JPH07313169A

JPH07313169A - 骨形成因子受容体改変体の遺伝子

Info

Publication number: JPH07313169A
Application number: JP6137935A
Authority: JP
Inventors: Toru Natsume; 徹夏目; Naoto Ueno; 直人上野
Original assignee: Nippon Meat Packers Inc
Current assignee: NH Foods Ltd
Priority date: 1994-05-26
Filing date: 1994-05-26
Publication date: 1995-12-05
Also published as: CA2191321A1; EP0771877A1; EP0771877A4; WO1995033058A1

Abstract

(57)【要約】【目的】骨形成因子（ＢＭＰ）の精製、測定などに有
用なＢＭＰ受容体改変体を提供することを目的とする。【構成】本発明は、ＢＭＰ受容体改変体をコードする
遺伝子、当該遺伝子から発現されるＢＭＰ受容体改変体
及びその用途に関する。本発明のＢＭＰ受容体改変体
は、ＢＭＰと特異的に結合する。従って、本発明のＢＭ
Ｐ受容体改変体は、ＢＭＰの精製、ＢＭＰに関係する各
種疾患の診断試薬、研究試薬、医療用医薬品などとして
広く利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、骨形成因子受容体の改
変体をコードする遺伝子、並びにそれより発現される骨
形成因子受容体改変体及びその用途に関する。より詳細
には、骨形成因子受容体の細胞外領域に関する改変体を
コードする遺伝子、並びにそれより発現され、各種骨疾
患の診断、骨形成関連物質のスクリーニング、骨形成因
子の精製等に有用な骨形成因子受容体改変体に関する。

【０００２】

【従来の技術】高齢者人口の増加や食生活の変化に伴
い、骨粗鬆症、骨軟化症、骨硬化症、骨腫瘍、骨折治癒
不全などのような骨組織障害に起因する疾患が増加して
おり、かかる骨組織障害疾患に対する薬剤及び治療法の
研究・開発が行われている。骨組織は形成と吸収を一生
涯繰り返す動的な器官である。骨形成は間葉系細胞由来
の骨芽細胞が、また骨吸収は造血系由来の破骨細胞が主
役を果たしており、リモデリングという機構により、古
い骨は新しい骨に置換され、骨全体として強度を保って
いる。休止相にある骨は、まず、破骨細胞により吸収さ
れる。次に破骨細胞によって吸収された骨は骨芽細胞に
よって修復される。この一連のリモデリングの過程に作
用する種々の増殖因子等が知られている。その中で、未
熟な細胞を骨芽細胞へ分化誘導させる因子を骨誘導因
子、骨芽細胞による骨形成を促す因子を骨形成因子と分
類すると、例えば、レチノイン酸は前者に属し、ＴＧＦ
-βは後者に属すると考えられる。同様な細胞増殖因子
と考えられるBone Morphogenetic Protein（いわゆる骨
形成因子、以下ＢＭＰと称する）は、骨誘導因子と骨形
成因子の両作用を有すると考えられている。そのｍＲＮ
Ａは、歯や骨等の骨組織の他、心臓、脳、肺、肝臓、腎
臓、皮膚、毛根などにも発現が確認されており、組織形
成における上皮−間葉系作用の重要な役割を持つと考え
られている他、その生物学的役割が注目されている。ま
た、蛋白質レベルでは骨組織、歯牙組織、骨肉腫に存在
することが確認されている。

【０００３】ＢＭＰの利用に関して、例えば、特表平２
−５００２４１号公報、特表平３−５０３６４９号公報
及び特表平３−５０５０９８号公報においては、ＢＭＰ
を有効成分とする硬骨及び軟骨誘導組成物や骨誘導組成
物が開示されている。また、特開平５−１３２４２６号
公報においては骨組織の形成促進剤として骨減少性疾患
の予防治療剤などが；特開平２−２８２３９６号公報に
おいては再生骨髄から同定された骨形成成長ポリペプチ
ドが；特表平５−５０５４０４号公報においては、ＴＧ
Ｆ-βとの共同的組合せによる骨修復のための骨形成蛋
白質の使用法が開示されている。現在、ＢＭＰについて
は、局所投与による医薬品開発が実施されているが、将
来的には骨折治癒促進、骨欠損の修復、骨粗鬆症等の骨
減少疾患の治療などへの臨床応用、並びに骨肉腫におけ
る新しい腫瘍マーカー及びＢＭＰ産生腫瘍治療剤、口腔
疾患治療剤としてもその臨床応用が期待されている。

