JPH0730114B2 - インヒビン - Google Patents
インヒビンInfo
- Publication number
- JPH0730114B2 JPH0730114B2 JP60069209A JP6920985A JPH0730114B2 JP H0730114 B2 JPH0730114 B2 JP H0730114B2 JP 60069209 A JP60069209 A JP 60069209A JP 6920985 A JP6920985 A JP 6920985A JP H0730114 B2 JPH0730114 B2 JP H0730114B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- inhibin
- molecular weight
- treatment
- sds
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、インヒビン（INHIBIN）に関する。インヒ
ビンは、避妊薬としてあるいは畜産に利用できる性ホル
モンである。
ビンは、避妊薬としてあるいは畜産に利用できる性ホル
モンである。
インヒビンは、Mc Cullagh（Science,76,19−20,（193
2））により去勢動物の下垂体に見られる去勢細胞の出
現を抑制する精巣の水溶性の抽出物として見い出され
た。卵巣性インヒビンとしてはDe Jongら（Nature,263,
71−72,（1976））によりウシの卵胞液中に見い出さ
れ、その後、ラット，ブタ，サル，ヒツジ，ウマ，ヒト
などの卵胞液中に多量のインヒビン活性が存在すること
が確かめられている。
2））により去勢動物の下垂体に見られる去勢細胞の出
現を抑制する精巣の水溶性の抽出物として見い出され
た。卵巣性インヒビンとしてはDe Jongら（Nature,263,
71−72,（1976））によりウシの卵胞液中に見い出さ
れ、その後、ラット，ブタ，サル，ヒツジ，ウマ，ヒト
などの卵胞液中に多量のインヒビン活性が存在すること
が確かめられている。
現在では、インヒビンは雌雄両性の性腺に存在する水溶
性の物質で、下垂体からのFSH（卵胞刺激ホルモン）の
合成，分泌を特異的に抑制する物質として考えられてい
る。インヒビンは卵胞の発育，成熟，排卵などの現象に
も関与していて視床下部下垂体性腺系で生殖生理上、重
要な役割を果している。
性の物質で、下垂体からのFSH（卵胞刺激ホルモン）の
合成，分泌を特異的に抑制する物質として考えられてい
る。インヒビンは卵胞の発育，成熟，排卵などの現象に
も関与していて視床下部下垂体性腺系で生殖生理上、重
要な役割を果している。
卵巣性インヒビンの内、ブタのものについてWilliamら
（Partial Purification of Porcine Follcular Fluid
Gonadostatin,Intraovarian Control Mechanisms,Advan
ces Experimental Medicine and Biology,vol.147,Plen
um Press,New York,99−116,1982）はブタ卵胞液の「セ
ファクリルＳ−300」によるゲル濾過クロマトグラフィ
ーの溶出液中分子量26,000の画分にインヒビン活性があ
ることを見い出している。しかるに、この文献において
は、インヒビンは精製されておらず、従って、インヒビ
ン活性は単一の物質によって発現されるのか、あるいは
インヒビン活性を有する複数の物質が存在するのかは明
らかにされていない。現に我々の研究によれば、ブタ卵
胞液中には分子量３万近辺のものに限っても、少くとも
３種のインヒビン活性を有する物質が見い出されてい
る。
（Partial Purification of Porcine Follcular Fluid
Gonadostatin,Intraovarian Control Mechanisms,Advan
ces Experimental Medicine and Biology,vol.147,Plen
um Press,New York,99−116,1982）はブタ卵胞液の「セ
ファクリルＳ−300」によるゲル濾過クロマトグラフィ
ーの溶出液中分子量26,000の画分にインヒビン活性があ
ることを見い出している。しかるに、この文献において
は、インヒビンは精製されておらず、従って、インヒビ
ン活性は単一の物質によって発現されるのか、あるいは
インヒビン活性を有する複数の物質が存在するのかは明
らかにされていない。現に我々の研究によれば、ブタ卵
胞液中には分子量３万近辺のものに限っても、少くとも
３種のインヒビン活性を有する物質が見い出されてい
る。
叙上のように、従来インヒビンは単一の物としては分離
されていないため、その特異な生理活性からして避妊薬
等に使用できる大きな可能性があるにも拘らず、その応
用はできなかった。従って、この発明の目的はインヒビ
ンを単一の物質として得ることにある。
されていないため、その特異な生理活性からして避妊薬
等に使用できる大きな可能性があるにも拘らず、その応
用はできなかった。従って、この発明の目的はインヒビ
ンを単一の物質として得ることにある。
本発明者らは、ブタの卵胞液よりインヒビンを単一物質
として分離，精製し、その物理的，化学的性質を明らか
にすることに成功した。
として分離，精製し、その物理的，化学的性質を明らか
にすることに成功した。
