JPH07303479A - 新規微生物 - Google Patents
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- JPH07303479A JPH07303479A JP5103887A JP10388793A JPH07303479A JP H07303479 A JPH07303479 A JP H07303479A JP 5103887 A JP5103887 A JP 5103887A JP 10388793 A JP10388793 A JP 10388793A JP H07303479 A JPH07303479 A JP H07303479A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
- A01N63/23—B. thuringiensis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、バチルス・スリンギエンシス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）株間の
プラスミド転移において有用なコンジュゲーションプロ
フィシエント・バチルス・スリンギエンシス株を製造す
る方法に関する。 【効果】 生物学的殺虫剤として有用な株が得られる。
ａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）株間の
プラスミド転移において有用なコンジュゲーションプロ
フィシエント・バチルス・スリンギエンシス株を製造す
る方法に関する。 【効果】 生物学的殺虫剤として有用な株が得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、殺虫毒素を製造する細
菌の新規株、それらの製造方法および昆虫性有害生物の
駆除におけるそれらの使用に関する。
菌の新規株、それらの製造方法および昆虫性有害生物の
駆除におけるそれらの使用に関する。
【０００２】さらに詳細には、本発明は、改良した殺虫
特性を有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（以下、Ｂ．
ｔ．と略す）ハイブリッドに関する。
特性を有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（以下、Ｂ．
ｔ．と略す）ハイブリッドに関する。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】一般
に生物学的殺虫剤、特にＢ．ｔ．は、それらの自然発生
性およびそれらの高い宿主特異性のために、広範囲スペ
クトルの化学的殺虫剤の特殊代替物としての使用が最近
増加している。
に生物学的殺虫剤、特にＢ．ｔ．は、それらの自然発生
性およびそれらの高い宿主特異性のために、広範囲スペ
クトルの化学的殺虫剤の特殊代替物としての使用が最近
増加している。
【０００４】上記物質が広く認められた結果、同時に、
標的有害生物に対する作用のスペクトルおよび非標的昆
虫を傷つけない能力に関してさらに細かい要求が生れ
た。
標的有害生物に対する作用のスペクトルおよび非標的昆
虫を傷つけない能力に関してさらに細かい要求が生れ
た。
【０００５】この結果を達成する様々な方法は、 ａ）突然変異が自然発生または誘導することができる場
合の突然変異した毒素コード化遺伝子を含む株の単離
（イギリス特許出願公開第２２１６１２７Ａ号参照）、 ｂ）所望の内毒素を発現させる（天然、突然変異または
構築した）遺伝子を導入するための電気穿孔または電気
形質転換のような技術を使用する株の形質転換（ボーン
およびエラー、ＦＥＭＳ、マイクロバイオロジー・レタ
ーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、
第５８巻、第１７１−１７８頁（１９８９年）参照）、 ｃ）異なるまたは補足的な宿主特異性を有する両方の親
株からのプラスミドを含むハイブリッド株を製造するた
めの天然産生株または突然変異株の接合（アメリカ特許
第４，７９７，２７９号参照）のように既知である。
合の突然変異した毒素コード化遺伝子を含む株の単離
（イギリス特許出願公開第２２１６１２７Ａ号参照）、 ｂ）所望の内毒素を発現させる（天然、突然変異または
構築した）遺伝子を導入するための電気穿孔または電気
形質転換のような技術を使用する株の形質転換（ボーン
およびエラー、ＦＥＭＳ、マイクロバイオロジー・レタ
ーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、
第５８巻、第１７１−１７８頁（１９８９年）参照）、 ｃ）異なるまたは補足的な宿主特異性を有する両方の親
株からのプラスミドを含むハイブリッド株を製造するた
めの天然産生株または突然変異株の接合（アメリカ特許
第４，７９７，２７９号参照）のように既知である。
【０００６】しかしながら、この後者の場合では、需要
のある遺伝子を有するプラスミドはコンジュゲーション
プロフィシェント（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｆ
ｉｃｉｅｎｔ、高接合性）でない株に存在するという問
題にしばしば遭遇する。（コンジュゲーションプロフィ
シエント・株はそれらが含むプラスミドの少なくとも１
種の供与体として十分に作用する能力を有するものであ
る。）このことは通常、所望のプラスミドの接合を試み
ても転移しないかまたは、供与体および受容細胞の役割
が逆転し、元来目的とした受容体のゲノムを欠いてお
り、例えばうまく成長せず、毒素の発現が乏しく、製剤
化が困難等の他の方法で欠損しているハイブリッドを導
くことを結果として有する。
のある遺伝子を有するプラスミドはコンジュゲーション
プロフィシェント（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｆ
ｉｃｉｅｎｔ、高接合性）でない株に存在するという問
題にしばしば遭遇する。（コンジュゲーションプロフィ
シエント・株はそれらが含むプラスミドの少なくとも１
種の供与体として十分に作用する能力を有するものであ
る。）このことは通常、所望のプラスミドの接合を試み
ても転移しないかまたは、供与体および受容細胞の役割
が逆転し、元来目的とした受容体のゲノムを欠いてお
