JPH05509312A - 組織由来の腫瘍増殖インヒビター，その調製方法及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組織由来の腫瘍増殖インヒビター、その調製方法及び使用本出願は、現在放棄さ れた１９８５年４月１９日に出願されたＵ、Ｓ、第７２５、００３号の一部継続 出願である、現在放棄された１９８６年４月７日に出願されたＵ、Ｓ、第８４７ ．９３１号の一部継続出願である、現在放棄された１９８６年１０月２０日に出 願されたＵ、Ｓ、第９２２．１２１号の一部継続出願である、１９８７年１０月 ２０日に出願されたＵ、Ｓ、第１１１　、０２２号の一部継続出願である、１９ ８８年４月２０日に出願されたＵ、Ｓ、第１８３，２２４号の一部継続出願であ る、１９８９年５月１７日に出願されたＵ、Ｓ、第３５３，４１０号の一部継続 出願である。

発明の背景 本出願を通して、種々の出版物は、括弧内のアラビア数字により示される。それ らの出版物のための十分な引用は、本明細書の最後で見出され得る。それらの出 版物の開示は、より十分に当業界の技術状態を記載するために本出願中に参照に より組込まれる。

トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）は、単独で又は他の分子と組合 して、細胞増殖及び分化を変性するために出現する多機能タンパク譬の種類の１ つである。伝えられることによれば、成熟前駆体及びその前駆体形のプロ領域を 含んで成るＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１．−β２．−β３．−β４及び−β５と 命名される分子のサブクラスを包含する（２４．２５．２６）。

成ｐ　ＴＧＦ−βは種々の種から単離されている。ネズミ、ウシ、ヒト及びブタ ＴＧＦ−βが単離され、そしてアミノ酸組成においてほとんどの差異を示さない （２６，２７，２８，２９）。

成Ｐ　ＴＧＦ−βのｃＤＮＡ配列、正常な及び形質転換された細胞におけるその 発現、及び真核細胞における生物学的に活性な成熟ＴＧＦ−βの生成方法が記載 されている（２６．２８．２９．５４．５５）。

成熟ＴＧＦ−β１及び−β２に対して向けられた抗体はこれまで記載されている （３２．３３．３４．３５．３６）。成熟ＴＧＦ−βの種々のイソ形量での高い 相同性のために、それらの抗体は実質的な交叉反応性を示す。ヒト族ｐ　ＴＧＦ −β３に対して特異的に向けられ、そして他のＴＧＦ−β３イソ形との実質的な 交叉反応性を示さない抗体は記載されたことがない。

発明の要約 本発明は、（１）（ａ）ヒトＴＧＦ−β３に対して特異的に結合し、そして（ｂ ）ＴＧＦ−β１又はＴＧＦ−β２と実質的に交叉反応性を示さない抗体及び（２ ）　ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域に対して向けられた抗体を供給する。さらに、 本発明は、ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域を含む医薬組成物を供給する。また、本 発明は、ＴＧＦ−βに関連する疾患を存する患者を診断し、検出し、そして処理 するための方法も提供する。

図面の簡単な説明 第１図は、ＴＧＦ−β３をコードするヌクレオチド配列及びその推定されるアミ ノ酸配列を示す。推定上のグリコジル化部位及びポリアデニル化シグナルは下線 を引かれている。成熟ＴＧＦ−β３の開始は、ヌクレオチド位１！１１６３〜１ １６５で星印により示される。

第２図は、ｐＯＲＦＸ及びｐＢｌｕｅ　−ＴＧＦ−β３プラスミドからノｐＣＭ Ｖ−ＴＧＦ−β３発現プラスミドの構成を間約に示す。

第３図は、ＴＧＦ−β３特異的プローブを用いての、親ＣＩ（０細胞（レーン１ ）、ＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（レーン ２）及び２０ｎＭのｌ’ｌＴＸにより増幅されたＣＩ（０６，３５（ＣＨＯ６， ３５／　２０ｎＭ）　（レーン３）のノザンハイプリダイゼーションにより決定 されたＴＧＦ−β３　＋５ＲＮＡ発現のレベルを示す。

第４図は、長方形の箱で示されるコード配列と共にＴＧＦ−β３をコードするｍ ＲＮＡの図を示す。胎盤（１，７ｋｂ）　、セイ帯（１，９ｋｂ）及びＡ６７３ （１，７ｋｂ）ライブラリバーから得られたｃＤＮＡ挿入体の相対的部分が示さ れている。箱の斜線部分は、ＴＧＦ−βに対して高い相同性を示すＣ−末端領域 を示す。胎盤ｃＤＮＡの５　’　ＥｃｏＲＩ　−Ｂｇ　ｍ制限フラグメントはバ ーにより示される。

第５図、（Ａ）は精製されたＴＧＦ−β１を用いてのミンク細胞増殖阻害の投与 量応答を示す。細胞増殖は、ＭＴＴ（３−Ｃ４，５−ジメチルチアゾール−２− イル）−２，５−ジフェニルライラヅリウムブロミド；チアゾイルブルー）の代 謝により定量化された。（Ｂ）は酸活性化血清フリー上清液、ＣＨＯ６，３５／ ２０ｎＭ　）ランスフエクタント及びＣＨＯ６，３５）ランスフエクタントを用 いてのミンク細胞増殖阻害の投与量応答を示す。細胞増殖は、ＭＴＴの代謝によ り定量化された。

第６図は、抗原として使用される種々のＴＧＦ−β３ペプチドの相対的位置を示 す。

第７図は、β３Ｖ抗体による天然の組換えＴＧＦ−８３タンパク質の免疫沈殿を 示す。

第８図、（Ａ）は還元条件下でゲルからの検出のためにβ３■及びβ３Ｖ抗体を 用いてＣＨＯ６，３５／２０口門トランスフエクタン）・のならし培地からのＴ ＧＦ−β３のイムノプロットを示す。（Ｂ）は非還元条件下でゲルからの検出の ためにβ３■及びβ３■抗体を用いてＣＨＯ６，３５／２０ｎＭ　トランスフェ クトントのならし培地からのＴＧＦ−β３のイムノプロットを示す。

第９図は、検出のためにβ３■抗体を用いてＣＨＯ６，３５／２０ｎＭ　）ラン スフェクタントの細胞抽出物（９Ａ）及びならし培地（９Ｂ）のウェスターンプ ロントを示す。

第１０Ａ、Ｂ、Ｃ，及びＤ図は、β３■抗体及び対照抗体によるヒトセイ帯のパ ラフィン断片への染色を示す。Ａ及びＣはβ３■抗体によるそれぞれの繊維芽細 胞及び上皮染色及び平滑筋繊維染色を示す。Ｂ及びＤば対照のウサギポリクロー ナル抗体による染色は示さない。