【０００４】上記のＢＭＰは１９６０年代に異所性の骨
形成を引き起こす骨基質に存在する蛋白性の分子として
命名されたものであり、１９８９年にその遺伝子配列が
判明し、既に構造が判明していたＴＧＦ-βファミリー
のメンバーであることが明らかになっている(Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 81, 371-375； Progress GrowthFac
tor Research 1, 267-280, 1989)。また、同様のファミ
リーに属する蛋白質として、今までにアクチビン等も知
られている(Nature 231, 776-778, 1986； Nature 231,
779-782, 1986)。ＢＭＰとして精製された骨基質から
の蛋白質の内、２から８までがＴＧＦ-βファミリーに
属するものであり、今までの知見からこれら７つのＢＭ
Ｐは３種のグループにその類似性から分類できる。即
ち、２と４からなるグループ、３からなるグループ、
５、６、７及び８からなるグループの３種である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、ＢＭＰ
は骨誘導及び骨形成を促進する因子であり、骨組織障害
の発症・治癒とは密接な関係を有しており、生体内にお
けるＢＭＰの測定は骨疾患の診断上重要である。また、
ＢＭＰに類似する作用を有する物質やＢＭＰに拮抗する
物質のスクリーニング方法、ＢＭＰの簡易な精製方法も
求められている。このような目的に対しては、一般的に
ＢＭＰに特異的な抗体を調製して応用することが広く知
られるが、従来までにそのような抗体は知られていな
い。このことは、ＢＭＰが動物種差をこえて進化の過程
で非常に良く保存されたペプチドであるため、抗体が作
られにくいことが原因であると考えらえている。そのた
め、抗体以外の物質を用いて、上記の問題を解決する技
術が広く求められていた。かかる問題から、本発明者等
は、ＢＭＰと特異的に反応し得る物質について鋭意研究
した結果、ＢＭＰの受容体の改変体を用いることにより
問題を解消しえることを見出した。

【０００６】より詳細には、本発明者等は永年にわたり
ＢＭＰ遺伝子に関する研究を実施してきており(Bioche
m. Biophys. Res. Commun. 186, 1487-1992； Growth F
actor7, 233-240； Growth Factors 8, 165-172, 199
3； Growth Factors 10, 173-176, 1993； Biochem.
J., 298, 275-280, 1993)、またＢＭＰに対する受容体
についても研究を重ねてきた（日本分子生物学会講演要
旨集 2175, 1992；3209, 1993）。ＢＭＰの受容体に関
して、その選択的な受容体については従来知られていな
かったが、最近、米国の企業及び本発明者等の研究によ
り、ＢＭＰの２種の受容体（ＢＭＰ２と４）が単離さ
れ、その性状が明らかになった（分子薬理学国際シンポ
ジウム 1994年）。ＢＭＰは、従来広く知られている細
胞増殖因子と同様に、細胞表面上に発現されている受容
体に結合することにより、その機能を果たす。受容体
は、その構造上の特徴として、一般的に、細胞外領域、
細胞内領域、そして膜貫通領域の３種の領域からなり、
ＢＭＰ受容体についてもシステイン残基に富む細胞外領
域と一つの膜貫通領域からなり、細胞内領域はＴＧＦ-
βファミリーに共通するセリンスレオニンキナーゼであ
ることが判明している。

【０００７】本発明者等は、本ＢＭＰ受容体がＢＭＰと
特異的に結合し得る性状に着目し、可溶性を有すると推
察される細胞外領域に、識別手段として人為的にエピト
ープタグを付加した改変体を用いれば、ＢＭＰを測定
し、ＢＭＰと同様な生物活性を有する物質のスクリーニ
ングやＢＭＰの精製を行うことが可能であろうと思料
し、鋭意研究を行った結果、上記の改変体が所期の目的
を達成し得ることを見出して本発明を完成した。即ち、
本発明は、ＢＭＰ受容体の細胞外領域にエピトープタグ
を付加した改変体、当該改変体をコードする遺伝子及び
当該改変体の用途を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、下記に示されるＢＭＰ受容体改
変体をコードする遺伝子、当該遺伝子を発現して得られ
るＢＭＰ受容体改変体及び当該改変体の用途を提供する
ものである。

