JPH0731191B2 - チログロブリンを使用する甲状腺ホルモンの免疫定量法 - Google Patents
チログロブリンを使用する甲状腺ホルモンの免疫定量法Info
- Publication number
- JPH0731191B2 JPH0731191B2 JP62115687A JP11568787A JPH0731191B2 JP H0731191 B2 JPH0731191 B2 JP H0731191B2 JP 62115687 A JP62115687 A JP 62115687A JP 11568787 A JP11568787 A JP 11568787A JP H0731191 B2 JPH0731191 B2 JP H0731191B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- thyroglobulin
- labeled
- amount
- bound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は甲状腺ホルモンT3及び／又はT4の定量的イムノ
アッセイ方法に係る。
アッセイ方法に係る。
甲状腺は首の付け根に位置する内分泌腺であり、２種類
のペプチドホルモン、トリヨードチロニンT3とチロキシ
ンT4を２つのヨウ化チロシン分子の縮合によって合成す
る。該ヨウ化チロシン分子はモノヨードチロシン及びジ
ヨードチロシンである。
のペプチドホルモン、トリヨードチロニンT3とチロキシ
ンT4を２つのヨウ化チロシン分子の縮合によって合成す
る。該ヨウ化チロシン分子はモノヨードチロシン及びジ
ヨードチロシンである。
この合成は、甲状腺タンパク質、チログロブリンから行
なわれる。チログロブリンもまた甲状腺ホルモンの予備
形である。これらホルモンの血管系内放出はタンパク質
分解過程によって行なわれ、これらホルモンは３種類の
血清タンパク質:TBG（チロキシン結合グロブリン）、TB
PA（チロキシン結合プレアルブミン）及びアルブミンに
よって輸送される。血液中には遊離形のホルモンと結合
形のホルモンとが質量作用の法則によって管理される動
的平衡状態で常に共存する。
なわれる。チログロブリンもまた甲状腺ホルモンの予備
形である。これらホルモンの血管系内放出はタンパク質
分解過程によって行なわれ、これらホルモンは３種類の
血清タンパク質:TBG（チロキシン結合グロブリン）、TB
PA（チロキシン結合プレアルブミン）及びアルブミンに
よって輸送される。血液中には遊離形のホルモンと結合
形のホルモンとが質量作用の法則によって管理される動
的平衡状態で常に共存する。
甲状腺ホルモンは脳以外の多くの組織に作用する。例え
ば、大部分の細胞の酸素消費を刺激する、脂肪及びグリ
コシドの代謝調節に関与する、正常な成長過程の進行に
必要である、等の機能をもつ。しかし乍ら、遊離形のホ
ルモンだけが生物学的に活性で細胞に浸透してホルモン
の生理学的作用を発揮することも知られている。
ば、大部分の細胞の酸素消費を刺激する、脂肪及びグリ
コシドの代謝調節に関与する、正常な成長過程の進行に
必要である、等の機能をもつ。しかし乍ら、遊離形のホ
ルモンだけが生物学的に活性で細胞に浸透してホルモン
の生理学的作用を発揮することも知られている。
従って、ホルモンT3及びT4の全濃度だけでなく遊離形の
ホルモンの濃度を定量し得る方法は甲状腺機能亢進又は
甲状腺機能低下の診断に極めて重要である。何故ならT4
及び／又はT3の全量の測定だけでは、輸送タンパク質の
変質によって生じた甲状腺機能亢進又は甲状腺機能低下
について誤診を生じ易いからである。実際、例えば妊娠
のとき、肝臓病のとき及びエストロゲンもしくはアヘン
を服用したとき、結合タンパク質の濃度が増加しT4又は
T3の全量がこれに伴って増加し甲状腺機能亢進と診断さ
れ易いが、遊離形のT3又はT4の量は正常で被検者の甲状
腺も正常である。
ホルモンの濃度を定量し得る方法は甲状腺機能亢進又は
甲状腺機能低下の診断に極めて重要である。何故ならT4
及び／又はT3の全量の測定だけでは、輸送タンパク質の
変質によって生じた甲状腺機能亢進又は甲状腺機能低下
について誤診を生じ易いからである。実際、例えば妊娠
のとき、肝臓病のとき及びエストロゲンもしくはアヘン
を服用したとき、結合タンパク質の濃度が増加しT4又は
T3の全量がこれに伴って増加し甲状腺機能亢進と診断さ
れ易いが、遊離形のT3又はT4の量は正常で被検者の甲状
腺も正常である。
逆に、結合タンパク質の量が減少するとT3又はT4の全量
が減少しこれは甲状腺機能低下と診断され易いが遊離形
のT3又はT4の量は正常である。
が減少しこれは甲状腺機能低下と診断され易いが遊離形
のT3又はT4の量は正常である。
従って、被検者の状態をより十分に診断するためには、
遊離形のT3又はT4の量を測定できるのが好ましい。これ
は直接測定されてもよく又はT3及びT4の全濃度とキャリ
ャータンパク質の飽和指数とから決定されてもよい。
遊離形のT3又はT4の量を測定できるのが好ましい。これ
は直接測定されてもよく又はT3及びT4の全濃度とキャリ
ャータンパク質の飽和指数とから決定されてもよい。
ヒト又は動物中の血清中で検出される甲状腺ホルモンT3
及びT4の量は少ないので高感度の定量方法を使用する必
要がある。
及びT4の量は少ないので高感度の定量方法を使用する必
要がある。
この種の定量に使用される慣用の方法はイムノアッセイ
を用いる方法である。特に、沃素125で標識したT4又はT
3を使用するラジオイムノアッセイが先ず使用された。
より最近には不均質相又は均質相でのエンザイムイムノ
アッセイ方法が開発された。
を用いる方法である。特に、沃素125で標識したT4又はT
3を使用するラジオイムノアッセイが先ず使用された。
より最近には不均質相又は均質相でのエンザイムイムノ
アッセイ方法が開発された。
不均質相方法のうちでは、蛍光偏光、蛍光移動又は酵素
阻害に基づく定量が公知である。これらの定量方法の利
点は全自動化できることであるが精巧な装置を使用する
必要がある。
阻害に基づく定量が公知である。これらの定量方法の利
点は全自動化できることであるが精巧な装置を使用する
必要がある。
不均質相方法のうちでは、遊離形のT3又はT4又は全量を
定量するためにT3又はT4と酵素によって標識された既知
量のT3又はT4と限定数のホルモン特異的抗体部位に対し
て拮抗させる方法が知られている（H.V.Weetall等、Cli
n.Chem.、vol.28、No.4（1982）、666−671ページ:Scha
ll等、Clin.Chem.、1978、24、1801−1804;ALBERT等、E
d.S.B.Pal、1987、153−174ページ）。同じタイプの不
均質相定量として、定量すべきホルモンと固体支持体に
固定された所定量のホルモンとをホルモン特異的標識抗
体の限定数の活性部位に対して拮抗させる方法もある
（Masao Ito等、Clin.Chem.、30/10、1682−1685（198
4）及びGnemmi等、Enzyme Labelled Immunoassay of Ho
rmone and Drugs、1978、Walter de Gruyter et Co.、B
erlin−New−York）。
定量するためにT3又はT4と酵素によって標識された既知
量のT3又はT4と限定数のホルモン特異的抗体部位に対し
て拮抗させる方法が知られている（H.V.Weetall等、Cli
n.Chem.、vol.28、No.4（1982）、666−671ページ:Scha
ll等、Clin.Chem.、1978、24、1801−1804;ALBERT等、E
d.S.B.Pal、1987、153−174ページ）。同じタイプの不
均質相定量として、定量すべきホルモンと固体支持体に
固定された所定量のホルモンとをホルモン特異的標識抗
体の限定数の活性部位に対して拮抗させる方法もある
（Masao Ito等、Clin.Chem.、30/10、1682−1685（198
4）及びGnemmi等、Enzyme Labelled Immunoassay of Ho
rmone and Drugs、1978、Walter de Gruyter et Co.、B
erlin−New−York）。
しかし乍らこれらの２種類の不均質相定量方法をホルモ
ンT3及びT4に使用するのは難しい。何故ならこれらホル
モンが一般に固体支持体に固定されると抗原活性を喪失
し、巨大分子に結合すると生物活性及び／又は抗原活性
を喪失するからである。更に、遊離形のT3及び／又はT4
の定量のためにかかる方法を使用するとき、標識T3分子
及び／又は標識T4分子がホルモンT3及びT4の輸送タンパ
ク質によって認識されないことが必要である。
ンT3及びT4に使用するのは難しい。何故ならこれらホル
モンが一般に固体支持体に固定されると抗原活性を喪失
し、巨大分子に結合すると生物活性及び／又は抗原活性
を喪失するからである。更に、遊離形のT3及び／又はT4
の定量のためにかかる方法を使用するとき、標識T3分子
及び／又は標識T4分子がホルモンT3及びT4の輸送タンパ
ク質によって認識されないことが必要である。
これに反して、ホルモンT3又はT4を粉末に化学結合する
ことによって定量を行なうこともできるが、この場合に
は定量を行なうために洗浄の問題が生じる。
ことによって定量を行なうこともできるが、この場合に
は定量を行なうために洗浄の問題が生じる。
発明の要旨 本発明の目的は、上記問題を解決し得る甲状腺ホルモン
T3及び／又はT4のイムノアッセイ方法を提供することで
ある。
T3及び／又はT4のイムノアッセイ方法を提供することで
ある。
本発明によれば、反応媒体中に遊離形で存在する、即ち
キャリヤータンパク質に結合していないチロキシンT4及
び／又はトリヨードチロニンT3のイムノアッセイ方法で
あって、定量すべきT3及び／又はT4を限定量で存在する
抗T3抗体及び／又は抗T4抗体の部位に対してチログロブ
リンと拮抗させ、次に抗T3抗体及び／又は抗T4抗体に結
合したチログロブリンの量を測定するか又は抗T3抗体及
び／又は抗T4抗体に結合しなかったチログロブリンの量
を測定することを特徴とする方法が提供される。
キャリヤータンパク質に結合していないチロキシンT4及
び／又はトリヨードチロニンT3のイムノアッセイ方法で
あって、定量すべきT3及び／又はT4を限定量で存在する
抗T3抗体及び／又は抗T4抗体の部位に対してチログロブ
リンと拮抗させ、次に抗T3抗体及び／又は抗T4抗体に結
合したチログロブリンの量を測定するか又は抗T3抗体及
び／又は抗T4抗体に結合しなかったチログロブリンの量
を測定することを特徴とする方法が提供される。
本文中の以後の記載において、T3及びT4に対して用いら
れる「遊離形」なる用語は、キャリャータンパク質に結
合していないT3及びT4を意味する。これは遊離T3又はT4
の定量にも有効でありまた文献で公知のごときT3又はT4
の全量の定量にも有効である。
れる「遊離形」なる用語は、キャリャータンパク質に結
合していないT3及びT4を意味する。これは遊離T3又はT4
の定量にも有効でありまた文献で公知のごときT3又はT4
の全量の定量にも有効である。
従って本発明方法では、抗体部位に対する拮抗反応のコ
ンペティターとしてチログロブリンを使用する。これに
より多くの利点が得られる。何故ならチログロブリンは
固相に固定されるか又は標識分子又は原子に結合するこ
とができしかもそのような結合を行なっても抗T3抗体及
び抗T4抗体によって認識され得るからである。更に、定
量がホルモンT3及びT4の輸送タンパク質によって妨害さ
れない。これは、コンペティターとして標識ホルモンT3
及び／又はT4は標識抗体の代わりにチログロブリンを使
用するからである。
ンペティターとしてチログロブリンを使用する。これに
より多くの利点が得られる。何故ならチログロブリンは
固相に固定されるか又は標識分子又は原子に結合するこ
とができしかもそのような結合を行なっても抗T3抗体及
び抗T4抗体によって認識され得るからである。更に、定
量がホルモンT3及びT4の輸送タンパク質によって妨害さ
れない。これは、コンペティターとして標識ホルモンT3
及び／又はT4は標識抗体の代わりにチログロブリンを使