り、例えばうまく成長せず、毒素の発現が乏しく、製剤
化が困難等の他の方法で欠損しているハイブリッドを導
くことを結果として有する。
【０００７】この問題のために実現できない望ましい接
合の例は、ｃｒｙＩＣ遺伝子を含むＢ．ｔ．クルスタキ
（ｋｕｒｓｔａｋｉ）株を現在まで製造不可能なことで
あった。レディー等は、Ｂ．ｔ．、バチルス・セレウス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）およびバチルス・
アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉ
ｓ）間のプラスミドの種間転移を述べているが、種内転
移を記載していない。
合の例は、ｃｒｙＩＣ遺伝子を含むＢ．ｔ．クルスタキ
（ｋｕｒｓｔａｋｉ）株を現在まで製造不可能なことで
あった。レディー等は、Ｂ．ｔ．、バチルス・セレウス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）およびバチルス・
アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉ
ｓ）間のプラスミドの種間転移を述べているが、種内転
移を記載していない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明により、所望のプ
ラスミドを含む接合不足な（ｃ−ｄ）Ｂ．ｔ．株は、そ
れをコンジュゲーションプロフィシエント・第二Ｂ．
ｔ．株と接合することによりコンジュゲーションプロフ
ィシエント・（ｃ−ｐ）株に変換することができること
が現在発見された。こうして得られたｃ−ｐであり、需
要のある遺伝子を有する所望のプラスミドを含む両全の
接合完了株（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）は、その
後所望の宿主と接合する供与細胞として使用することが
できる。
ラスミドを含む接合不足な（ｃ−ｄ）Ｂ．ｔ．株は、そ
れをコンジュゲーションプロフィシエント・第二Ｂ．
ｔ．株と接合することによりコンジュゲーションプロフ
ィシエント・（ｃ−ｐ）株に変換することができること
が現在発見された。こうして得られたｃ−ｐであり、需
要のある遺伝子を有する所望のプラスミドを含む両全の
接合完了株（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）は、その
後所望の宿主と接合する供与細胞として使用することが
できる。
【０００９】コンジュゲーションデフィシェント（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ、不接合性）
Ｂ．ｔ．株の語は、約２％未満の頻度のプラスミド転移
を示すもの、さらに好ましくは約１％未満の頻度のプラ
スミド転移を示すものを意味する。
ｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ、不接合性）
Ｂ．ｔ．株の語は、約２％未満の頻度のプラスミド転移
を示すもの、さらに好ましくは約１％未満の頻度のプラ
スミド転移を示すものを意味する。
【００１０】本発明により、供与体としてコンジュゲー
ションプロフィシエント・Ｂ．ｔ．株とコンジュゲーシ
ョンデフィシェント・Ｂ．ｔ．株を接合することを含む
コンジュゲーションデフィシェント・Ｂ．ｔ．株をコン
ジュゲーションプロフィシエント・Ｂ．ｔ．株に変換す
る方法を提供する。
ションプロフィシエント・Ｂ．ｔ．株とコンジュゲーシ
ョンデフィシェント・Ｂ．ｔ．株を接合することを含む
コンジュゲーションデフィシェント・Ｂ．ｔ．株をコン
ジュゲーションプロフィシエント・Ｂ．ｔ．株に変換す
る方法を提供する。
【００１１】別の態様では、本発明はａ）供与体として
のコンジュゲーションプロフィシエント・Ｂ．ｔ．株を
コンジュゲーションデフィシェント・Ｂ．ｔ．株と接合
し、ｂ）所望の宿主株と接合するために供与株としてこ
うして得られたＢ．ｔ．株を使用することを含むコンジ
ュゲーションデフィシェント・Ｂ．ｔ．株からのプラス
ミドを所望の宿主株に転移する方法に関する。
のコンジュゲーションプロフィシエント・Ｂ．ｔ．株を
コンジュゲーションデフィシェント・Ｂ．ｔ．株と接合
し、ｂ）所望の宿主株と接合するために供与株としてこ
うして得られたＢ．ｔ．株を使用することを含むコンジ
ュゲーションデフィシェント・Ｂ．ｔ．株からのプラス
ミドを所望の宿主株に転移する方法に関する。
【００１２】上記ｂ）による接合の後で得られたＢ．
ｔ．株のプラスミド含量をさらに修飾しまたは加えるこ
とが望ましい場合、それは次に、供与体または受容体と
して所望の最終Ｂ．ｔ．株のプラスミドおよび／または
他のゲノム特徴の一部または全部を有する別のＢ．ｔ．
株と接合することができる。
ｔ．株のプラスミド含量をさらに修飾しまたは加えるこ
とが望ましい場合、それは次に、供与体または受容体と
して所望の最終Ｂ．ｔ．株のプラスミドおよび／または
他のゲノム特徴の一部または全部を有する別のＢ．ｔ．
株と接合することができる。
【００１３】接合は、ゴンザレス・ジェイエムおよびカ
ールトン・ビーシー、１９８２年、バチルス・スリンギ
エンシスにおけるプラスミド転移、第８５−９５頁、ジ
ェネティックス・アンド・セルラー・テクノロジー（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ）、Ｌ．Ｐ．ケージ編集、第１巻、ジェネテ
ィック・イクスチェンジ、Ｕ．Ｎ．ストレイプス等編
集、マーセル・デッカー・インコーポレイテッド、ニュ
ーヨークおよびバーゼル、フィッシャー・エイチエム、
１９８３年、プラスミド・ウント・プラスミドウーベル
トラグング・バイ・バチルス・スリンギエンシス、ＰＨ
ＤテシスＥＴＨ第７３７５番、スイス・フェデラル・イ
ンスティテュート・オブ・テクノロジー、ＡＤＡＧアド
ミニストラチオン・ウント・ドルック・アクチエンゲゼ
ルシャフト、第８３頁、アメリカ特許第４，７９７，２
７９号およびヨーロッパ特許第１７８１５１号（本事項
の内容は引用して本明細書に包括させる）に記載される
ような通常の方法で実施する。
ールトン・ビーシー、１９８２年、バチルス・スリンギ
エンシスにおけるプラスミド転移、第８５−９５頁、ジ
