JPH0730352B2 - 酵素による油脂の精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は酵素による油脂の精製法に関し、さらに詳しく
は油脂にモノグリセライドリパーゼおよび／またはジグ
リセライドリパーゼ（以下これらを総称して部分グリセ
ライドリパーゼという）を作用せしめ、油脂中のトリグ
リセライドに混在するモノグリセライドおよび／または
ジグリセライド（以下これらを総称して部分グリセライ
ドという）を加水分解することを特徴とする油脂の精製
法に関する。

即ち、本発明は油脂に含まれる不純物たる部分グリセラ
イドを分解除去して、高トリグリセライド含量の油脂を
提供することを目的とする。

従来の技術 油脂は、脂肪酸とグリセロールとのエステル、即ちトリ
グリセライドを主成分として含有し、トリグリセライド
以外の成分としては部分グリセライド、遊離脂肪酸およ
び不ケン化物を少量含有している。

油脂に混在する部分グリセライドは、その起源である動
植物並びに微生物の生体内で合成されたもの、油脂の貯
蔵中にそこに含まれるリパーゼの作用若しくは非酵素的
な作用でトリグリセライドが部分加水分解されてきたも
の、或いはエステル交換、脂肪酸とグリセロールからの
油脂の合成などの油脂加工の工程で副産物として生じた
ものなどに由来している。天然の油脂では、特にアブラ
ヤシ（Elaeis guineensis）の果肉より採取されるパー
ム油およびオリーブ（Olea europaea）の果実より採取
されるオリーブ油は水分含量が高いため油脂の採取工程
および貯蔵中に酵素による加水分解を受けやすく、また
コメ油の原料である米糠には強いリパーゼ活性が含まれ
るため、それぞれの油脂は部分グリセライド含量が高
い。

従来油脂中の不純物を除去する方法としては、まず、脂
肪酸の除去を目的としたアルカリ精製、有臭成分やその
他の揮発成分並びに脂肪酸の除去を目的とした真空水蒸
気蒸留、およびガム質、炭水化物、蛋白質などの除去を
目的とした脱ガムが行われており、これらの不純物の除
去は比較的容易である。ところが、トリ，ジおよびモノ
グリセライド相互の分離は、これらの分析のための手
段、即ちケイ酸を用いたカラムクロマトグラフイーや薄
層クロマトグラフイー並びに分子篩効果を利用したゲル
パーミエーシヨンクロマトグラフイーなどの手法が用い
られているすぎない。また、脂肪酸の除去と油脂の構成
トリグリセライドの分別を目的として、トリグリセライ
ドの融点の差を利用した分別結晶、溶剤に対する溶解度
の差を利用した液−液抽出および沸点の差を利用した分
別蒸留並びに分子蒸留が行われているが、これらの方法
ではモノグリセライドは多少除去されるものの、ジグリ
セライドの除去は困難であった。

発明が解決しようとする問題点 上記したクロマトグラフイー法による油脂からの部分グ
リセライドの除去は、実験室的には可能であっても工業
的規模では到底採用されるものではなかった。また、油
脂中の構成トリグリセライドの分別を目的とした前記の
手段では、ジグリセライドはトリグリセライドと共融混
合物を作るためこれらの分離ができなかった。即ち、従
来油脂から工業的に部分グリセライドを除去することが
切望されていたにもかかわらず、その目的に適した方法
が実質的に存在しなかったと言える。

部分グリセライドの混在に油脂に様々の好ましからざる
影響を及ぼす。第一に、部分グリセライドはトリグリセ
ライドの結晶核の生成を妨げる作用があり、例えばパー
ム油中の約２％以上のモノグリセライドの存在はトリグ
リセライドの結晶核の生長を阻害し、また同油中の約13
％のジグリセライドの存在はα型結晶のライフタイムを
著しく長くし、更に、一般に油脂または油脂製品中のジ
グリセライドの存在はトリグリセライドのβ′からβ型
への結晶転移を抑制するとされている（Olaginiaux,2
9,421,1974;Oil Palm News,22,10−18,1977;J.Sci.Food
Agric.,32,1197,1981およびFette Seifen Anstrichm,8
5,64,1983）。

