク質及びＣＤ２７、ＣＤ３０、ＦＡＳ
の融合タンパク質等が挙げられる。本発明は、開発され
た可溶性リンパ球リガンドタンパク質が細胞外マトリッ
クス会合タンパク質の結合に関与することを証明するも
のである。白血球レセプターとそのリガンドとの相互作
用が白血球機能の調節をもたらすので、本発明の可溶性
タンパク質の投与によるこの相互作用の阻害が白血球活
性を効果的に変化させる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、白血球と標的
組織の細胞外マトリックスと会合したタンパク質との相
互作用を阻害することが可能なＴ細胞表面リガンドの可
溶性融合分子及び白血球作用の阻害方法に関する。本発
明の可溶性融合分子としては、免疫グロブリン鎖（Ｒ
ｇ）に融合したＴ細胞表面リガンドの細胞外ドメインが
ある。本発明の特に好ましい融合分子としては、４−１
ＢＢＲｇ、ＣＤ３０Ｒｇ、ＣＤ２７Ｒｇ、ＣＤ４０Ｒｇ
及びＴＮＦＲｇが挙げられる。本発明及びその実施態様
を更に明らかに記述するために、下記定義が包含され
る。本明細書で用いられる「可溶性リンパ球リガンドタ
ンパク質」及びその文法上の変形体は、免疫グロブリン
（Ｒｇ）又はＴ細胞レセプター領域のような可溶性構造
タンパク質に融合した４−１ＢＢ、ＣＤ３０、ＣＤ２
７、ＦＡＳ、ＭＲＣＯＸ４０、ＴＮＦレセプター（ＴＮ
ＦＲ）のようなリンパ球レセプタータンパク質の細胞外
領域を含む融合タンパク質を意味する。本発明の具体的
な可溶性リンパ球リガンドタンパク質としては、４−１
ＢＢＲｇ、ＣＤ２７Ｒｇ及びＦＡＳＲｇ等が挙げられ
る。

【００１０】本明細書で用いられる「細胞外マトリック
ス会合タンパク質」とは、組織の細胞外マトリックスに
見られるタンパク質を意味し、フィブロネクチン、ラミ
ニン、コラーゲンＶＩ型及び会合したＴＮＦ様分子が挙
げられる。本明細書で用いられる「クローニングベクタ
ー」は、クローンされるべき外来ＤＮＡが挿入される任
意のプラスミド又はウイルスである。本明細書で用いら
れる「プラスミド」は、自律性自己複製染色体外環状Ｄ
ＮＡである。本明細書で用いられる「オープンリーディ
ングフレーム」（ＯＲＦ）は、タンパク質に（潜在的
に）翻訳しうるＤＮＡ配列である。本明細書で用いられ
る「遺伝子（シストロン）」は、ペプチド鎖の配列をコ
ードするＤＮＡのセグメントであり、コーディング領域
（リーダー及びトレーラー）及び個々のコーディングセ
グメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）の前
後の領域を含めることができる。本明細書で用いられる
「発現」は、ペプチド又はタンパク質を産生するために
構造遺伝子により行われる過程である。転写及び翻訳の
組み合わせである。

【００１１】本明細書で用いられる「塩基対」（ｂｐ）
は、ＤＮＡ二重らせんのアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）
又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との組み合わせで
ある。本明細書で用いられる「発現ベクター」は、外来
ＤＮＡが挿入及び／又は発現される任意のプラスミド又
はウイルスである。本明細書で用いられる「下流」と
は、更に発現方向に進む配列を意味し、例えば、遺伝子
のペプチドコード領域は、開始コドンの下流又は遺伝子
のない３′方向にあり、上流は５′から問題の配列まで
である。本明細書で用いられる「ポリメラーゼ鎖反応」
（ＰＣＲ）は、ＤＮＡ鎖をコピーするために温度安定性
ＤＮＡポリメラーゼを逐次使用し、加熱により相補的鎖
を分離し、プライマーを加え、この過程を約３０回繰り
返してＤＮＡの約１０⁹コピーを作製することによるＤ
ＮＡ分子の増幅を意味する。ＰＣＲ法の使用により、微
量のＤＮＡを増幅して種々の方法に有用な十分量のＤＮ
Ａを作製することができる。

【００１２】「単位用量」は、動物に単位投薬として適
切な物理的に分離している単位を意味し、各単位は必要
な希釈剤、即ち、担体又は賦形剤と共に所望の治療効果
を生じるように算出された活性物質の所定量を含む。本
発明の新規な単位用量の基準が定められ、（ａ）活性物
質のユニークな特徴及び達成されるべき具体的な治療効
果及び（ｂ）そのような活性物質を治療用に配合する当
該技術において固有の制約に直接的に左右される。ペプ
チド配列に関して本明細書及び特許請求の範囲で用いら
れる文法上種々の形の「対応する」とは、アミノ末端と
カルボキシ末端のいずれか又は双方において３個までの
アミノ酸を加減して記載され、ペプチド及び／又はポリ
ペプチド配列に沿った特定のアミノ酸残基にのみ保存的
置換を含んでいるペプチド配列を意味する。上記で用い
た「保存的置換」とは、アミノ酸残基１個が別の生物学
的に類似した残基に置き換えられていることを示す。保
存的置換の例としては、Ｉle、Ｖal、Ｌeu又はＭetのよ
うな疎水性残基１個を別の残基に又はＡrgとＬys、Ｇlu
とＡsp又はＧlnとＡsnとの間等のように極性残基１個を
別の残基に置き換えることが挙げられる。

【００１３】場合によっては、イオン残基の反対に荷電
したイオン残基による置換、例えば、ＡspのＬysによる
置換は、当該技術において保存的と決められており、そ
れらのイオン基は単に可溶性を助けるためであると考え
られる。しかしながら、一般的には、本明細書で述べら
れる置換は、相対的に短い領域にあるので、イオン残基
のもう１つの反対の電荷のイオン残基による置換は、非
イオン残基とイオン残基及びＰhe、Ｔyr又はＴrpのよう
な大きい残基とＧly、Ｉle及びＶalのような大きくない
残基による置換のように「ラジカル置換」であると考え
られる。「非イオン」及び「イオン」残基は、生理的ｐ
Ｈ値において各々電荷をもたない又は通常は電荷をもっ
たアミノ酸残基を示す一般の意味で本明細書に用いられ
る。非イオン残基の例としてはＴhr及びＧlnがあり、イ
オン残基の例としてはＡrg及びＡspがある。

【００１４】本明細書において同じ意味で用いられる
「薬学的に許容しうる塩」及び「生理的に許容しうる
塩」とは、医薬業界で用いられる非毒性アルカリ金属
塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩を意味し、
ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネ
シウム及びアンモニウム塩等が挙げられ、当該技術にお
いて周知の方法により調製される。この用語は、非毒性
酸付加塩も包含し、通常、本発明の化合物と適切な有機
酸又は無機酸とを反応させることにより調製される。代
表的な塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重
硫酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸
塩、ラウリル酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リ
ン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマ
ル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩等が挙げられる。本明細
書で用いられる「細胞接着分子」とは、血管内皮及び／
又は顆粒細胞を認識しこれに結合する特定の炎症細胞表
面分子を意味する。本明細書で用いられる「操作的に結
合された」とは、分子の結合親和性が結合により阻害さ
れないような方法での分子の結合を意味する。

【００１５】本明細書で用いられる「ＩｇＧ定常領域」
とは、γ鎖の最初の１０７個のアミノ酸又はその断片に
対応する可変部に隣接するＩｇＧ分子のγ鎖のドメイン
を意味する。γ鎖定常領域内の４つのドメインは、ＣＨ
₁ 、Ｈ、ＣＨ₂ 及びＣＨ₃ を示す。ＣＨ₁ は可変部に隣
接し、アミノ酸残基１１４−２２３を含む。Ｈ（ヒン
ジ；残基２２４−２４５）はＣＨ₁ に隣接し、２つの免
疫グロブリン重鎖を共有結合で連結するジスルフィド結
合を形成するシステイン残基を含む。ＣＨ₂ はヒンジに
隣接し、アミノ酸残基２４６−３６１を含み、アミノ酸
残基３６２−４９６を含むＣＨ₃ が続く。本明細書で用
いられる「ライブラリー」とは、問題の転写系から得ら
れたクローン化ＤＮＡ断片の大きなランダムコレクショ
ンを意味する。更に、遺伝子ライブラリーが標識ｃＤＮ
Ａプローブでスクリーンされた。担体は、活性化合物を
投与するのに有効な物質であり、組成物の他の成分と適
合しその宿主に有害でない意味の「許容しうる」でなけ
ればならない。医薬組成物は、製薬技術において周知の
任意の方法で調製され、すべてが活性化合物とその担体
の組み合わせを含む。