第１１Ａ、Ｂ及び０図は、抗体β３■によるミンク細胞増殖のＴＧＦ−β３阻害 の特異的中和を示す。

第１２図：　ＤＮＡ合成、コラーゲン合成及びアルカリホスファターゼ活性に対 するＴＧＦ−β３（黒丸）及びＴＧＦ−β１　（白丸）の効果。

胎児ラットの頭頂骨からの骨芽細胞に冨む培養物を集密まで培養し、そして次に 、血清を、既知の濃度でＴＧＦ−β３又はＴＧＦ−β１による２３時間の処理の 前、２０時間、除去した。　（Ａ）　ＤＮＡ合成速度が培養の最後の２時間、〔 ３Ｈ〕−チミジンにより細胞をラヘリングすることによって測定され；酸不溶性 材料がシンチレーションカウンチングによりアンセイされた。（Ｂ）コラーゲン 合成が培養の最後の２時間、〔３Ｈ］プロリンによりラベルすることによって測 定され；酸不溶性細胞抽出物は非特異的なプロテアーゼフリーの細菌性コラ−ゲ ナーゼにより消化され、そして放射能が酵素放出された上清液において決定され た。（Ｃ）アルカリホスファターゼ活性が、ｐ−二トロフェノール（ＰＮＰ）へ のｐ−二トロフェニルホスフエートの加水分解により細胞抽出物において測定さ れた。データは、条件光たり４〜６回の培養物の平均±ＳＥＭである。

第１３図：　ＴＧＦ−β３による造血幹細胞の阻害。−次骨髄細胞が免疫消耗に より前駆幹細胞のために富化され、そして上記のように培養された。細胞がＭｏ −Ｔ細胞ならし培地の存在下で増殖され、そして上昇する濃度（０，１０，１０ ０，１０００）の精製されたＴＧＦ−β３及びコロニーの大きさが３，７及び１ ４日目に決定された。ＴＧＦ−β３は、投与量及び時間依存性態様で造血幹細胞 の増殖及び続くそのコロニーサイズの上昇を阻害した。

第１４図：インビトロでの化学保護剤としてのＴＧＦ−β３の評価−ミンク細胞 が１０％ウシ胎児血清により補充されたＤｌＩＥＭ　１００μＩを含む９６−ウ ェルにおいて、１０３個の細胞／ウェルで接種された。処理された細胞を含むウ ェルは、２５μｌのＴＧＦ−β３を受けた（５０ｎｇ／ｍｌ）。ＴＧＦ−β３と の２４時間のインキュベーションの後、２５μｌのコルヒチン又はビンブラスチ ンが添加された。さらに２４時間後、培地を除去し、そして細胞をグルベソコＰ ＳＢにより１度洗浄し、そして新鮮な完全な培地を添加した。細胞はさらに７日 間インキュベートされた。細胞増殖は、前に記載されたように＋ｚｓＩ−ヨード ー２′デオキシウリジンの摂取により定量化された。

発明の詳細な説明 本発明によれば、成熟ＴＧＦ−β３は、実質的に１１２個のアミノ酸から成り、 そしてヌクレオチド１１６３〜１１６５によりコードされるアラニンにより始ま りそしてヌクレオチド１４９６〜１４９８によりコードされるセリンにより終わ る第１図に示されるアミノ酸配列に実質的に同一の配列を有するそれぞれ２つの ポリペプチドを含んで成る組換えホモ二量体タンパク質として定義される。

さらに、本発明において使用される場合、ＴＧＦ−β３前駆体は、ヌクレオチド ２６３〜２６５によりコードされるメチオニンにより始まりそしてヌクレオチド １４９６〜１４９８によりコードされるセリンにより終わる第１図に示されるア ミノ酸配列に実質的に同一の配列によりコードされるそれぞれ２つのポリペプチ ドを含んで成る組換えホモ二量体タンパク質である。

さらに、本発明において使用される場合、ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域は、成 熟ＴＧＦ−β３を伴わないでＴＧＦ−β３前駆体を含んで成る組換えタンパク質 である。さらに、ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域は、ヌクレオチド２６３〜２６ ５によりコードされるメチオニンにより始まり、そしてヌクレオチド１１６０〜 １１６２によりコードされるアルギニンにより終わる第１図に示されるアミノ酸 配列に実質的に同一の配列によりコードされるタンパク質領域である。

また、本発明に使用される場合、ＴＧＦ−βとは、成ｐ　ＴＧＦ−β（たとえば ＴＧＦ−β１．−β２．−β３）、ＴＧＦ−β前駆体（たとえばＴＧＦ−β１前 駆体、ＴＧＦ−β２前駆体、ＴＧＦ−β３前駆体）、又はＴＧＦ−β（たとえば ＴＧＦ−β１．−β２．−β３）前駆体のプロ領域を意味する。

成熟ＴＧＦ−βに向けられる抗体はこれまで記載された通りである。

しかしながら、それらの抗体は、それらの間で高い相同性のために種々のＴＧＦ −βイソ形に対して実質的な交叉反応性を示す９驚くべきことには、本明細書に 開示される抗体は、成熟ＴＧＦ−β３に特異的に向けられ、そして他のＴＧＦ− βイソ形との実質的な交叉反応性を示さない。

本発明は、（ａ）ヒ）　ＴＧＦ−β３に特異的に結合し、そして（ｂ）ＴＧＦ− β１又はＴＧＦ−β２との実質的な交叉反応性を示さない抗体（たとえばモノク ローナル又はポリクローナル抗体）を供給する。

本発明の１つの態様において、抗体は、アミノ酸配列ＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮ Ｃにより定義されるエピトープに向けられる。もう１つの態様において、対象の 抗体は、アミノ酸配列ＹＬＲ３ＡＤＴＴＨ５ＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳ Ｙ　ニより定義されるエピトープに向けられる。

一般的に、抗体は２つの分子を含んで成り、個々の分子は２つの異なったポリペ プチドを有し、その短い方のポリペプチドは抗体のし鎖として機能し、そして長 い方のポリペプチドは抗体のＨ鎖として機能する。しかしながら、本発明で使用 される場合、抗体は、機能的な定義、すなわち天然に存在するか、人工的に誘発 されたか、又は組換え体であるかにかかわらず、特異的免疫反応性を有するいづ れかの分子として与えられる。通常、本発明において使用される場合、抗体は、 Ｈ鎖又はＬ鎖からの少なくとも１つの可変領域を含むであろう（３７〜４３）。

従って、天然に存在するか又は組換え抗体分子のフラグメントは、本発明の範囲 内に包含される。本発明で使用される場合、免疫反応活性を示すＦａｂタンパク 質又はＦ（ａｂ’　）ｚタンパク質は抗体である。

本発明は、（ａ）ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域に特異的に結合し、そして（ｂ ）成Ｗ！ＴＧＦ−β３と交叉反応性を実質的に示さない抗体をさらに提供する。

本発明の１つの例において、（ａ）ＴｃＦ−β３前駆体のプロ領域に特異的に結 合する対象の抗体は、アミノ酸配列ＧＤＩＬＥＮＩＨＥＶＭＥＩＫＲＫＧＶＤＮ ＥＤＤ　（第１表）により定義されるエピトープに向けられる。他の例において 、対象の抗体は、アミノ酸配列ＧＤＩＬＥＮＩＨＥＶＭＥＩＫ　（第１表）によ り定義されるエピトープに向けられる。さらにもう１つの例において、対象の抗 体は、アミノ酸量列ＥＥ門ＨＧＥＲＥＥＧＣＴＱＥＮＴＥＳＥＹにより定義され るエピトープに向けられる。