用するからである。
チログロブリンは、ホルモンT3及びT4の合成出発物質で
あり、したがってこれらのホルモンの配列を内含する複
雑な構造のグリコタンパク質である。しかしながら、こ
の複雑な構造中でこれらの配列がホルモンT3又はT4に特
異的な抗体によって認識されると想定することはできな
かった。実際、C.Marriq等によりEur.J.Biochem.,111,3
3−47（1980）に発表されたようなチログロブリンの構
造に関する従来の研究によって判明していたことは、こ
の構造中にはホルモンT3及びT4の生成部位が複数個存在
することと、ホルモンT3の生合成はこの分子の極めて限
られた領域でしか起こらないホルモンT4の生合成はそれ
より多くの部位で起こり得ることだけである。さらに、
上記論文によると、このような部位はチログロブリンの
３次元構造の変化により利用されなくなる可能性があ
る。そこで、これら従来の研究結果に鑑みて、チログロ
ブリンは抗T3抗体又はT4抗体に対して（少なくとも、イ
ムノアッセイに使用できるほど充分な）反応性を有する
とは考えられていなかった。
あり、したがってこれらのホルモンの配列を内含する複
雑な構造のグリコタンパク質である。しかしながら、こ
の複雑な構造中でこれらの配列がホルモンT3又はT4に特
異的な抗体によって認識されると想定することはできな
かった。実際、C.Marriq等によりEur.J.Biochem.,111,3
3−47（1980）に発表されたようなチログロブリンの構
造に関する従来の研究によって判明していたことは、こ
の構造中にはホルモンT3及びT4の生成部位が複数個存在
することと、ホルモンT3の生合成はこの分子の極めて限
られた領域でしか起こらないホルモンT4の生合成はそれ
より多くの部位で起こり得ることだけである。さらに、
上記論文によると、このような部位はチログロブリンの
３次元構造の変化により利用されなくなる可能性があ
る。そこで、これら従来の研究結果に鑑みて、チログロ
ブリンは抗T3抗体又はT4抗体に対して（少なくとも、イ
ムノアッセイに使用できるほど充分な）反応性を有する
とは考えられていなかった。
しかしながら、本発明者等は、これに反して、抗T3抗体
又は抗T4抗体に対するT3又はT4のコンペティターとして
チログロブリンを利用できることを見出して本発明に到
達した。
又は抗T4抗体に対するT3又はT4のコンペティターとして
チログロブリンを利用できることを見出して本発明に到
達した。
本発明の方法においては、種々の動物種に由来のチログ
ロブリン、例えばウシのチログロブリン又はブタのチロ
グロブリンを使用し得る。
ロブリン、例えばウシのチログロブリン又はブタのチロ
グロブリンを使用し得る。
更に、種々の形態のチログロブリン、例えばモノマー状
態、天然状態、変性状態、重合状態又は水解状態のチロ
グロブリンを使用し得る。
態、天然状態、変性状態、重合状態又は水解状態のチロ
グロブリンを使用し得る。
本発明方法は、生物サンプルのT4又はT2の全濃度又は該
サンプルの遊離T4又はT3の濃度を測定するために使用さ
れ得る。何故なら前記のごとく本発明の定量方法によっ
て遊離T3及び／又はT4を測定し得るからである。しかし
乍ら、サンプルのT4又はT3の全濃度を測定したいとき
は、サンプルのキャリャータンパク質に結合されたホル
モンT3及び/T4を遊離するためにサンプルを処理する。
この処理ではT3及び／又はT4とキャリヤータンパク質と
の結合インヒビターを添加する。このインヒビターは例
えばサリチル酸、メルチオレート又は8-アニリノ‐1-ナ
フタリンスルホン酸（ANS）である。この処理によって
サンプルを本発明の定量に直接使用し得る。
サンプルの遊離T4又はT3の濃度を測定するために使用さ
れ得る。何故なら前記のごとく本発明の定量方法によっ
て遊離T3及び／又はT4を測定し得るからである。しかし
乍ら、サンプルのT4又はT3の全濃度を測定したいとき
は、サンプルのキャリャータンパク質に結合されたホル
モンT3及び/T4を遊離するためにサンプルを処理する。
この処理ではT3及び／又はT4とキャリヤータンパク質と
の結合インヒビターを添加する。このインヒビターは例
えばサリチル酸、メルチオレート又は8-アニリノ‐1-ナ
フタリンスルホン酸（ANS）である。この処理によって
サンプルを本発明の定量に直接使用し得る。
また本文の以下の記載中T3及び／又はT4の定量なる用語
は、T3及び／又はT4の全濃度の定量と遊離形のT3及び／
又はT4の定量との双方を意味する。
は、T3及び／又はT4の全濃度の定量と遊離形のT3及び／
又はT4の定量との双方を意味する。
本発明方法を実施するためには、先ず限定量で存在する
抗T3抗体及び／又は抗T4抗体の部位に対して定量すべき
T3及び／又はT4とチログロブリンとの拮抗反応を行な
う。この反応の終わりに、抗体に結合したチログロブリ
ンと抗体に結合したT3及び／又はT4と遊離チログロブリ
ンと遊離T3及び／又はT4とが得られる。抗体に結合した
チログロブリンの量はサンプル中に存在するT4及び／又
はT3の量に依存し、この結合チログロブリンの量はT4及
び／又はT3の量の増加に伴って減少する。従ってサンプ
ル中に存在するT4及び／又はT3の量を定量するために
は、抗体に結合したチログロブリンの量を測定するか又
は遊離形のチログロブリンの量を測定する。
抗T3抗体及び／又は抗T4抗体の部位に対して定量すべき
T3及び／又はT4とチログロブリンとの拮抗反応を行な
う。この反応の終わりに、抗体に結合したチログロブリ
ンと抗体に結合したT3及び／又はT4と遊離チログロブリ
ンと遊離T3及び／又はT4とが得られる。抗体に結合した
チログロブリンの量はサンプル中に存在するT4及び／又
はT3の量に依存し、この結合チログロブリンの量はT4及
び／又はT3の量の増加に伴って減少する。従ってサンプ
ル中に存在するT4及び／又はT3の量を定量するために
は、抗体に結合したチログロブリンの量を測定するか又
は遊離形のチログロブリンの量を測定する。
上記の測定はイムノアッセイに使用される従来の定量方
法で行なわれる。この方法では、拮抗反応に使用される
化合物の１つ例えばこの場合チログロブリン又は抗T3抗
体及び／又は抗T4抗体を標識するか、又は、抗体結合チ
ログロブリン又は遊離チログロブリンに結合し得る付加
的標識化合物を使用する。
法で行なわれる。この方法では、拮抗反応に使用される
化合物の１つ例えばこの場合チログロブリン又は抗T3抗
体及び／又は抗T4抗体を標識するか、又は、抗体結合チ
ログロブリン又は遊離チログロブリンに結合し得る付加
的標識化合物を使用する。
一般的に、これら付加的化合物は、抗T3及び／又は抗T4
抗体を産生した種のガンマグロブリンの特異的標識抗
体、又は標識抗チログロブリン、又は抗T3抗体及び／又
は抗T4抗体から構成される。また標識化合物とタンパク
質とを含む系、例えばビオチニル化した抗T3抗体及び／
又は抗T4抗体の定量でも使用されるアビジン標識ビオチ
ニル化抗体系を付加化合物として使用することも可能で
ある。この定量において、チログロブリンあるいは種々
の抗体の標識化は従来の方法により行なわれる。
抗体を産生した種のガンマグロブリンの特異的標識抗
体、又は標識抗チログロブリン、又は抗T3抗体及び／又
は抗T4抗体から構成される。また標識化合物とタンパク
質とを含む系、例えばビオチニル化した抗T3抗体及び／
又は抗T4抗体の定量でも使用されるアビジン標識ビオチ
ニル化抗体系を付加化合物として使用することも可能で
ある。この定量において、チログロブリンあるいは種々
の抗体の標識化は従来の方法により行なわれる。
本文の以下の記載中、チログロブリン又は種々のタイプ
の抗体に使用される「標識」なる用語は、例えば放射性
物質、蛍光物質、発光物質、酵素、蛍光発色団、吸光発
色団、ビオチン等の標記物質でチログロブリン又は抗体
が修飾されることを意味する。
の抗体に使用される「標識」なる用語は、例えば放射性
物質、蛍光物質、発光物質、酵素、蛍光発色団、吸光発
色団、ビオチン等の標記物質でチログロブリン又は抗体
が修飾されることを意味する。
抗体に結合したチログロブリン又は遊離形のチログロブ
リンの量を容易に測定するためには、抗体結合チログロ
ブリンと遊離チログロブリンとを分離し得る従来の不均
質相定量方法を使用し得る。
リンの量を容易に測定するためには、抗体結合チログロ
ブリンと遊離チログロブリンとを分離し得る従来の不均
質相定量方法を使用し得る。
しかし乍らまた、かかる分離を含まない均質相の定量方
法の使用も可能である。
法の使用も可能である。
不均質相定量を行なうとき、チログロブリン又は抗T3抗
体及び／又は抗T4抗体が固定された固相を使用する。
体及び／又は抗T4抗体が固定された固相を使用する。
使用可能な固相には、種々のタイプがあり、例えば、ポ
リマー又はその他の材料から成る管、球又はフィン状の
マクロ固相（肉眼で認識し得る）を使用し得る。
リマー又はその他の材料から成る管、球又はフィン状の
マクロ固相（肉眼で認識し得る）を使用し得る。
使用可能なポリマーは、例えば、ポリスチレン、ポリア
ミド、ポリプロピレン、ポリオキシメチレン及びスチレ
ンコポリマーである。
ミド、ポリプロピレン、ポリオキシメチレン及びスチレ
ンコポリマーである。
また、チログロブリン又は抗T3抗体又は抗T4抗体を含有
する微細ミクロ固相、例えばポリマー、タンパク質又は
その他の材料から成る粉末、集塊の使用も可能である。
かかる相は物理化学的方法又は免疫的方法によって不溶
化されたチログロブリン又は抗T3抗体又は抗T4抗体から
構成されてもよい。これらミクロ固相は例えば、反応媒
体中に沈澱物を形成することによって得られる。沈澱物
は、定量に使用される抗T3抗体及び／又は抗T4抗体と同
じ種に由来する抗IgG抗体及びIgG抗体の格子から成る。
この格子は、チログロブリン−抗T3、チログロブリン−
抗T4、T3−抗T3及び／又はT4−抗T4の複合体を保持し得
る。この格子は例えば、抗T3抗体及び／又は抗T4抗体が
ウサギに由来するとき、ウサギ抗IgG及びウサギIgGヒツ
ジ抗血清から形成される。
する微細ミクロ固相、例えばポリマー、タンパク質又は
その他の材料から成る粉末、集塊の使用も可能である。
かかる相は物理化学的方法又は免疫的方法によって不溶
化されたチログロブリン又は抗T3抗体又は抗T4抗体から
構成されてもよい。これらミクロ固相は例えば、反応媒
体中に沈澱物を形成することによって得られる。沈澱物
は、定量に使用される抗T3抗体及び／又は抗T4抗体と同
じ種に由来する抗IgG抗体及びIgG抗体の格子から成る。
この格子は、チログロブリン−抗T3、チログロブリン−
抗T4、T3−抗T3及び／又はT4−抗T4の複合体を保持し得
る。この格子は例えば、抗T3抗体及び／又は抗T4抗体が
ウサギに由来するとき、ウサギ抗IgG及びウサギIgGヒツ
ジ抗血清から形成される。
微細固相を使用する場合、従来技術により拮抗反応を行
なった液体媒体から例えば遠心によって固相を分離し得
る。
なった液体媒体から例えば遠心によって固相を分離し得
る。
これに反して、管、球又はフィンのタイプの固相を使用
する場合、特にこれらの固相が反応を生じる管中に固定
されているときは分離工程がより簡単である。
する場合、特にこれらの固相が反応を生じる管中に固定
されているときは分離工程がより簡単である。
好ましい実施態様の説明 不均質相における本発明の定量方法の種々の実施態様を
以下に説明する。
以下に説明する。
I.固相に固定されたチログロブリンによる不均質相定量 この定量を行なうために、一般には、チログロブリンの
溶液例えばウシのチログブリン又はブタのチログロブリ
ンの溶液を使用して前記の固相にチログロブリンを固定
する。所望量のチログロブリンを固定するために種々の
温度で１時間から１晩の範囲の十分な時間にわたり前記
チログロブリン溶液と固相との接触を維持する。この量
は、特に接触時間と使用温度とに左右される。
溶液例えばウシのチログブリン又はブタのチログロブリ
ンの溶液を使用して前記の固相にチログロブリンを固定
する。所望量のチログロブリンを固定するために種々の
温度で１時間から１晩の範囲の十分な時間にわたり前記
チログロブリン溶液と固相との接触を維持する。この量