この発明の32Kインヒビン−IIと名付けられたインヒビ
ンは、以下の性質を有するものである。
ンは、以下の性質を有するものである。
（ａ）分子量:32kd（SDS−ゲル電気泳動法及び高速液体
クロマトグラフィー法） （ｂ）還元により分子量20kdと13kd（SDS−ゲル電気泳
動法）のポリペプチドが生じ、活性を失う。
クロマトグラフィー法） （ｂ）還元により分子量20kdと13kd（SDS−ゲル電気泳
動法）のポリペプチドが生じ、活性を失う。
（ｃ）コンカナバリンＡセファロースカラムに吸着さ
れ、α−メチルマンノシドによって溶出される。
れ、α−メチルマンノシドによって溶出される。
（ｄ）等電点:p16付近 （ｅ）プロテアーゼ処理により失活し、ノイラミニダー
ゼ処理及びエンドグリコシダーゼＨ処理により失活しな
い。
ゼ処理及びエンドグリコシダーゼＨ処理により失活しな
い。
（ｆ）Ｎ−末端アミノ酸配列： 分子量20×103のポリペプチド： Ser Thr 分子量13×103のポリペプチド： Gly Leu （ｇ）ブタ卵胞液中に存在し、卵胞刺激ホルモンの上昇
を抑制する。
を抑制する。
本発明のインヒビンは、例えば以下の方法で得ることが
できる。
できる。
ブタ卵巣を集め、卵胞液を吸引等により採取する。イン
ヒビンは、「マトリックス ゲル レッドＡ」（アミコ
ン社）に特異的に吸着されるので（Molecular and Cell
ular Endocrinology,21,109−117,（1981））、まず、
このゲルによるマフィニティ−クロマトグラフィーを行
う。
ヒビンは、「マトリックス ゲル レッドＡ」（アミコ
ン社）に特異的に吸着されるので（Molecular and Cell
ular Endocrinology,21,109−117,（1981））、まず、
このゲルによるマフィニティ−クロマトグラフィーを行
う。
ついで本発明者らの研究によれば、「フェニルセファロ
ース」，「セファクリル Ｓ−200」，「DEAE セファ
クリル CL6B」によるクロマトグラフィー及び最後に逆
相高速液体クロマトグラフィーによる精製がこの物質の
精製には最も適している。これらのクロマトグラフィー
における溶離溶媒としては8Mウレアが最適である。
ース」，「セファクリル Ｓ−200」，「DEAE セファ
クリル CL6B」によるクロマトグラフィー及び最後に逆
相高速液体クロマトグラフィーによる精製がこの物質の
精製には最も適している。これらのクロマトグラフィー
における溶離溶媒としては8Mウレアが最適である。
インヒビンの活性は、以下のようにして測定することが
できる。
できる。
（１）ラット下垂体前葉細胞培養法 ラット下垂体前葉をトリプシン及びビオカーゼにより分
散し、細胞濃度５〜８万個/0.1ml/ウエルとなるように
プラスチックプレートに入れる。各ウエルにインヒビン
検体0.1mlを加え、37℃に10％炭酸ガスを含む空気中に
て72時間保つ。培地はDMEMに５％ヒト臍帯血清,2.5％FC
S,5％馬血清を加えたものを用いる。活性は培地中に放
出されたFSH含量をラジオイムノアッセイにより測定し
て、FSH放出の抑制度で以って表わす。32Kインヒビン−
IIは、ED50＝1.2ng/ml−培地の活性を持つ。
散し、細胞濃度５〜８万個/0.1ml/ウエルとなるように
プラスチックプレートに入れる。各ウエルにインヒビン
検体0.1mlを加え、37℃に10％炭酸ガスを含む空気中に
て72時間保つ。培地はDMEMに５％ヒト臍帯血清,2.5％FC
S,5％馬血清を加えたものを用いる。活性は培地中に放
出されたFSH含量をラジオイムノアッセイにより測定し
て、FSH放出の抑制度で以って表わす。32Kインヒビン−
IIは、ED50＝1.2ng/ml−培地の活性を持つ。
（２）生体内試験法 35日令の雄ラットを去勢し、去勢後６から24時間にかけ
て上昇してくる血中FSHをラジオイムノアッセイにて測
定する。インヒビン検体は、去勢と同時に腹腔内投与
し、９時間後の血中FSH値の上昇に対する抑制程度を測
定する。この方法では（１）の方法に比べ約5,000倍の
検体量を必要とする。
て上昇してくる血中FSHをラジオイムノアッセイにて測
定する。インヒビン検体は、去勢と同時に腹腔内投与
し、９時間後の血中FSH値の上昇に対する抑制程度を測
定する。この方法では（１）の方法に比べ約5,000倍の
検体量を必要とする。
本発明の卵巣性インヒビンは、ヒトの避妊薬として用い
られる他、家畜の妊娠時期を揃える等畜産に応用でき
る。
られる他、家畜の妊娠時期を揃える等畜産に応用でき
る。
（１）インヒビンの分離，精製 ブタ卵巣より吸引により卵細胞を採取し、10,000rpm,1
時間の遠心により上澄液を集めた。この上澄液に２倍容
の50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）を加え、同じ緩衝
液により緩衝化された「マトリックスゲル レッドＡ」
カラム（8.0×25cm）にのせ、ついで上記緩衝液に0.15M
KClを加えた溶液で充分洗浄後、上記緩衝液に1.0M尿素
と1.2M KClを加えた溶液で溶出した。
時間の遠心により上澄液を集めた。この上澄液に２倍容
の50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）を加え、同じ緩衝
液により緩衝化された「マトリックスゲル レッドＡ」
カラム（8.0×25cm）にのせ、ついで上記緩衝液に0.15M