【０００９】ＢＭＰ受容体の細胞外領域をコードする
遺伝子と、抗体が認識する抗原決定基をコードした遺伝
子を結合させたＢＭＰ受容体改変体の遺伝子。抗体が認識する抗原決定基をコードした遺伝子が、抗
癌遺伝子ｍｙｃ抗体が認識する抗原決定基をコードした
遺伝子である上記記載のＢＭＰ受容体改変体の遺伝
子。配列番号１で示される塩基配列又は当該塩基配列の一
部を有するＢＭＰ受容体改変体の遺伝子。上記〜で規定される遺伝子から発現されるＢＭＰ
受容体改変体。配列番号２に示されるアミノ酸配列又は当該配列を含
むアミノ酸配列からなるＢＭＰ受容体改変体。上記又はに記載されるＢＭＰ受容体改変体を用い
ることを特徴とするＢＭＰの測定方法。上記又はに記載されるＢＭＰ受容体改変体を用い
ることを特徴とするＢＭＰ類似又はＢＭＰに拮抗する化
合物のスクリーニング方法。上記又はに記載されるＢＭＰ受容体改変体を用い
るＢＭＰの精製方法。上記又はに記載されるＢＭＰ受容体改変体を有効
成分として含有する骨疾患治療剤。

【００１０】本発明にかかるＢＭＰ受容体改変体をコー
ドする遺伝子は、ＢＭＰ受容体の細胞外領域をコードす
る遺伝子と、抗体が認識する抗原決定基をコードした遺
伝子を結合させた遺伝子である。一般に、蛋白質性物質
の識別を可能又は容易にするため、蛋白質性物質に、抗
体が認識し得る抗原決定基（エピトープ）を付加し、標
識化された抗体等を用いて当該蛋白質性物質の識別や同
定を行うことは、エピトープタグ法として広く知られて
いる。かかる方法については、例えば、Methodin Enzym
ology 194, 509頁, 1991年に抗原決定基の付加方法とし
て詳述されている。上記の本発明の遺伝子は、ＢＭＰ受
容体の細胞外領域に抗原決定基が付加した蛋白質を発現
させるために用いられる遺伝子であり、かかる遺伝子に
より発現された蛋白質は抗体により同定ないし識別可能
になる。

【００１１】上記の抗体が認識する抗原決定基（以下、
便宜上、エピトープタグと称する）としては特に限定さ
れず、上記の文献に記載される各種のエピトープタグな
どが挙げられ、例えば、癌遺伝子であるｍｙｃの抗ｍｙ
ｃモノクローナル抗体（９Ｅ１０）で認識される、この
抗体の抗原決定基となるアミノ酸配列（Glu-Gln-Lys-Le
u-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu）；抗インフルエンザヘマ
グルチニン抗体（１２ＣＡ５）で認識される、この抗体
の抗原決定基となるアミノ酸配列（Tyr-Pro-Tyr-Asp-Va
l-Pro-Asp-Tyr-Ala）が例示される。また、エピトープ
タグとして、ｌａｃＺ遺伝子で発現されるペプチドも利
用することができ、この際には、抗体として、抗β-ガ
ラクトシダーゼ抗体が使用される。本発明のＢＭＰ受容
体改変体をコードする遺伝子においては、ＢＭＰ受容体
の細胞外領域をコードする遺伝子（例えば、ＢＭＰ受容
体遺伝子を５’末端から３８０番塩基で切断した遺伝
子）と、上記のエピトープタグをコードした遺伝子が結
合している。より具体的には、例えば、上記の抗癌遺伝
子ｍｙｃ抗体が認識する抗原決定基の例においては、Ｂ
ＭＰ受容体の細胞外領域をコードする遺伝子に、抗ｍｙ
ｃモノクローナル抗体（９Ｅ１０）の抗原決定基となる
上記のアミノ酸配列をコードした遺伝子を、当該細胞外
領域をコードする遺伝子の３’末端側に付加した遺伝子
が例示される。

【００１２】ＢＭＰ受容体をコードする遺伝子は、ＢＭ
Ｐ受容体のｍＲＮＡより調製することができる。より具
体的には、ＢＭＰ受容体のｍＲＮＡは、ＢＭＰ受容体を
発現している臓器、組織、細胞などから、フェノール
法、グアニジウムチオシアネート法などの慣用の方法に
より抽出し、オリゴｄＴセルロースカラムなどの精製手
段を用いて精製することにより得ることができる。かく
して得られたｍＲＮＡからランダムプライマー法などの
慣用の方法により、ＢＭＰ受容体のｃＤＮＡを調製す
る。

【００１３】一方、ＴＧＦ-βやアクチビンの受容体の
アミノ酸配列の相同性の高い部分に基づき、その部分か
ら想定されるＰＣＲ用プライマー（オリゴヌクレオチ
ド）を合成する。得られたプライマーを用いて、上記の
ｃＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する。ＰＣＲ法により増
幅されたｃＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動法、アク
リルアミドゲル電気泳動法などのゲル電気泳動法により
分離、抽出を行う。抽出されたＤＮＡ断片を、Ｍ１３ジ
デオキン法などの常法に準じ又は市販の塩基配列決定キ
ットなどを用いて、その塩基配列を決定し、ＴＧＦ-β
やアクチビンの受容体の塩基配列とは異なる配列を有す
るＤＮＡ断片を選択する。得られたＤＮＡ断片をプロー
ブとして用いることにより、ｃＤＮＡライブラリーから
ＢＭＰ受容体の全長をコードするｃＤＮＡを単離するこ
とができ、また単離されたｃＤＮＡは常法に準じて塩基
配列を決定することができる。