ェネティックス・アンド・セルラー・テクノロジー（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ）、Ｌ．Ｐ．ケージ編集、第１巻、ジェネテ
ィック・イクスチェンジ、Ｕ．Ｎ．ストレイプス等編
集、マーセル・デッカー・インコーポレイテッド、ニュ
ーヨークおよびバーゼル、フィッシャー・エイチエム、
１９８３年、プラスミド・ウント・プラスミドウーベル
トラグング・バイ・バチルス・スリンギエンシス、ＰＨ
ＤテシスＥＴＨ第７３７５番、スイス・フェデラル・イ
ンスティテュート・オブ・テクノロジー、ＡＤＡＧアド
ミニストラチオン・ウント・ドルック・アクチエンゲゼ
ルシャフト、第８３頁、アメリカ特許第４，７９７，２
７９号およびヨーロッパ特許第１７８１５１号（本事項
の内容は引用して本明細書に包括させる）に記載される
ような通常の方法で実施する。
【００１４】ｃ−ｐおよびｃ−ｄ株並びに次の受容また
は供与株の選択は、勿論最終生成物の所望の特性により
異なる。
は供与株の選択は、勿論最終生成物の所望の特性により
異なる。
【００１５】スペクトルおよび作用のレベルに関して
は、所望の特異性および作用のレベルを有する殺虫性内
毒素をコード化する遺伝子を有するプラスミドを含む株
を選択する。適当な遺伝子およびそれらを含むＢ．ｔ．
株の検討については、ヘフテおよびホワイトリー、マイ
クロビアル・レビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ）、第５３巻、第２番、第２４２−２５５頁
（１９８９年６月）（本事項の内容は引用して本明細書
に包括させる）参照。
は、所望の特異性および作用のレベルを有する殺虫性内
毒素をコード化する遺伝子を有するプラスミドを含む株
を選択する。適当な遺伝子およびそれらを含むＢ．ｔ．
株の検討については、ヘフテおよびホワイトリー、マイ
クロビアル・レビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ）、第５３巻、第２番、第２４２−２５５頁
（１９８９年６月）（本事項の内容は引用して本明細書
に包括させる）参照。
【００１６】遺伝子の例は、例えばレピドプテラ（Ｌｅ
ｐｉｄｏｐｔｅｒａ）（例えばスプドプテラ・エスピー
ピー（Ｓｐｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、ディプテラ
（Ｄｉｐｔｅｒａ）および／またはコレオプテラ（Ｃｏ
ｌｅｏｐｔｅｒａ）に対する作用を有する内毒素をコー
ド化する遺伝子である。プラスミドはまた、内毒素の作
用を増強することができるような有用な蛋白質をコード
化する遺伝子を含むことができる。
ｐｉｄｏｐｔｅｒａ）（例えばスプドプテラ・エスピー
ピー（Ｓｐｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．））、ディプテラ
（Ｄｉｐｔｅｒａ）および／またはコレオプテラ（Ｃｏ
ｌｅｏｐｔｅｒａ）に対する作用を有する内毒素をコー
ド化する遺伝子である。プラスミドはまた、内毒素の作
用を増強することができるような有用な蛋白質をコード
化する遺伝子を含むことができる。
【００１７】本発明の方法は、例えばｃｒｙＩＣ遺伝子
の、その遺伝子を含まない任意のＢ．ｔ．種への接合転
移を達成するために使用することができる。特に、本発
明の方法の使用は、初めてｃｒｙＩＣ遺伝子を含むＢ．
ｔ．クルスタキ株の製造を提供した。
の、その遺伝子を含まない任意のＢ．ｔ．種への接合転
移を達成するために使用することができる。特に、本発
明の方法の使用は、初めてｃｒｙＩＣ遺伝子を含むＢ．
ｔ．クルスタキ株の製造を提供した。
【００１８】それ故、本発明は、さらにｃｒｙＩＣ遺伝
子を含むＢ．ｔ．クルスタキ株に関する。
子を含むＢ．ｔ．クルスタキ株に関する。
【００１９】本書に使用したＢ．ｔ．クルスタキ株の語
は、鞭毛血清型３ａ３ｂにより特徴づけられるＢ．ｔ．
株を意味する。
は、鞭毛血清型３ａ３ｂにより特徴づけられるＢ．ｔ．
株を意味する。
【００２０】次の限定されない接合実施例では、温度は
セ氏である。本発明による所望の作用を生ずる遺伝子お
よび株の他の組み合わせは、本明細書に記載されたのと
同様または別の方法で構築および使用することができ
る。
セ氏である。本発明による所望の作用を生ずる遺伝子お
よび株の他の組み合わせは、本明細書に記載されたのと
同様または別の方法で構築および使用することができ
る。
【００２１】
実施例１ ａ）Ｂ．ｔ．エントモシダス（ｅｎｔｏｍｏｃｉｄｕ
ｓ）６．１供与株の構築 ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）の接合プラスミドｐＡＭ
β１（エリスロマイシン耐性遺伝子を含む）を含むＢ．
ｔ．クルスタキＨＤ−７３株（アグリカルチュラル・リ
サーチ・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）、ペオ
リア、イリノイ５１６０４から、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ
−４４８８として入手可能）の培養物１ｍｌおよびＢ．
ｔ．エントモシダス６．１（ナショナル・コレクション
・オブ・ミクロオーガニズム・カルチャー（ＣＮＣ
Ｍ）、パリから、受託番号１−６６０として入手可能）
の自然発生ストレプトマイシン耐性突然変異の培養物１
ｍｌ（それぞれ対数増殖相（約５×１０7細胞／ｍｌ）
中）を混合し、０．４５μｍ酢酸セルロースメンブラン
フィルターで濾過する。濾過物をルリア・メディウムプ
レート（蒸留水１リットル中ＬＡ：バクト・アガー１５
ｇ、ディフコ；バクト・トリプトン１０ｇ、ディフコ；
バクト酵母抽出物５ｇ、ディフコ；ＮａＣｌ１０ｇ）に
置き、３０℃で６−２４時間インキュベートする。
ｓ）６．１供与株の構築 ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）の接合プラスミドｐＡＭ
β１（エリスロマイシン耐性遺伝子を含む）を含むＢ．
ｔ．クルスタキＨＤ−７３株（アグリカルチュラル・リ
サーチ・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）、ペオ
リア、イリノイ５１６０４から、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ
−４４８８として入手可能）の培養物１ｍｌおよびＢ．