KClを加えた溶液で充分洗浄後、上記緩衝液に1.0M尿素
と1.2M KClを加えた溶液で溶出した。
得られた溶出液に1/4容の2M KClを加え、「フェニルセ
ファロース」カラム（2.5×30cm）にのせ、50mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.5）に1M KClを加えた緩衝液で充分洗
浄後、50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）に8M尿素を加え
た溶液で溶出した。
ファロース」カラム（2.5×30cm）にのせ、50mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.5）に1M KClを加えた緩衝液で充分洗
浄後、50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）に8M尿素を加え
た溶液で溶出した。
溶出液を、「セファクリル Ｓ−200」カラムを用いて
ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。展開緩衝液とし
て8M尿素を含むトリス塩酸緩衝液を用いた。これにより
分子量約８万と約３万の位置にインヒビン活性が認めら
れた。分子量３万の分画を集め、「DEAE−セファロース
CL6B」カラム（1.5×30cm）を用いてイオン交換クロ
マトグラフィーを行った。インヒビン活性は３個所に分
れて溶出され、第二のピークが最も活性が強かった（第
１図）。
ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。展開緩衝液とし
て8M尿素を含むトリス塩酸緩衝液を用いた。これにより
分子量約８万と約３万の位置にインヒビン活性が認めら
れた。分子量３万の分画を集め、「DEAE−セファロース
CL6B」カラム（1.5×30cm）を用いてイオン交換クロ
マトグラフィーを行った。インヒビン活性は３個所に分
れて溶出され、第二のピークが最も活性が強かった（第
１図）。
上記第二のピークの分画を集め、下記のように逆相高速
液体クロマトグラフィーを行った。インヒビン−IIはア
セトニトリル濃度34％の位置に単一ピークとして溶出さ
れた。
液体クロマトグラフィーを行った。インヒビン−IIはア
セトニトリル濃度34％の位置に単一ピークとして溶出さ
れた。
カラム：「TSK−120T」,4.0×150mm,溶出：（Ａ）10％
トリフルオル酢酸（TFA）：アセトニトリル：水＝1:10:
90,（Ｂ）10％TFA:アセトニトリル：水＝1:60:40による
直線グラジェント。
トリフルオル酢酸（TFA）：アセトニトリル：水＝1:10:
90,（Ｂ）10％TFA:アセトニトリル：水＝1:60:40による
直線グラジェント。
以上の精製工程における蛋白量，インヒビン活性等の変
化は第１表に示すとおりである。
化は第１表に示すとおりである。
得られた標品は、再逆相高速液体クロマトグラフィー,S
DS−ゲル電気泳動により単一であり、そのインヒビン活
性は卵胞液と比較して約5,000倍になっていた。卵細胞
１あたり約0.7mgの精製標品が得られた。
DS−ゲル電気泳動により単一であり、そのインヒビン活
性は卵胞液と比較して約5,000倍になっていた。卵細胞
１あたり約0.7mgの精製標品が得られた。
（２）32Kインヒビン−IIの物性 （ａ）逆相高速液体ゲル濾過クロマトグラフィー（カラ
ムTSK−3000SW）による分子量は32kdである。
ムTSK−3000SW）による分子量は32kdである。
（ｂ）SDS−ゲル電気泳動による分子量は、32kdであ
る。
る。
（ｃ）還元剤，酸化剤により容易に失活し、SDS−ゲル
電気泳動で分子量約20kdと約13kdの２つのポリペプチド
が生じる。
電気泳動で分子量約20kdと約13kdの２つのポリペプチド
が生じる。
（ｄ）上記ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸は20kdのも
のはSer The Ala Pro,13kdのものはGly Leu Gln Cysで
あった。
のはSer The Ala Pro,13kdのものはGly Leu Gln Cysで
あった。
（ｅ）32Kインヒビン−IIは、コンカナバリンＡセファ
ロースカラムに吸着され、α−メチルマンノシドによっ
て溶出されるので、糖蛋白質である。
ロースカラムに吸着され、α−メチルマンノシドによっ
て溶出されるので、糖蛋白質である。
（ｆ）32Kインヒビン−IIは、プロテアーゼ処理によっ
て失活する（トリプシンにて60％，ペプシンにて85％，
キモトリプシンにて70％，プロナーゼにて95％，サーモ
ライシンにて98％失活する。）。
て失活する（トリプシンにて60％，ペプシンにて85％，
キモトリプシンにて70％，プロナーゼにて95％，サーモ
ライシンにて98％失活する。）。
（ｇ）32Kインヒビン−IIは、イノラミニダーゼ処理，
エンドグリコシダーゼＨ処理によっては失活しない。
エンドグリコシダーゼＨ処理によっては失活しない。
（ｈ）等電点:p16付近
第１図は32Kインヒビン−IIのイオン交換クロマトグラ
フィーの溶出パターンである。
フィーの溶出パターンである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 寒川 賢治 宮崎県宮崎郡清武町加納甲1520―24 (72)発明者 松尾 寿之 宮崎県宮崎郡清武町木原6653Ａ―104 (72)発明者 五十嵐 正雄 群馬県前橋市日吉町４丁目357―４