さらに、本発明は、サンプルからＴＧＦ−β３前駆体を検出するための方法を提 供する。この方法は、サンプルと適切な量の上記抗体とを、その抗体がＴＧＦ− β３前駆体に結合するような条件下で接触せしめ、そしてＴＧＦ−β３前駆体に 結合される抗体を検出し、そしてそれによってサンプルからＴＧＦ−β３前駆体 を検出することを含んで成る。

さらに、本発明はサンプルからＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域を検出するための 方法を提供し、ここで前記方法とは、サンプルと適切な量の上記抗体とを、その 抗体がＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域に結合するような条件下で接触せしめ、そ してＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域に結合される抗体を検出し、そしてそれによ って、サンプルからＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域を検出することを含んで成る 。

本発明はまた、ヒト対象におけるＴＧＦ−βレベルの変動に関係する障害を診断 するための方法も提供する。その方法は、（１）対象からサンプルを得、（２） サンプル中のＴＧＦ−βの存在を検出し、そして（３）サンプル中のＴＧＦ−β の量を決定し、それによって障害を診断することを含んで成る。本発明によれば 、その障害は、オステオポローシス、免疫抑制疾患、骨疾患、ＡＩＤＳウィルス 感染、皮膚疾患、心筋性虚血症、筋障害性疾患、結合組織疾患又は神経性疾患か ら成る群から選択されたいづれかの障害であるが、但しこれだけには限定されな い。

さらに、上記方法によれば、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β１であり得る。

他方、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β２でもあり得る。さらに、ＴＧＦ−βはＴＧＦ− β３でもあり得る。ＴＧＦ−β３が好ましい。

上記方法の１つの例において、ＴＧＦ−βが成Ｐ　ＴＧＦ−β３である場合、成 熟ＴＧＦ−β３レヘルでの変動の検出は、成熟ＴＧＦ−β３に特異的に結合し、 そして成熟ＴＧＦ−β１又は成熟ＴＧＦ−β２との交叉反応性を実質的に示さな い抗体によりもたらされ得る。他方、検出は、ヒトＴＧＦ−β３前駆体のプロ領 域に特異的に結合し、そして成熟ＴＧＦ−β３との交叉反応性を実質的に示さな い抗体によりもたらされ得る。

ＴＧＦ−β３は二官能価増殖因子である。本明細書に開示される実験は、ＴＧＦ −β３が他の外因性因子への暴露の性質及びその因子の濃度に依存して同じ標的 細胞を阻害し、又は刺激することを示す。

細胞増殖及び分化の可能なモジュレータ−として、他の外因性因子と共にＴＧＦ −β３レヘルの調節が正常な組織の機能及び成長のために重要である。

本発明は、ＴＧＦ−βに関連する障害を有する愚者を処理するための方法を提供 し、ここで前記方法とは、ＴＧＦ−βを特異的にＬＥ　ｆｆｉし、そしてＴＧＦ −β活性を中和する抗体の量を患者に投与することを含んで成る。

上記方法によれば、その方法は、ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ− β活性を中和する抗体の量を患者に投与することを含んで成る、癌を有する患者 を処理することを包含する。

さらに、本発明は、ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ−β活性を中和 する抗体の量を患者に投与することを含んで成る、免疫抑制疾患を有する患者を 処理することをさらに包含する。

本発明の方法はまた、ＡＩＤＳウィルス感染を有する患者を処理することも包含 する。その方法は、ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ−β活性を中和 する抗体の量を患者に投与することを含んで成る。

また、本発明の方法は、心筋性虚血症を有する患者の処理を包含する。その方法 は、ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ−β活性を中和する抗体の量を 患者に投与することを含んで成る。

本発明は、ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ−β活性を中和する抗体 の量を患者に投与することを含んで成る、筋障害性疾患を有する患者を処理する ことを包含する。

本発明は、ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ−β活性を中和する抗体 の量を患者に投与することを含んで成る、結合組織疾患を有する患者を処理する ことを包含する。

さらに本発明は、ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ−β活性を中和す る抗体の量を患者に投与することを含んで成る、アテローム硬化症を有する患者 を処理することを包含する。

本発明は、ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ−β活性を中和する抗体 の量を患者に投与することを含んで成る、神経性疾患を有する患者を処理するこ とを包含する。

本発明は、ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ−β活性を中和する抗体 の量を、患者に投与することを含んで成る、骨障害を有する患者を処理すること を包含する。

上記処理方法の１つの例において、抗体（たとえばポリクローナル、好ましくは モノクローナル抗体）は、成Ｐ　ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ− β前駆体のプロ領域との交叉反応性を実質的に示さない抗体である。もう１つの 例において、抗体は、成熟ＴＧＦ−β３に特異的に結合し、そして成熟ＴＧＦ− β１又は成熟ＴＧＦ−β２との交叉反応性を実質的に示さない抗体である。本発 明のさらにもう１つの例において、抗体は人体適合された抗体であり得る。他の 例においては、抗体はＦ（ａｂ）フラグメント又はＦ（ａｂ’　）ｚフラグメン トの形で存在することができる。

本明細書で使用される場合、人体適合された抗体とは、ヒト不変頭載を含むポリ ペプチドを含んで成る構造的に構築された抗体又は当業者により、ヒトにおいて 非免疫原性にされるように構築された抗体を包含する（３７．３８．３９．４０ ．４１．４２．４３）。

本発明はまた、ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域の有効量及び適切な医薬キャリヤー を含んで成る医薬組成物を供給する。本発明の医薬組成物の１つの例において、 ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域はＴＧＦ−β１前駆体のプロ領域である。さらに、 ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域はＴＧＦ−β２前駆体のプロ領域である。好ましく は、ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域はＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域である。

本発明は、癌の症状を緩和するために上記医薬組成物の有効量を患者に投与し、 そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、癌を有する患者を処理す るための方法を提供する。

また、本発明は、結合組織疾患の症状を緩和するために上記医薬組成物の有効量 を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、結合組 織疾患を有する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、神経性疾患の症状を緩和するために上記医薬組成物の有効量を患者に 投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、神経性疾患を有 する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、また、免疫抑制疾患の症状を緩和するために上記医薬組成物の有効量 を患者に投与し、そしてそれによってΦ者を処理することを含んで成る、免疫抑 制疾患を有する患者を処理するための方法を提供する。

さらに、本発明は、ＴＧＦ−βに関連する骨疾患の症状を緩和するために上記医 薬組成物の有効量を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含 んで成る、ＴＧＦ−βに関連する骨疾曇を有する患者を処理するための方法を提 供する。

さらに、本発明は、心筋性虚血症の症状を緩和するために上記医薬組成物の有効 量を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、心筋 性虚血症を有する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、また筋障害性疾、患の症状を緩和するために上記医薬岨る。