【００１４】本発明にかかるＢＭＰ受容体の細胞外領域
をコードする遺伝子とエピトープタグをコードした遺伝
子を結合させた遺伝子は、上記で調製されたＢＭＰ受容
体の全長をコードするｃＤＮＡを適当なベクターに組み
込み、エピトープタグをコードする塩基配列及び翻訳終
止配列に相補的な配列を含む適当なプライマーを用い
て、当該ベクターをＰＣＲ法で増殖し、増幅された遺伝
子を常法に準じて単離・精製することにより、本発明の
遺伝子を得ることができる。なお、ＢＭＰ受容体の全長
をコードするｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、細胞
外領域をコードするＤＮＡ断片を分離し、これにエピト
ープタグをコードするＤＮＡ断片を結合させることによ
っても調製することができる。

【００１５】本発明のＢＭＰ受容体改変体は、ＢＭＰ受
容体の細胞外領域にエピトープタグが結合した蛋白質で
あり、上述のＢＭＰ受容体の細胞外領域をコードする遺
伝子とエピトープタグをコードした遺伝子を結合させた
遺伝子を遺伝子工学的に発現させることにより調製する
ことができる。かかる遺伝子工学的発現は、常法に準じ
て行うことができ、例えば、ＢＭＰ受容体の細胞外領域
をコードする遺伝子とエピトープタグをコードした遺伝
子を結合させた遺伝子又はそれを適当な制限酵素で切断
したＤＮＡ断片を、適当な発現ベクターに組み込み、ベ
クターに対して適当な宿主（例えば、大腸菌、枯草菌等
のバクテリア、酵母、カビ、動植物培養細胞など）に挿
入して形質転換し、この形質転換体を培養することによ
り行われ、培養上清（又は培養細胞を破砕した後の上
清）からＢＭＰ受容体改変体を得ることができる。かく
して得られたＢＭＰ受容体改変体は、透析、塩析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ーなどの慣用の方法により精製することができるが、エ
ピトープタグを認識する抗体を結合した担体を用いたア
フィニティクロマトグラフィーに付すことにより簡便且
つ高度に精製することができる。

【００１６】また、塩基配列から演繹されるアミノ酸配
列に基づき、ペプチドの固相合成法により、本発明のＢ
ＭＰ受容体改変体を調製することもできる。なお、本発
明のＢＭＰ受容体改変体は、実質的に同効物であるかぎ
り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸で
置換されていたり、他のアミノ酸配列が挿入されていた
り、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸
が結合していてもよく、また同様に糖鎖が付加、欠失又
は置換されていてもよい。

【００１７】本発明のＢＭＰ受容体改変体がＢＭＰと特
異的に反応することは、後記実施例に示されるように、
ＢＭＰとの競争反応により明らかになった。即ち、マウ
スの頭蓋冠由来のＭＣ３Ｔ３細胞は骨芽細胞に分化する
ことが知られており、その過程はＢＭＰによって促進さ
れる。又、その指標としてはアルカリホスファターゼ
（ＡＬＰａｓｅ）活性が上昇することが知られている
（蛋白、核酸、酵素 33, No.2, 186, 1988)。この細胞
の培養系に、牛骨由来のＢＭＰを添加するとＡＬＰａｓ
ｅ活性が増加する。しかし、ＢＭＰと共にＢＭＰ受容体
改変体を含む培養液を添加すると、添加量依存的にＡＬ
Ｐ活性は減少した。この結果から、ＢＭＰ受容体改変体
はＢＭＰと結合し、競合阻害をもたらしていることが明
らかになった。