次に、ジグリセライドは、前述のようにトリグリセライ
ドと共融混合物を作り、これらの分離を困難とするだけ
でなく、油脂の固体脂指数を減少させる作用があるた
め、結晶に関与する高融点トリグリセライドの見掛けの
含有量が実際より低下するので固体部の収量が低下し、
そして同時に液体部にも固体部の一部が残存することと
なるので、トリグリセライドの分別が不完全となる。ま
た、部分グリセライドはそれ自身乳化作用を有するため
極性有機溶媒を用いたトリグリセライドの分別結晶にお
いてその効率を低下させる原因となる。

上記トリグリセライドの分別に及ぼす影響の他に、油脂
中での部分グリセライドの存在が問題となる例として、
カカオ代用脂のようにシャープな融点が要求される油脂
製品の場合、部分グリセライドは油脂の融点を不明瞭か
つ幅広いものとする原因物質となる。

問題点を解決するための手段、作用 本発明によれば、油脂に部分グリセライドリパーゼを作
用せしめることにより油脂中に混在する部分グリセライ
ドのみが加水分解され、その結果トリグリセライドから
の分離が容易となる。

本発明で使用される部分グリセライドリパーゼは、グリ
セロールの三つの水酸基のいずれか一つが脂肪酸でエス
テル化されたいわゆるモノグリセライドおよび／または
グリセロールの1,2（または2,3）乃至1,3の位置の水酸
基が脂肪酸でエステル化されたいわゆるジグリセライド
を加水分解する性質を有するが、三つの位置全てが脂肪
酸でエステル化されたトリグリセライドに対する特異性
は全く若しくはほとんど有しない酵素である。部分グリ
セライドばかりでなくトリグリセライドに高い特異性を
有するいわゆるトリグリセライドリパーゼは、トリグリ
セライドをまず速やかに加水分解するため本発明の目的
には使用できない。

本発明で用いられる部分グリセライドリパーゼの例とし
ては、ラット小腸、ブタ脂肪組織などの動物臓器由来の
モノグリセライドリパーゼまたはジグリセライドリパー
ゼ、ペニシリウム（Penicillium）属の糸状菌が産生す
るモノグリセライドおよびジグリセライドに特異性を有
するリパーゼが挙げられる。好ましくはペニシリウム属
菌株由来のリパーゼ、特に好ましくはATCC 34613なる受
託番号でアメリカン タイプ カルチャーコレクシヨン
に寄託されているペニシリウム・サイクロピウム（Peni
cillium cyclopium）の産生する部分グリセライドリパ
ーゼが用いられる。該菌株は当該寄託機関のカタログに
掲載されており、何人も入手可能である。ペニシリウム
・サイクロピウムがトリグリセライドリパーゼと同時に
部分グリセライドリパーゼを産生すること、それ自体は
公知である（J.Biochem.,87,205−211,1980）。しかし
ながら、当該部分グリセライドリパーゼが本発明の目的
に使用できることを示唆する如何なる先行文献も本発明
者らは知らない。

本発明に使用される部分グリセライドリパーゼをペニシ
リウム属の菌株より取得するには、部分グリセライドリ
パーゼを産生する能力を有するペニシリウム属菌株を通
常の微生物の培養に用いられる培地に増殖せしめ、培養
物中に部分グリセライドリパーゼを蓄積せしめ、これよ
り採取することができる。培養物から採取した部分グリ
セライドリパーゼの純化は、公知の精製手段により行う
ことができるが、本発明の目的にはあえて純粋の状態に
まで精製する必要はない。ただし、粗製酵素中にトリグ
リセライドリパーゼが含まれる場合にはそれを除去しな
ければならない。本発明において特に好適に用いられる
ペニシリウム・サイクロピウムATCC 34613株の培養物中
にはトリグリセライドリパーゼが含まれるが、その粗製
酵素液をクロマトグラフイー、特に好ましくはDEAE−セ
フアロースCL−6Bを使用するクロマトグラフイーに付す
ことによってトリグリセライドリパーゼを分離除去する
ことができる。