【００１６】治療用の場合、本発明で用いられる薬剤
は、慣用的な医薬組成物として投与することができる。
そのような組成物は、経口又は非経口投与又は坐薬に適
するように処方することができる。これらの組成物にお
いて、典型的には、生理的に許容しうる担体に薬剤を溶
解又は分散させる。一例として、本発明の化合物は、無
菌懸濁液又は溶液のような液状組成物又は適切な保存剤
を含む等張製剤として用いることができる。注射用等張
無菌食塩水又はグルコース水溶液で構成される注射用媒
体が本発明の目的に十分適する。本発明の化合物が投与
に組み込まれている追加の液状剤形としては、綿実油、
ゴマ油、ヤシ油、落花生油等の食用油を含む香味乳剤及
び同様の医薬賦形剤を含むエリキシル剤が挙げられる。
発明の化合物は、単位用量の化合物を含むことが好まし
い錠剤又は丸剤のような組成物として用いることもでき
る。この目的に、薬剤（有効成分）を非毒性の生理的に
許容しうる担体としてコーンスターチ、ラクトース、ス
クロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステ
アリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、ゴム又は
類似材料のような慣用の打錠用成分と混合する。本発明
の組成物の錠剤又は丸剤は、長時間あるいは遅延作用を
与える単位剤形を供給するために積層あるいは配合する
ことができる。

【００１７】本明細書で記載される医薬処方は、上記担
体成分の他に、場合に応じて、１種以上の追加の担体成
分、例えば、希釈剤、バッファー、香味剤、バインダ
ー、界面活性剤、シックナー、滑沢剤、保存剤（酸化防
止剤を含む）等及び企図された宿主の血液と処方を等張
にする目的で含められた物質を含めることができること
は理解されるべきである。錠剤又は丸剤は、胃で崩壊し
ないように作用し有効成分をそのまま十二指腸に通過す
るさせるか又は放出を遅らせるエンベロープとしての腸
溶層を施すことができる。高分子酸又はそのような酸と
シェラック、シェラックとアセチルアルコール、酢酸セ
ルロース等の材料との混合物のような種々の材料を腸溶
層又は剤皮に用いることができる。特に適切な腸溶剤皮
は、スチレン−マレイン酸コポリマーを剤皮の腸溶性を
与える既知の材料と共に含む。本明細書で用いられる文
法上種々の形の「標識」、「指示手段」及び「標識指示
手段」は、反応生成物の存在を指示又は検出する検出可
能なシグナルの生成に直接にあるいは間接に関与する単
一原子及び分子を意味する。そのような標識は臨床診断
化学において周知のものであり、別の新規な方法及び／
又は系と用いる限りにおいてのみ本発明の一部を構成す
る。

【００１８】指示手段は、抗体又はタンパク質抗原にこ
れらを変性せずに化学結合して有効な免疫蛍光トレーサ
ーである蛍光性色素（染料）を形成する蛍光標識物質と
することができる。適切な蛍光標識物質は、フルオレセ
インイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチ
オシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−
ナフタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラ
メチルローダミンイソシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リッ
サミン等の蛍光性色素である。免疫蛍光分析法は当該技
術において周知であり、例えば、DeLuca, “Immunofluo
rescence Analysis" in Immunofluorescence Analysis,
Marchalonis等,(1982)eds.,John Wiley& Sons,Ltd.,p
p.189-231 に記載されており、これを参考として本明細
書に引用する。他の好ましい指示手段は、比色物質及び
酵素、例えば上記のように連結されるセイヨウワサビペ
ルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等及び放射性
元素、好ましくはγ線を放射する元素である。γ線を放
射する¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁸I、¹³²I及び⁵¹Ｃｒのような元素
が放射性指示群の１種の代表である。有効な標識手段の
もう１つの群は、ポジトロンを放射する¹¹Ｃ、¹⁸Ｆ、¹⁵
Ｏ及び¹³Ｎのような元素である。このように放射された
ポジトロンは、存在する電子との相互作用の際にγ線を
発生する。

【００１９】Ｔ細胞活性化マーカー４−１ＢＢは、リン
ホカイン活性化細胞毒性Ｔ細胞系Ｌ３から調製したｃＤ
ＮＡライブラリーの微分スクリーニングで単離した(Kwo
n,B.S.等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2896-290
0)。４−１ＢＢ遺伝子の３オーバーラップｃＤＮＡ細胞
系のヌクレオチド配列決定は、２５６個のアミノ酸を有
するＩ型膜タンパク質をコードすることを示した。４−
１ＢＢの細胞外ドメインは２つの領域、システインを多
く含んだ領域及びセリン／トレオニンを多く含んだ領域
に分けることができる。予想した４−１ＢＢアミノ酸配
列と既知の他のタンパク質との間の発表されている比較
は、４−１ＢＢの細胞外ドメインが神経成長因子レセプ
ターファミリー（ＮＧＦＲ）の種類に対して限定相同性
を有し (Mallett,S.等(1991) Immunol.Today 12:220-22
3)、その細胞質ドメインがリンパ球特異的タンパク質チ
ロシンキナーゼｐ５６１ｃｋの推定結合部位を含む(Sha
w,A.S.等(1990)Mol.Cell.Biol.10:1853-1862) ことを示
している。ＲＮＡブロット実験は、４−１ＢＢをコード
するｍＲＮＡが多数の活性化Ｔ−細胞系で発現されるこ
とを示した(Kwon,B.S.等(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 84:2986-2900;Kwon,B.S.等(1989) Cell.Immunol.121:
414-422)。４−１ＢＢの機能を明らかにする最初の段階
として、４−１ＢＢリガンドを同定し確認した。

【００２０】４−１ＢＢ組換え体免疫グロブリン融合タ
ンパク質（４−１ＢＢ Ｒｇ）を用いた免疫組織化学実
験は、４−１ＢＢ Ｒｇが種々の組織に広範囲に結合し
たことを示し、細胞外マトリックス成分が関与すること
を示した。４−１ＢＢとフィブロネクチン、ラミニン、
ビトロネクチン及びコラーゲンＶＩのような数種の細胞
外マトリックスタンパク質との間の相互作用は、ＣＯＳ
細胞トランスフェクタント発現４−１ＢＢを用いて確認
した。リガンド阻止実験は、種々のアニオン炭水化物ポ
リマー、例えばフコイダン、硫酸デキストラン又はグリ
コサミノグリカンヘパリン、硫酸コンドロイチン及びヒ
アルロナンが細胞外マトリックスタンパク質−４−１Ｂ
Ｂ相互作用を阻止することができたことを示し、炭水化
物がこの相互作用に関与することを示している。

【００２１】４−１ＢＢ Ｒｇが実際に試験されたすべ
ての組織に結合したことを示す免疫組織化学実験は、細
胞外マトリックス成分がこの分子のリガンドとして作用
されることを示した。細胞外マトリックスタンパク質と
４−１ＢＢとの間の相互作用は、ＣＯＳ細胞トランスフ
ェクタントを用いて確認した。ＣＯＳ細胞発現４−１Ｂ
Ｂは、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン及
びコラーゲンＶＩを結合するがコラーゲンＩは結合しな
いことが判明し、ＣＤ４０を発現するもの (Stamenkovi
c,I.等(1989)EMBO J.8:1403-1410) はこれらのタンパク
質のすべてを結合しなかった。この結合は、濃度依存性
及び飽和性であることが判明した。４−１ＢＢへのフィ
ブロネクチン結合は、リンパ球インテグリンへのフィブ
ロネクチン結合を仲介することが知られているＲＧＤ又
はＣＳ−１配列(Springer T.A.(1990) Nature 346:425-
434)では仲介されなかった。フィブロネクチンペプチド
との結合実験は、フィブロネクチン分子の異なった領域
が４−１ＢＢに結合することができることを示した。フ
ィブロネクチンの６つのタンパク質分解切断断片のうち
４つが濃度依存方法で４−１ＢＢ−フィブロネクチン相
互作用を阻害することが可能であった。しかしながら、
これらのうちの１つ、Ｃ１２０だけがフィブロネクチン
−細胞付着を仲介することが以前に知られている配列を
含んでいる(Pytela,R.(1985)Cell 40:191-198)。