本発明は、また免疫抑制疾患の症状を緩和するために成熟ＴＧＦ−成物の有効量 を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、筋障害 性疾患を有する愚者を処理するだめの方法を提供する。

さらに、本発明は、アテローム硬化症の症状を緩和するために上記医薬組成物の を動量を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、 アテローム硬化症を有する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、さらに関節炎の症状を緩和するために上記医薬組成物の有効量を患者 に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、関節炎を有す る患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、さらにＡＩＤＳウィルス感染の症状を緩和するために上記医薬組成物 の有効量を患者に投与し、そしてそれによって愚者を処理することを含んで成る 、ＡＩＤＳウィルス感染を存する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、またＴＧＦ−βに関連する疾患の症状を緩和するために成熟ＴＧＦ− β３の有効量を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで 成る、ＴＧＦ−βに関連する疾患を有する患者を処理するための方法を提供する 。

本発明は、また結合組織疾患の症状を緩和するために成熟ＴＧＦ−β３の有効量 を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、結合組 織疾患を有する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、また神経性疾患の症状を緩和するために成熟Ｔ’Ｇ　Ｆ−β３の有効 量を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、神経 性疾患を有する患者を処理するための方法を提供する。１つの例において、その 神経性疾患は脱髄疾徹であり得ことを含んで成る、筋障害性疾患を有する患者を 処理するための方法を提供する。

本発明は、また炎症性疾患の症状を緩和するためにＴＧＦ−β３前駆体の有効量 を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、炎症性 疾患を有する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、また敗血性ショフクの症状を緩和するためにＴＧＦ−β３前駆体の有 効量を患者に投与し、そしてそれによって１色者を処理することを含んで成る、 敗血性ショフクを有する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、骨疾患の症状を緩和するためにＴＧＦ−β３前駆体の有効量を患者に 投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、骨疾患を有する 患者を処理するための方法を提供する。

本発明において骨疾患とは骨の破損であり得る。

本発明は、また皮膚疾患の症状を緩和するためにＴＧＦ−β３前駆体の有効量を 患者に投与し、そしてそれによって曇者を処理することを含んで成る、皮膚疾患 を有する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、また心筋性虚血症の症状を緩和するためにＴＧＦ−β３前駆体の有効 量を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、心筋 性虚血症を有する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、また筋障害性疾患の症状を緩和するためにＴＧＦ−β３前駆体のを効 目を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、筋障 害性疾患を有する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、またアテローム硬化症の症状を緩和するためにＴＧＦ　−β３前駆体 の有効量を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る 、アテローム硬化症を有する患者を処理するための方法を提供する。

本発明は、またＡＩＤＳウィルス感染の症状を緩和するためにＴＧＦ−β３前駆 体の有効量を患者に投与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成 る、ＡＩＤＳウィルス感染を有する患者を処理するための方法を提供する。

本発明はまた癌の症状を緩和するためにＴＧＦ−β３前駆体の有効量を患者に投 与し、そしてそれによって患者を処理することを含んで成る、癌を有する患者を 処理するための方法を提供する。

本発明はまた、活性的に分割する腫瘍細胞を実質的に有さない骨髄を得るための 方法も提供し、ここで前記方法は：　（ａ）正常な造血細胞及び活性的に増殖す る腫瘍細胞を含む骨髄とその正常な造血細胞の増殖が一時的に阻害されるような 有効量のＴＧＦ−βとを接触し；（ｂ）続いて、骨髄と腫瘍阻害薬物とを腫瘍細 胞の増殖を永久的に妨げる条件下で接触し；そして（ｃ）正常な造血細胞の増殖 を可能にするために骨髄を培養し、それによって、活性的に分割する腫瘍細胞を 実質的に有さない骨髄を得ることを含んで成る。本発明によれば、ＴＧＦ−βは 、ＴＧＦ−βｌ、ＴＧＦ−β２、又はＴＧＦ−β３であり、ＴＧＦ−β３が好ま しい。

さらに、本発明は、活性的に分割する腫瘍細胞を実質的に有さない骨髄を得るた めの方法を提供する。その方法は、（ａ）正常な造血細胞及び活性的に増殖する 腫瘍細胞を含む骨髄と有効量のＴＧＦ　−βとを接触し１（ｂ）ＩＩＩＩ！細胞 の終結的分化及び除去が可能にされる条件下でＴＧＦ−βの存在下で適切な時間 、段階（ａ）の骨髄を培養し；そして（ｃ）活性的に増殖する腫瘍細胞を実質的 に有さない骨髄を得ることを含んで成る。本発明によれば、ＴＧＦ−βはＴＧＦ −β１．ＴＧＦ−β２又はＴＧＦ−β３であり得る。ＴＧＦ−β３が好ましい。

最後に、本発明は化学治療剤により引き起こされる正常な細胞の細胞毒性化を阻 害するための方法を提供し、ここで前記方法は、化学治療剤の存在下で増殖する 正常細胞が一時的に阻害されるような条件下で多量のＴＧＦ−β３と正常な細胞 とを接触せしめ、それによって正常な細胞の細胞毒性化を阻害することを含んで 成る。