は、特に接触時間と使用温度とに左右される。
チログロブリンを固相に固定し、このような固相を使用
してトリヨードチロニンとチロキシンとを別々に定量す
ることも可能であり同時に定量することも可能である。
してトリヨードチロニンとチロキシンとを別々に定量す
ることも可能であり同時に定量することも可能である。
チロキシンT4だけを定量するためには、定量すべきチロ
キシンT4を含有するサンプルを固定チログロブリン及び
限定量の抗T4抗体と接触させ、次に固定チログロブリン
に結合した抗T4抗体の量を測定する。
キシンT4を含有するサンプルを固定チログロブリン及び
限定量の抗T4抗体と接触させ、次に固定チログロブリン
に結合した抗T4抗体の量を測定する。
トリヨードチロニンT3だけを定量するためには、定量す
べきトリヨードチロニンT3を含有するサンプルを固定チ
ログロブリンと限定量の抗T3抗体とに接触させ、次に固
定チログロブリンに結合した抗T3抗体の量を測定する。
べきトリヨードチロニンT3を含有するサンプルを固定チ
ログロブリンと限定量の抗T3抗体とに接触させ、次に固
定チログロブリンに結合した抗T3抗体の量を測定する。
双方の場合に、標識モノクローナル又はポリクローナル
の抗T4抗体又は抗T3抗体又はその断片を抗体として使用
することによって固定チログロブリンに結合した抗T4抗
体及び／又は抗T3抗体の量を容易に測定し得る。
の抗T4抗体又は抗T3抗体又はその断片を抗体として使用
することによって固定チログロブリンに結合した抗T4抗
体及び／又は抗T3抗体の量を容易に測定し得る。
好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼの如き酵素を
ラベルとして使用し得る。該酵素は使用抗体に容易に結
合でき、その酵素活性は簡単な比色法によって好条件で
測定できる。
ラベルとして使用し得る。該酵素は使用抗体に容易に結
合でき、その酵素活性は簡単な比色法によって好条件で
測定できる。
また、例えばβ−ガラクトシダーゼ又はアルカリホスフ
ァイターゼの如き別の酵素の使用も可能である。
ァイターゼの如き別の酵素の使用も可能である。
上記の両方の定量において、固定チログロブリンに結合
した抗T3抗体又は抗T4抗体の量、又は抗T3抗体及び／又
は抗T4抗体に結合しないチログロブリンの量を検出する
ために第２抗体を使用することも可能である。
した抗T3抗体又は抗T4抗体の量、又は抗T3抗体及び／又
は抗T4抗体に結合しないチログロブリンの量を検出する
ために第２抗体を使用することも可能である。
この場合、抗T3抗体又は抗T4抗体は第１抗体を構成し、
第１抗体又はチログロブリンに結合し得る標識第２抗体
が使用される。例えば、第２抗体は未反応のチログロブ
リンのT3部位又はT4部位に結合し得る標識抗T3又は抗T4
でもよい。
第１抗体又はチログロブリンに結合し得る標識第２抗体
が使用される。例えば、第２抗体は未反応のチログロブ
リンのT3部位又はT4部位に結合し得る標識抗T3又は抗T4
でもよい。
この方法によれば、抗T3抗体又は抗T4抗体を標識するた
めに該抗体を化学的に修飾する必要がないのでT3又はT4
と抗T3抗体又は抗T4抗体との反応が妨害されない。
めに該抗体を化学的に修飾する必要がないのでT3又はT4
と抗T3抗体又は抗T4抗体との反応が妨害されない。
しかし乍ら、蛍光ラベルの使用に適した変形例によれ
ば、米国特許第4174384号に記載の方法を使用し蛍光反
応の消滅によってチログロブリンに結合した抗体の量を
検出するために第１抗体を蛍光発色団で標識し第２抗体
を吸光発色団で標識する。
ば、米国特許第4174384号に記載の方法を使用し蛍光反
応の消滅によってチログロブリンに結合した抗体の量を
検出するために第１抗体を蛍光発色団で標識し第２抗体
を吸光発色団で標識する。
チロキシンT4とトリヨードチロニンT3とを同時に定量す
るためには、T3とT4とを含有する定量すべきサンプルを
チログロブリンと限定量の抗T3抗体及び抗T4抗体とに接
触させ、次にチログロブリンに結合した抗T3抗体の量と
チログロブリンに結合した抗T4抗体の量とを測定する。
るためには、T3とT4とを含有する定量すべきサンプルを
チログロブリンと限定量の抗T3抗体及び抗T4抗体とに接
触させ、次にチログロブリンに結合した抗T3抗体の量と
チログロブリンに結合した抗T4抗体の量とを測定する。
この場合、前記同様に標識抗T3抗体と標識抗T4抗体とを
使用し得るが、これらを異なる原子及び／又は分子によ
って標識することが必要である。
使用し得るが、これらを異なる原子及び／又は分子によ
って標識することが必要である。
例えば、抗T3抗体はβ−ガラクトシダーゼで標識し抗T4
抗体をアルカリホスファイターゼで標識してもよく、又
はその逆にしてもよい。これはC.Blake等、「Clinical
Chemistry」、vol.28、no.7（1982）、1469−1973ペー
ジに記載されている。
抗体をアルカリホスファイターゼで標識してもよく、又
はその逆にしてもよい。これはC.Blake等、「Clinical
Chemistry」、vol.28、no.7（1982）、1469−1973ペー
ジに記載されている。
この後者の定量では、第２グループの標識抗体を使用す
ることによってチログロブリンに結合した抗T3抗体及び
抗T4抗体の量を検出し得る。この場合、限定量で導入さ
れる抗T3抗体及び抗T4抗体は夫々、第１及び第２抗体を
構成し、第１の抗T3抗体に特異的に結合し得る標識第３
抗体と第２の抗T4抗体に結合し得る標識第４抗体とを使
用する。第３抗体と第４抗体は異なる標識がされてい
る。
ることによってチログロブリンに結合した抗T3抗体及び
抗T4抗体の量を検出し得る。この場合、限定量で導入さ
れる抗T3抗体及び抗T4抗体は夫々、第１及び第２抗体を
構成し、第１の抗T3抗体に特異的に結合し得る標識第３
抗体と第２の抗T4抗体に結合し得る標識第４抗体とを使
用する。第３抗体と第４抗体は異なる標識がされてい
る。
この場合、使用されるラベルは特に酵素、例えばβ−ガ
ラクトシダーゼとアルカリホスファターゼとの組み合わ
せである。
ラクトシダーゼとアルカリホスファターゼとの組み合わ
せである。
II.固相に固定された抗体による不均質相定量 この定量では、抗体を前記のごとくポリマー又は別の材
料のマクロ相又はミクロ相から構成され得る固相に固定
し、固定された抗体を利用してトリヨードチロニン及び
チロキシンを別々に又は同時に定量する。
料のマクロ相又はミクロ相から構成され得る固相に固定
し、固定された抗体を利用してトリヨードチロニン及び
チロキシンを別々に又は同時に定量する。
この場合には、定量方法は同じであるが、抗T3抗体及び
／又は抗T4抗体に結合したチログロブリンの量を測定で
きるようにチログロブリンの別の反応部位に特異的に結
合し得る第２グループの標識第２抗体を使用するか又は
標識チログロブリンを使用するのが好ましい。
／又は抗T4抗体に結合したチログロブリンの量を測定で
きるようにチログロブリンの別の反応部位に特異的に結
合し得る第２グループの標識第２抗体を使用するか又は
標識チログロブリンを使用するのが好ましい。
第２グループの抗体を使用するとき、該抗体はチログロ
ブリンの別の反応部位に特異的に結合し得る標識抗T3抗
体及び／又は標識抗T4抗体から構成され得る。
ブリンの別の反応部位に特異的に結合し得る標識抗T3抗
体及び／又は標識抗T4抗体から構成され得る。
チロキシンT4の定量的イムノアッセイに使用される第１
の場合、定量すべきチロキシンを、チログロブリンと固
相に固定された限定量の抗T4抗体と標識抗T3抗体及び／
又は抗T4抗体とに接触させ、次にチログロブリンを介し
て固体支持体に結合した標識抗T3及び／又は抗T4抗体の
量を測定する。
の場合、定量すべきチロキシンを、チログロブリンと固
相に固定された限定量の抗T4抗体と標識抗T3抗体及び／
又は抗T4抗体とに接触させ、次にチログロブリンを介し
て固体支持体に結合した標識抗T3及び／又は抗T4抗体の
量を測定する。
トリヨードチロニンT3の定量的イムノアッセイに使用さ
れる第２の場合、定量すべきトリヨードチロニンを、チ
ログロブリンと固相に固定された限定量の抗T3抗体と標
識抗T3抗体及び／又は抗T4抗体とに接触させ、次にチロ
グロブリンを介して固体支持体に結合した標識抗T4及び
／又は抗T3抗体の量を測定する。
れる第２の場合、定量すべきトリヨードチロニンを、チ
ログロブリンと固相に固定された限定量の抗T3抗体と標
識抗T3抗体及び／又は抗T4抗体とに接触させ、次にチロ
グロブリンを介して固体支持体に結合した標識抗T4及び
／又は抗T3抗体の量を測定する。
標識チログロブリンを使用する場合、チロキシンT4（又
はトリヨードチロニンT3）を含有する定量すべき液体サ
ンプルを標識チログロブリンと固体支持体に固定された
抗T4抗体（又は抗T3抗体）とに接触させ、次に前記支持
体に結合した標識チログロブリンの量を測定する。
はトリヨードチロニンT3）を含有する定量すべき液体サ
ンプルを標識チログロブリンと固体支持体に固定された
抗T4抗体（又は抗T3抗体）とに接触させ、次に前記支持
体に結合した標識チログロブリンの量を測定する。
好ましくは、直接チログロブリンに結合するか又は抗チ
ログロブリン抗体を介してチログロブリンに結合し得る
酵素によって標識されたチログロブリンを使用する。即
ち後者の場合チログロブリン−抗チログロブリン抗体−
酵素の複合化合物である。
ログロブリン抗体を介してチログロブリンに結合し得る
酵素によって標識されたチログロブリンを使用する。即
ち後者の場合チログロブリン−抗チログロブリン抗体−
酵素の複合化合物である。
上記の２つのタイプの不均質定量は、従来の装置特に内
部に固相を内蔵する管を用いて行なわれる。固相は管自
体の壁を形成してもよく又は例えばフィンデバイスの形
状で管に挿入されてもよい。後者については1983年６月
９日出願のC.E.A.の欧州特許出願公開第0097573号に記
載されている。
部に固相を内蔵する管を用いて行なわれる。固相は管自
体の壁を形成してもよく又は例えばフィンデバイスの形
状で管に挿入されてもよい。後者については1983年６月
９日出願のC.E.A.の欧州特許出願公開第0097573号に記
載されている。
これらの定量のためには、先ずチログロブリン（又は抗
T3抗体及び／又は抗T4抗体）を固相に固定し、次に定量
すべき液体サンプルと抗T3及び／又は抗T4抗体（又はチ
ログロブリン）とを管に導入する。
T3抗体及び／又は抗T4抗体）を固相に固定し、次に定量
すべき液体サンプルと抗T3及び／又は抗T4抗体（又はチ
ログロブリン）とを管に導入する。
サンプル中に存在するT3及び／又はT4とチログロブリン
とは抗体部位に対して拮抗し、所定の割合の抗体が固定
チログロブリンに結合する（又はチログロブリンの一部
が固定抗体に結合する）。この処理後、液相を管から除
去し、固相を洗浄し、固相に結合した抗体の量（又は固
相に結合したチログロブリンの量）を測定する。このた
めには、前記の如き従来の検出方法を使用してもよく又
は標識抗T3抗体及び／又は抗T4抗体（又は標識チログロ
ブリン）を使用してもよく又は第２グループの標識抗体
を使用してもよい。
とは抗体部位に対して拮抗し、所定の割合の抗体が固定
チログロブリンに結合する（又はチログロブリンの一部
が固定抗体に結合する）。この処理後、液相を管から除
去し、固相を洗浄し、固相に結合した抗体の量（又は固
相に結合したチログロブリンの量）を測定する。このた
めには、前記の如き従来の検出方法を使用してもよく又
は標識抗T3抗体及び／又は抗T4抗体（又は標識チログロ
ブリン）を使用してもよく又は第２グループの標識抗体
を使用してもよい。
第２グループの標識抗体を使用する場合、該抗体は拮抗
反応中に添加されてもよく又は固相の洗浄処理後に添加
されてもよい。
反応中に添加されてもよく又は固相の洗浄処理後に添加
されてもよい。
各タイプの定量について、標準検量曲線を作成するため
に既知量のT3及び／又はT4を含有するサンプルを処理し
次にこの標準検量曲線と比較することによってサンプル
のT3及び／又はT4の濃度を測定する。
に既知量のT3及び／又はT4を含有するサンプルを処理し