【００２２】フィブロネクチンのＴ３０及びＴ６０タン
パク質分解断片を用いた阻止実験は、細胞外マトリック
スタンパク質すべてに対して４−１ＢＢの結合部位がオ
ーバーラップしていることを示している。Ｔ３０及びＴ
６０は、ラミニン、ビトロネクチン及びコラーゲンＶＩ
の４−１ＢＢへの結合を完全に阻止した。細胞外マトリ
ックスタンパク質は、Ａrg−Ｇly−Ａsp（ＲＧＤ）及び
ＣＳ-1と独立した機序でプロテオグリカンに結合するこ
とが知られている (Ruoslahti,E.等(1991) Cell 64:867
-869; Ruoslahti,E.(1988)Ann.Rev.Cell.Biol.4:229-25
5)。阻止実験を用いて、４−１ＢＢ−細胞外マトリック
スタンパク質相互作用をグリコサミノグリカンと他のア
ニオン炭水化物ポリマーで阻害することができ、４−１
ＢＢ Ｒｇ自体がプロテオグリカンである可能性を調べ
た。４−１ＢＢと細胞外マトリックスタンパク質との相
互作用は、アニオン炭水化物ポリマーフコイダンで完全
に阻止され、グルコサミノグリカン、硫酸ヘパリン、硫
酸コンドロイチン及びヒアルロナン並びにオリゴ糖硫酸
デキストランで部分的に阻止された。逆に、脱硫酸ヘパ
リン及び単糖類、フコース、マンノース、グルコース、
グルコース−６−スルフェート、Ｎ−アセチル−グルコ
サミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン及びＮ−アセチ
ル−ノイラミン酸は相互作用に影響しなかった。これら
の結果は、炭水化物が４−１ＢＢと細胞外マトリックス
タンパク質との相互作用を仲介することに関与すること
ができることを示している。

【００２３】４−１ＢＢ ＲｇのコンドロイチンＡＢＣ
リアーゼ、ヒアルロニダーゼ、ヘパリナーゼ及びヘパラ
チナーゼによる消化は、４−１ＢＢ Ｒｇ上のこれらの
グリコサミノグリカンの存在を証明しなかった。ケラタ
ナーゼ消化は４−１ＢＢ Ｒｇの分子量を減少させ、４
−１ＢＢ Ｒｇは抗−ケラチンｍＡｂと反応し、４−１
ＢＢ ＲｇがＧlcＮac( β-1,3 )Ｇal( β-1,4 )ＧlcＮ
Ａｃ配列を有する炭水化物部分(Fukuda,M.N.(1981)J.Bi
ol.Chem.256:3900-3905)とおそらく硫酸ケラタンを含む
ことを示している。Ｎ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナー
ゼ及びノイラミニダーゼによる消化は、４−１ＢＢがＮ
−連鎖炭水化物、Ｏ−連鎖炭水化物及びシアル酸を含む
ことを示す。これらの結果は、４−１ＢＢが糖タンパク
質であることを示している。

【００２４】４−１ＢＢが神経成長因子レセプター（Ｎ
ＧＦＲ）ファミリーの種類に相同であることは以前に報
告されたが、４−１ＢＢと細胞外マトリックスタンパク
質との相互作用は予想されなかった (Mallett,S.等(199
1)Immunol.Today 12:220-223; Smith,C.A.等(1990)Scie
nce 248:1019-1023)。このファミリーのタンパク質は、
ＮＧＦＲ(Radeke,M.J.等(1987)Nature 325:593-597) 、
腫瘍壊死因子の２つのレセプター (Loetscher,H.等(199
0)Cell 61:351-359; Schall,T.J.等(1990)Cell61:361-3
70;Smith C.A.等(1990)Science 248:1019-1023)、Ｂ−
細胞抗原ＣＤ３０(Durkop,H.等(1992)Cell 68:421-42
7)、ＣＤ４０ (Stamenkovic,I.等(1989)EMBO J.8:1403-
1410) 及びＦＡＳ(Itoh,N.等(1991)Cell 66:233-243)、
Ｔ細胞表面抗原ＯＸ−４０ (Mallett,S.等(1990)EMBO
J.9:1063-1068) 及びＣＤ２７(Camerini,D.等(1991)J.I
mmunol.147:3165-3169)及びＳＦＶ−Ｔ２と称するショ
ープ線維腫ウイルスのオープンリーディングフレーム(S
prag,S.R.(1990)Trends in Biochem.Sci.15:366-368)か
らなる。これらのタンパク質の４種（ＮＧＦＲ、ＴＮＦ
Ｒ-1及びII及びＣＤ４０）のリガンドだけが同定されて
おり(Sprang,S.R.(1990)Trends in Biochem.Sci.15:366
-368;Bothwell,M.(1991)Cell 65:915-918)、細胞外マト
リックスタンパク質に結合することは以前には全く報告
されていない。更に、対照として用いられるＣＤ４０
Ｒｇ及びＣＯＳ細胞トランスフェクタント発現ＣＤ４０
(Stamenkovic,I.等(1989)EMBO J.8:1403-1410) は細胞
外マトリックスタンパク質への結合を示さなかった。

【００２５】これらの観察は、４−１ＢＢとｎＢＲＦの
他のタンパク質との間の相同性及びＦＡＳＴＰプログラ
ムを用いたＳＷＩＳＰＲＯＴデータベースの再試験をも
たらした。以前に報告されている相同性の他に、４−１
ＢＢはラミナン(Sasaki,M.等(1988)J.Biol.Chem.263:16
536-16544)、プロテオグリカンペルレカン(Noonan,D.M.
等(1991)J.Biol.Chem.266:22939-22947)及びヒトβ５イ
ンテグリン鎖 (Cheresh,D.A.等(1989)Cell 57:59-69; M
clean,J.W.等(1990)J.Biol.Chem.265:17126-17131)の短
い腕を有するＣysを多く含んだドメインに著しく相同で
ある。配列線列は、４−１ＢＢの細胞外ドメインが７個
のＣys残基を各々含む２つのラミナン様のＣysを多く含
んだドメインに分けることができることを示す。これら
のＣys残基は、４−１ＢＢ及びラミナンとペルレカンの
Ｃysを多く含んだドメイン間に保存される（データは示
されていない）。おもしろいことに、細胞付着を仲介す
ることに関与する非−ＲＧＤ配列は、ラミナンＢ１鎖上
のＣysを多く含んだ１つのドメインにマップされている
(Graf,J.等(1987)Cell 48:989-996)。４−１ＢＢとヒト
β５インテグリン鎖との間の相同性が起こりうる意味は
明らかではない。相同性の算法は２つの配列の残基数と
合っているが、そのほとんどはタンパク質のインテグリ
ンファミリーの種類の間に保存されない。更に、β５イ
ンテグリンはビトロネクチンとフィブロネクチンに結合
することが既知であるが、この接着相互作用はＲＧＤ配
列により仲介される(Springer,T.A.(1990) Nature 346:
425-434)。結合実験と共にこれらの観察は、４−１ＢＢ
が１種以上の遺伝子ファミリーと遠い関係であることを
示している。