本発明は、次の詳細な実験のセクションに例示される。このセクションは、本発 明の理解の目的のために示されるが、本発明を限定するものではない。

韮貞度ス眉 棗藷五ユ日幻組肚４ ＡＬ（急性白血病） ＡＮＬＬ　（成人の非リンパ球性白血病）ＡＰＲＴ　（アデノシルホスホリボシ ルトランスフェラーゼ）ＢＦＩＩ−Ｅ　（バースト形成単位−赤芽球系）ＢＳＡ 　（ウシ血清アルブミン） ＣＬ　（慣性白血病） ＣＬＬ　（慢性リンパ球性白血病） Ｃ１ＩＬ　（慢性骨髄性白血病） ＣＮＢｒ　（臭化シアン） ＣＦ［ｌ　（コロニー形成単位） ＣＦＵ−Ｅ　（コロニー形成単位−赤芽球系）ＣＦＵ−ＧＥＭＭ　（コロニー形 成単位−顆粒球、赤芽球、マクロファージ、単球） ＣＦｔｌ−ＧＭ　（コロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ）ＣＦＵ−ｍｅ ｇ　（コロニー形成単位−巨核球）ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卯巣）ＣＭ Ｖ　（サイトメガロウィルス） Ｃ５Ｆ　（コロニー刺激因子） ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）ＤＭＥＭ　（ダルベノロ変性イーグル培 地）ＤＭＦ　（ジメチルホルムアミド） ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド ＤＮＡ　（デオキシリボ核酸） ＥＰＯ　（エリトロポエチン） ＦＣＳ　（ウシ胎児血清） Ｇ−ＣＳＦ　（顆粒球−コロニー刺激因子）ＧＭ−ＣＳＦ　（顆粒球／マクロフ ァージ−コロニー刺激因子）ｋｂ　（キロ塩基対） ｋＤａ　（キロダルトン） ＨＰＬＣ　（高圧液体クロマトグラフィー）ＩＬ−３（インターロイキン−３） ＩＬ−４（インターロイキン−４） ＭＥ門　（変性イーグル培地） ｌｌｌＲＮＡ　（メンセンジャーリボ核酸）ＲＮＡ　（リボ核酸） ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子−β） ＴＩＦ　（腫瘍阻害因子） 響ＢＣ　（赤血球細胞） 完全なＴＧＦ−β３タンパク質をコードするＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡの１５００ ｂｐ　Ａｌｕｉ−Ｈｇａｌ制限フラグメント（部位は第１回に示される）を、Ｂ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ＋ 　ＣＡ）にクローン化し、プラスミドρＢｌｕｅ　−　ＴＧＦ−β３を得る。こ のヘクターのｆｌ遺転子間領域は、ｆ１ヘルパーファージによるその宿主細胞の 感染を通して一本鎖ＤＮＡの生成を可能にする。ＴＧＦ−β３の開始コドンは、 翻訳の効率に影響を与えることが示されている。Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（ ＣＣＡＣＣＣＡＴＧ　）　Ｇ）（１１）の部分を形成しない、＆［ｌ換えＴＧＦ −β３タンパク質の高収率を促進するために、開始コドンのフランキング配置を 、Ｎａｋａｎａｙｅ　ａｎｄ　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１５）の方法を用いてＣＡＣ ＡＣ（ＡＴＧ）　ＡをＣＣＡＣＣＣＡＴＧ）Ａに変えることによってより効果的 な翻訳配列に変異誘発した。変異誘発は、配列分析により確かめられた。発現収 率は、ＴＧＦ−β３の５′及び３′未翻語（非コード）配列の欠失によりさらに 最適化される。続いて、突然変異誘発されたｐＢｌｕｅ−ＴＧＦ−β３をＫｐｎ 　Ｉ及びＳｐａ　Ｉにより切断し、ｃＤＮＡ挿入体を端に有する２つのポリリン カー制限部位を得た。このフラグメントを、ＫρＩ１１及びＸｂａ　Ｉにより切 断された真核細胞発現ベクターｐＯＲＦＥＸ（１）中にクローン化した。この構 成体（ｐＣＭＶ　：　ＴＧＦ−β３）において、ＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡ配列は 、サイトロメガロウェルス即時初期プロモーターにより転写的に調節される（第 ２図）。

ＤＮＡトーンスフェクション　び゛　−ＴＧＦ−β３を発現する安定形質転換体 を、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（［１）ＩＦＲ）遺伝子（それ自体のプロモータ ーにより駆動されるハムスターＤ）ＩＦＲミニ遺伝子を含むｐＤＣＨＩＰプラス ミド）により、ＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細 胞中にｐＣＭＶ　−ＴＧＦ−β３構造体（第２図）を同時トライスフエクトする ことによって得た（１９）。

標準のＣａＰＯａ・ＤＮＡ　沈ｎ法（８）がＤＮＡトランスフェクションのため に使用された。Ｉ）ＣＭＶ：　ＴＧＦ−β３　（５，７ｋｂ）及びｐｉ）ＣＦＩ ＩＰ（２，５ｋｂ　）を、それぞれ１０Ｈｇ　：　５００ｎｇの比でＣａＰＯ４ により同時沈殿せしめ、そしてその沈殿物を０．５Ｘ１０’個のＣＨＯ（ＤＨＦ Ｒ−）細胞に添加した。

Ｄ）ＩＦＲ十表視表現型る形質転換体の選択を、１０％の透析されたウシ胎児血 清により補充されたαＭＥＭ　（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　 ＮＹ）において行なった。

遺伝子増幅のためには、−次トランスフエクタントを、上昇するメトトレキセー ト（ＭＴＸ　；　Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅＩｌｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉ ｓ、　Ｍｏ）による段階的な選択にゆだねた。第１段階の選択は２０ｎＭのＭＴ Ｘにより行なわれた。ＴＧＦ−β３発現レベルを、アクチンの発現に対してＴＧ Ｆ−β３　ａ＋ＲＮＡの発現を標準化するＲＮＡサイトドント　ハイブリダイゼ ーションにより測定した。初期の高い発現を有する３種のクローンのうち２種の クローン（りｏ　−７ＣＨＯ６，３５及びＣＨＯ９，１）は、２０ｎＭのＭＴＸ 濃度で高められたＴＧＦ−β３　ｍＲＮＡ発現を示した。ＣＨＯ細胞（＋／−７ １）　＋　ＣＨＯ６，３５（レーア２　）及びＣＨＯ６，３５／　２０ｎＭ　（ レ−ン３）からの合計１２ＮＡ　（７５Ｈｇ）を、１．２％アガロース−ホルム アルデヒド上で分別し、ニトロセルロース上にプロットし、そしてＴＧＦ−β３ 特異的プローブ（セイ帯から単離された一部のＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡクローン のＥｃｏＲＩ　−５ａｒａ　Ｉ　ｃＤＮＡ　＠限フラグメント；第４図を参照の こと）によりプローブした。最高レベルの発現を有するＣＨＯ６，３５／２０ｎ Ｍ　（２０ｎＭのＭＴＸでの一部トランスフエクタントＣＨＯクローン６．３５ ）を、ならし培地からの初期タンパク質精製のために及び追加の遺伝子増幅のた めに選択した。

追加のＭＴＸ選択（１０ＨＭのＭＴＸ　）からの最良のクローンを拡張し、そし て凍結ストックのバンクを確立した。このクローン、６．３５Ｈを、ＴＧＦ−β ３のすべての続く生成に使用し、そして１０％の透析されたウシ胎児血清により 補充されたαＭＥＭを有するＴ２２５フラスコ（２２５ｃｍ”）に維持した。Ｔ ＧＦ−β３生成は、１０％の透析されたＦＢＳにより補充されたαＭＥ？ｌの６ ．３５Ｈの３種の集密的Ｔ２２５フラスコからの細胞にょるＮｕｎｃ細胞工場（ 工場当たり６０００Ｃ５１”の表面積）での接種を包含し軟寒天でのＮＲＫ細胞 の増殖は、傷の治癒において重要なパラメーターである細胞外マトリックスタン パク質の生成を刺激することによって誘発できることが示された。

免１検１ ＴＧＦ−β３タンパク質の種々の部分的アミノ酸配列に対応するペプチドを、ｔ Ｂｏｃ化学を用いてＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成機（Ｍ ｏｄｅｌ　４３０Ａ）上で合成した（第６図）。ペプチドをグルタルアルデヒド によりキーホール　リンベット（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）のヘモシアニ ンに結合し、そしてウサギの免疫化のために使用した。酵素結合イムノソルベン トアッセイをまず用いて、抗体力価を特徴づけた（第１表）。この及び次の免疫 学的実験のために、標準の技法が使用すした（９）。β３■又はβ３■ペプチド により注射された免疫化されたウサギからの高い力価の抗体を、Ａｆｆｉ−ｐｒ ｅｐ　１０　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ。