本発明において精製の対象となる油脂は、天然または合
成の油脂、これらの加工された油脂、並びにそれらを含
む油脂製品である。天然の油脂には、動物の組織、植物
の果実および種子、微生物の培養物などから抽出された
粗原油、並びにこれら粗原油にアルカリ精製、脱ガム、
脱臭などの処理を施した精製油が含まれ、合成の油脂に
は、触媒の存在下脂肪酸とグリセロールから合成された
油脂が含まれ、加工油脂には、油脂に当分野で用いられ
る一般的な加工技術である分別、水素添加、エステル交
換などの処理を施したものが含まれる。より具体的に
は、大豆油、綿実油、パーム油、ヤシ油、オリーブ油、
コメ油、ゴマ油、コーン油、サフラワー油、牛脂、豚
油、魚油などの粗原油およびこれらの精製油、並びにそ
れらを加工した硬化油、エステル交換油、天ぷら油、フ
ライ油、サラダ油、ハードバター、マーガリン、シヨー
トニング、精製ラード、乾性油などが挙げられる。

本発明における油脂と部分グリセライドとの反応の条件
は、用いる部分グリセライドリパーゼの加水分解活性が
発見され得れば如何なる条件でもよい。例えば、反応の
温度は用いる部分グリセライドリパーゼの至適温度およ
び油脂の融点に応じて適切な値を選ぶことができる。通
常20〜55℃が好ましい。反応の時間は、油脂中の部分グ
リセライドが要求される値に低下する時間を選べばよ
い。リパーゼ反応は一般に可逆的であり、反応系の水分
含量が高いときは加水分解反応を、低いときはエステル
合成反応を触媒する。従って本発明では水分の存在は必
須であり、水分含量の高い程好ましいと言えるが、多す
ぎる水分の添加は酵素反応後の油脂の精製に際し水分の
除去が煩わしいだけである。好適な水分含量に油脂に対
して0.5〜10倍（v/w）である。水分の調整には水または
用いる部分グリセライドリパーゼに適したpHの緩衝液が
用いられる。部分グリセライドリパーゼの使用量は、油
脂中に存在する部分グリセライドの量、反応の温度、時
間などに応じて変えることができるが、通常油脂1g当り
0.1〜1,000単位、特に好ましくは１〜100単位である。
本発明では、部分グリセライドリパーゼを不溶性担体に
結合させ、固定化酵素として使用することもできる。固
定化酵素は酵素を反覆または連続して使用できるため好
ましい。

更に本発明では、反応系に有機溶媒を添加することが好
ましい。有機溶媒の添加は、反応系の水分含量を少なく
することができ、また高融点の油脂を溶解し、反応速度
を促進するという効果がある。用いられる有機溶媒は油
脂を溶解するが、部分グリセライドリパーゼの加水分解
活性を阻害しなければ如何なるものでもよい。例えば、
好ましい有機溶媒としてはｎ−ヘキサン、シクロヘキサ
ン、デカン、ウンデカン、ヘキサデカン、テトラデカ
ン、ペンタデカン、石油エーテル、ジエチルエーテル、
アセトン、メチルエチルケトンが挙げられる。有機溶媒
の添加量は油脂に対し0.1〜10倍（v/w）が好ましい。

反応の操作は、油脂と水溶性の酵素は本来親和性を欠く
ため、互いに接触を良くするように物理的条件を整える
ことが望まれる。例えば、撹拌装置のついた反応槽にビ
ーズを入れて反応することにより油脂と部分グリセライ
ドリパーゼの接触面を増大し、反応を速やかに進行させ
ることができる。