ｔ．エントモシダス６．１（ナショナル・コレクション
・オブ・ミクロオーガニズム・カルチャー（ＣＮＣ
Ｍ）、パリから、受託番号１−６６０として入手可能）
の自然発生ストレプトマイシン耐性突然変異の培養物１
ｍｌ（それぞれ対数増殖相（約５×１０7細胞／ｍｌ）
中）を混合し、０．４５μｍ酢酸セルロースメンブラン
フィルターで濾過する。濾過物をルリア・メディウムプ
レート（蒸留水１リットル中ＬＡ：バクト・アガー１５
ｇ、ディフコ；バクト・トリプトン１０ｇ、ディフコ；
バクト酵母抽出物５ｇ、ディフコ；ＮａＣｌ１０ｇ）に
置き、３０℃で６−２４時間インキュベートする。
【００２２】濾過物をルリア・ブロス（ＬＢ：アガーな
しで上記と同様）１ｍｌに移し、細胞を激しく撹拌する
ことにより再けんだくする。分割量を、接合完了体を選
択するためにストレプトマイシン１ｍｇ／ｍｌおよびエ
リスロマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＡプレート上に
プレートする。
しで上記と同様）１ｍｌに移し、細胞を激しく撹拌する
ことにより再けんだくする。分割量を、接合完了体を選
択するためにストレプトマイシン１ｍｇ／ｍｌおよびエ
リスロマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＡプレート上に
プレートする。
【００２３】こうして得られた接合完了体を再単離し、
接合完了体クローン中のＢ．ｔ．クルスタキＨＤ−７３
に由来する５０ＭＤａ伝達性プラスミドの存在を、本プ
ラスミドが有するｃｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子に属するＤＮ
Ａ配列のプラスミドパターン分析またはポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）増幅により決定する。ｃｒｙＩＡ
（ｃ）含有接合完了体中のｃｒｙＩＣ遺伝子の存在は、
ｃｒｙＩＣ遺伝子の１部分のＰＣＲ増幅により確かめら
れ、両方の遺伝子を含む接合完了株は、Ｂ．ｔ．エント
モシダス６．１供与株として選択される。５．２および
５．６ＭＤａプラスミドのようなＢ．ｔ．クルスタキＨ
Ｄ−７３からのある種の他のプラスミドもまた、工程中
転移することができることに特に注意しなければならな
い。本実施例で得られ、次の接合で使用されたｃｇ８
９．７．４４株もまたこれらの２種のプラスミドを含
む。
接合完了体クローン中のＢ．ｔ．クルスタキＨＤ−７３
に由来する５０ＭＤａ伝達性プラスミドの存在を、本プ
ラスミドが有するｃｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子に属するＤＮ
Ａ配列のプラスミドパターン分析またはポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）増幅により決定する。ｃｒｙＩＡ
（ｃ）含有接合完了体中のｃｒｙＩＣ遺伝子の存在は、
ｃｒｙＩＣ遺伝子の１部分のＰＣＲ増幅により確かめら
れ、両方の遺伝子を含む接合完了株は、Ｂ．ｔ．エント
モシダス６．１供与株として選択される。５．２および
５．６ＭＤａプラスミドのようなＢ．ｔ．クルスタキＨ
Ｄ−７３からのある種の他のプラスミドもまた、工程中
転移することができることに特に注意しなければならな
い。本実施例で得られ、次の接合で使用されたｃｇ８
９．７．４４株もまたこれらの２種のプラスミドを含
む。
【００２４】ｂ）Ｂ．ｔ．クルスタキ受容株の構築 テトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＢＣ
１６．１（クレフト等、モレキュラー・アンド・ジェネ
ラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）第１６２巻、第５９−６７頁）を、ボーンおよび
エラー（ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レターズ（Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第５８
巻、第１７１−１７８頁（１９８９年））（本事項の内
容は引用して本明細書に包括させる）に記載されたよう
な電気穿孔法を使用して、ＵＳＤＡから入手できるＢ．
ｔ．クルスタキ株［ＨＤ５６２］に導入する。形質転換
した細胞の選択は、テトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを
含むＬＡプレートで行う。１種の上記株はＨＤ５６２
（ｐＢＣ１６．１）と命名する。自然発生または誘導さ
れた抗生物質耐性突然変異体の選択のような受容株を構
築する他の方法もまた使用することができる。
１６．１（クレフト等、モレキュラー・アンド・ジェネ
ラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）第１６２巻、第５９−６７頁）を、ボーンおよび
エラー（ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レターズ（Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第５８
巻、第１７１−１７８頁（１９８９年））（本事項の内
容は引用して本明細書に包括させる）に記載されたよう
な電気穿孔法を使用して、ＵＳＤＡから入手できるＢ．
ｔ．クルスタキ株［ＨＤ５６２］に導入する。形質転換
した細胞の選択は、テトラサイクリン５０μｇ／ｍｌを
含むＬＡプレートで行う。１種の上記株はＨＤ５６２
（ｐＢＣ１６．１）と命名する。自然発生または誘導さ
れた抗生物質耐性突然変異体の選択のような受容株を構
築する他の方法もまた使用することができる。
【００２５】ｃ）Ｂ．ｔ．クルスタキＨＤ５６２におけ
るｃｒｙＩＣの接合転移 ｃｇ８９．７．４４およびＨＤ５６２（ｐＢＣ１６．
１）株の接合を上記最初の部分ａ）に記載されたように
実施する。接合完了株を、エリスロマイシン５０μｇ／
ｍｌおよびテトラサイクリン２５μｇ／ｍｌを含むＬＡ
プレートの濾過物から採取した細胞けんだく液の分割量
をプレートすることにより単離する。これらの条件で成
長することができるクローンは、ｐＢＣ１６．１および
ｐＡＭβ１プラスミドの両方を含む。ｐＢＣ１６．１が