次にこの標準検量曲線と比較することによってサンプル
のT3及び／又はT4の濃度を測定する。
本発明は目的はまた、１種類だけの抗体を使用したチロ
キシンT4の不均質相定量用キットを提供することであ
る。
キシンT4の不均質相定量用キットを提供することであ
る。
本発明のキットは、 一同条件でチログロブリンで被覆された固相を各々が収
容した一連の管と、 −チロキシンT4の標準サンプルを収容した一連のフラス
コと、 −標準抗T4抗体を収容したフラスコとを含む。
容した一連の管と、 −チロキシンT4の標準サンプルを収容した一連のフラス
コと、 −標準抗T4抗体を収容したフラスコとを含む。
好ましくは、標識抗T4抗体が抗T4モノクローナル抗体と
西洋ワサビペルオキシダーゼの如き酵素との複合化合物
から形成される。
西洋ワサビペルオキシダーゼの如き酵素との複合化合物
から形成される。
この場合、キットは更に、 −酵素検出用色素原を収容した少なくとも１つのフラス
コと、 −酵素検出用基質バッファを収容したフラスコと、 −酵素反応を停止させ得る酸を収容したフラスコとを含
む。
コと、 −酵素検出用基質バッファを収容したフラスコと、 −酵素反応を停止させ得る酸を収容したフラスコとを含
む。
酵素検出に使用される色素原はo-フェニレンジアミン‐
ビス‐塩酸塩であり酵素反応を停止させる酸はシュウ酸
である。
ビス‐塩酸塩であり酵素反応を停止させる酸はシュウ酸
である。
この種のキットの構成の一例を以下に示す。
−チログロブリンが結合したフィン型の固相を含む64個
のELSA管と、 −西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したモノクローナ
ル抗T4抗体の複合化合物を収容した２つのフラスコと、 −０〜50pg/mlの範囲の凍結乾燥T4の標準サンプルを収
容した５つのフラスコと、 −凍結乾燥T4を含むコントロール血清を入れた２つのフ
ラスコと、 −生理食塩水溶媒中に32mgのオルトフェニレンジアミン
−2HClを含有する凍結乾燥色素原を入れた２つのフラス
コと、 −0.02％のH2O2と防腐剤とを含む32mlの基質バッファを
入れた１つのフラスコと、 −各々が3.15gの粉末シュウ酸を収容した２つのサッシ
ェ。
のELSA管と、 −西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したモノクローナ
ル抗T4抗体の複合化合物を収容した２つのフラスコと、 −０〜50pg/mlの範囲の凍結乾燥T4の標準サンプルを収
容した５つのフラスコと、 −凍結乾燥T4を含むコントロール血清を入れた２つのフ
ラスコと、 −生理食塩水溶媒中に32mgのオルトフェニレンジアミン
−2HClを含有する凍結乾燥色素原を入れた２つのフラス
コと、 −0.02％のH2O2と防腐剤とを含む32mlの基質バッファを
入れた１つのフラスコと、 −各々が3.15gの粉末シュウ酸を収容した２つのサッシ
ェ。
トリヨードチロニンT3の定量に関しても同じ成分を使用
して同じタイプのキットを製造し得る。但し、標識抗T4
抗体に代えて標識抗T3抗体を使用する。該抗体はまた抗
T3抗体と酵素との複合化合物でもよい。
して同じタイプのキットを製造し得る。但し、標識抗T4
抗体に代えて標識抗T3抗体を使用する。該抗体はまた抗
T3抗体と酵素との複合化合物でもよい。
III.均質相定量 本発明によれば、定量すべきT3又はT4とチログロブリン
との間の同じ拮抗反応を利用して均質相でチロキシン又
はトリヨードチロニンを定量することも可能である。こ
の場合には例えば異なる３種類の処理方法を使用し得
る。
との間の同じ拮抗反応を利用して均質相でチロキシン又
はトリヨードチロニンを定量することも可能である。こ
の場合には例えば異なる３種類の処理方法を使用し得
る。
第１の処理方法では、チログロブリンと結合したときに
酵素活性が低いという特性をもつマレイン酸デヒドロゲ
ナーゼの如き酵素によって標識されたチログロブリンを
使用する。逆に、チログロブリン−マレイン酸デヒドロ
ゲナーゼ複合体に抗T4抗体が結合すると初期活性の一部
が回復する。その結果、定量すべきサンプル中に存在す
るT4又はT3の量の関数として酵素活性が減少するので均
質相の定量を行なうことができる。このチログロブリン
−マレイン酸デヒドロゲナーゼ複合化合物を使用する場
合、抗T4（又は抗T3）抗体を、定量すべきホルモンT4
（又はT3）と酵素活性を測定し得る基質（マレイン酸）
とを含有するサンプルに接触させる。次に反応混合物中
でNADHの出現に対応する340nmで測定することによって
一定時間の反応速度を直接測定する。
酵素活性が低いという特性をもつマレイン酸デヒドロゲ
ナーゼの如き酵素によって標識されたチログロブリンを
使用する。逆に、チログロブリン−マレイン酸デヒドロ
ゲナーゼ複合体に抗T4抗体が結合すると初期活性の一部
が回復する。その結果、定量すべきサンプル中に存在す
るT4又はT3の量の関数として酵素活性が減少するので均
質相の定量を行なうことができる。このチログロブリン
−マレイン酸デヒドロゲナーゼ複合化合物を使用する場
合、抗T4（又は抗T3）抗体を、定量すべきホルモンT4
（又はT3）と酵素活性を測定し得る基質（マレイン酸）
とを含有するサンプルに接触させる。次に反応混合物中
でNADHの出現に対応する340nmで測定することによって
一定時間の反応速度を直接測定する。
第２の処理方法では、抗T4抗体（又は抗T3抗体）に結合
しないときにアセチルコリンエステラーゼを非可逆的に
阻害するホスホネートに結合したチログロブリンを使用
する。この場合、定量すべきサンプルを、ホスホネート
に結合したチログロブリンと限定量の抗T4（又は抗T3）
抗体とに接触させる。その結果、チログロブリン−ホス
ホネート−抗T4複合体の一部が分散しチログロブリン−
ホスホネートは阻害作用を発揮する。ここでヨウ化アセ
チルβ−（メチルチオコリン）を基質として使用し415n
mで読取りを行なうことによってアセチルコリンエステ
ラーゼの阻害された量を比色法によって検出すると抗T4
（抗T3）抗体に結合したチログロブリン−ホスホネート
の量が測定できる。
しないときにアセチルコリンエステラーゼを非可逆的に
阻害するホスホネートに結合したチログロブリンを使用
する。この場合、定量すべきサンプルを、ホスホネート
に結合したチログロブリンと限定量の抗T4（又は抗T3）
抗体とに接触させる。その結果、チログロブリン−ホス
ホネート−抗T4複合体の一部が分散しチログロブリン−
ホスホネートは阻害作用を発揮する。ここでヨウ化アセ
チルβ−（メチルチオコリン）を基質として使用し415n
mで読取りを行なうことによってアセチルコリンエステ
ラーゼの阻害された量を比色法によって検出すると抗T4
（抗T3）抗体に結合したチログロブリン−ホスホネート
の量が測定できる。
第３の処理方法では、フルオレセインの如き蛍光色素に
結合したチログロブリンを使用する。該蛍光色素の蛍光
は化合物が対応抗体に結合すると増加する。この場合、
定量すべきサンプルを、フルオレセイン標識チログロブ
リンと抗T4（又は抗T3）抗体とに接触させ、次に反応混
合物中の蛍光の偏光を測定する。この偏光はチログロブ
リン−フルオロセイン化合物に結合した定量すべきT4
（又はT3）の量に反比例する。
結合したチログロブリンを使用する。該蛍光色素の蛍光
は化合物が対応抗体に結合すると増加する。この場合、
定量すべきサンプルを、フルオレセイン標識チログロブ
リンと抗T4（又は抗T3）抗体とに接触させ、次に反応混
合物中の蛍光の偏光を測定する。この偏光はチログロブ
リン−フルオロセイン化合物に結合した定量すべきT4
（又はT3）の量に反比例する。
本発明の目的はまた、特に抗T3及び／又は抗T4抗体を精
製すべく使用され得る固体支持体に抗T3及び／又は抗T4
抗体を固定する方法を提供することである。
製すべく使用され得る固体支持体に抗T3及び／又は抗T4
抗体を固定する方法を提供することである。
本発明によれば、固体支持体に抗T4及び／又は抗T3抗体
固定する方法は、先ず該支持体にチログロブリンを固定
し、次にチログロブリンが固定した支持体を前記抗T3抗
体及び／又は抗T4抗体の溶液と接触させる。
固定する方法は、先ず該支持体にチログロブリンを固定
し、次にチログロブリンが固定した支持体を前記抗T3抗
体及び／又は抗T4抗体の溶液と接触させる。
かかる固体支持体はまた、抗T3抗体及び／又は抗T4抗体
を精製するために使用できる。実際、これら抗体を単離
するためにはこれら抗体を含有する溶液をチログロブリ
ンが固定された支持体と接触させるだけでよい。次に支
持体と適当な溶液例えば塩酸、グリシン、尿素又はNaSC
Nの溶液とを接触させることによって結合抗体を回収し
得る。
を精製するために使用できる。実際、これら抗体を単離
するためにはこれら抗体を含有する溶液をチログロブリ
ンが固定された支持体と接触させるだけでよい。次に支
持体と適当な溶液例えば塩酸、グリシン、尿素又はNaSC
Nの溶液とを接触させることによって結合抗体を回収し
得る。
本発明方法で使用される抗T3抗体及び抗T4抗体はポリク
ローナル抗体でもよく又はモノクローナル抗体でもよ
い。
ローナル抗体でもよく又はモノクローナル抗体でもよ
い。
ポリクローナル抗体は例えば、カルボジイミド法によっ
て調製されたウシ血清アルブミンとT3又はT4との複合化
合物を用いヒツジ又はウサギを高度免疫することによっ
て得られる。
て調製されたウシ血清アルブミンとT3又はT4との複合化
合物を用いヒツジ又はウサギを高度免疫することによっ
て得られる。
C.R.Soc.Biol.Paris、164、296−301、1970に記載のSte
inbuch等の方法を用いカプリル酸で沈澱させることによ
って抗血清から免疫グロブリンを回収する。次にW.Knap
p、K.Holubar、G.Wick（Eds.）、Elsevier/North Holla
nd Biomedical Press、1978、215−224ページに記載のW
ilson M.B.及びNakane P.K.の過ヨウ素酸ナトリウム法
を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼの如き酵素によっ
てポリクローナル抗体を標識する。
inbuch等の方法を用いカプリル酸で沈澱させることによ
って抗血清から免疫グロブリンを回収する。次にW.Knap
p、K.Holubar、G.Wick（Eds.）、Elsevier/North Holla
nd Biomedical Press、1978、215−224ページに記載のW
ilson M.B.及びNakane P.K.の過ヨウ素酸ナトリウム法
を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼの如き酵素によっ
てポリクローナル抗体を標識する。
また精製IgGに対してペプシン消化及び２−メルカプト
エチルアミンによる還元を順次行なって抗血清の免疫グ
ロブリンのFab′画分を調製することも可能である。こ
のように調製されたFab′画分を次に、Ishikawa等、J.I
mmunoassay、1983、4/3に記載のマレイミド方法を使用
して西洋ワサビペルオキシダーゼの如き酵素によって標
識し得る。
エチルアミンによる還元を順次行なって抗血清の免疫グ
ロブリンのFab′画分を調製することも可能である。こ
のように調製されたFab′画分を次に、Ishikawa等、J.I
mmunoassay、1983、4/3に記載のマレイミド方法を使用
して西洋ワサビペルオキシダーゼの如き酵素によって標
識し得る。
モノクローナル抗体を使用する場合、該有モノクローナ
ル抗体は、Nature、256、495-497ページ、1975に記載の
Kohler G.及びMilstein C.方法によって調製できる。こ
の方法は主としてマウス又は別の適当な動物にチロキシ
ン又はトリヨードチロニンを例えばT3又はT4−ウシ血清
アルブミン複合化合物の形態で注射する。次にマウスを
殺し、脾臓細胞を採取しこれをミエローマ細胞と融合さ
せる。この結果、所謂「ハイブリドーマ」なるハイブリ
ッド細胞が調製されin vitroで複製される。ハイブリド