本発明従い、部分グリセライドリパーゼにより加水分解
された油脂中の部分グリセライドはグリセロールと遊離
脂肪酸を生成するが、グリセロールは直ちに水層に移行
するため自動的にトリグリセライドより分離され、一方
遊離脂肪酸はそののまま油槽中に残存するが、前述の従
来の油脂の精製手段、即ちアルカリ精製、分別結晶、真
空蒸留、低級アルコールとのエステルの真空蒸留などの
処理により容易にトリグリセライドから分離することが
できる。

以下に試験例および実施例を示して本発明を詳細に説明
する。ただし、油脂の成分の分析および部分グリセライ
ドリパーゼの単位の定義は次のとおりである。

油脂の成分の分析 原料油脂または油脂と部分グリセライドリパーゼとの反
応混合物を石油エーテルに抽出し、その油層成分を調製
用シリカゲル薄層プレート（PLK5、ワットマン社製）に
供し、石油エーテル：ジエチルエーテル：酢酸（80:30:
1、容量比）で展開後、沃素蒸気でスポットを検出し
た。各グリセライドおよび脂肪酸に相当するスポットを
回収し、グリセライドはトリグリセライドリパーゼを使
用した酵素的なグリセライド分析用試薬組成物（商品
名:Triglyceride G-test wako、和光純薬社製）により
測定し、脂肪酸はアシルCoA合成酸素を用いた酵素的な
遊離脂肪酸分析用試薬組成物（商品名:NEFA C-test wak
o、同社製）により測定した。各分子種の割合はモル比
（％）で表示した。

部分グリセライドリパーゼの単位の定義 2.5mM ｐ−ニトロフエニルラウリン酸および2.0％トリ
トンＸ−100を含む50mM酢酸緩衝液（pH5.6）0.95mlと酵
素液0.05mlを混合し、37℃において15分間インキュベー
トした後、アセトン2.0mlを添加して反応を停止する。
次いで、反応で遊離したｐ−ニトロフエノールの量を41
0nmにおける吸光度の強度から求める。部分グリセライ
ドリパーゼの活性は、上記反応において１分間に１マイ
クロモルのｐ−ニトロフエノールを遊離せしめる酵素の
量を１単位とした。

試験例部分グリセライドリパーゼの調製 米糠４％およびコーン・ステイープ・リカー３％より成
る液体培地（pH6.0）にペニシリウム・サイクロピウム
ATCC 34613を接種し、26℃において通気、撹拌下、
２日間培養した。得られた培養液より菌体をろ別した
後、ろ液を限外ろ過により濃縮した。この濃縮液をDEAB
−セフアロースCL−6B（ファルマシア社製）を用いたク
ロマトグラフイーに付し、共存するトリグリセライドリ
パーゼを分離除去し、精製部分グリセライドリパーゼ標
品を得た。この標品はモノグリセライドおよびジグリセ
ライドを加水分解するが、トリグリセライドに対する作
用はほとんど有しないことが確認された。

以下の説明では全てこの部分グリセライドリパーゼを使
用した。

実施例１ 製造ロツトの異なる２種類の未精製のパーム油各々1.0g
と部分グリセライドリパーゼの水溶液1.0ml（20単位）
およびｎ−ヘキサン3.0ml並びに径5mmのガラスビーズ30
個を容量100mlの三角フラスコに入れ、40℃において１
時間振盪（振幅3cm、サイクル140回／分）した。元の２
種類のパーム油にはジグリセライドとモノグリセライド
が各々、計6.48％および13.31％含まれていたが、反応
後は全く検出されなかった（第１表に示す）。同表にお
いて、TG、FA、DGおよびMGはそれぞれトリグリセライ
ド、脂肪酸、ジグリセライドおよびモノグリセライドを
表す（以下同様）。