ＨＤ５６２からｃｇ８９．７．４４へ転移する可能性を
覆すために、接合完了クローンをストレプトマイシンを
含むＬＡプレートに転移する。ｃｇ８９．７．４４の唯
一の誘導体が本培地で成長することができ、このスクリ
ーニングはこれらの誤った陽性を除去する。
るｃｒｙＩＣの接合転移 ｃｇ８９．７．４４およびＨＤ５６２（ｐＢＣ１６．
１）株の接合を上記最初の部分ａ）に記載されたように
実施する。接合完了株を、エリスロマイシン５０μｇ／
ｍｌおよびテトラサイクリン２５μｇ／ｍｌを含むＬＡ
プレートの濾過物から採取した細胞けんだく液の分割量
をプレートすることにより単離する。これらの条件で成
長することができるクローンは、ｐＢＣ１６．１および
ｐＡＭβ１プラスミドの両方を含む。ｐＢＣ１６．１が
ＨＤ５６２からｃｇ８９．７．４４へ転移する可能性を
覆すために、接合完了クローンをストレプトマイシンを
含むＬＡプレートに転移する。ｃｇ８９．７．４４の唯
一の誘導体が本培地で成長することができ、このスクリ
ーニングはこれらの誤った陽性を除去する。
【００２６】こうして選択されたエリスロマイシンおよ
びテトラサイクリン耐性ＨＤ５６２誘導体を単離し、ｃ
ｒｙ遺伝子のそれらの含量は、各型のｃｒｙ遺伝子に特
異的なプライマーのセットを使用して、ＰＣＲ増幅によ
り分析する。ｃｒｙＩＣ遺伝子を含むＨＤ５６２誘導体
はこれらの方法により得られ、その全てはプラスミドの
不適合性のためおそらくｃｒｙＩＡ（ｃ）およびｃｒｙ
IIＡ遺伝子を消失する。クローンＣｇ９０６５．２７４
はこれらの誘導体の１種である。
びテトラサイクリン耐性ＨＤ５６２誘導体を単離し、ｃ
ｒｙ遺伝子のそれらの含量は、各型のｃｒｙ遺伝子に特
異的なプライマーのセットを使用して、ＰＣＲ増幅によ
り分析する。ｃｒｙＩＣ遺伝子を含むＨＤ５６２誘導体
はこれらの方法により得られ、その全てはプラスミドの
不適合性のためおそらくｃｒｙＩＡ（ｃ）およびｃｒｙ
IIＡ遺伝子を消失する。クローンＣｇ９０６５．２７４
はこれらの誘導体の１種である。
【００２７】ｄ）ｃｒｙＩＣ含有接合完了体におけるｃ
ｒｙＩＡ（ｃ）の再導入 ｃｒｙＩＡ（ｃ）は遺伝子で、その生成物は広範囲のレ
ピドプテランペストに対して最も活性を有するので、そ
れは例えば第三接合の上記ｃ）と同様に得られたｃｒｙ
ＩＣ含有接合完了体へ再導入される。最初に、接合転移
のための指標として使用するｐＡＭβ１プラスミドを自
然に消失した誘導体は、テトラサイクリンおよびエリス
ロマイシン含有ＬＡプレートで、テトラサイクリン含有
ＬＡプレートで成長する選択されたクローンを無作為に
再画線接種することにより単離する。ｐＡＭβ１プラス
ミドを消失したクローンは、本培地で成長することがで
きず、従って単離する。クローンｃｇ９０６５．２７
４．１は上記クローンの例である。
ｒｙＩＡ（ｃ）の再導入 ｃｒｙＩＡ（ｃ）は遺伝子で、その生成物は広範囲のレ
ピドプテランペストに対して最も活性を有するので、そ
れは例えば第三接合の上記ｃ）と同様に得られたｃｒｙ
ＩＣ含有接合完了体へ再導入される。最初に、接合転移
のための指標として使用するｐＡＭβ１プラスミドを自
然に消失した誘導体は、テトラサイクリンおよびエリス
ロマイシン含有ＬＡプレートで、テトラサイクリン含有
ＬＡプレートで成長する選択されたクローンを無作為に
再画線接種することにより単離する。ｐＡＭβ１プラス
ミドを消失したクローンは、本培地で成長することがで
きず、従って単離する。クローンｃｇ９０６５．２７
４．１は上記クローンの例である。
【００２８】次の段階は、ｃｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子の９
０６５．２７４．１株への再導入を含む。このことは、
ｃｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子を含むＢ．ｔ．クルスタキＨＤ
−７３からの５０ＭＤａプラスミドを転移するために、
受容株ｃｇ９０６５．２７４．１と供与株ｃｇ８９．
７．４４を接合することにより行うことができる。トラ
ンス接合クローンは、再度エリスロマイシンおよびテト
ラサイクリンの両方を含むＬＡプレートで選択され、Ｈ
Ｄ５６２に属していることは、上記に記載したストレプ
トマイシンに対するそれらの感受性により証明される。
接合完了クローンのｃｒｙ遺伝子含量は、各型のｃｒｙ
遺伝子に特異的なプライマーのセットを使用して、ＰＣ
Ｒ増幅により分析する。ｃｒｙＩＡ（ｃ）およびｃｒｙ
ＩＣの両方を含むＨＤ５６２誘導体は、上記の方法で単
離され、そのほとんどは、おそらくｃｒｙＩＡ（ｃ）お
よびｃｒｙＩＡ（ｂ）を有するプラスミドの不適合性の
ため、ｃｒｙＩＡ（ｂ）遺伝子を消失する。
０６５．２７４．１株への再導入を含む。このことは、
ｃｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子を含むＢ．ｔ．クルスタキＨＤ
−７３からの５０ＭＤａプラスミドを転移するために、
受容株ｃｇ９０６５．２７４．１と供与株ｃｇ８９．
７．４４を接合することにより行うことができる。トラ
ンス接合クローンは、再度エリスロマイシンおよびテト
ラサイクリンの両方を含むＬＡプレートで選択され、Ｈ
Ｄ５６２に属していることは、上記に記載したストレプ
トマイシンに対するそれらの感受性により証明される。
接合完了クローンのｃｒｙ遺伝子含量は、各型のｃｒｙ
遺伝子に特異的なプライマーのセットを使用して、ＰＣ
Ｒ増幅により分析する。ｃｒｙＩＡ（ｃ）およびｃｒｙ
ＩＣの両方を含むＨＤ５６２誘導体は、上記の方法で単
離され、そのほとんどは、おそらくｃｒｙＩＡ（ｃ）お
よびｃｒｙＩＡ（ｂ）を有するプラスミドの不適合性の
ため、ｃｒｙＩＡ（ｂ）遺伝子を消失する。
【００２９】すなわち、ｃｒｙ遺伝子を有する全てのプ
ラスミド、さらに正確にはｃｒｙＩＡ（ｂ）遺伝子を有
するプラスミドに適合することが知られているプラスミ
ドでｃｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子を再導入することがさらに
望ましい。ＨＤ５６２株のｃｒｙＩＡ（ｃ）保持５０Ｍ
ＤａプラスミドおよびｃｒｙＩＡ（ｂ）保持プラスミド
は不適合なため、ｃｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子の存在および
ＨＤ７３からの５０ＭＤａプラスミドの複製開始点に含