【００１８】本発明のＢＭＰ受容体改変体は、そのＢＭ
Ｐ受容体細胞外領域部分でＢＭＰと特異的に反応し、エ
ピトープタグ部分でそれを認識する抗体と特異的に反応
するという特性を有する。本発明のＢＭＰの測定方法
は、かかる特性を利用し、免疫学的測定法に準じた方法
により、ＢＭＰを測定（定量及び定性）するものであ
る。例えば、ＢＭＰを含有する試料をマイクロプレート
に採り、プレートにＢＭＰを吸着させ、必要に応じてウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）などでブロッキングした
後、本発明のＢＭＰ受容体改変体を添加してＢＭＰと結
合させ、次いで標識化抗体を添加して当該改変体のエピ
トープタグと結合させた後、標識活性を測定することに
よりＢＭＰを測定することができる。また、この方法に
おいて、標識化抗体に代え、非標識化抗体を反応させ、
その後、標識化された二次抗体又は標識化されたプロテ
インＡを反応させてもよい。標識としては特に限定され
ないが、従来から免疫学的測定法で用いられている酵素
（例えば、パーオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β-ガラクトシダーゼ等）、放射活性物質（例え
ば、¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、³Ｈ等)、蛍光性物質などを用いれば
よい。

【００１９】なお、本発明のＢＭＰの測定方法は、上記
の方法に限定されるものではなく、競争法など免疫学的
測定法として知られている各種方法が適用でき、かかる
方法は当業者にとって周知である。本発明の測定方法に
よれば、ＢＭＰを迅速に且つ高感度、高精度で測定する
ことができ、少なくとも１〜１００ｎｇの間にて定量性
が確認されている。また、本発明の測定法の利点とし
て、免疫学的測定法では前駆体と活性型との認別が困難
であるのに対して、本測定法では、生理的に意味のある
分子として検出することが可能であることが挙げられ
る。

【００２０】また、本発明のＢＭＰ受容体改変体を用い
れば、上記の測定法に準じた方法により、ＢＭＰと類似
した生理活性を有する物質のスクリーニング又はＢＭＰ
と拮抗する作用を有する物質のスクリーニングを行うこ
とができる。例えば、本発明のＢＭＰ受容体改変体のエ
ピトープタグに標識抗体が結合した複合体を調製してお
き、ある試験物質を上記の複合体と反応させ、反応が生
じれば、その試験物質はＢＭＰと類似の生理活性を有す
る物質であることが推察される。

【００２１】更に、本発明のＢＭＰ受容体改変体は、Ｂ
ＭＰと特異的に結合するのでＢＭＰの単離・精製に利用
することができ、本発明のＢＭＰの精製方法はかかる特
性を利用したアフィニティクロマトグラフィー法による
ＢＭＰの精製方法に関する。より詳細に一例をもって説
明すると、エピトープタグを認識する抗体を不溶性担体
に化学的又は物理的に結合させた担体を調製し、これに
本発明のＢＭＰ受容体改変体を接触させて担体に固定化
する。次いで、この担体とＢＭＰを含有する試料と接触
させることによりＢＭＰを担体に固定化し、その後適当
な溶出液にてＢＭＰを溶出することにより、ＢＭＰを精
製することができる。上記の不溶性担体としては、セフ
ァロースなどの慣用の担体を用いることができ、また精
製はカラム法、バッチ法の何れにても行うことができ
る。なお、本発明のＢＭＰの精製方法は、上記の方法に
限定されるものではなく、アフィニティクロマトグラフ
ィー法として知られている各種方法が適用でき、かかる
方法は当業者にとって周知である。本発明の精製方法に
よれば、ＢＭＰを簡便、迅速且つ高度に精製することが
できる。

【００２２】本発明の骨疾患治療剤は、ＢＭＰ受容体改
変体を有効成分として含有することからなり、前述のよ
うに、本発明のＢＭＰ受容体改変体はＢＭＰと特異的且
つ競合的に反応することから、ＢＭＰ産生腫瘍などのＢ
ＭＰが関与する骨疾患の治療・予防に有用である。上記
の治療剤は、種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、
カプセル剤等）で投与し得るが、一般的には有効成分で
あるＢＭＰ受容体改変体のみ又はそれと慣用の担体と共
に注射剤又は経口剤とされる。当該注射剤は常法により
調製することができ、例えば、ＢＭＰ受容体改変体を適
切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水
等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次
いで無菌的な容器に充填することにより調製することが
できる。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒
剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、
懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの
製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。製
剤中のＢＭＰ受容体改変体含量は、剤形、適用疾患など
に応じて適宜調整することができる。