Ｒ４ｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）に接合されるそれぞれのペプチドβ３抗原から構成 される親和性マトリックスを用いて精製した。

第　１　表 ペプチド　配　列　エリザ力価 Ｉ　ＥＥＭＨＧＥＲＥＥＧＣＴＱＥＮＴＥＳＥＹ　１　：　６．０００ＩＩ　Ｌ 　ＧＤＩＬＥＮＩＨＥＶＭＥＩＫＲＫＧＶＤ）ＪＥＤＤ　１　：　１０，０００ Ｕ　ｓ　ＧＤＩＬＥＮＩＨＥＶＭＥＩＫ　１　：　１９，０００ＩＩＩ　ＤＴＮ ＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣ１：　２６，０００ＩＶ　ＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧ ＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣ１：　１９，０００Ｖ　ＹＬＲ５ＡＤＴＴ）Ｉ ＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＹ　１　：　２６．０００ＶＩ　ＣＶＰＱ ＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＶＶＫＳＣ１：４．ｏｏ。

親和性精製されたβ３■抗体は、ＴＧＦ−β１又は〜β２のいづれかからの同種 ペプチド配列に比較して、β３■ペプチドのために３００倍以上の特異性を示す 。さらに、この抗体の有意な交叉反応性は、ＴＧＦ−β１又は−β２タンパク質 のいづれに対しても観察されなかった。しかしながら、この抗体は、ならし培地 からの生来の組換えＴＧＦ−β３タンパク質を免疫沈殿せしめるひじょうに制限 された能力のみを示す。親和性精製されたβ３Ｖ抗体は、ＴＧＦ−β１がらのそ の対応するペプチド配列に比較してβ３■ペプチドのために少なくとも４００倍 の選択性を示す。この抗体はまた、生来のＴＧＦ−β３タンパク質を効果的に免 疫沈殿することができる（第７図）。

第８Ａ／Ｂ図は、検出のためにβ３■及びβ３Ｖ抗体を用いてＣＨＯ６，３５／ ２０ｎＭ　）ランスフェクタントにより生成されるならし培地におけるＴＧＦ− β３のイムノプロットを示す。ペプチドプロンキング実験のために、抗体を、プ ロントと共にインキュベートする前、８０倍過剰モルのペプチドと共にブレイン キュベートした。検出のために、ヤギ抗−ウサギＩｇＧに接合されるアルカリホ スファターゼ（Ｚｙｍｅｄ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ＋　ＣＡ）を、二次 抗体として使用した。第８Ａ図は、サンプルが電気泳動の前、還元にゆだねられ るゲルのウェスターンプロットを示し、そして第８Ｂ図は、非還元条件下でのサ ンプルのウェスターンプロントを示す０個々の図において、レーン１〜３及び４ 〜６は、それぞれβ３Ｖ及びβ３■抗体により免疫プロットされたならし培地に 対応し、レーン２及び５は過剰の同種ペプチドの存在下で行なわれたイムノプロ ットに対応し、そしてレーン３及び６は過剰の関係ないペプチド配列の存在下で のイムノプロントを示す。

親和性精製されたβ３■及びβ３Ｖ抗体を用いて還元条件下でＣＨＯ６，３５／ ２０ｎＭ細胞からのならし培地のウェスターンプロットは、５０ｋＤａ及び１２ ｋＤａのバンドを検出した。これらのバンドは、Ｇｅｎ　ｔｒｙなど、（６）及 びＭａｄｉｓｅｎなど、（１３）により記載されるＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β ２のプロセンシングへの類似性により、ＴＧＦ−β３前駆体及び成Ｐ　ＴＧＦ− β３に対応する（第８図）。

非還元条件下で、１００ｋＤａ及び２４ｋＤａのバンドが観察され、これらはＴ ＧＦ−β３前駆体及び成熟Ｔ（、Ｆ−β３のホモニ量体形に対応すると思われる 。見掛けの前駆体は、あるグリコジル化されたタンパク質の特徴的な広いハンド として見える。ＴＧＦ−β３の前駆体形のシグナルペプチド配列の切断に続いて 、４３ｋＤａのＭ−を有するタンパク質を予測できる（還元された条件下で）。

ＴＧＦ−β３の主要配列に基づけば、４つのＮ結合されたグリコジル化部位が存 在し、これらは、検出された前駆体タンパク質がグリコジル化されることを示す 。第９Ａ／Ｂ図は、検出のためにβ３Ｖ抗体を用いてのＣＨＯ６，３５／２０ｎ Ｍ　）ランスフェクタントの細胞抽出物（第９Ａ図）及びならし培地（第９Ｂ図 ）のウェスターンプロットを示す。細胞抽出物の調製のためには、細胞をゲル電 気泳動の前、まずリン酸緩衝溶液により洗浄し、次にＳＤＳ／β−メルカプトエ タノールにより直接的に溶解した。ペプチドブロンキングのためには（レーン２ 及び４）、抗体を、プロットＣ２’Ｉプロティン−Ａが検出のために使用された ）とのインキュヘーンゴンの前、１００倍過剰の特異的ペプチドと共にインキュ ベートした。還元条件下でのＣ）１０６．３５／２０ｎＭの細胞抽出物において は、可能性ある前駆体形に対応する５０ｋＤａのハンドのみが検出される（第９ Ａ／Ｂ図）。抗体の特異性は、ウェスターンプロットの前、ペプチド免疫原によ る抗体の予備吸収により示された（第８Ａ／Ｂ図及び第９Ａ／ＢＩＩ）。予測さ れるように、ｍＲＮＡ及び生物学的活性データに基づけば、抗体は親ＣＨＯ（Ｄ ＨＦＲ−）細胞のならし培地におけるいづれのＴＧＦ−β３タンパク譬も検出し なかった。

両抗体をまた、生来の組換えＴＧＦ−β３タンパク質の免疫沈殿のために試験し た（第７図）。ＣＩＯ６，３２／２０ｎＭを集密度まで増殖し、そして５％の透 析された及び５％の透析されていないウシ胎児血清の存在下でメチオニンフリー ＤＭＥＦＩにおいて２時間、〔１″Ｓ〕メチオニンによりラベル化した。培地を 集め、そして１０ｕｇ／ｍｌの親和性精製された抗体及び２０μｇ／ｍｌ　（１ ：　２の希釈度）のプロティンＡアガロースにより４°Ｃで２時間、免疫沈殿せ しめた。１２，５％のＳＯＳポリアクリルアミドゲル上でのその免疫沈殿された タンパク質の分離は、成熟ＴＧＦ−β３　（１２ｋＤａ）及び前駆体ＴＧＦ−β ３　（５０ｋＤａ）に同じように移動する２つのタンパク質を示した（第７図） 。しかしながら、１つの特別な免疫沈殿されたタンパク質が４３ｋＤａで見出さ れた。