Claims (1)
- 【請求項１】以下の性質を有するインヒビン。 （ａ）分子量:32kd（SDS−ゲル電気泳動法及び高速液体
クロマトグラフィー法） （ｂ）還元により分子量20kdと13kd（SDS−ゲル電気泳
動法）のポリペプチドが生じ、活性を失う。 （ｃ）コンカナバリンＡセファロースカラムに吸着さ
れ、α−メチルマンノシドによって溶出される。 （ｄ）等電点:p16付近 （ｅ）プロテアーゼ処理により失活し、ノイラミニダー
ゼ処理及びエンドグリコシダーゼＨ処理により失活しな
い。 （ｆ）Ｎ−末端アミノ酸配列： 分子量20×103のポリペプチド： Ser Thr 分子量13×103のポリペプチド： Gly Leu （ｇ）ブタ卵胞液中に存在し、卵胞刺激ホルモンの上昇
を抑制する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60069209A JPH0730114B2 (ja) | 1985-04-03 | 1985-04-03 | インヒビン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60069209A JPH0730114B2 (ja) | 1985-04-03 | 1985-04-03 | インヒビン |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23863394A Division JPH07238097A (ja) | 1994-09-07 | 1994-09-07 | インヒビンを抗原とするＩｇＧ抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61229826A JPS61229826A (ja) | 1986-10-14 |
| JPH0730114B2 true JPH0730114B2 (ja) | 1995-04-05 |
Family
ID=13396101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60069209A Expired - Lifetime JPH0730114B2 (ja) | 1985-04-03 | 1985-04-03 | インヒビン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0730114B2 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3650689T2 (de) * | 1985-04-18 | 1999-04-08 | Biotechnology Australia Pty. Ltd., East Roseville, Neussuedwales | Rekombinantes inhibin |
| JP2652534B2 (ja) * | 1985-04-18 | 1997-09-10 | バイオテクノロジー・オーストラリア・ピーテイーワイ・リミテツド | 組換えインヒビン |
| US4740587A (en) * | 1985-07-18 | 1988-04-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Inhibin and method of purifying same |
| US5089396A (en) * | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
| ZA867569B (en) * | 1985-10-03 | 1988-06-29 | Genentech Inc | Nucleic acid encoding the alpha or beta chains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
| US4997815A (en) * | 1988-11-01 | 1991-03-05 | Children's Hospital Medical Center Of Northern California | Method for augmenting fetal hemoglobin by treatment with activin and/or inhibin |
| US5942220A (en) * | 1990-03-16 | 1999-08-24 | Chiron Corporation | Inhibitor of cytokine activity and applications thereof |
| JP6956942B2 (ja) * | 2017-04-28 | 2021-11-02 | 味の素株式会社 | ゲル濾過クロマトグラフィーにおけるタンパク質の回収率を高める方法 |
-
1985
- 1985-04-03 JP JP60069209A patent/JPH0730114B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61229826A (ja) | 1986-10-14 |
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