ーマの集団を選択し操作して個々のクローンを単離す
る。このクローンの各々は注射されたチロキシン又はト
リヨードチロニンに対して単一種の抗体を産生する。
ル抗体は、Nature、256、495-497ページ、1975に記載の
Kohler G.及びMilstein C.方法によって調製できる。こ
の方法は主としてマウス又は別の適当な動物にチロキシ
ン又はトリヨードチロニンを例えばT3又はT4−ウシ血清
アルブミン複合化合物の形態で注射する。次にマウスを
殺し、脾臓細胞を採取しこれをミエローマ細胞と融合さ
せる。この結果、所謂「ハイブリドーマ」なるハイブリ
ッド細胞が調製されin vitroで複製される。ハイブリド
ーマの集団を選択し操作して個々のクローンを単離す
る。このクローンの各々は注射されたチロキシン又はト
リヨードチロニンに対して単一種の抗体を産生する。
本発明の別の特徴及び利点は、添付図面に基づいた非限
定的代表実施例に関する以下の記載より明らかにされる
であろう。
定的代表実施例に関する以下の記載より明らかにされる
であろう。
実施例 実施例1:全チロキシンT4の定量 1.反応体の調製 （ａ）チログロブリンを含有する固体支持体の調製 「Proceedings of the Society for Experimental Biol
ogy and Medicine」、29（1931-32）に記載の方法で甲
状腺から産生又は精製されたウシ又はブタのチログロブ
リンを使用する。これを5mg/mlの割合で燐酸ナトリウム
バッファ（0.1mol-1;pH7.2）に溶解し−20℃で保存す
る。固体支持体は表面積2.5cm2の５枚羽根プロペラの形
状のポリアミドフィンデバイスから形成される。これを
C.E.A.の欧州特許EP−A0097573に記載のごとき平板管に
入れる。
ogy and Medicine」、29（1931-32）に記載の方法で甲
状腺から産生又は精製されたウシ又はブタのチログロブ
リンを使用する。これを5mg/mlの割合で燐酸ナトリウム
バッファ（0.1mol-1;pH7.2）に溶解し−20℃で保存す
る。固体支持体は表面積2.5cm2の５枚羽根プロペラの形
状のポリアミドフィンデバイスから形成される。これを
C.E.A.の欧州特許EP−A0097573に記載のごとき平板管に
入れる。
チログロブリンを固定するためには、先ず同じ燐酸バッ
ファ溶液で希釈して濃度0.025mg/mlのチログロブリン溶
液を調製し、この溶液を管に充填する。室温で１晩維持
し溶液を除去してフィンデバイスを同じ燐酸バッファ
（0.1mol/l;pH7.2）で数回洗浄し、この同じバッファ中
に４℃で保存する。
ファ溶液で希釈して濃度0.025mg/mlのチログロブリン溶
液を調製し、この溶液を管に充填する。室温で１晩維持
し溶液を除去してフィンデバイスを同じ燐酸バッファ
（0.1mol/l;pH7.2）で数回洗浄し、この同じバッファ中
に４℃で保存する。
ウシ又はブタのチログロブリンを使用する場合、フィン
に固定される量は２μｇである。
に固定される量は２μｇである。
（ｂ）西洋ワサビペルオキシダーゼによって形成された
酵素に結合した抗T4抗体の調製 先ずチロキシンのカルボキシル基及び／又はアミン基と
ウシ血清アルブミンのアミン基及び／又はカルボキシル
基との間でカルボジイミドによる触媒反応によって免疫
チロキシン−ウシ血清アルブミン（BSA）の複合化合物
を調製する。
酵素に結合した抗T4抗体の調製 先ずチロキシンのカルボキシル基及び／又はアミン基と
ウシ血清アルブミンのアミン基及び／又はカルボキシル
基との間でカルボジイミドによる触媒反応によって免疫
チロキシン−ウシ血清アルブミン（BSA）の複合化合物
を調製する。
このために、0.01mol/lのNaOH20mlに20mgのT4を溶解
し、10％ジメチルホルムアミドを添加する。次にこの溶
液と40mgのウシ血清アルブミンとを混合する。溶解後、
80mgの1-エチル‐３（3-ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミドを添加し、0.5NのHClでpH8.5に調整する。混
合物を室温で10〜12時間インキュベートし、140mmol/l
のNaCl溶液に１晩透析する。この結果、チロキシン／ウ
シ血清アルブミン複合化合物が得られる。これを凍結乾
燥し−20℃で保存する。
し、10％ジメチルホルムアミドを添加する。次にこの溶
液と40mgのウシ血清アルブミンとを混合する。溶解後、
80mgの1-エチル‐３（3-ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミドを添加し、0.5NのHClでpH8.5に調整する。混
合物を室温で10〜12時間インキュベートし、140mmol/l
のNaCl溶液に１晩透析する。この結果、チロキシン／ウ
シ血清アルブミン複合化合物が得られる。これを凍結乾
燥し−20℃で保存する。
この複合化合物1mgをフロインド完全アジュバントに乳
濁させてからヒツジに皮内注射してヒツジを免疫する。
この注射を毎月１回ずつ８か月間繰り返し、頚静脈穿刺
によって採血する。ラジオイムノアッセイによって抗血
清力価を測定する。この力価はT4I125トレーサーの活性
の50％と結合し得る最終希釈として定義される。力価1/
50000でアフィニティ定数５×10-9mol-1の抗血清が得ら
れる。
濁させてからヒツジに皮内注射してヒツジを免疫する。
この注射を毎月１回ずつ８か月間繰り返し、頚静脈穿刺
によって採血する。ラジオイムノアッセイによって抗血
清力価を測定する。この力価はT4I125トレーサーの活性
の50％と結合し得る最終希釈として定義される。力価1/
50000でアフィニティ定数５×10-9mol-1の抗血清が得ら
れる。
Steinbuch及びAudran、Archives of Biochemistry and
Biophysics、1979、134、279-284のカプリル酸方法によ
って抗T4ヒツジ血清から免疫グロブリンIgG濃縮画分を
調製する。
Biophysics、1979、134、279-284のカプリル酸方法によ
って抗T4ヒツジ血清から免疫グロブリンIgG濃縮画分を
調製する。
10mlの血清に20mlの酢酸ナトリウムバッファ（0.06mol/
l;pH4）と0.68mlのカプリル酸（純度96％）とを添加す
る。カプリル酸は撹拌を維持し乍ら滴下される。室温で
30分間撹拌を維持し、混合物を10000gで10分間遠心す
る。IgGを含有する上清を紙で過し、燐酸ナトリウム
バッファ（17.5mmol/l;pH6.5）に４℃で１晩透析する。
これにより400mgのIgGを回収し、燐酸ナトリウムバッフ
ァ（17.5mmol/l;pH6.5）で平衡したセルロースカラムに
通して精製する。回収されたIgG画分の純度をヒツジの
抗タンパク質ウサギ免疫血清に対する電気泳動によって
測定する。この結果純度90％以上の精製IgGが得られ
る。
l;pH4）と0.68mlのカプリル酸（純度96％）とを添加す
る。カプリル酸は撹拌を維持し乍ら滴下される。室温で
30分間撹拌を維持し、混合物を10000gで10分間遠心す
る。IgGを含有する上清を紙で過し、燐酸ナトリウム
バッファ（17.5mmol/l;pH6.5）に４℃で１晩透析する。
これにより400mgのIgGを回収し、燐酸ナトリウムバッフ
ァ（17.5mmol/l;pH6.5）で平衡したセルロースカラムに
通して精製する。回収されたIgG画分の純度をヒツジの
抗タンパク質ウサギ免疫血清に対する電気泳動によって
測定する。この結果純度90％以上の精製IgGが得られ
る。
W.Knapp、K.Holubar及びG.Wick（Eds）、Immunofluores
cence and related staining technics Elseviet/North
Holland Biomedical Press、1978、215-224ページに記
載のM.B.Wilson及びP.K.Nakaneの過ヨウ素酸ナトリウム
法によってこのIgG画分から抗T4西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ複合化合物を調製する。
cence and related staining technics Elseviet/North
Holland Biomedical Press、1978、215-224ページに記
載のM.B.Wilson及びP.K.Nakaneの過ヨウ素酸ナトリウム
法によってこのIgG画分から抗T4西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ複合化合物を調製する。
結合反応後、NaBH4で還元し、複合化合物を硫酸アンモ
ニウム（NH4）2SO4で沈澱させアリコート画分を１％ウ
シ血清アルブミンと共に−20℃で保存する。
ニウム（NH4）2SO4で沈澱させアリコート画分を１％ウ
シ血清アルブミンと共に−20℃で保存する。
使用のときは１％ウシ血清アルブミンとANS（0.04％）
とを燐酸バッファ（0.1mol/l;pH7.2）中に含有する混合
物で西洋ワサビペルオキダーゼで標識した抗T4IgGを希
釈する。
とを燐酸バッファ（0.1mol/l;pH7.2）中に含有する混合
物で西洋ワサビペルオキダーゼで標識した抗T4IgGを希
釈する。
（ｃ）標準サンプルの調製 標準サンプルを調製するために、濃度1mg/mlのチロキシ
ンT4を0.01Nの炭酸ナトリウムに溶解した。次にサンプ
ルを希釈し所望濃度にした。この希釈のためには、100m
g/mlの活性炭で４℃で１晩処理し２回遠心して0.22μの
篩で過してT4を除去したヒト血清プールを使用した。
ンT4を0.01Nの炭酸ナトリウムに溶解した。次にサンプ
ルを希釈し所望濃度にした。この希釈のためには、100m
g/mlの活性炭で４℃で１晩処理し２回遠心して0.22μの
篩で過してT4を除去したヒト血清プールを使用した。
2.定量的エンザイムイムノアッセイ（全T4） ブタのチログロブリンで被覆されたフィンデバイスを各
々が内蔵する平底管に、夫々がT4濃度0;25;50;125;250
μg/l及び20mg/dl（ブランク）の標識サンプルを10又は
20μｌ導入した。次に前記希釈剤で20μg/mlに希釈した
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗T4IgG0.5mlを各管に
導入した。室温で１時間インキュベートし、各管に存在
する液相を吸引し、フィンデバイスを0.05％Tween20を
含有する蒸留水で２回洗浄した。次に5.5mmol/lの酸素
添加水と3g/lのビシクロ塩酸オルトフェニレンジアミン
（最終pH5±0.1）とを含有する燐酸クエン酸ナトリウム
バッファ（0.1mol/l;pH5.5）から成る0.5mlの基質溶液
を添加し、管を室温で暗中に30分間維持することによっ
てフィンに結合した酵素活性を測定した。ここで１〜2m
lの1NのHClを添加して反応を停止させ、492nmで吸光度
を測定した。
々が内蔵する平底管に、夫々がT4濃度0;25;50;125;250
μg/l及び20mg/dl（ブランク）の標識サンプルを10又は
20μｌ導入した。次に前記希釈剤で20μg/mlに希釈した
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗T4IgG0.5mlを各管に
導入した。室温で１時間インキュベートし、各管に存在
する液相を吸引し、フィンデバイスを0.05％Tween20を
含有する蒸留水で２回洗浄した。次に5.5mmol/lの酸素
添加水と3g/lのビシクロ塩酸オルトフェニレンジアミン
（最終pH5±0.1）とを含有する燐酸クエン酸ナトリウム
バッファ（0.1mol/l;pH5.5）から成る0.5mlの基質溶液
を添加し、管を室温で暗中に30分間維持することによっ
てフィンに結合した酵素活性を測定した。ここで１〜2m
lの1NのHClを添加して反応を停止させ、492nmで吸光度
を測定した。
得られた結果を第１図に示す。第１図は492nmの吸光度
をサンプルのT4濃度の関数として示し、定量の標準検量
曲線に対応する。この曲線を用いて定量すべきサンプル
のT4濃度を測定し得る。