その４３ｋＤａタンパク質は、非グリコジル化前駆体又はタンパク質分解された 破壊生成物のいづれかに対応する。β３■抗体に比較して、β３■抗体は、ＴＧ Ｆ−β３タンパク質の免疫沈殿化においてより一層効果的である口上がわかった 。免疫沈殿の特異性を、８０倍モル過剰のいづれかの同種ペプチド又は無関係の ペプチド配列と共に抗体を予備インキュベートすることによって決定した。その 特異的ナヘフチドは、すべての３Ｍのバンドの完全な競争を示し、そして無関係 のペプチドはそれを示さなかった。予測されるように、ＴＧＦ−β３タンパク質 におけるアミノ酸組成及びメチオニンの分布に基づけば、５０ｋＤａは有意に多 くのｆｆ５５ラヘルを含む。

β３Ｖ親和性精製された抗体をまた、ヒトセイ帯のパラフィン断片に使用した（ 第１０Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ図）。繊維芽細胞及び上皮細胞（第１０Ａ図）は、セイ帯 血管系の平滑筋繊維（第１０Ｃ図）と同じように染色され、ところが結合組織も 細胞外マトリックスもこの抗体により染色されなかった。対照のウサギポリクロ ーナル抗体（Ｐ２１０此上／蛯上に対するＩｇ：Ｏ５１力タログ番号ＰＣＯ２） は、染色性を示さなかった（第１０Ｂ及びＤ図）。セイ帯組織の強い染色は、高 レヘルのｍＲＮＡを有するセイ帯からの抽出物を示す初期データと一致する。

丁ＧＰ−３モノクロ−Ｊし　のＵ 次の特徴を有する、すなわちアミノ酸１〜１９がＴｒｐＥ及びポリリンカーセグ メントによりコードされ、そしてアミノ酸２０〜１７０がＴＧＦ−β３前駆体の アミノ酸２７３〜４１２に対応する（十分な成ＰＴＧＦ　−β３配列を含む）　 ＴｒｐＥ　−ＴＧＦ−β３融合を、旦−ユユにおいて生成した。その融合タンパ ク質は、ＰＢＳ中での音波処理の後、不溶性画分に存続した。続いて、そのタン パク質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での分離により精製し、そしてエレ クトロエルニージョンにより単離した。この材料は、次の手段によるマウスの感 作のために使用された： ａ　、　Ｂａ１．ｂ／　Ｃ雌マウスを、０．７及び１４日目、ＲＩＢＩアジュバ ントにおける１００μｇのＴｒｐＥ　−ＴＧＦ−β３により腹腔内悪作し；５． ２４日目、試験ブリードは、ＴｒｐＥ−ＴＧＦ−β３及び精製されたＴＧＦ−β ３タンパク質に対して高い力価を示し；Ｃ０次にマウスを、２８．２９及び３日 目、同じ抗原１ｏｏμｇにより追加免疫化し； ｄ、肺臓融合を次の日に行ない；そしてｅ、ハイブリドーマ選択、培養及びサブ クローン化の方法を、標準方法に従って行なった（９）。

５種の安定したハイブリドーマを生成し、そしてそれらの特徴は第２表に示され る。すべてのクローンは、ＩｇＧＫクラスの抗体を生成した。モノクローナル抗 体を精製されたＴＧＦ−β３によりイムノプロットした。すべての５種のモノク ローナル抗体は、ＥＬＩＳＡによりＴＧＦ−β１との非反応性を示すが、しかし ＴＧＦ−β２とは交叉反応した。

ＴＧＦ−β３合成ペプチドを用いてのモノクローナル抗体により認識されるエピ トープの分析は、すべての抗体がアミノ酸残、Ｉ　３８０〜４１２と反応するこ とを示した。

２：ＴＧＦ−３る ３、１２５−０．０４９　ｎｇ／ｍｌの濃度でのヒト血小板ＴＧＦ−β１（Ｇｏ ｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　ＭＡ）　、ブタＴＧＦ−β２　 （Ｒ＆　Ｄ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）又は精製された組換えヒトＴＧＦ−β３を 、５μｇ／ａ＋１の親和性精製されたボリクひ一ナルウサギ抗体（β３■抗体及 び抗−ＴＧＦ−β（Ｒ＆　Ｄ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ））と共に３７°Ｃで３時 間インキュベートした。対照ＴＧＦ−β３．　ＴＧＦ−β２又はＴＧＦ−β工を 抗体なしでインキュベートシた。抗体処理された及び対照の未処理のＴＧＦ〜β ３．　ＴＧＦ−β２又はＴＧＦ−β１によるミンク細胞の増殖阻害を、本明細書 に記載されるようにして決定した。第１１Ａ、　ＩＩＢ及びＩＩＣ図は、β３Ｖ 抗体（黒丸）がＴＧＦ−３３の増殖阻害活性を中和するが、しかし抗体の不在（ 白丸）下で同一濃度のＴＧＦ−βの増殖阻害活性に関して、ミンク細胞に対して 、ＴＧＦ−β２又はＴＧＦ−β１の活性は中和しないことを示す、抗−ＴＧＦ− β（Ｒ＆　Ｄ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）はＴＧＦ−β３゜ＴＧＦ−β２及びＴＧ Ｆ−β１を中和する（第１１Ａ、　ＩＩＢ及びＩＩＣ図）（黒丸）。抗体は、Ｔ ＧＦ−β３の不在下でＣＣＬ−６４細胞の増殖に対していづれの有意な効果も有 さなかった。　ＴＧＦ−β３ペプチドβ３Ｖに対する抗体は、ＴＧＦ〜β３の増 殖阻害活性を明らかに特異的に中増殖を、Ｉｗａｔａ、　Ｋ、に、、など、　（ １０）により記載されるＴＧＦ−β３についての単層アッセイの変法を用いて決 定した。非白血病纏胞を、ウェル当たり２Ｘ１０’個の細胞の接種密度で、培地 １００ｕ＋を存する９６−ウェル＆ＩＩ′！ａ培養プレート上に継代培養した。

細胞を、１０％ウシ胎児血清及び２％　Ｌ−グルタミンを含むダルベツコ変性イ ーグル培地に維持し、そしてアッセイした。それらの細胞を、２５ｎｇ／ｍｌ（ １μＭ）のＴＧＦ−β３により処理し、未処理の対照ウェル中の細胞が９０％集 密度である場合、１μＣ４／信１の５−〔１”Ｉ）−ヨード−２′デオキシウリ ジンにより２４時間パルスし、そして収穫した。

白血病細胞（Ｋ５６２．　ＫＧ　１．　ＫＧ　ｌａ、　Ｈｕｔ７８及びＵ９３７ ）を、培地５０μｌに接種した。Ｋ５６２を、１０％ウシ胎児血清により補充さ れたＲＰ旧に、ウェル当たりｌＸ１０３個の細胞の密度で接種した。ＫＧ−１及 びＫＧ−１ａを、１０％ウシ胎児血清により補充されたｌ５ｃｏｖｅ培地に、ウ ェル当たり３．５　Ｘ　１０ｆｆ個の細胞の密度で接種した。Ｈｕ　ｔ７８及び Ｕ９３７を、１０％ウシ胎児血清により補充されたＲＰＭＩに、ウェル当たり３ ．５Ｘ１０’個の細胞の密度で接種した。細胞増殖を顕微鏡試験により決定した 。例は第２表に示され、そしてそれは、ＴＧＦ−β３によるいくつかのヒト腫瘍 系の阻害を示す。