【００２６】ここに示した結果は、４−１ＢＢが細胞外
マトリックスタンパク質の結合に関与するＴ細胞表面タ
ンパク質であることを示している。証拠の増加は、白血
球細胞外マトリックスレセプターとそれらのリガンドと
の間の相互作用が白血球機能の調節を生じることを示し
ている(Springer,T.A.(1990)Nature 346:425-434; Noji
m Y.等(1990)J.Exp.Med.172:1185-1192)。この研究は、
４−１ＢＢ−細胞外マトリックス相互作用がＴ細胞機能
の調節を生じ、４−１ＢＢの細胞質ドメインとｐ５６
^lck との間の相互作用がこの過程に関与することを示し
ている。可溶性４−１ＢＢと４−１ＢＢに対する抗体
は、正常Ｔ細胞が高レベルの４−１ＢＢを発現する条件
を同定及び／又は高レベルのこのタンパク質を発現する
細胞系を同定するために用いられる。これらの細胞が同
定されると、細胞外マトリックスタンパク質と４−１Ｂ
Ｂとの間の相互作用の役割が更に確認することができ
る。本明細書で後記される実施例で示されるように本発
明を更に明らかにし可能にするために、開示された結果
を与えるのに用いられる材料及び方法の一般記述が示さ
れる。これらの材料及び方法は用いられる技術を具体的
に説明するものであり、本発明を限定するものではな
い。これらの方法の他の変更及び修正は周知であり、本
発明により企図される。

【００２７】ＣＤ４０及び４−１ＢＢの他に、白血球で
発現されるＴＮＦ遺伝子ファミリーの他の種類の可溶性
免疫グロブリン融合タンパク質が調製されており、本発
明により企図される。図１０は、Ｔ細胞抗原ＣＤ２７の
ＣＯＳ細胞トランスフェクタント発現融合タンパク質及
びＢ細胞抗原ＣＤ３０を示すものである。白血球抗原Ｆ
ＡＳの場合、同様の可溶性免疫グロブリン融合分子が調
製されている。これらのタンパク質は、ＣＤ４０及び４
−１ＢＢ融合タンパク質の調製に用いた同様の方法で調
製された。これらの融合タンパク質は、白血球相互作用
を阻害するために用いることができ、これにより臨床に
おいて免疫応答を調節する方法が提供される。ＣＤ４０
及び４−１ＢＢを用いた実験と同様に、これらのタンパ
ク質はＣＤ４０の場合に示されたようにＴＮＦに関与す
るリガンドを有し及び／又は４−１ＢＢのように細胞外
マトリックス会合タンパク質に結合する。本発明の融合
タンパク質は、免疫応答を調節することができる特異的
リガンドを単離するために用いられるであろう。

【００２８】全長４−１ＢＢｃＤＮＡの調製 業者(Cetus) によって示された条件及び試薬を用いたポ
リメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、全長４−１Ｂ
ＢｃＤＮＡ配列を増幅した。シグナル配列のすぐ上流の
配列をコードし、Ｈind III 部位を含む下記配列を有す
る４−１ＢＢ合成プライマーを合成した。 5′-GCG ACG CGT AAG CTT GTC CTG TGC ATG TGA CAT TT
C-3′（配列I.D.No.1) ＸhoＩ制限部位を含む下記配列を有する逆プライマーを
合成した。 5′-CAC TCG AGC GGC CGC TCA CAG CTC ATA GCC TCC TC
C-3′（配列I.D.No.2) 全長４−１ＢＢＰＣＲ生産物をＨind III 及びＸhoＩで
消化し、Ｈind III-ＸhoＩ−切断ＣＤＭ８ベクターに連
結した(Seed,B.(1987) Nature 329:840-842)。

【００２９】４−１ＢＢ−Ｒｇの調製 ４−１ＢＢの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片
を記載されているようにＰＣＲで単離することにより、
本実験に用いられる可溶性４−１ＢＢ−免疫グロブリン
融合タンパク質（４−１ＢＢ−Ｒｇ）を生成した(Aruff
o,A.等(1990)Cell 61:1303-1313)。シグナルペプチド切
断点のすぐ下流の配列をコードし、ＫpnＩ部位を含む下
記配列を有する４−１ＢＢプライマーを合成した。 5′-CCG CGG GTA CCC GTG CAG AAC TCC TGT GAT AAC TG
T-3′（配列I.D.No.3) ＢamＨＩ制限部位を含む下記配列を有する逆プライマー
を合成した。 5′-CCG CTA CGT AGG ATC CTG CAA GGA GTC CCC TCC TG
G-3′（配列I.D.No.4) ４−１ＢＢ細胞外領域ＰＣＲ生産物をＢamＨ１及びＫpn
Ｉで消化し、ＫpnＩ−ＢamＨ１−切断ＣＤ５−ＩｇＧ１
ベクターに連結した(Aruffo,A.等(1990)Cell 61:1303-1
313)。対照としてこれらの実験で用いられるＣＤ４０ｃ
ＤＮＡ及びＣＤ４０−免疫グロブリン融合タンパク質
（ＣＤ４０ Ｒｇ）は以前に記載されている (Stamenko
vic,I.等(1989) EMBO J 8:1403-1410)。得られた構築物
をＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、記載されているよ
うに上清から所望の融合タンパク質を回収した(Aruffo,
A.等(1990)Cell 61:1303-1313)。

【００３０】４−１ＢＢ免疫組織実験 光学顕微鏡免疫組織化学に用いられる手法は詳細に記述
されている(Farr,A.G.等(1981) Immunol.Methods 47:12
9)。マウス胸腺、リンパ節、脾臓又は皮膚の新たに切断
した６μm の低温切片をアミノアルキルシラン処理スラ
イドに載せ (Rentrop,M.等(1986) Histochem.J.18:27
1)、少なくとも２時間風乾した後、−２０℃においてア
セトン中で固定した(Guan,J.L.等(1990)Cell 60:53-61;
Nojim,Y.等(1990)J.Exp.Med.172:1185-1192;Ruoslahti,
E.(1988)Ann.Rev.Biochem.57:375-413; Ruoslahti,E.等
(1991)Cell 64:867-869;Ruoslahti,E.(1988)Ann.Rev.Ce
ll.Biol.4:229-255;Doege,K.(1986)J.Biol.Chem.262:17
757-17767)。ＰＢＳですすいだ後、切片をＣａ⁺²及びＭ
ｇ⁺²（各２mM) を含むＰＢＳで希釈した４−１ＢＢＲｇ
又はヒトＩｇＧ１と室温で１時間インキュベートした。
これ以後の溶液及び希釈液はすべて二価のカチオンを含
有した。ＰＢＳで数回洗浄した後に一次抗体と同様の条
件を用いてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ１
抗体とインキュベートした。電子供与体として3,３′−
ジアミノベンジジンを用いてペルオキシダーゼ活性を証
明した。次いでスライドを水和し、カバーグラスを載
せ、対抗染色せずに写真をとった。

【００３１】精製４−１ＢＢ−Ｒｇマトリックス分子の結合 精製４−１ＢＢ−Ｒｇのマウスフィブロネクチン、ラッ
トラミニン、ヒトビトロネクチン、ヒトコラーゲンＶＩ
及びＩ型(Telios Pharmaceuticals)及びウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ)(Sigma)への結合をＥＬＩＳＡ法を用いて
試験した。ポリスチレン９６−ウェルプレートをＰＢ
Ｓ、１mMＣａＣl2、１mMＭｇＣl2（ＰＢＳ／Ｃａ²⁺／Ｍ
ｇ²⁺）で５μg/mlまで希釈したアフィニティー精製ヤギ
抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃ部分(Cappel)で２２℃において１
時間被覆した。ウェルをｄｄＨ₂Oで１：１０に希釈した
１０Ｘ試験片希釈剤濃縮物(Genetic Systems) で４℃に
おいて一晩遮断した。ウェルを洗浄し、適切な濃度（ラ
ミナンの場合1.０μg/ml) の（ＰＢＳ／Ｃａ²⁺／Ｍ
ｇ²⁺）で希釈した１００μl/ウェルの４−１ＢＢ又はＣ
Ｄ４０−Ｒｇで２２℃において１時間処理した。ウェル
を希釈度１：２の２０μg/mlから0.０６μg/mlまで測定
したＰＢＳ／Ｃａ²⁺／Ｍｇ²⁺に希釈したビオチン結合細
胞外マトリックスタンパク質で２２℃において１時間処
理した。上記のように１Ｘ試験片希釈剤濃縮物で１：５
００に希釈したペルオキシダーゼ結合アビジン(Sigma)
を用いて、結合した物質を２２℃で１時間検出した。ウ
ェルを洗浄し、ＥＩＡバッファー基質(Genetic System
s) で１：１００に希釈したＥＩＡ色原体試薬(Genetic
Systems) で２２℃において１５分間処理した。ストッ
プバッファー(Genetic Systems) を加えて比色反応物を
急冷し、二波長４５0,６３０のＥＬＩＳＡリーダーで光
学濃度を測定した。