をサンプルのT4濃度の関数として示し、定量の標準検量
曲線に対応する。この曲線を用いて定量すべきサンプル
のT4濃度を測定し得る。
この実施例では、種々の濃度のブタ又はウシのチログロ
ブリンをもつフィンデバイスを用い、T4が0ng/mlの標準
サンプルに対して同様の処理を行なうことによって定量
を最適化した。これらの種々の濃度は、前記の1.（ａ）
と同じ処理モードでフィンデバイスを調製するときに固
定溶液中で種々の濃度のチログロブリンを使用すること
によって得られる。
ブリンをもつフィンデバイスを用い、T4が0ng/mlの標準
サンプルに対して同様の処理を行なうことによって定量
を最適化した。これらの種々の濃度は、前記の1.（ａ）
と同じ処理モードでフィンデバイスを調製するときに固
定溶液中で種々の濃度のチログロブリンを使用すること
によって得られる。
得られた結果を第２図に示す。第２図は、492nmでの吸
光度を固体支持体調製に使用された溶液のチログロブリ
ン濃度（μg/ml）の関数として示す。曲線１はウシのチ
ログロブリンによっ得られた結果を示し、曲線２はブタ
のチログロブリンによっ得られた結果を示す。
光度を固体支持体調製に使用された溶液のチログロブリ
ン濃度（μg/ml）の関数として示す。曲線１はウシのチ
ログロブリンによっ得られた結果を示し、曲線２はブタ
のチログロブリンによっ得られた結果を示す。
この図より、両方の場合に0.01mg/mlに近い濃度で吸収
プラトーが得られることが理解されよう。
プラトーが得られることが理解されよう。
第２図の結果は、ブタのチログロブリンはウシのチログ
ロブリンよりも抗T4抗体との結合能力が高いことを示
す。
ロブリンよりも抗T4抗体との結合能力が高いことを示
す。
標準サンプルでT4の代わりにウシのチログロブリン又は
ブタのチログロブリンを使用することによって処理する
と、これらの２種類のチログロブリンのチロキシンT4の
反応当量を算出し得る。ウシのチログロブリンは5mgの
チログロブリンに対して700ngのT4を含有しておりこれ
はチログロブリン１モル当たりT40.14モルに相当する。
ブタのチログロブリンを使用することによって処理する
と、これらの２種類のチログロブリンのチロキシンT4の
反応当量を算出し得る。ウシのチログロブリンは5mgの
チログロブリンに対して700ngのT4を含有しておりこれ
はチログロブリン１モル当たりT40.14モルに相当する。
ブタのチログロブリンの場合、チログロブリン１モル当
たり0.6モル当量のT4を含有している。
たり0.6モル当量のT4を含有している。
実施例2:全トリヨードチロニンT3の定量 この実施例では、サンプルのトリヨードチロニン濃度を
測定するために実施例１と同様に処理するが、抗T3抗体
として西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗T3IgG
を使用する。これは、西洋ワサビペルオキシダーゼに結
合した抗T4IgGと同様にして得られた。
測定するために実施例１と同様に処理するが、抗T3抗体
として西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗T3IgG
を使用する。これは、西洋ワサビペルオキシダーゼに結
合した抗T4IgGと同様にして得られた。
この固体支持体は0.1mg/mlのウシチログロブリンを含有
する燐酸ナトリウムバッファ（0.1mol/l;pH7.2）中に45
℃で１時間浸漬することによってウシチログロブリンで
被覆されたポリスチレンビーズから成る。同じバッファ
で数回洗浄した後に0.01％のThimerosalを含有する同じ
バッファ中に４℃でビーズを保存する。使用前に、PBS
（pH7.2;0.1mol/l）中の１％BSA溶液でビーズを半時間
飽和する。
する燐酸ナトリウムバッファ（0.1mol/l;pH7.2）中に45
℃で１時間浸漬することによってウシチログロブリンで
被覆されたポリスチレンビーズから成る。同じバッファ
で数回洗浄した後に0.01％のThimerosalを含有する同じ
バッファ中に４℃でビーズを保存する。使用前に、PBS
（pH7.2;0.1mol/l）中の１％BSA溶液でビーズを半時間
飽和する。
同じ希釈剤を使用し標準サンプルを同じ処理モードで調
製する。
製する。
定量のためには、0.1mlの標準サンプル又は定量すべき
サンプルと、希釈剤で1/2000に希釈した西洋ワサビペル
オキシダーゼ標識抗T3IgG0.3mlとウシチログロブリンで
被覆されたビーズとをクーペルに導入する。上記希釈率
は出発抗血清の1/20000希釈に対応する。室温で２時間
インキュベート後、ビーズを取出し5mlの蒸留水で３回
洗浄し、使い捨てのポリスチレン管に移す。次に実施例
１と同じ処理モードを用い基質溶液を0.3mlだけ使用し
てビーズの酵素活性を測定する。実施例１と同様に半時
間後に1mlの1NのHClを添加して反応を停止する。
サンプルと、希釈剤で1/2000に希釈した西洋ワサビペル
オキシダーゼ標識抗T3IgG0.3mlとウシチログロブリンで
被覆されたビーズとをクーペルに導入する。上記希釈率
は出発抗血清の1/20000希釈に対応する。室温で２時間
インキュベート後、ビーズを取出し5mlの蒸留水で３回
洗浄し、使い捨てのポリスチレン管に移す。次に実施例
１と同じ処理モードを用い基質溶液を0.3mlだけ使用し
てビーズの酵素活性を測定する。実施例１と同様に半時
間後に1mlの1NのHClを添加して反応を停止する。
種々の標準サンプルについて得られた結果を第３図に示
す。第３図は、492nmの吸光度をT3濃度（ng/ml）の関数
として示す。これはT3の標準検量曲線に対応する。
す。第３図は、492nmの吸光度をT3濃度（ng/ml）の関数
として示す。これはT3の標準検量曲線に対応する。
この曲線を用いて定量すべきサンプルのT3濃度を測定し
得る。
得る。
この実施例では、種々の濃度のウシチログロブリンを含
むポリスチレンビーズを用いT3濃度が0ng/ml又は5ng/ml
の標準サンプルについて同じ処理を行なって定量を最適
化した。得られた結果を第４図に示す。第４図の曲線３
はT3濃度0ng/mlのサンプルの吸光度の変化をビーズ調製
に使用した溶液のウシチログロブリン濃度（μg/ml）の
関数として示す。曲線４はT3濃度5ng/mlのサンプルの吸
光度の変化をビーズ調製に使用した溶液のウシチログロ
ブリン濃度（μg/ml）の関数として示す。
むポリスチレンビーズを用いT3濃度が0ng/ml又は5ng/ml
の標準サンプルについて同じ処理を行なって定量を最適
化した。得られた結果を第４図に示す。第４図の曲線３
はT3濃度0ng/mlのサンプルの吸光度の変化をビーズ調製
に使用した溶液のウシチログロブリン濃度（μg/ml）の
関数として示す。曲線４はT3濃度5ng/mlのサンプルの吸
光度の変化をビーズ調製に使用した溶液のウシチログロ
ブリン濃度（μg/ml）の関数として示す。
更に、トリヨードチロニンの代わりにウシチログロブリ
ンを含有する標準サンプルを使用して実施例１と同様に
処理すると第３図の標準検量曲線からウシチログロブリ
ンのトリヨーチロニン反応当量が得られる。これによれ
ば、ウシチログロブリンは１モル当たり0.06モルのT3当
量を含有する。
ンを含有する標準サンプルを使用して実施例１と同様に
処理すると第３図の標準検量曲線からウシチログロブリ
ンのトリヨーチロニン反応当量が得られる。これによれ
ば、ウシチログロブリンは１モル当たり0.06モルのT3当
量を含有する。
ブタチログロブリンで被覆されたポリスチレンビーズか
ら成る固体支持体を使用して同じ処理を繰り返す。これ
らの条件下でも同様の結果が得られる。
ら成る固体支持体を使用して同じ処理を繰り返す。これ
らの条件下でも同様の結果が得られる。
実施例3;遊離チロキシンT4の定量 この実施例では、ブタチログロブリンで被覆されたポリ
プロピレンフィンを使用して実施例１と同様に処理す
る。実施例１と同様にして1ml当たり遊離T4を０〜50pg
の範囲で含有する標準サンプルを調製する。参照の方法
によって遊離T4の標準検量曲線を作成する。
プロピレンフィンを使用して実施例１と同様に処理す
る。実施例１と同様にして1ml当たり遊離T4を０〜50pg
の範囲で含有する標準サンプルを調製する。参照の方法
によって遊離T4の標準検量曲線を作成する。
実施例１と同様にヒツジに免疫することによって得られ
た抗血清のFab′画分から抗T4/酵素複合化合物を形成す
る。このFab′画分は実施例１で得られたIgGに対してペ
プシン消化及び2-メルカプロエチルアミン還元を順次行
なうことによって得られる。ペプシン消化を行なうため
には2mol/lのNaCl0.125mlと2mgのペプシンとを20mg/ml
のIgG2.5mlに添加する。混合物を37℃で24時間インキュ
ベートし、1Nの炭酸ナトリウムをpH8になるまで添加し
て消化を停止する。遠心後、Ultrogel ACA44カラムで上
清を過し、燐酸ナトリウムバッファ（0.1mol/l;pH6）
で断片を溶出する。このようにして20ml中に12mgのFa
b′2が回収される。これを分子量35000のポリエチレン
グリコールで10倍に濃縮する。次にpH6の燐酸ナトリウ
ム（0.1ml/l）／エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（5mm
ol/l）バッファ中の0.1mol/lの２−メルカプトメチルア
ミン0.22mlを添加して得られたFab′画分を還元する。
混合物を37℃で１時間30分間インキュベートし、同じ燐
酸ナトリウム/EDTAバッファを用いSephadex G25カラム
に溶液を過する。この結果、10.5mgのFab′画分が得
られる。
た抗血清のFab′画分から抗T4/酵素複合化合物を形成す
る。このFab′画分は実施例１で得られたIgGに対してペ
プシン消化及び2-メルカプロエチルアミン還元を順次行
なうことによって得られる。ペプシン消化を行なうため
には2mol/lのNaCl0.125mlと2mgのペプシンとを20mg/ml
のIgG2.5mlに添加する。混合物を37℃で24時間インキュ
ベートし、1Nの炭酸ナトリウムをpH8になるまで添加し
て消化を停止する。遠心後、Ultrogel ACA44カラムで上
清を過し、燐酸ナトリウムバッファ（0.1mol/l;pH6）
で断片を溶出する。このようにして20ml中に12mgのFa
b′2が回収される。これを分子量35000のポリエチレン
グリコールで10倍に濃縮する。次にpH6の燐酸ナトリウ
ム（0.1ml/l）／エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（5mm
ol/l）バッファ中の0.1mol/lの２−メルカプトメチルア
ミン0.22mlを添加して得られたFab′画分を還元する。
混合物を37℃で１時間30分間インキュベートし、同じ燐
酸ナトリウム/EDTAバッファを用いSephadex G25カラム
に溶液を過する。この結果、10.5mgのFab′画分が得
られる。
この抗体画分を以下の方法で西洋ワサビペルオキシダー
ゼによって標識する。
ゼによって標識する。
先ず14mgの西洋ワサビペルオキシダーゼを2.1mlの燐酸
ナトリウムバッファ（0.1mol/l;pH7）に溶解する。別に
7.5mgのN-スクシンイミジル‐4-（N-マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン‐1-カルボキシレートを0.18mlのジ
メチルホルムアミドに溶解する。次に両方の溶液を混合
し撹拌下で30℃で45分間インキュベートする。遠心後、
Sephadex G25カラムに上清を過し、燐酸ナトリウムバ
ッファ（0.1mol/l;pH6）で溶出し、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ濃度5.2mg/mlのマレイミドペルオキシダーゼ溶
液を得る。次に10mlの該溶液を1mlの燐酸ナトリウムバ
ッファ（0.1mol/l;pH6）に混合し、1mlのEDTA（5mmol/
l）／燐酸ナトリウム（0.1mol/l;pH6）バッファ中の10.