まれるＤＮＡ配列の欠乏についてＢ．ｔ．単離物をスク
リーンすることが可能である。その配列は、同時に係属
している１９９１年６月２６日出願のアメリカ特許出願
第０７／７３６，６６８号（本事項の内容は引用して本
明細書に包括させる）の論題である。オリゴヌクレオチ
ドプライマーはこれらの配列の検出を可能にするために
設計および合成され、Ｂ．ｔ．株はｃｒｙＩＡ（ｃ）遺
伝子があり、ＨＤ７３の５０ＭＤａプラスミドの複製開
始点に相同な配列がない点で選択することができる。
Ｂ．ｔ．クルスタキ株ＨＤ８９は上記株である。
ラスミド、さらに正確にはｃｒｙＩＡ（ｂ）遺伝子を有
するプラスミドに適合することが知られているプラスミ
ドでｃｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子を再導入することがさらに
望ましい。ＨＤ５６２株のｃｒｙＩＡ（ｃ）保持５０Ｍ
ＤａプラスミドおよびｃｒｙＩＡ（ｂ）保持プラスミド
は不適合なため、ｃｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子の存在および
ＨＤ７３からの５０ＭＤａプラスミドの複製開始点に含
まれるＤＮＡ配列の欠乏についてＢ．ｔ．単離物をスク
リーンすることが可能である。その配列は、同時に係属
している１９９１年６月２６日出願のアメリカ特許出願
第０７／７３６，６６８号（本事項の内容は引用して本
明細書に包括させる）の論題である。オリゴヌクレオチ
ドプライマーはこれらの配列の検出を可能にするために
設計および合成され、Ｂ．ｔ．株はｃｒｙＩＡ（ｃ）遺
伝子があり、ＨＤ７３の５０ＭＤａプラスミドの複製開
始点に相同な配列がない点で選択することができる。
Ｂ．ｔ．クルスタキ株ＨＤ８９は上記株である。
【００３０】ＨＤ８９供与株の構築。これはＢ．ｔ．エ
ントモシダス６．１をＢ．ｔ．クルスタキＨＤ８９に置
き換えて、上記実施例１ａ）と同様に実施することがで
きる。接合完了体のＢ．ｔ．クルスタキＨＤ７３に由来
する５０ＭＤａ伝達性プラスミドの存在は、ＨＤ７３の
５０ＭＤａプラスミドの複製開始点に相同なＤＮＡの配
列のＰＣＲによる増幅により決定される。５０ＭＤａプ
ラスミドの存在は、別法としてプラスミドＤＮＡ抽出物
のアガロースゲル電気泳動により確認することができ
る。ＨＤ８９株の本来のプラスミド補足の完全性もまた
同じ方法で確認される。ｃｇ９１０４３．６７株は上記
の株である。
ントモシダス６．１をＢ．ｔ．クルスタキＨＤ８９に置
き換えて、上記実施例１ａ）と同様に実施することがで
きる。接合完了体のＢ．ｔ．クルスタキＨＤ７３に由来
する５０ＭＤａ伝達性プラスミドの存在は、ＨＤ７３の
５０ＭＤａプラスミドの複製開始点に相同なＤＮＡの配
列のＰＣＲによる増幅により決定される。５０ＭＤａプ
ラスミドの存在は、別法としてプラスミドＤＮＡ抽出物
のアガロースゲル電気泳動により確認することができ
る。ＨＤ８９株の本来のプラスミド補足の完全性もまた
同じ方法で確認される。ｃｇ９１０４３．６７株は上記
の株である。
【００３１】ＨＤ８９からのｃｒｙＩＡ（ｃ）保持プラ
スミドのｃｇ９０６５．２７４への転移による最終株の
構築 ＨＤ８９のｃｒｙＩＡ（ｃ）含有プラスミドの転移は、
受容株ｃｇ９０６５．２７４．１とｃｇ９１０４３．６
７株を接合することにより達成される。これは、上記実
施例１（ｃ）と同様に実施する。ｃｒｙＩＡ（ａ）、ｃ
ｒｙＩＡ（ｂ）、ｃｒｙＩＡ（ｃ）、ｃｒｙＩＣおよび
ｃｒｙIIＡを含むＨＤ５６２誘導体は、この方法で単離
する。ｃｇ９２００４．２４株は上記株である。
スミドのｃｇ９０６５．２７４への転移による最終株の
構築 ＨＤ８９のｃｒｙＩＡ（ｃ）含有プラスミドの転移は、
受容株ｃｇ９０６５．２７４．１とｃｇ９１０４３．６
７株を接合することにより達成される。これは、上記実
施例１（ｃ）と同様に実施する。ｃｒｙＩＡ（ａ）、ｃ
ｒｙＩＡ（ｂ）、ｃｒｙＩＡ（ｃ）、ｃｒｙＩＣおよび
ｃｒｙIIＡを含むＨＤ５６２誘導体は、この方法で単離
する。ｃｇ９２００４．２４株は上記株である。
【００３２】生物学的活性 トランス接合ＨＤ５６２誘導体の有用性は、トリコプル
シア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）およびヘ
リオチス・ゼア（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ）のよう
な感染しやすいレピドプテラン（りんし類）有害生物に
対する作用のそれらの本来のレベルを保持したままの、
スポドプテラ・エキシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅ
ｘｉｇｕａ）のようなスポドプテラ・エスピーピー（Ｓ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ）に対するそれらの改良し
た殺虫作用により示される。
シア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）およびヘ
リオチス・ゼア（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ）のよう
な感染しやすいレピドプテラン（りんし類）有害生物に
対する作用のそれらの本来のレベルを保持したままの、
スポドプテラ・エキシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅ
ｘｉｇｕａ）のようなスポドプテラ・エスピーピー（Ｓ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ）に対するそれらの改良し
た殺虫作用により示される。
【００３３】 株 スポドプテラ・エキシグアに対するＬＣ５０ ｃｇ９２００４．２４ １１４０ ＨＤ５６２ １８９０
【００３４】ＬＣ５０は昆虫ダイエット中の胞子形成し
た培養物のｐｐｍとして示す。
た培養物のｐｐｍとして示す。
【００３５】接合完了体は、従来のＢ．ｔ．による殺虫
剤に対する耐性を取得した昆虫集団の制御のための耐性
管理に特に有効である。
剤に対する耐性を取得した昆虫集団の制御のための耐性
管理に特に有効である。
【００３６】それ故、本発明はまた、本発明の方法によ
り製造されるＢ．ｔ．ハイブリッドの殺虫有効量を、昆
虫またはそれらの生育地に適用することを含む昆虫を駆