【００３２】下記変更を含む上記のＥＬＩＳＡ法を用い
て、４−１ＢＢ−Ｒｇの細胞外マトリックスタンパク質
への結合阻止を試験した。ウェルを４−１ＢＢ−Ｒｇ又
はＣＤ４０−Ｒｇで被覆した後、フィブロネクチントリ
プシン断片を４nM、0.８nM、0.１６nM及び0.０３２nMま
で希釈し、ＲＧＤ及びＣＳ−１ペプチドを１００μl／
ウェルで加えたＰＢＳ／Ｃａ²⁺／Ｍｇ²⁺で５００μg/m
l、１００μg/ml、２０μg/ml及び４μg/mlまで希釈
し、２２℃で１時間インキュベートし、その後ビオチン
結合細胞外マトリックスタンパク質を洗浄しないウェル
に上記のように加え、２２℃で更に１時間インキュベー
トした。

【００３３】ＣＯＳ細胞で発現した４−１ＢＢのマトリ
ックス分子への結合 ＤＥＡＥデキストラン法を用いて全長４−１ＢＢｃＤＮ
Ａあるいは全長ＣＤ４０ｃＤＮＡを含むＣＤＭ８ベクタ
ーをＣＯＳ細胞にトランスフェクトした(Aruffo,A.等(1
990)Cell 61:1303-1313)。トランスフェクションの２４
時間後、細胞をトリプシン処理し、１５×３５mmプレー
トに播種し、更に２４時間増殖した。染色する前に、細
胞を染色バッファー（２％ＦＢＳ、１mMＣａＣl₂、１mM
ＭｇＣl₂を含むＰＢＳ）で洗浄した。細胞を４μg のビ
オチン結合細胞外マトリックスタンパク質と２２℃にお
いて１時間インキュベートした。細胞を染色バッファー
で２回洗浄し、5.０μg のフルオレセインイソチオシア
ネート（ＦＩＴＣ）結合アビジン(Molecular Probes)又
は1.０μg のフィコエリトリン結合アビジン(Biomeda)
と４℃で３０分間インキュベートした。細胞を染色バッ
ファーで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で試験した。

【００３４】阻止実験においては、細胞を染色バッファ
ーで洗浄し、４００μg の単純糖質又は１００μg の複
合糖質又はポリマーと２２℃で１時間インキュベートし
た。次いで、洗浄せずに４μg のビオチン結合細胞外マ
トリックスタンパク質を加え、２２℃で１時間インキュ
ベートした。染色は上記のように進めた。ＣＯＳ細胞発
現４−１ＢＢ又はＣＤ４０の蛍光を単一像プログラム及
び２フィルター：５１５nmより長い光を集めるジアクロ
イックフィルターと６０５nmより長い光を集めるロング
パスフィルターの組み合わせを用いるＡＣＡＳ５７０顕
微鏡(Meridian)で測定した。３５mm² プレートはすべて
同じ濃度で細胞を含有した。各走査は、1.８mm² 面積の
平均蛍光を測定し、各プレートを３回走査した。４００
um² より小さい蛍光の全面積を取り除くことによりバッ
クグランド蛍光を差し引いた。各走査は正の制御（ビオ
チン化ＦＮとフィコエリトリン結合アビジンで染色した
４−１ＢＢ発現ＣＯＳ細胞）の％として示し、各試料の
走査を平均して平均及び標準偏差を生成した。

【００３５】４−１ＢＢ−Ｒｇ消化 ＣＤ４０−Ｒｇ又は４−１ＢＢ−Ｒｇをトランスフェク
トしたＣＯＳ細胞をＣys／Ｍetを含まないＤＭＥＭ中で
３０分間インキュベートした後、1.０ｍＣｉの ³⁵Ｓ−シ
ステイン及び1.０ｍＣｉの³⁵Ｓ−メチオニン(Amersham)
を加えた。１８時間後、Ｒｇ融合タンパク質を記載され
ているように精製した(Aruffo,A.等(1990)Cell 61:1303
-1313)。³⁵Ｓ標識４−１ＢＢ−Ｒｇ又はＣＤ４０−Ｒｇ
を各々ｐＨ7.０、7.０、7.４及び7.４のＰＢＳ中ヘパリ
ナーゼ（0.０１７U/ml）、ヘパラチナーゼ(ICN、0.０１
７U/ml）、ケラチナーゼ(ICN、0.３３U/ml）又はヒアル
ロニダーゼ(Sigma、１７U/ml）で３７℃において１８時
間消化した。コンドロイチンＡＢＣリアーゼ(ICN) 消化
を４０mM酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）を含む４０mMト
リス−ＨＣl(ｐＨ8.０）中1.０U/mlの酵素を用いて３７
℃で１８時間行った。Ｎ−グリカナーゼ(Genzyme) 消化
を0.１トリス−ＨＣl(ｐＨ8.０）中３５U/ml酵素を用い
て３７℃で１８時間行った。ノイラミニダーゼ(Genzym
e) 消化を１０mMＣa(ＯＡｃ)₂を含む0.１M ＮａＯＡｃ
（ｐＨ6.５）中0.４U/ml酵素を用いて３７℃で２時間行
った。Ｏ−グリカナーゼ(Genzyme) 消化（0.１７U/ml）
をノイラミニダーゼ処理融合タンパク質により３７℃で
１８時間行った。消化した後、ＳＤＳゲル試料バッファ
ーを加え、消化物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。ゲ
ルを固定し、乾燥し、フィルムに露出した。

【００３６】ウェスタンブロット分析 タンパク質を7.５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動
し、次いで、ニトロセルロースに８０mAで１時間電気ブ
ロットした。膜をＰＢＳ中５％無脂肪乳で２２℃におい
て１８時間遮断した後、ＰＢＳ0.０５％トゥイーン−２
０(PBS-Tween（登録商標))で１：１００に希釈した抗−
硫酸ケラタン抗体(5D4,ICN) を含めて２時間遮断した。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）溶液で１回洗浄した
後、膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で１：１００
に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇ(Tag
o)と２２℃で２時間インキュベートした。ブロットを洗
浄し、基質として４−クロロ−１−ナフトールで展開し
た。本発明を一般的に記載してきたので、個々の実施例
によって更に理解を得ることができるが、これらは具体
的に説明するためのものであり、特にことわらない限り
限定されるものではない。

【００３７】

【実施例１】可溶性４−１ＢＢ免疫グロブリンキメラの調製 ４−１ＢＢリガンドを同定及び確認するために、４−１
ＢＢの可溶性免疫グロブリンを調製した。この組換え体
グロブリン（Ｒｇ）を免疫組織化学実験に用いて、４−
１ＢＢリガンドを発現する組織を同定した。４−１ＢＢ
の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片をヒトＩｇ
Ｇ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに遺伝的融合
することにより４−１ＢＢ Ｒｇキメラをコードする融
合遺伝子を調製し、哺乳動物発現ベクターにサブクロー
ンした（図１）。ＣＯＳ細胞にトランスフェクトする
と、このプラスミドは４−１ＢＢ Ｒｇを発現及び分泌
させる。４−１ＢＢ Ｒｇはジスルフィド連鎖ホモ二量
体として産生され（図２）、トランスフェクトした細胞
の上清に濃度〜１４mg/lで蓄積する。上清からこれらの
実験で用いられる４−１ＢＢ Ｒｇタンパク質をプロテ
インＡカラムのアフィニティークロマトグラフィーによ
り回収した。非特異的及びＦｃ介在結合の対照として、
ＣＤ４０ Ｒｇキメラ又はヒトＩｇＧ１を用いた。ヒト
Ｂ細胞表面タンパク質ＣＤ４０と４−１ＢＢは遠い関係
である (Mallett,S.等(1991) Immunol.Today 12:220-22
3)。