5mgのFab′断片と共に30℃で１時間インキュベートす
る。Fab′−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化合物をU
ltrogelカラムで過し、燐酸ナトリウムバッファ（0.1
mol/l;pH6.5）で溶出する。第１ピークは分子量100000
の複合体に対応する（溶出容量;90ml）。
ナトリウムバッファ（0.1mol/l;pH7）に溶解する。別に
7.5mgのN-スクシンイミジル‐4-（N-マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン‐1-カルボキシレートを0.18mlのジ
メチルホルムアミドに溶解する。次に両方の溶液を混合
し撹拌下で30℃で45分間インキュベートする。遠心後、
Sephadex G25カラムに上清を過し、燐酸ナトリウムバ
ッファ（0.1mol/l;pH6）で溶出し、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ濃度5.2mg/mlのマレイミドペルオキシダーゼ溶
液を得る。次に10mlの該溶液を1mlの燐酸ナトリウムバ
ッファ（0.1mol/l;pH6）に混合し、1mlのEDTA（5mmol/
l）／燐酸ナトリウム（0.1mol/l;pH6）バッファ中の10.
5mgのFab′断片と共に30℃で１時間インキュベートす
る。Fab′−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化合物をU
ltrogelカラムで過し、燐酸ナトリウムバッファ（0.1
mol/l;pH6.5）で溶出する。第１ピークは分子量100000
の複合体に対応する（溶出容量;90ml）。
定量を行なうために、ブタチログロブリンで放覆された
ポリプロピレンフィンを内蔵する管に0.05mlの標準サン
プル又は定量すべきサンプルと0.1％のウシ血清アルブ
ミンを含む燐酸ナトリウムバッファ（0.1mol/l;pH7.2）
に300ng/mlに希釈した0.5mlの抗T4Fab′−西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ複合体とを導入する。37℃で３時間イン
キュベートし、次に管から液体を除去しフィンを蒸留水
で２回洗浄する。実施例１で使用した基質溶液0.5mlを
添加し、室温で30分間インキュベートしてフィンの酵素
活性を測定する。1mlの1Nシュウ酸を添加して反応を停
止し492nmでの光学密度を測定する。
ポリプロピレンフィンを内蔵する管に0.05mlの標準サン
プル又は定量すべきサンプルと0.1％のウシ血清アルブ
ミンを含む燐酸ナトリウムバッファ（0.1mol/l;pH7.2）
に300ng/mlに希釈した0.5mlの抗T4Fab′−西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ複合体とを導入する。37℃で３時間イン
キュベートし、次に管から液体を除去しフィンを蒸留水
で２回洗浄する。実施例１で使用した基質溶液0.5mlを
添加し、室温で30分間インキュベートしてフィンの酵素
活性を測定する。1mlの1Nシュウ酸を添加して反応を停
止し492nmでの光学密度を測定する。
得られた結果を第５図に示す。第５図は定量の標準検量
曲線に対応する。
曲線に対応する。
実施例4;全チロキシンT4の定量 この定量では、実質的に実施例３と同じ処理モードを使
用するが、ウシチログロブリンで被覆されたポリスチレ
ンビーズと実施例１の西洋ワサビペルオキシダーゼで標
識された抗T4抗体とを使用する。定量のために、ポリス
チレンビーズを収容した管に0.05mlの標準サンプル又は
定量すべきサンプルと、１％のBSAと0.04％のANSとを含
有する燐酸ナトリウムバッファ（0.1mol/l;pH7.2）中に
20μg/mlに希釈した0.3mlの抗T4−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合体とを導入する。室温で１時間インキュベ
ートする。液体とビーズとを分離し、ビーズを蒸留水で
２回洗浄する。次に実施例１で使用した基質0.3mlを添
加し、室温で30分間インキュベートして酵素活性を測定
する。１cm3の1Nシュウ酸を添加して反応を停止し492nm
での光学密度を測定する。
用するが、ウシチログロブリンで被覆されたポリスチレ
ンビーズと実施例１の西洋ワサビペルオキシダーゼで標
識された抗T4抗体とを使用する。定量のために、ポリス
チレンビーズを収容した管に0.05mlの標準サンプル又は
定量すべきサンプルと、１％のBSAと0.04％のANSとを含
有する燐酸ナトリウムバッファ（0.1mol/l;pH7.2）中に
20μg/mlに希釈した0.3mlの抗T4−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合体とを導入する。室温で１時間インキュベ
ートする。液体とビーズとを分離し、ビーズを蒸留水で
２回洗浄する。次に実施例１で使用した基質0.3mlを添
加し、室温で30分間インキュベートして酵素活性を測定
する。１cm3の1Nシュウ酸を添加して反応を停止し492nm
での光学密度を測定する。
実施例5;全チロキシンT4の定量 この実施例では、酵素標識チログロブリンとポリプロピ
レン固体支持体に固定された抗T4抗体とを使用して不均
質相で定量を行なう。
レン固体支持体に固定された抗T4抗体とを使用して不均
質相で定量を行なう。
（ａ）固定抗T4抗体の調製 先ず実施例１と同様に調製された抗T4抗体をポリプロピ
レン支持体に固定する。このために0.03mg/mlの抗T4IgG
を含有する抗T4溶液100mlに100個の支持体を浸漬させ反
応混合物を室温で18時間撹拌する。次に支持体を１の
PBSで洗浄しPBS中の0.1％のBSAによって室温で４時間を
要して支持体を被覆する。次に支持体を蒸留水で洗浄
し、凍結乾燥してポリスチレン壜にいれ室温で保存す
る。
レン支持体に固定する。このために0.03mg/mlの抗T4IgG
を含有する抗T4溶液100mlに100個の支持体を浸漬させ反
応混合物を室温で18時間撹拌する。次に支持体を１の
PBSで洗浄しPBS中の0.1％のBSAによって室温で４時間を
要して支持体を被覆する。次に支持体を蒸留水で洗浄
し、凍結乾燥してポリスチレン壜にいれ室温で保存す
る。
（ｂ）標識チログロブリンの調製 次に以下の方法で西洋ワサビペルオキシダーゼによって
標識されたチログロブリンを調製する。Immunochemistr
y、vol.8、p.1175（1971）に記載のAvrameas及びTernyn
ckの方法を用い、100mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ
を１％のグルタルアルデヒドによって活性化する。次に
グルタルアルデヒドで活性化した西洋ワサビペルオキシ
ダーゼを、生理食塩水で平衡したSephadex G25（2.5×2
0cm）に通して褐色でない画分を回収する。4.5mlの活性
西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液に1mlの炭酸水素塩／
炭酸塩溶液（1M;pH9.5）を添加し、次に撹拌下の溶液に
1M;pH9.5の炭酸水素塩／炭酸塩溶液に溶解した3mgのチ
ログロブリンを添加する。反応混合液を室温で５時間撹
拌し、４℃で１晩静置する。次に無水ポリエチレングリ
コールPEG35000に透析してチログロブリン−西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ複合化合物を2mlに濃縮し、Sepharose
4Bで過することによって複合体を精製する。
標識されたチログロブリンを調製する。Immunochemistr
y、vol.8、p.1175（1971）に記載のAvrameas及びTernyn
ckの方法を用い、100mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ
を１％のグルタルアルデヒドによって活性化する。次に
グルタルアルデヒドで活性化した西洋ワサビペルオキシ
ダーゼを、生理食塩水で平衡したSephadex G25（2.5×2
0cm）に通して褐色でない画分を回収する。4.5mlの活性
西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液に1mlの炭酸水素塩／
炭酸塩溶液（1M;pH9.5）を添加し、次に撹拌下の溶液に
1M;pH9.5の炭酸水素塩／炭酸塩溶液に溶解した3mgのチ
ログロブリンを添加する。反応混合液を室温で５時間撹
拌し、４℃で１晩静置する。次に無水ポリエチレングリ
コールPEG35000に透析してチログロブリン−西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ複合化合物を2mlに濃縮し、Sepharose
4Bで過することによって複合体を精製する。
次に生理食塩水中で０〜50％エチレングリコールの不連
続勾配で溶出することによってSepharoseカラムで複合
化合物を精製する。酵素活性を測定することによって溶
出曲線を確認する。チログロブリン−西洋ワサビペルオ
キシダーゼ複合化合物を含むピークを１％BSAと0.01％
チメロサルの添加によって安定化し、等容のグリセロー
ルと混合し−20℃で保存する。
続勾配で溶出することによってSepharoseカラムで複合
化合物を精製する。酵素活性を測定することによって溶
出曲線を確認する。チログロブリン−西洋ワサビペルオ
キシダーゼ複合化合物を含むピークを１％BSAと0.01％
チメロサルの添加によって安定化し、等容のグリセロー
ルと混合し−20℃で保存する。
（ｃ）T4の標準サンプルの調製 実施例１と同じ処理モードで調製する。
（ｄ）定量的エンザイムイムノアッセイ 抗T3抗体で被覆されたポリプロピレン支持体を含むポリ
スチレン管に、0.025mlの標準サンプルと１％BSAと0.04
％ANSとを含むPBに希釈した0.5mlのチログロブリン−西
洋ワサビペルオキシダーゼ複合体とを導入する。室温で
１時間インキュベートし、管を空にしてポリプロピレン
支持体を0.05％のTween20を含む5mlの蒸留水で２回洗浄
する。次に、実施例１に従って新しく調製された基質0.
5mlを各管に導入し、管を暗中で室温で30分間維持す
る。ここで1Nシュウ酸1mlを添加して酵素反応を停止
し、T4濃度200mg/mlの標準サンプルに対応するブランク
に比較して492nmでの吸光度を測定する。
スチレン管に、0.025mlの標準サンプルと１％BSAと0.04
％ANSとを含むPBに希釈した0.5mlのチログロブリン−西
洋ワサビペルオキシダーゼ複合体とを導入する。室温で
１時間インキュベートし、管を空にしてポリプロピレン
支持体を0.05％のTween20を含む5mlの蒸留水で２回洗浄
する。次に、実施例１に従って新しく調製された基質0.