【００２３】製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添
加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロ
ブリン、ゼラチン、グリシン、マンニトール、グルコー
ス、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコール
などが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必
要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止
剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製
剤とした場合は凍結保存、または凍結乾燥等により水分
を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用
時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
本発明の骨疾患治療剤は、その製剤形態に応じた適当な
投与経路により投与され得る。その投与量は、患者の症
状、年齢、体重などにより適宜調整される。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、ＢＭＰ受容体改変体を
コードする遺伝子が提供され、それを発現することによ
りＢＭＰ受容体改変体を効率的に得ることができる。得
られたＢＭＰ受容体改変体を用いることにより、ＢＭＰ
を簡便且つ高精度で測定することができ、またＢＭＰと
同様な生理活性を有する物質又はＢＭＰと拮抗する物質
のスクリーニングが可能となり、更にＢＭＰを迅速且つ
高度に精製に精製することができる。また、ＢＭＰ受容
体改変体は、ＢＭＰと特異的に結合することから、ＢＭ
Ｐに起因する骨疾患の治療・予防を図るための骨疾患治
療剤としても有用である。従って、本発明のＢＭＰ受容
体改変体は、ＢＭＰの精製、ＢＭＰに関係する各種疾患
の診断試薬、研究試薬、医療用医薬品などとして広く利
用することができる。

【００２５】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらの例に限定されるものではな
い。実施例１マウスＢＭＰ受容体の作製ＴＧＦ-βやアクチビンの受容体間で最も相同性が高い
細胞内キナーゼ領域ＶＩＩＩとＸＩのアミノ酸配列（Th
r-Met-Ala-Pro-Glu-ValとGlu-Cys-Trp-Asp-His-Asp）を
基に、下記の２種類の合成オリゴヌクレオチドを合成し
た。その合成オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。合成オリゴヌクレオチド１：５’−ＴＡ（ＴＣ）ＡＴＧＧＣ（ＴＣＡＧ）ＣＣ（ＴＣ
ＡＧ）ＧＡ（ＡＧ）ＧＴ−３’ 合成オリゴヌクレオチド２：５’−（ＡＧ）ＴＣ（ＡＧ）ＴＧ（ＡＧ）ＴＣＣＣＡ
（ＡＧ）ＣＡ（ＴＣ）ＴＣ−３’ これらの合成オリゴヌクレオチドの合成は常法に従い、
Milligen Biosearch社製の装置を用いた。次に、ＢＭＰ
に反応して骨芽細胞に分化することが知られているＭＣ
３Ｔ３−Ｅ１細胞から、文献(Anal. Biochem. 162, 156
-157, 1987)に記載された方法を用いて全ＲＮＡを分離
・精製した。

【００２６】更に、この得られたＲＮＡを鋳型として常
法（ランダムプライマー法）を用いてｃＤＮＡを合成し
た。このｃＤＮＡと前述の合成したオリゴヌクレオチド
をプライマーとして用いて、文献(Science 230, 1350-1
354, 1985など)に記載されたＰＣＲ法を用いて、上記の
ＴＧＦ-βやアクチビンの受容体に類似した遺伝子断片
を増幅した。この増幅された遺伝子断片の塩基配列を決
定し、ＴＧＦ-βやアクチビンの受容体とは異なる配列
を持つ遺伝子断片を同定した。更に、この遺伝子断片を
プローブとして、目的とするマウスＢＭＰ受容体を完全
にコードする遺伝子を、マウスｃＤＮＡライブラリーか
ら単離した。得られたクローンの中で、ｍＴＦＲ１１と
称する全長３．９ｋｂのクローンがマウスＢＭＰ受容体
であることが判明した。

【００２７】実施例２ツメガエルＢＭＰ受容体の作製ツメガエル初期胚から作製した全ＲＮＡを鋳型として実
施例１と同様の方法によってツメガエルＢＭＰ受容体遺
伝子断片を同定し、ｘＴＦＲ１１と命名した。この遺伝
子断片をプローブとして、ツメガエルＢＭＰ受容体を完
全にコードする遺伝子を、ツメガエルステージ３−５の
ｃＤＮＡライブラリーから単離した。

【００２８】実施例３受容体改変体の作製及びその発現実施例１と同様な方法で以下に示すオリゴヌクレオチド
を合成した。オリゴヌクレオチド３：５’−ＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＴＣ
ＧＧＡＧＡＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＧＧＡＴＧ
ＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧ−３’ オリゴヌクレオチド４：５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’ 次に、実施例１で得られたｍＴＦＲ１１ｃＤＮＡをBlue
script KS(-)ベクターにサブクローニングし、このベク
ターとオリゴヌクレオチド３及び４を用いてＰＣＲ法を
行い、ＢＭＰ受容体の細胞外領域に対応する遺伝子配列
の３’側に、抗癌遺伝子ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）が認識
する抗原決定基のアミノ酸配列（Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-
Ser-Glu-Glu-Asp-Leu）をコードする塩基配列（５’−
ＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧ
ＡＣＣＴＧ−３’）と蛋白質翻訳終止配列（ＴＡＧ）を
付加した遺伝子断片を増幅し、その塩基配列を決定し
た。当該遺伝子断片（ｍｙｃ-ｓｍＢＭＰＲと称する）
の塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１において、
下線を付した部分がエピトープタグをコードする配列で
ある。また、当該塩基配列から推定されるＢＭＰ受容体
改変体のアミノ酸配列を配列番号２に示す。