【００３８】

【実施例２】４−１ＢＢリガンドの組織分布 ４−１ＢＢ Ｒｇを用いた免疫組織実験は、一次及び二
次リンパ組織の他に、腎、肝、皮膚の表皮及び真皮のよ
うな多くの組織と幅広い反応性を示した。イソタイプ適
合ヒトＩｇＧ１対照は結合を示さなかった（図３）。胸
腺内では、４−１ＢＢが皮質及び髄質のリンパ及び間質
要素の双方に結合し、髄質の方が広範囲に標識化した。
脾臓では、４−１ＢＢ Ｒｇが白色髄より赤色髄を広範
囲に結合した。上皮又は間充織誘導の組織における４−
１ＢＢ Ｒｇに対するリガンドの広範な分布は、細胞外
マトリックス成分がリガンドとして機能する可能性を高
めた。。

【００３９】

【実施例３】細胞外マトリックスタンパク質は４−１ＢＢのリガンド
である ４−１ＢＢと細胞外マトリックスタンパク質との間の相
互作用の可能性を調べるために、４−１ＢＢ完全タンパ
ク質を非相同系で発現し、細胞外マトリックスタンパク
質への結合能を試験した。４−１ＢＢ完全タンパク質を
コードするｃＤＮＡ断片をマウスＴ細胞ｃＤＮＡライブ
ラリーから単離し、哺乳動物発現ベクターＣＤＭ８にサ
ブクローンし(Seed,B.(1987)Nature329:840-843)、ＣＯ
Ｓ細胞にトランスフェクトした。ビオチン結合フィブロ
ネクチン、ラミニン、ビトロネクチン及びコラーゲンＶ
Ｉは、ＣＯＳ細胞発現４−１ＢＢに結合したが、ビオチ
ン結合コラーゲンＩ及びＢＳＡ又はフィコエリトリン結
合strept−アビジン単独は結合しなかった（図３Ｅ−
Ｈ）。ＣＯＳ細胞発現ＣＤ４０(Stamenkovic,I.(1989)E
MBO J 8:1403-1410)は、精製細胞外マトリックス又は対
照タンパク質のいずれにも結合を示さなかった。相互作
用物と細胞外マトリックスタンパク質の相対親和性を評
価するために、４−１ＢＢ Ｒｇを抗−ヒトＩｇＧ抗体
で被覆したプラスチックに固定化し、増加濃度の細胞外
マトリックスタンパク質に結合する能力を試験した（図
４）。フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン及
びコラーゲンＶＩの４−１ＢＢへの結合は飽和可能であ
り、半最大結合は濃度各々〜5.０、1.５、1.０及び2.０
μg/mlで達した。コラーゲンＩ、ＢＳＡ及びアルカリ性
ホスファターゼ結合アビジン単独は、試験される細胞外
マトリックスタンパク質及び対照タンパク質にすべて結
合を示さなかった（図４）。

【００４０】

【実施例４】 ４−１ＢＢ−細胞外マトリックスタンパク質相互作用は
ＲＧＤ又はＣＳ−１配列で仲介されない フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン及びコラ
ーゲンに結合することが知られているインテグリンを含
むリンパ球と細胞外マトリックスとの間の相互作用を仲
介する多くのタンパク質が同定されている(Springer,T.
A.(1990) Nature 346:425-434)。ある場合には、インテ
グリンと細胞外マトリックスタンパク質との間の相互作
用は、細胞外マトリックスタンパク質のＡrg−Ｇly−Ａ
sp（ＲＧＤ）配列により仲介されることが知られている
(Ruoslahti,E.等(1987)Science238:491-497)。例え
ば、フィブロネクチンとＶＬＡ−５インテグリンとの間
の相互作用は、ＲＧＤ依存性であることが知られている
(Rytela,R.等(1985)Cell 40:191-198)が、フィブロネク
チンとＶＬＡ-4インテグリンとの間の相互作用は、フィ
ブロネクチンの選択的にスプライスされたドメイン（Ｃ
Ｓ−１）により仲介されることが知られている(Wayner,
E.等81989)J.Cell Biol.109:1321-1330; Guan,J.L.等(1
990)Cell 60:53-61)。４−１ＢＢ細胞外マトリックスタ
ンパク質結合のＲＧＤ及びＣＳ−１配列の役割を調べる
ために、プラスチックに固定化された４−１ＢＢ Ｒｇ
にフィブロネクチンが結合することを阻止する数個のＲ
ＧＤ及びＣＳ−１ペプチドの能力を試験した。これらの
ペプチドはフィブロネクチンあるいはビトロネクチンへ
の細胞結合を阻害するＲＧＤペプチド、詳細には、フィ
ブロネクチンとビトロネクチンの双方又はＣＳ−１ペプ
チド、ＣＳ−１ペプチドのスクランブル形又はＲＧＤと
ＣＳ−１ペプチドの混合物に結合することを阻害するＲ
ＧＤを包含する。これらのペプチド及びペプチドの組み
合わせは、フィブロネクチン−ＶＬＡ−４相互作用を阻
害するより高い１０Ｘ濃度でさえも４−１ＢＢ Ｒｇ−
フィブロネクチン接着にほとんどあるいは全く効果がな
かった (Nojim,Y.等(1990)J.Exp.Med.172:1185-1192)。

【００４１】４−１ＢＢフィブロネクチン相互作用を仲
介することに関与するフィブロネクチン分子の領域又は
領域群を同定する努力として、フィブロネクチンの６オ
ーバーラップタンパク質分解断片を用いて、多くの阻止
実験を行った（図５)(Ruoslahti,E.(1988) Ann.Rev.Bio
chem.57:375-413)。これらのうちの３種Ｔ３０、Ｔ６０
及びＣ１２０はフィブロネクチンの固定化４−１ＢＢ
Ｒｇへの結合を濃度依存方法で阻止し、Ｃ４５ペプチド
は部分的阻止効果を有し、Ｃ４０及びＰ５０は阻止効果
がなかった（図６）。本実験は、フィブロネクチン内の
複数部位が４−１ＢＢ−フィブロネクチン相互作用を仲
介することを明らかにするものである。

【００４２】

【実施例５】４−１ＢＢの細胞外マトリックスタンパク質結合部位は
オーバーラップする 異種細胞外マトリックスタンパク質と４−１ＢＢとの間
の相互作用が４−１ＢＢタンパク質の同一領域によって
仲介されるかどうかを求めるために、Ｔ３０及びＴ６０
フィブロネクチンタンパク質分解断片を用いて阻止実験
を行った。Ｔ３０及びＴ６０断片は、ラミニン、ビトロ
ネクチン及びコラーゲンＶＩの固定化４−１ＢＢ Ｒｇ
への結合を濃度依存方法で阻止することが判明した（図
７）。

【００４３】

【実施例６】４−１ＢＢ接着はグリコサミノグリカンにより阻害され
る ＲＧＤ又はＣＳ−１ペプチドが４−１ＢＢ Ｒｇと細胞
外マトリックス成分との間の相互作用を妨害することが
できないことから、この相互作用の根拠を更に実験し
た。プロテオグリカンが主にＲＧＤに無関係な機序によ
り細胞外マトリックスタンパク質及び成長因子に結合す
ることが知られているので (Ruoslahti,E.等(1990)Cell
64:867-869;Ruoslahti,E.(1988)Ann.Rev.Cell Biol.4:
229-255)、我々は細胞外マトリックス成分との４−１Ｂ
Ｂ相互作用についてグリコサミノグリカンの作用を試験
し、４−１ＢＢがプロテオグリカンであるかどうかを求
めた。細胞外マトリックスタンパク質と４−１ＢＢとの
間の相互作用を阻害するグリコサミノグリカン及び単糖
類の能力をＣＯＳ細胞トランスフェクタント発現４−１
ＢＢを用いて試験した。グリコサミノグリカンヘパリ
ン、ヒアルロナン及び硫酸コンドロイチンは、細胞外マ
トリックスタンパク質の４−１ＢＢへの結合を部分的に
阻害したが、脱硫酸ヘパリンは効果がなかった（図
８）。細胞外マトリックスタンパク質と４−１ＢＢとの
間の相互作用は、アニオン炭水化物ポリマーフコイダン
及び硫酸デキストランによっても阻害された（図８）。
単純糖質フコース、ガラクトース、マンノース、グルコ
ース、ガラクトース−６−スルフェート、Ｎ−アセチル
−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン及びＮ
−アセチル−ノイラミン酸は、４−１ＢＢ−フィブロネ
クチン相互作用にほとんどあるいは全く効果がなかっ
た。