実施例２ 脂肪酸が除去された精製パーム油製品1.0g、部分グリセ
ライドリパーゼの水溶液0.5ml（20単位）並びに下記第
２表に示す量の水およびｎ−ヘキサンを混合した４種類
反応混合物を調整し、実施例１準じて反応した。元のパ
ーム油にはジグリセライドとモノグリセライドが合計2.
06％含まれていたが、反応終了後は全く検出されなかっ
た（第２表に示す）。

実施例３ 実施例２において、パーム油に代えて脂肪酸が除去され
た精製コメ油製品を用い同じ操作を行った。第３表に示
すように、反応混合物に水とｎ−ヘキサンを適当量添加
することにより、部分グリセライドの含量を顕著に低下
させることができた。

実施例４ 加工ーム油1.0g、部分グリセライドリパーゼの水溶液1.
0ml（10単位）と下記第４表に示す各種の有機溶媒3.0ml
または50mM酢酸緩衝液（pH5.6）2.0mlを混合し、実施例
１に準じて反応した。これら有機溶媒の添加により、低
水分含量でも顕著に部分グリセライドを分解することが
できた（第４表に示す）。

実施例５ 加工した以下の油脂、即ち、パーム油、オリーブ油、コ
メ油、菜種油、ゴマ油および綿実油の各々1.0g、50mM酢
酸緩衝液（pH4.5）5.0mlと下記第５表に示す活性を含む
部分グリセライドリパーゼの水溶液1.0mlを混合し、同
表に示す温度および反応時間、実施例１に準じて操作し
た。反応前後の油脂の組成を第５表に示す。

実施例６ トリグリセライド76.4％、脂肪酸10.3％、1,3-ジグリセ
ライド8.9％、1,2-ジグリセライド2.8％およびモノグリ
セライド1.6％からなる組成の未精製パーム油1,000gと
部分グリセライドリパーゼの水溶液1,000ml（20,000単
位）およびｎ−ヘキサン3,000mlを混合し、撹拌下、40
℃において１時間反応した。反応混合物を静置して油層
と水層を分別した後、得られた油層に20゜Ｂの水酸化
ナトリウム151mlを加え、60℃において撹拌し、生成し
たセツケンの沈澱をろ別した。得られた油状物を減圧蒸
留に付して溶媒を除去し、精製パーム油833gを得た。こ
の油脂の組成は、トリグリセライド99.98％、脂肪酸0.0
2％で、部分グリセライドは検出されなかった。

発明の効果 本発明によれば、トリグリセライドの分解を伴うことな
く、油脂に不純物として混在する部分グリセライドが酵
素によって脂肪酸とグリセロールに加水分解され、その
結果トリグリセライドからの分離が容易となった。本発
明に従って精製された油脂はトリグリセライド含量が高
く、その結晶性、融点等の物理的性質が改善され、高品
質、高付加価値の油脂製品となり得る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】油脂のペニシリウム属由来のモノグリセラ
   イドおよび／またはジグリセライドには作用するがトリ
   グリセライドには実質的に作用しない性質を有するリパ
   ーゼを油脂1g当り0.1〜1,000単位添加し、水分含量を油
   脂に対して0.1〜10倍（v/w）で、必要に応じてｎ−ヘキ
   サン、シクロヘキサン、デカン、ウンデカン、ヘキサデ
   カン、テトラデカン、ペンタデカン、石油エーテル、ジ
   エチルエーテル、アセトン、メチルエチルケトンより選
   ばれる１つ以上の有機溶媒を油脂に対して0.1〜10倍（v
   /w）の存在下に作用せしめ、油脂中に存在するモノグリ
   セライドおよび／またはジグリセライドを加水分解する
   ことを特徴とする酵素による油脂の精製法。
2. 【請求項２】リパーゼがペニシリウム・サイクロピウム
   ATCC34613株の産生するリパーゼである特許請求の範囲
   第１項記載の酵素による油脂の精製法。