【００２９】この遺伝子断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩに
て消化した後、動物細胞用発現ベクターであるｐｃＤＮ
ＡＩａｍｐにサブクローニングした。この工程の概略を
図１に示す。次に、上記ベクターをＤＥＡＥ−ｄｅｘｔ
ｒａｎ法でＣＯＳ７細胞を形質転換し、発現させること
により本発明のＢＭＰ受容体改変体を得た。即ち、上記
の細胞ＣＯＳ７細胞は底面積６０００ｃｍ²の培養皿に
１×１０⁸個培養した。１０μｇのＤＮＡを３ｍｌのＤ
ＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎと混和し培養皿に添加し、室温
にて１５分放置した後、洗浄し、１０％血清を含む培養
液で一日培養した。その後、無血清培地に置換し、更に
３日間培養し合計５Ｌの培養上清を回収した。回収した
培養上清は、分子量１００００Ｄのフィルター（旭化
成）で限外濾過濃縮し、当量のＴｒｉｓ系緩衝液に混合
し、抗癌遺伝子ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０を担
体（アフィゲル）に結合させて調製したアフィニティー
カラム（５ｍｌ）に吸着させた。吸着画分はｐＨ３．０
のクエン酸緩衝液で溶出し、溶出後、Ｔｒｉｓ系緩衝液
に透析することにより、本発明のＢＭＰ受容体改変体が
得られ、これを４℃で保存した。

【００３０】なお、培養液と上記のアフィニティーカラ
ムで精製した後の試料について、ＳＤＳ−電気泳動法で
分析した結果を図２に示す。図２に示されるように、精
製前と比較して、カラム吸着画分は分子量１８ＫＤの蛋
白質のみであり、これは理論上の分子量とよく一致し
た。このことから、抗体を結合したアフィニティクロマ
トグラフィーにより、ＢＭＰ受容体改変体を精製できる
ことが確認された。

【００３１】実施例４生物活性の測定４８穴のマイクロプレートに１穴あたり１０⁴個のＭＣ
３Ｔ３細胞を播種した。２日間培養した後、１０ｎｇ／
ｍｌのＢＭＰを含む培地に交換し、４８時間培養を行っ
た。このとき、実施例１で調製したＢＭＰ受容体改変体
を１０又は５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、アルカリホ
スファターゼ（ＡＬＰａｓｅ）活性を無添加群と比較し
た。ＡＬＰａｓｅ活性の測定は、まず培養上清を廃棄し
た後、リン酸緩衝液でよく洗浄し、次いで発色基質であ
るパラニトロフェノール１０ｍＭ溶液を各ウェルに添加
し、１時間反応後、４０５ｎｍの吸光度を測定すること
によって行った。その結果を図３に示す。図３に示され
るように、ＢＭＰ受容体改変体を添加することによりＢ
ＭＰ活性の阻害が認められた。

【００３２】実施例５ＥＬＩＳＡ測定の実施１０から１００ｎｇのＢＭＰを含む試料を９６穴マイク
ロプレートに４℃にて１２時間吸着させる。洗浄後、５
％ＢＳＡでブロッキング後、実施例１で得たＢＭＰ受容
体改変体を１穴あたり２００ｎｇ加え、室温にて２時間
反応し、上清を除去後、洗浄した。次いで、抗癌遺伝子
ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０（一次抗体）を１０
０ｎｇ／ウェル添加し、室温にて１時間反応させ、上清
の除去・洗浄を行った。その後、ワサビパーオキシダー
ゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）を１００ｎｇ／
ウェル添加して、更に室温にて１時間反応させた後、上
清の除去・洗浄を行った。発色は０．１％ｏ-フェニレ
ンジアミンにより行い、４９０ｎｍの吸光度を測定し
た。その結果を図４に示す。図４において、Ａｂは一次
抗体を意味する。図４に示されるように、本発明のＢＭ
Ｐ受容体改変体を用いることにより、ＢＭＰを定量でき
ることが判明した。