【００４４】４−１ＢＢは、コンドロイチン／硫酸デル
マタン付着に推測されるＳer−Ｇly配列を含まず (Doeg
e,K.等(1987)J.Biol.Chem.262:17757-17767;Oldberg,A.
等(1987)Biochem.J.243:255-259)、コンドロイチンＡＢ
Ｃリアーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパラチナーゼ及びヒアル
ロニダーゼで処理した４−１ＢＢ ＲｇのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析は、これらのグリコサミノグリカンの存在を証
明しなかった（図９）。ケラチナーゼ（エンド−β−ガ
ラクトシダーゼ）による消化は４−１ＢＢ Ｒｇの分子
量を減少させ（図９）、４−１ＢＢ Ｒｇは抗−硫酸ケ
ラタンモノクローナル抗体５Ｄ４と反応し(Caterson,B.
等(1983)J.Biol.Chem.258:8848-8854)、４−１ＢＢ Ｒ
ｇがＧlcＮac（β-1,3）Ｇal（β-1,4）ＧlcＮac配列を
含む炭水化物部分(Fukuda,M.N.(1981)J.Biol.Chem.256:
3900-3905)及びおそらく硫酸ケラタンで修飾されること
を示した。Ｎ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナーゼ及びノ
イラミニダーゼによる同様の消化物は、４−１ＢＢ Ｒ
ｇがＮ−連鎖及びＯ−連鎖炭水化物及びシアル酸を含む
ことを示している（図９）。上記の説明及び実施例は、
本発明を具体的に説明したものであるが、限定するもの
ではない。本発明の真の精神及び範囲を逸脱することな
く多くの変更及び修正を行うことができる。

【００４５】配列表 （１）一般情報： （ｉ） 出願人： Aruffo,Alejandro Chalupny,N.Jan Marken,John Ledbetter,Jeffrey A. （ii） 発明の名称： 白血球機能を調節する細胞外マ
トリックスレセプターリガンド （iii) 配列数： ４ （iv) 住所： （Ａ） 宛先： Bristol-Myers Squibb Company （Ｂ） 町： 3005 First Avenue （Ｃ） 市： Seattle （Ｄ） 州： Washington （Ｅ） 国： USA （Ｆ） 郵便番号：98121 （ｖ） コンピューターリーダブルフォーム： （Ａ） メディアムタイプ： フロッピーディスク （Ｂ） コンピューター： IBM PCコンパチブル （Ｃ） オペレーションシステム：PC-DOS/MS-DOS （Ｄ） ソフトウェア： Patent In Release
#1.0,Version #1.25 （vi) 現在の出願データ： （Ａ） 出願番号： US （Ｂ） 出願日： 1992年10月30日 （Ｃ） 分類： （viii) 弁理士／代理人インフォメーション （Ａ） 名前： Sorrentino,Joseph
M. （Ｂ） 登録番号： 32,598 （Ｃ） 参照／整理番号： ON0095- （ix) 電気通信インフォメーション （Ａ） 電話： 206 728-4800 （Ｂ） テレファックス： 206 727-3601

【００４６】（２） SEQ ID NO: 1の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ： 36塩基対 （Ｂ） タイプ： 核酸 （Ｃ） ストランデッドネス： 1 本鎖 （Ｄ） トポロジー： 線状 （ii) 分子型： cDNA （xi） 配列記述：SEQ ID NO: 1： GCGACGCGTA AGCTTGTCCT GTGCATGTGA CATTTC 36

【００４７】（２） SEQ ID NO: 2の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ： 36塩基対 （Ｂ） タイプ： 核酸 （Ｃ） ストランデッドネス： 1 本鎖 （Ｄ） トポロジー： 線状 （ii) 分子型： cDNA （xi） 配列記述：SEQ ID NO: 2： CACTCGAGCG GCCGCTCACA GCTCATAGCC TCCTCC 36

【００４８】（２） SEQ ID NO: 3の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ： 36塩基対 （Ｂ） タイプ： 核酸 （Ｃ） ストランデッドネス： 1 本鎖 （Ｄ） トポロジー： 線状 （ii) 分子型： cDNA （xi） 配列記述：SEQ ID NO: 3： CCGCGGGTAC CCGTGCAGAA CTCCTGTGAT AACTGT 36

【００４９】（２） SEQ ID NO: 4の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ： 36塩基対 （Ｂ） タイプ： 核酸 （Ｃ） ストランデッドネス： 1 本鎖 （Ｄ） トポロジー： 線状 （ii) 分子型： cDNA （xi） 配列記述：SEQ ID NO: 4： CCGCTACGTA GGATCCTGCA AGGAGTCCCC TCCTGG 36

【図面の簡単な説明】

【図１】４−１ＢＢ免疫グロブリン融合遺伝子を示す。
４−１ＢＢ Ｒｇ融合遺伝子を含む哺乳動物発現ベクタ
ーＣＤＭ７プラスミドの要素としては、ヒトサイトメガ
ロウイルスエンハンサー／プロモーター要素（ＣＭ
Ｖ）；及びＳＶ４０ウイルス由来イントロンとポリアデ
ニル化配列（スプライス＋Ａｎ）；及びＳＶ４０ウイル
ス由来の複製（ＳＶ４０ ori);及び大腸菌由来の複製
(πＶＸ ori);Ｍ１３ファージ由来の複製（Ｍ１３ or
i);及び細菌遺伝マーカーＳupＦ遺伝子（ＳupＦ）が挙
げられる。４−１ＢＢ Ｒｇは、ＣＤ５由来アミノ末端
分泌シグナル配列（ＣＤ５ss);４−１ＢＢの細胞外ドメ
インをコードするｃＤＮＡ断片（４−１ＢＢ）；及びヒ
トＩｇＧ１のヒンジ（Ｈ）と不変部ドメイン（ＣＨ２及
びＣＨ３）をコードするゲノムＤＮＡ断片を含む。４−
１ＢＢ Ｒｇ融合体の要素の各々に隣接するユニークな
制限酵素部位が示されている。

【図２】放射能標識４−１ＢＢ Ｒｇを材料及び方法に
おいて記載したプロテインＡ−セファロースカラムから
吸着及び溶離して精製し、非還元（レーン１）又は還元
（レーン２）条件下で電気泳動した。電気泳動移動度の
分子量基準を左に示す。

【図３】４−１ＢＢ Ｒｇのマウス組織切片に対する反
応性及び細胞外マトリックスタンパク質のＣＯＳ細胞発
現４−１ＢＢへの結合を示す。 Ａ．皮質（ｃ）及び髄質（ｍ）双方におけるマウス胸腺
への４−１ＢＢ Ｒｇ結合の免疫ペルオキシダーゼ局在
化。胸腺の髄質域の間質細胞がより広範囲に標識され
た。 Ｂ．マウス胸腺組織と正常ヒトＩｇＧ１及びペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗−ヒトＩｇとの反応性。胸腺髄質内の
顆粒細胞及び他の細胞により示される内在性ペルオキシ
ダーゼ活性と関係した反応生産物のみが認められた。 Ｃ．マウス脾臓への４−１ＢＢ結合の免疫ペルオキシダ
ーゼ局在化。脾臓の白色髄質（ｗｐ）と赤色髄質（ｒ
ｐ）の両域が４−１ＢＢ Ｒｇを結合し、赤色髄質域が
より広範囲に結合した。 Ｄ．４−１ＢＢ Ｒｇを正常ヒトＩｇＧ１に置き換える
と、反応生産物の付着は内在性ペルオキシダーゼと区別
できなかった。 Ａ−Ｄ ５０Ｘ。 Ｅ及びＦ．ビオチン化ラミニンの４−１ＢＢをトランス
フェクトしたＣＯＳ細胞への結合を示す位相及び免疫蛍
光顕微鏡写真。位相顕微鏡写真の矢印はＣＯＳ細胞結合
ラミニンを確認するものである。 Ｇ及びＨ．ビオチン化フィブロネクチンの４−１ＢＢを
トランスフェクトしたＣＯＳ細胞への結合を示す位相及
び免疫蛍光顕微鏡写真。位相顕微鏡写真の矢印はＣＯＳ
細胞結合フィブロネクチンを確認するものである。 Ｅ−Ｈ ２００Ｘ。