5mlを各管に導入し、管を暗中で室温で30分間維持す
る。ここで1Nシュウ酸1mlを添加して酵素反応を停止
し、T4濃度200mg/mlの標準サンプルに対応するブランク
に比較して492nmでの吸光度を測定する。
標準サンプルで得られた結果を第６図に示す。第６図は
492nmでの吸光度を標準T4濃度（μg/l）の関数として示
しT4の標準検量曲線を与える。
492nmでの吸光度を標準T4濃度（μg/l）の関数として示
しT4の標準検量曲線を与える。
この曲線を用いると、前記と同様に処理し492nmでの吸
光度を測定し標準検量曲線に参照して該吸光度に対応す
るT4濃度を読取ることによって、定量すべきサンプルの
T4濃度を測定し得る。
光度を測定し標準検量曲線に参照して該吸光度に対応す
るT4濃度を読取ることによって、定量すべきサンプルの
T4濃度を測定し得る。
第１図及び第２図は本発明方法によるチロキシンT4の定
量を示す曲線、第３図及び第４図は本発明方法によるト
リヨードチロニンT3の定量を示す曲線、第５図は本発明
方法によるT4の定量を示す曲線、第６図は標識チログロ
ブリンを使用したT4の定量を示す曲線である。
量を示す曲線、第３図及び第４図は本発明方法によるト
リヨードチロニンT3の定量を示す曲線、第５図は本発明
方法によるT4の定量を示す曲線、第６図は標識チログロ
ブリンを使用したT4の定量を示す曲線である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 米国特許4481298（ＵＳ，Ａ) Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，ｖｏｌ．28，Ｎｏ．７，（1982）, Ｐ．1469−1473 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，ｖｏｌ．28，Ｎｏ．４，（1982）, Ｐ．666−671 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ, ｖｏｌ．94，61029ｄ，（1981)
Claims (21)
- 【請求項１】サンプル中に遊離形で存在するチロキシン
T4及びトリヨードチロニンT3から選択される少なくとも
１種の甲状腺ホルモンの免疫定量方法であって、定量す
べき甲状腺ホルモンを限定量で存在する定量すべき甲状
腺ホルモンに対する抗体の部位に対してチログロブリン
と拮抗させ、次に定量すべき甲状腺ホルモンに対する抗
体に結合したチログロブリンの量を測定するか又は定量
すべき甲状腺ホルモンに対する抗体に結合しなかったチ
ログロブリンの量を測定してサンプル中に遊離形で存在
するチロキシンT4及びトリヨードチロニンT3から選択さ
れる少なくとも１種の甲状腺ホルモンを免疫定量するこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項２】チログロブリンが固相に固定されているこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】固定チログロブリンを含有する固相が物理
化学的方法又は免疫的方法によって不溶化されたチログ
ロブリンから成ることを特徴とする特許請求の範囲第２
項に記載の方法。 - 【請求項４】定量すべきT4を含有するサンプルを固定チ
ログロブリン及び限定量の抗T4抗体と接触させ、次に固
定チログロブリンに結合した抗T4抗体の量を測定するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。 - 【請求項５】定量すべきトリヨードチロニンT3を含有す
るサンプルを固定チログロブリン及び限定量の抗T3抗体
と接触させ、次に固定チログロブリンに結合した抗T3抗
体の量を測定することを特徴とする特許請求の範囲第２
項に記載の方法。 - 【請求項６】定量すべきT3とT4とを含有するサンプルを
固定チログロブリンと限定量の抗T3抗体及び抗T4抗体と
に接触させ、次にチログロブリンに結合した抗T3抗体の
量とチログロブリンに結合した抗T4抗体の量とを測定す
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方
法。 - 【請求項７】定量すべき甲状腺ホルモンに対する抗体が
標識抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第４項
又は第５項に記載の方法。 - 【請求項８】抗T3抗体又は抗T4抗体が第１抗体を構成す
ること、及び、第１抗体に結合し得る標識第２抗体を使
用することを特徴とする特許請求の範囲第４項又は第５
項に記載の方法。 - 【請求項９】抗T3抗体又は抗T4抗体が第１抗体を構成す
ること、及び、第１抗体に結合し得る第２抗体を使用す
ること、及び、第１抗体が蛍光発色団で標識され第２抗
体が吸光発色団で標識されていることを特徴とする特許
請求の範囲第４項又は第５項に記載の方法。 - 【請求項１０】抗T3抗体及び抗T4抗体が異なる原子及び
分子の少なくとも一方によって標識されていることを特
徴とする特許請求の範囲第６項に記載の方法。 - 【請求項１１】抗T3抗体及び抗T4抗体が異なる２種類の
酵素によって標識されていることを特徴とする特許請求
の範囲第10項に記載の方法。 - 【請求項１２】抗T3抗体が第１抗体を構成し抗T4抗体が
第２抗体を構成すること、及び、第１抗体に特異的に結
合し得る標識第３抗体と第２抗体に特異的に結合し得る
標識第４抗体とを使用し第３抗体と第４抗体との標識が
異なっていることを特徴とする特許請求の範囲第６項に
記載の方法。 - 【請求項１３】定量すべきチロキシンを、チログロブリ
ンと固相に固定された限定量の抗T4抗体と標識された抗
T3抗体又は抗T4抗体とに接触させ、次にチログロブリン
を介して固体支持体に結合した標識抗T3抗体又は抗T4抗
体の量を測定することを特徴とする特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 - 【請求項１４】定量すべきトリヨードチロニンを、チロ
グロブリンと固相に固定された限定量の抗T3抗体と標識
された抗T3抗体又は抗T4抗体とに接触させ、チログロブ
リンを介して固体支持体に結合した標識抗T4抗体又は抗
T3抗体の量を測定することを特徴とする特許請求の範囲
第１項に記載の方法。 - 【請求項１５】標識抗体が放射性物質、蛍光物質、発光
物質、酵素、蛍光発色団、吸光発色団、PAP標識プロテ
インＡ、アビジン及びビオチンから選択された標識物質
によって修飾された抗体であることを特徴とする特許請
求の範囲第７項に記載の方法。 - 【請求項１６】標識抗体が放射性物質、蛍光物質、発光
物質、酵素、蛍光発色団、吸光発色団、PAP標識プロテ
インＡ、アビジン及びビオチンから選択された標識物質
によって修飾された抗体であることを特徴とする特許請
求の範囲第８項に記載の方法。 - 【請求項１７】標識物質が西洋ワサビペルオキシダーゼ
であることを特徴とする特許請求の範囲第15項又は第16
項に記載の方法。 - 【請求項１８】定量すべきチロキシンT4又はトリヨード
チロニンT3を含有するサンプルを、標識チログロブリン
と固相に固定された抗T4抗体又は抗T3抗体とに接触さ
せ、次に該支持体に結合した標識チログロブリンの量を
測定することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 - 【請求項１９】固定された抗T4抗体又は抗T3抗体を含有
する固相が、物理化学的方法又は免疫的方法によって不
溶化された抗T4抗体又は抗T3抗体から成ることを特徴と
する特許請求の範囲第18項に記載の方法。 - 【請求項２０】チログロブリンが酵素によって標識され
ていることを特徴とする特許請求の範囲第18項に記載の
方法。 - 【請求項２１】標識チログロブリンが、チログロブリン
／抗チログロブリン抗体／酵素の複合化合物であること
を特徴とする特許請求の範囲第18項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8606763A FR2598514B1 (fr) | 1986-05-12 | 1986-05-12 | Procede de dosage immunologique des hormones thyroidiennes t3 et/ou t4 utilisant la thyroglobuline |
| FR8606763 | 1986-05-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62274259A JPS62274259A (ja) | 1987-11-28 |
| JPH0731191B2 true JPH0731191B2 (ja) | 1995-04-10 |
Family
ID=9335113
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62115687A Expired - Lifetime JPH0731191B2 (ja) | 1986-05-12 | 1987-05-12 | チログロブリンを使用する甲状腺ホルモンの免疫定量法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4966838A (ja) |
| EP (1) | EP0246152B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0731191B2 (ja) |
| AT (1) | ATE66533T1 (ja) |
| DE (1) | DE3772254D1 (ja) |
| FR (1) | FR2598514B1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2598514B1 (fr) * | 1986-05-12 | 1988-07-01 | Commissariat Energie Atomique | Procede de dosage immunologique des hormones thyroidiennes t3 et/ou t4 utilisant la thyroglobuline |
| DE3727238A1 (de) * | 1987-08-14 | 1989-02-23 | Henning Berlin Gmbh | Immunologisches bestimmungsverfahren zur bestimmung von hapteneigenschaften aufweisenden freien substanzen |
| US5196349A (en) * | 1987-12-01 | 1993-03-23 | Ciba Cornign Diagnostics Corp. | Immunoassays for thyroid hormones using thyroglobulin |
| US5342788A (en) * | 1988-04-15 | 1994-08-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and standard solution for the determination of thyroxine (T4) or triiodothyronine (T3) |
| DE4022878A1 (de) * | 1990-07-18 | 1992-01-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Konservierung von diagnostischen tests |
| WO1997005487A1 (en) * | 1995-07-26 | 1997-02-13 | Universite De Montreal | ELISA SERODIAGNOSIS OF PIG PLEUROPNEUMONIA SEROTYPES 5a AND 5b |
| US6153440A (en) * | 1998-09-23 | 2000-11-28 | The Regents Of The University Of California | Simultaneous measurement of free triiodothyronine and free thyroxine by equilibrium dialysis and immunoassay |
| US7552039B2 (en) * | 1999-10-15 | 2009-06-23 | Hemopet | Method for sample processing and integrated reporting of dog health diagnosis |
| SE0002820L (sv) * | 2000-08-04 | 2002-02-05 | Jordanian Pharmaceutical Mfg & | Medicinskt kit |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4481298A (en) | 1981-04-13 | 1984-11-06 | Amf Incorporated | Pre-precipitated double antibody immunoassay method |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4171311A (en) * | 1978-01-16 | 1979-10-16 | International Diagnostics Tech. Inc. | Imides of thyroxin and triiodothyronine |
| US4311690A (en) * | 1978-06-20 | 1982-01-19 | Damon Corporation | Test set and method for the determination of free hormones |
| US4426453A (en) * | 1980-09-18 | 1984-01-17 | Amersham International Limited | Derivatives of iodothyronine compounds and their use in an assay for the free iodothyronine compounds |
| US4410633A (en) * | 1980-09-25 | 1983-10-18 | Corning Glass Works | Method for the measurement of free thyroxine or 3,5,3'-triiodothyronine in a liquid sample |
| DE3380125D1 (en) * | 1982-03-22 | 1989-08-03 | Amersham Int Plc | Assay for the free portion of substances in biological fluids |
| EP0165669A1 (en) * | 1984-05-04 | 1985-12-27 | Corning Glass Works | Improved method of measuring free ligand |
| US4544724A (en) * | 1984-06-19 | 1985-10-01 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Silylated vinyl alcohol polymers |
| FR2598514B1 (fr) * | 1986-05-12 | 1988-07-01 | Commissariat Energie Atomique | Procede de dosage immunologique des hormones thyroidiennes t3 et/ou t4 utilisant la thyroglobuline |
-
1986
- 1986-05-12 FR FR8606763A patent/FR2598514B1/fr not_active Expired
-
1987
- 1987-05-11 AT AT87401061T patent/ATE66533T1/de active
- 1987-05-11 DE DE8787401061T patent/DE3772254D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-11 EP EP87401061A patent/EP0246152B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-11 US US07/048,060 patent/US4966838A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-12 JP JP62115687A patent/JPH0731191B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-08-17 US US07/569,396 patent/US5010017A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4481298A (en) | 1981-04-13 | 1984-11-06 | Amf Incorporated | Pre-precipitated double antibody immunoassay method |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔ，ｖｏｌ．９４，６１０２９ｄ，（１９８１） |
| ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．４，（１９８２），Ｐ．６６６−６７１ |
| ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．７，（１９８２），Ｐ．１４６９−１４７３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2598514B1 (fr) | 1988-07-01 |
| US4966838A (en) | 1990-10-30 |
| EP0246152B1 (fr) | 1991-08-21 |
| FR2598514A1 (fr) | 1987-11-13 |
| US5010017A (en) | 1991-04-23 |
| ATE66533T1 (de) | 1991-09-15 |
| EP0246152A1 (fr) | 1987-11-19 |
| JPS62274259A (ja) | 1987-11-28 |
| DE3772254D1 (de) | 1991-09-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4514505A (en) | Monoclonal antibody mixtures and use thereof for enhanced sensitivity immunoassays | |
| Ohkaru et al. | Development of a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of human heart type fatty acid-binding protein in plasma and urine by using two different monoclonal antibodies specific for human heart fatty acid-binding protein | |
| Yolken | Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): a practical tool for rapid diagnosis of viruses and other infectious agents | |
| US4935339A (en) | Delayed solid phase immunologic assay | |
| US5011771A (en) | Multiepitopic immunometric assay | |
| Yorde et al. | Competitive enzyme-liked immunoassay with use of soluble enzyme/antibody immune complexes for labeling. I. Measurement of human choriogonadotropin. | |
| US5126241A (en) | Process for the determination of a specifically bindable substance | |
| EP0238353A2 (en) | Methods of immunoassay | |
| US20060165676A1 (en) | Identification of tsh receptor autoantibodies using affinity-purified antibodies | |
| CA2008360A1 (en) | Myocardial infarction immunoassay | |
| JPS63112599A (ja) | 免疫複合体レセプター | |
| JPS5923251A (ja) | 多価抗原の測定法及び測定試薬 | |
| JPH0467914B2 (ja) | ||
| JP3499570B2 (ja) | Ｔｓｈレセプター自己抗体を検出するためのレセプター結合アッセイ | |
| GB2098730A (en) | Immunolocalisation | |
| JPH0731191B2 (ja) | チログロブリンを使用する甲状腺ホルモンの免疫定量法 | |
| EP0124366A2 (en) | Method of measuring biological ligands | |
| Buchs et al. | Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies | |
| US6201109B1 (en) | Assay for bone alkaline phosphatase | |
| FI78787C (fi) | Immunometrisk metod foer bestaemning av en hapten. | |
| EP0368273A2 (en) | New method of assay for antigen | |
| HOSHINO et al. | A new homogeneous enzyme immunoassay. Its application to measurement of α-fetoprotein | |
| US6210906B1 (en) | Specific antibodies to kringle 5 of apo(a) and methods of use therefor | |
| Kohno et al. | Novel enzyme immunoassay of anti‐insulin IgG in human serum | |
| WO1997016727A1 (en) | Assay background reduction using glycoproteins with oxidized carbohydrates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080410 Year of fee payment: 13 |