【００３３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：６３５配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列 GAA TTC TGA AGA AAG CAG CAG GTG AAA GTC ATT GCC AAG TGA TTT TGT 48 TCT GTA AGG AAG CCT CCC TCA TTC ACT TAC ACC AGT GAG ACA GCA GGA 96 CCA GTC ATT CAA AGG GCC GTG TAC AGG ACG CGT GCG AAT CAG ACA ATG 144 Met 1 ACT CAG CTA TAC ACT TAC ATC AGA TTA CTG GGA GCC TGT CTG TTC ATC 192 Thr Gln Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Cys Leu Phe Ile 5 10 15 ATT TCT CAT GTT CAA GGG CAG AAT CTA GAT AGT ATG CTC CAT GGC ACT 240 Ile Ser His Val Gln Gly Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly Thr 20 25 30 GGT ATG AAA TCA GAC TTG GAC CAG AAG AAG CCA GAA AAT GGA GTG ACT 288 Gly Met Lys Ser Asp Leu Asp Gln Lys Lys Pro Glu Asn Gly Val Thr 35 40 45 TTA GCA CCA GAG GAT ACC TTG CCT TTC TTA AAG TGC TAT TGC TCA GGA 336 Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser Gly 50 55 60 65 CAC TGC CCA GAT GAT GCT ATT AAT AAC ACA TGC ATA ACT AAT GGC CAT 384 His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn Gly His 70 75 80 TGC TTT GCC ATT ATA GAA GAA GAT GAT CAG GGA GAA ACC ACA TTA ACT 432 Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr Thr Leu Thr 85 90 95 TCT GGG TGT ATG AAG TAT GAA GGC TCT GAT TTT CAA TGC AAG GAT TCA 480 Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys Lys Asp Ser 100 105 110 CCG AAA GCC CAG CTA CGC AGG ACA ATA GAA TGT TGT CGG ACC AAT TTG 528 Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr Asn Leu 115 120 125 TGC AAC CAG TAT TTG CAG CCT ACA CTG CCC CCT GTT GTT ATA GGT CCG 576 Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Val Val Ile Gly Pro 130 135 140 145 TTC TTT GAT GGC AGC ATC CGA GAG CAG AAG CTG ATC TCC GAG GAG GAC 624 Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 150 155 160 CTG TAG AAT TC 635 Leu 162

【００３４】配列番号：２配列の長さ：１６２配列の型：蛋白質トポロジー：直鎖状配列 Met Thr Gln Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Cys Leu Phe 1 5 10 15 Ile Ile Ser His Val Gln Gly Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly 20 25 30 Thr Gly Met Lys Ser Asp Leu Asp Gln Lys Lys Pro Glu Asn Gly Val 35 40 45 Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser 50 55 60 Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn Gly 65 70 75 80 His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr Thr Leu 85 90 95 Thr Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys Lys Asp 100 105 110 Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr Asn 115 120 125 Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Val Val Ile Gly 130 135 140 Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 145 150 155 160 Asp Leu 162

【図面の簡単な説明】

【図１】制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化したｍｙｃ-ｓｍ
ＢＭＰＲを発現ベクターｐｃＤＮＡＩａｍｐにサブクロ
ーニングする工程の概略を示す図である。

【図２】実施例３における培養液及びそれをアフィニテ
ィーカラムで精製した後の試料についてのＳＤＳ−電気
泳動の結果を示す図である。

【図３】実施例４における、ＢＭＰ受容体改変体のＢＭ
Ｐに対する競合阻害を示す図である。

【図４】実施例５における、ＢＭＰ受容体改変体を用い
てＢＭＰを測定した結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 14/71 8318−4ＨＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】骨形成因子（ＢＭＰ）受容体の細胞
外領域をコードする遺伝子と、抗体が認識する抗原決定
基をコードした遺伝子を結合させた骨形成因子受容体改
変体の遺伝子。
【請求項２】抗体が認識する抗原決定基をコード
した遺伝子が、抗癌遺伝子ｍｙｃ抗体が認識する抗原決
定基をコードした遺伝子である請求項１記載の骨形成因
子受容体改変体の遺伝子。
【請求項３】配列番号１で示される塩基配列又は
当該塩基配列の一部を有する骨形成因子受容体改変体の
遺伝子。
【請求項４】請求項１、２又は３で規定される遺
伝子から発現される骨形成因子受容体改変体。
【請求項５】配列番号２で示されるアミノ酸配列
又は当該配列を含むアミノ酸配列からなる骨形成因子受
容体改変体。
【請求項６】請求項４又は５に記載される骨形成
因子受容体改変体を用いることを特徴とする骨形成因子
の測定方法。
【請求項７】請求項４又は５に記載される骨形成
因子受容体改変体を用いることを特徴とする骨形成因子
類似又は骨形成因子に拮抗する化合物のスクリーニング
方法。
【請求項８】請求項４又は５に記載される骨形成
因子受容体改変体を用いる骨形成因子の精製方法。
【請求項９】請求項４又は５に記載される骨形成
因子受容体改変体を有効成分として含有する骨疾患治療
剤。