除する方法を提供する。さらに、本発明は、ｃｒｙＩＣ
遺伝子を含むＢ．ｔ．クルスタキ株の殺虫有効量を、昆
虫またはそれらの生育地に適用することを含む昆虫を駆
除する方法を提供する。上記Ｂ．ｔ．ハイブリッドは、
殺虫組成物型、例えばけんだく濃縮物型または粉末型で
好便に使用する。上記組成物は、適当な希釈剤、好まし
くはＵＶ保護剤、界面活性剤、乳化剤等のような付加的
な殺虫用に許容される添加物を含む。それらは、既知
Ｂ．ｔ．株含有生物学的殺虫剤にしたがって通常の方法
で製造する。
り製造されるＢ．ｔ．ハイブリッドの殺虫有効量を、昆
虫またはそれらの生育地に適用することを含む昆虫を駆
除する方法を提供する。さらに、本発明は、ｃｒｙＩＣ
遺伝子を含むＢ．ｔ．クルスタキ株の殺虫有効量を、昆
虫またはそれらの生育地に適用することを含む昆虫を駆
除する方法を提供する。上記Ｂ．ｔ．ハイブリッドは、
殺虫組成物型、例えばけんだく濃縮物型または粉末型で
好便に使用する。上記組成物は、適当な希釈剤、好まし
くはＵＶ保護剤、界面活性剤、乳化剤等のような付加的
な殺虫用に許容される添加物を含む。それらは、既知
Ｂ．ｔ．株含有生物学的殺虫剤にしたがって通常の方法
で製造する。
【００３７】本明細書に使用する希釈剤の語は、液体ま
たは固体の農業用に許容される原料を意味し、それら
は、本発明のＢ．ｔ．ハイブリッドに加えて、それらを
容易または良好な適用型にし、それぞれ使用できるまた
は所望の作用強度に活性剤を希釈することができる。
たは固体の農業用に許容される原料を意味し、それら
は、本発明のＢ．ｔ．ハイブリッドに加えて、それらを
容易または良好な適用型にし、それぞれ使用できるまた
は所望の作用強度に活性剤を希釈することができる。
【００３８】上記Ｂ．ｔ．ハイブリッドが接合により得
られると、窒素源（例えば魚肉）、炭水化物源（例えば
スターチ）および鉱物塩を含み約７のｐＨに調整した適
当な栄養培地中で発酵により経済的に再製造／増加させ
得ることが理解される。
られると、窒素源（例えば魚肉）、炭水化物源（例えば
スターチ）および鉱物塩を含み約７のｐＨに調整した適
当な栄養培地中で発酵により経済的に再製造／増加させ
得ることが理解される。
【００３９】上記発酵は２０−４０℃、例えば３０℃の
温度で好便に実施する。適当な発酵時間は、２４−７２
時間、例えば３６時間である。
温度で好便に実施する。適当な発酵時間は、２４−７２
時間、例えば３６時間である。
【００４０】本発明のＢ．ｔ．ハイブリッドの適当なけ
んだく濃縮物は、所望の濃度までの発酵液の蒸発により
得ることができる。添加剤は必要時に加えることができ
る。
んだく濃縮物は、所望の濃度までの発酵液の蒸発により
得ることができる。添加剤は必要時に加えることができ
る。
【００４１】同様に、水和製剤は、所望により乳化剤、
ＵＶ保護剤等を含む発酵液のスプレー乾燥およびこうし
て得られた固体の粉砕化により得ることができる。
ＵＶ保護剤等を含む発酵液のスプレー乾燥およびこうし
て得られた固体の粉砕化により得ることができる。
【００４２】こうして得られた製剤は、希釈剤として栄
養培地の成分の実質的な部分を含む。
養培地の成分の実質的な部分を含む。
【００４３】別法として、発酵液は、栄養培地の大きな
粒子を分離するために遠心にかけ、その後上記記載のよ
うに変換して、適当なけんだく濃縮物または水和製剤に
することができる。適当な製剤は、例えば製剤化生成物
ｍｇまたはｍｌあたり１，０００−４０，０００ＩＵを
含む。
粒子を分離するために遠心にかけ、その後上記記載のよ
うに変換して、適当なけんだく濃縮物または水和製剤に
することができる。適当な製剤は、例えば製剤化生成物
ｍｇまたはｍｌあたり１，０００−４０，０００ＩＵを
含む。
【００４４】可溶性濃縮物 約１．８６％ビート糖蜜、１．４％無油綿実内胚乳粉、
１．７％コーンスティープリカー固体および０．１％炭
酸カルシウムを含む水性栄養培地を形成し、ｐＨを７．
２−７．６の範囲内に調整し、バッチを１２１℃で２０
−３０分間滅菌し、その後その体積の５％のＢ．ｔ．ハ
イブリッドを接種する。培養方法は、約５ｐｉｓｇ背圧
で３０℃のインキュベーション温度での撹拌で実施す
る。ブイヨンを１８−２０℃に冷却し、そのｐＨを濃Ｈ
2ＳＯ4で約５．５に調整する。ブイヨンを１５０メッシ
ュ平方インチを有するスクリーンにとおし、生じるスク
リーンした培養物を不純物部分を除去するために遠心に
かけ、所望の有効性を有する濃縮物体積まで蒸発させ
る。この濃縮物に、乳化剤（例えばイソオクチルフェニ
ルポリオキシエタノール）０．４重量％およびＵＶ吸収
体０．８重量％を加える。
１．７％コーンスティープリカー固体および０．１％炭
酸カルシウムを含む水性栄養培地を形成し、ｐＨを７．
２−７．６の範囲内に調整し、バッチを１２１℃で２０
−３０分間滅菌し、その後その体積の５％のＢ．ｔ．ハ
イブリッドを接種する。培養方法は、約５ｐｉｓｇ背圧
で３０℃のインキュベーション温度での撹拌で実施す
る。ブイヨンを１８−２０℃に冷却し、そのｐＨを濃Ｈ
2ＳＯ4で約５．５に調整する。ブイヨンを１５０メッシ
ュ平方インチを有するスクリーンにとおし、生じるスク
リーンした培養物を不純物部分を除去するために遠心に
かけ、所望の有効性を有する濃縮物体積まで蒸発させ
る。この濃縮物に、乳化剤（例えばイソオクチルフェニ
ルポリオキシエタノール）０．４重量％およびＵＶ吸収
体０．８重量％を加える。
【００４５】水和剤 上記実施例で得られた蒸発した濃縮物をスプレー乾燥さ
せ、こうして得られた工業用濃縮物を１０％シリカおよ
び９０％ダイズ蛋白質を含む「担体混合物」と混合する
（担体混合物の量は、工業用濃縮物の有効性および水和
剤の所望の有効性により異なる）。
せ、こうして得られた工業用濃縮物を１０％シリカおよ
び９０％ダイズ蛋白質を含む「担体混合物」と混合する
（担体混合物の量は、工業用濃縮物の有効性および水和
剤の所望の有効性により異なる）。
【００４６】この本水和剤に乳化剤０．４重量％および
ＵＶ吸収体０．８重量％を加えることができる。
ＵＶ吸収体０．８重量％を加えることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ０１Ｎ 63/00 Ｆ Ｃ１２Ｎ 15/09 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (12)
- 【請求項１】 コンジュゲーションデフィシェント・バ
チルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（以下、Ｂ．ｔ．と略す）株
と、供与体としてのコンジュゲーションプロフィシエン
ト・Ｂ．ｔ．株を接合することを含む、コンジュゲーシ
ョンデフィシェント・Ｂ．ｔ．株をコンジュゲーション
プロフィシエント・Ｂ．ｔ．株に変換する方法。 - 【請求項２】 ａ）コンジュゲーションデフィシェント
・Ｂ．ｔ．株と供与体としてのコンジュゲーションプロ
フィシエント・Ｂ．ｔ．株を接合し、ｂ）こうして得ら
れたＢ．ｔ．株を高い殺虫作用または有益な発酵特性を
有するＢ．ｔ．株のような所望の株と接合するために供
与株として使用することを含むコンジュゲーションデフ
ィシェント・Ｂ．ｔ．株からのプラスミドを所望の宿主
株に転移する方法。 - 【請求項３】 プラスミドが、殺虫性内毒素をコード化
する遺伝子を含む請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 プラスミドが、スポドプテラ・エスピー
ピー（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）に対して殺虫
作用を有する内毒素をコード化する遺伝子を含む請求項
２または３の何れか１項記載の方法。 - 【請求項５】 プラスミドが、ｃｒｙＩＣ遺伝子または
それに相同の遺伝子または同様の殺虫作用およびスペク
トルを有する遺伝子を含む請求項２記載の方法。 - 【請求項６】 プラスミドが、殺虫性結晶蛋白質の作用
を増強させる物質をコード化する遺伝子を含む請求項２
記載の方法。 - 【請求項７】 プラスミドがｃｒｙＩＣ遺伝子を含む請
求項２記載の方法。 - 【請求項８】 ｃｒｙＩＣ遺伝子を含むＢ．ｔ．クルス
タキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）株。 - 【請求項９】 請求項１、２または７の何れか１項に記
載の方法により製造されるＢ．ｔ．株。 - 【請求項１０】 請求項９記載のＢ．ｔ．株の殺虫有効
量を、昆虫またはそれらの生育地に適用することを含む
昆虫を駆除する方法。 - 【請求項１１】 請求項８記載のＢ．ｔ．株の殺虫有効
量を、昆虫またはそれらの生育地に適用することを含む
昆虫を駆除する方法。 - 【請求項１２】 適当な希釈剤と一緒に、請求項８また
は９の何れか１項記載のＢ．ｔ．株を含む殺虫用組成
物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87700892A | 1992-05-01 | 1992-05-01 | |
| US877008 | 1992-05-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07303479A true JPH07303479A (ja) | 1995-11-21 |
Family
ID=25369068
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5103887A Pending JPH07303479A (ja) | 1992-05-01 | 1993-04-30 | 新規微生物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0582541A3 (ja) |
| JP (1) | JPH07303479A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0817856A1 (en) * | 1995-03-22 | 1998-01-14 | Novo Nordisk A/S | Introduction of dna into bacillus strains by conjugation |
| CA2234656C (en) * | 1995-10-13 | 2008-01-08 | Dow Agrosciences Llc | Modified bacillus thuringiensis gene for lepidopteran control in plants |
| CN108893419B (zh) * | 2018-05-24 | 2021-08-03 | 苏州中益世纪生态环境设计研究有限公司 | 微生物菌株及其筛选方法与在处理重金属污染土壤中的应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8526774D0 (en) * | 1985-10-30 | 1985-12-04 | Sandoz Ltd | Bacillus thuringiensis hybrids |
| US5080897A (en) * | 1987-05-08 | 1992-01-14 | Ecogen Inc. | Novel bacillus thuringiensis strains, and related insecticidal compositions |
| US5147640A (en) * | 1988-11-07 | 1992-09-15 | Ecogen Inc. | Strains of bacillus thuringiensis insecticidal compositions containing the same |
| EP0433945A3 (en) * | 1989-12-18 | 1991-10-23 | Sandoz Ltd. | Insecticides produced by transformation of b.t. kurstaki with heterologeous genes |
-
1993
- 1993-04-27 EP EP93810302A patent/EP0582541A3/en not_active Withdrawn
- 1993-04-30 JP JP5103887A patent/JPH07303479A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0582541A3 (en) | 1995-04-19 |
| EP0582541A2 (en) | 1994-02-09 |
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