【図４】４−１ＢＢの細胞外マトリックスタンパク質へ
の結合を示す。４−１ＢＢ Ｒｇをアフィニティー精製
ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体で被覆したプラスチックに固定
化し、ビオチン結合フィブロネクチン、ビトロネクチ
ン、ラミニン又はＢＳＡの増加量に結合する能力を材料
及び方法の項で記載したＥＬＩＳＡアッセイを用いて測
定した。対照として、同様に固定化したＣＤ４０ Ｒｇ
融合タンパク質のビオチン結合フィブロネクチン及びラ
ミニンへの結合をモニターした。データは３回の実験試
料の平均として示される。ＳＤは＜１％であった。デー
タは少なくとも３回の別々の実験の代表が示されてい
る。

【図５】４−１ＢＢ Ｒｇのフィブロネクチンへの結合
が複数のフィブロネクチンドメインにより仲介されるこ
とを示す。細胞外マトリックスタンパク質は、オーバー
ラップ結合部位で４−１ＢＢ Ｒｇに結合する。阻止実
験で用いたヒトフィブロネクチンポリペプチド及びタン
パク質分解断片の模式図。２種のトリプシン由来断片Ｔ
３０及びＴ６０は、各々近似分子量３０及び６０ｋＤを
有する。α−キモトリプシン由来断片Ｃ４５、Ｃ１２０
及びＣ４０は、各々近似分子量４５６、１２０及び４０
ｋＤを有する。ペプシン由来断片Ｐ５０は、近似分子量
５０ｋＤを有する。これらのペプチドは、Telios Pharm
aceuticals Inc.(San Diego,CA) から入手した。

【図６】フィブロネクチンの異種タンパク質分解断片が
フィブロネクチンのプラスチックに固定化した４−１Ｂ
Ｂ Ｒｇへの結合を阻止する能力を材料及び方法の項で
記載したＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。各断片
を４種の異なる濃度で試験した。試験したフィブロネク
チン断片としては、Ｔ３０、Ｔ６０、Ｃ１２０、Ｃ４
０、Ｃ４５及びＰ５０がある。データは３回の実験試料
の平均として示される。ＳＤが示されている。データは
少なくとも３回の別々の実験の代表が示されている。

【図７】フィブロネクチンのＴ３０及びＣ４０断片の増
加量がラミニン、ビトロネクチン及びコラーゲンＶＩの
プラスチックに固定化した４−１ＢＢ Ｒｇへの結合を
阻害する能力を材料及び方法の項で記載したＥＬＩＳＡ
アッセイを用いて測定した。データは３回の実験試料の
平均として示される。データは少なくとも３回の別々の
実験の代表が示されている。

【図８】４−１ＢＢの細胞外マトリックスタンパク質へ
の結合のグリコサミノグリカン阻止を示す。４−１ＢＢ
Ｒｇは、Ｎ−連鎖及びＯ−連鎖オリゴ糖類で修飾され
るが、グリコサミノグリカンでは修飾されない。アニオ
ン炭水化物ポリマーフコイダン（Ｈ）及び硫酸デキスト
ラン（Ｄ）及びグリコサミノグリカンヘパリン（Ｃ）、
コンドロイチン（Ｅ）及びヒアルロナン（Ｆ）及び脱硫
酸ヘパリン（Ｇ）がフィブロネクチンのＣＯＳ細胞トラ
ンスフェクタント発現４−１ＢＢへの結合を遮断する能
力を材料及び方法で記載したように試験した。結合は、
阻害剤なし（Ａ）で４−１ＢＢ ＣＯＳ細胞トランスフ
ェクタントのフィブロネクチンへの結合に相対する結合
％として示される。対照には、フィコエリトリン結合ス
トレパビジン単独のＣＯＳ細胞発現４−１ＢＢへの結合
（Ｂ）及びＣＯＳ細胞トランスフェクタント発現ＣＤ４
０のフィブロネクチンへの結合（Ｉ）を含めた。データ
は３回の走査の平均として示される。ＳＤは、材料及び
方法に記載されるように算出される。データは少なくと
も３回の別々の実験の代表が示されている。

【図９】放射能標識精製４−１ＢＢ Ｒｇをコンドロイ
チンＡＢＣリアーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパラチナーゼ、
ケラタナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｎ−グリカナーゼ、
Ｏ−グリカナーゼ及びノイラミニダーゼ（レーン２−
９）を用いて材料及び方法で記載したように処理した。
処理４−１ＢＢ Ｒｇタンパク質の電気泳動移動度を材
料及び方法の項で記載したＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて未
処理４−１ＢＢ Ｒｇタンパク質（レーン１）と比較し
た。電気泳動移動度の分子量基準を左に示す。

【図１０】蛍光（Ａ，Ｅ）又は位相差顕微鏡（Ｂ，Ｆ）
下で見た抗−ＣＤ３０ｍＡｂ（Ａ，Ｂ）又は抗−ＣＤ２
７ｍＡｂ（Ｅ，Ｆ）で染色したＣＯＳ細胞の模擬トラン
スフェクションを示す。ＣＤ３０Ｒｇ（Ｃ，Ｄ）又はＣ
Ｄ２７Ｒｇ（Ｇ，Ｈ）でトランスフェクトしたＣＯＳ細
胞も同様に染色され、各々蛍光（Ｃ，Ｇ）又は位相差顕
微鏡（Ｄ，Ｈ）下で見られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 19/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9050−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ (72)発明者 エヌ ジャン チャルプニ アメリカ合衆国 ワシントン州 98136 シアトル カリフォルニア アベニュー サウスウェスト 304−6312 (72)発明者 ジョン マーケン アメリカ合衆国 ワシントン州 98146 シアトル シックスス アベニュー サウ スウェスト 10256 (72)発明者 ジェフリー エイ レドベッター アメリカ合衆国 ワシントン州 98177 シアトル ノースウェスト ワンハンドレ ッドアンドサーティーンス プレイス 306

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 白血球機能を調節する方法であって、可
   溶性リンパ球リガンドタンパク質を患者に投与すること
   により組織上の白血球レセプターと細胞外マトリックス
   会合タンパク質との間の相互作用を阻害して該リンパ球
   リガンドタンパク質が該細胞外マトリックス会合タンパ
   ク質に結合し該白血球との相互作用を阻止することを含
   む方法。
2. 【請求項２】 該リンパ球リガンドタンパク質が神経成
   長因子レセプタースーパーファミリーの１種である請求
   項１記載の方法。
3. 【請求項３】 該タンパク質が可溶性４−１ＢＢタンパ
   ク質である請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 該タンパク質が可溶性ＣＤ２７である請
   求項２記載の方法。
5. 【請求項５】 該タンパク質が可溶性ＣＤ３０である請
   求項２記載の方法。
6. 【請求項６】 該タンパク質が可溶性ＣＤ４０である請
   求項２記載の方法。
7. 【請求項７】 該タンパク質が可溶性ＴＮＦである請求
   項２記載の方法。
8. 【請求項８】 白血球と細胞外マトリックス会合タンパ
   ク質との相互作用を阻害することが可能な可溶性リンパ
   球レセプタータンパク質。
9. 【請求項９】 ４−１ＢＢ融合タンパク質を含む請求項
   ８記載の可溶性タンパク質。
10. 【請求項１０】 ４−１ＢＢ融合タンパク質が４−１Ｂ
    Ｂ−Ｒｇである請求項９記載の可溶性タンパク質。
11. 【請求項１１】 ＣＤ２７融合タンパク質を含む請求項
    ８記載の可溶性タンパク質。
12. 【請求項１２】 ＣＤ２７融合タンパク質がＣＤ２７Ｒ
    ｇである請求項１１記載の可溶性タンパク質。
13. 【請求項１３】 ＣＤ３０融合タンパク質を含む請求項
    ８記載の可溶性タンパク質。
14. 【請求項１４】 ＣＤ３０融合タンパク質がＣＤ３０Ｒ
    ｇである請求項１３記載の可溶性タンパク質。
15. 【請求項１５】 ＦＡＳ融合タンパク質を含む請求項８
    記載の可溶性タンパク質。
16. 【請求項１６】 ＦＡＳ融合タンパク質がＦＡＳＲｇで
    ある請求項１５記載の可溶性タンパク質。