４：ＴＧＦ−３のための　アッセイの汗プレートを、ＴＧＦ−β３ペプチドβ３ ■に対して製造された親和性精製されたウサギポリクローナル抗体（０，１Ｍの ＮａＨＣＯｚにおいて５μｇ／ｌｌｌ、ｐＨ９，１）　５０μｌにより被覆した 。プレートを４°Ｃで一晩インキュベートした。未結合抗体を吸出しにより除去 した。プレートを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ　（ＰＢＳ−ＢＳ八）１００μｍに より室温で１時間、ブロックした。次に、プレートを、０．０５％　Ｔｉ１ｅｅ ｎ　２０を含むリン酸緩衝７８ｎ　（ＰＢＳ）　（ＰＢＳＴ　）により２度洗浄 した。ＰＢＳ−ＢＳＡ　５０μｌの最終体積におけるサンプルを適切なウェルに 添加し、そして室温で１時間インキュベートした。すべてのウェルは、丁ＧＦ− β３に対するマウスモノクローナル抗体５０μｌ　（ＰＢＳにおいて５Ｍｇ／ｍ ｌ）を受ける。室温で１時間のインキュベーションの後、未結合抗体を除去し、 そしてプレートをＰＢＳＴにより４度洗浄した。すべてのウェルは、ヤギ抗−マ ウス抗体に結合されるアルカリホスファターゼの適切な希釈溶液５０ｔ！ｌを受 ける。室温で１時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴにより４度 洗浄した。

アルカリホスファターゼのための基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ ルホスフェート）１００μＩをすべてのウェルに添加し、そして室温で１５分間 インキュベートした。個々のウェルの吸光度を４９０ｎｍで測定した。このアッ セイを用いて、３〜５ｎｇ／ｍｌの組換えＴＧＦ−β３を検出した。

５：１１Ｉ！−へのＴＧＦ−３の ＴＧＦ−β様活性を骨細胞により生成し、そして多量が細胞外骨マトリックスに 見出され、これはこの組織においてＴＧＦ−βの重要な生理学的機能を示唆する （２）。ＴＧＦ−βは培養されたラット胎児骨細胞において細胞複製及びコラー ゲン生成を刺激しく３，４．５）、そしてラット胚間充繊細胞の軟骨形成を誘発 する（１７）　、さらに、ＴＧＦ−β様活性を有する分子は、骨の再吸収の後、 インビトロで開放され、そして骨形成の連結された工程と改造（ｒｅｎｏｄｅｌ 　ｉｎｇ　）の間の再吸収との間のリンクをもたらすことができる。

第２表 培養におけるヒト細胞系の増殖に対するＴＧＦ−β３（１ｎＭ）の効果 山−Ｘ里ｉ率 ヒト腫瘍 八５４９（肺腺癌）４６ Ａ３７５　（黒色ＩＩＩ）　４７ Ａ２０５８　（黒色腫）８８ ＷｉＤＲ（ＩＩＪＩｉ腺癌）２４ 台ＣＦ７（乳　癌）５７ ヒト白血病細胞 に５６２　（Ｃ門Ｌ）５５ ＫＧ−１（ＡＭＬ）　５０ ＫＧ−１ａ　（ＡＭＬ）　５０ ＨｕＴ　７Ｂ　（Ｔ細胞リンパ腫）５０Ｕ９３７　（ｕ織球リンパ腫）５０ 正常なヒト Ｈｕｆ　（包皮繊維芽細胞）　６ 実験例は、規則的なコラゲナーゼ消化による切除された骨断片からの種々の細胞 集団を単離することである（３．４．５）。後で開放される集団は、骨芽細胞表 現型に関連する生化学的特徴、たとえばタイプ■コラーゼン生成、高められたア ルカリホスファターゼ活性及びオステオカルシン合成を有する骨形成細胞のため に富化される（１４）。そのような単離された骨細胞に関する研究は、ＴＧＦ− βｌが骨芽細胞系からの細胞の可能なレギュレーターであることを示した（４） 。モル基礎に基づけば、ＴＧＦ−β１は、胎児骨からの骨芽細胞富化培養物につ いてこれまで記載された最も可能性あるマイトジェンの１種である。　ＴＧＦ− β１に対する分裂応答は、１１００ｐ以下の最適濃度を伴って、二相性である（ ２．３．４）。さらに、ＴＧＦ−βは、骨芽細胞表現型に関連する種々の活性の 発現を変え：アルカリホスファターゼ活性は低められ、そしてタイプＩコラーゲ ンの合成は、多くの他の結合組織系におけるＴＧＦ−βの効果に類似して高めら れる（３．４）。

下記実験を行ない、ラット胎児頭頂骨からの骨芽細胞富化培養物に対するヒト組 換えＴＧＦ−β３の効果を評価し、そして骨細胞表面タンパク質へのＴＧＦ−β ３の特異的結合を特徴づけた。

員土ｌ■ 隣接する縫合糸を有さないように切開された頭頂骨を、生後２２日のラット胎児 （Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ＋　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄ ｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　Ｍ＾）から得、 そして前記のようにして、５回の連続的な２０分間のコラゲナーゼ消化にゆだね た（１４．２０）。

最初の酵素処理の間に開放される細胞の集団（集団１）を、はとんど分化されて いない繊維芽細胞様細胞により富化し、そして最後の３種の集団（番号３〜５） を、骨芽細胞表現型の特性を示す特徴を。

発現する細胞により富化する。

集団１からの細胞及び集団３〜５からの細胞のプールを、０．３２ｃｍ”のウェ ルに１２．５００個の細胞／ｃ＠”でプレートし、そして前記のようにしてダル ヘノコ変性イーグル培地において培養した（３．　４．１４）。

集密度に達した後（約６〜８Ｘ１０’個の細胞／　ｃ　ｍ　”　）、その培養物 から２０時間、血清を奪い；次に対象の要因を、血清フリー培地における培養物 に添加し、そしてさらに２３時間インキユヘーヒトた。

助ル釦収 試験要因のマイトジェン効果を試験するために、細胞培養物を、処理の最後の２ 時間、〔３Ｈ〕チミジン（８０Ｃ４／ｍモル）によりパルスラベルし、そして０ ．１Ｍのドデシル硫酸ナトリウム及び０．ＩＮの水酸化ナトリウムの添加により 溶解した。１０％ＴＣＡによる沈殿により形成される不溶性材料を、ガラス繊維 フィルターとに集め、エタノールによりすすぎ、そしてシンチレーションカウン ターにより測定した。データは、０．３２ｃｍ”当たりに結合される酸−沈殿可 能〔３Ｈ］チミジンの合計量として示される。

叉ｌバ又１金戊 コラーゲン及び非コラーゲンタンパク質合成を測定するために、２ＣＩｌｚの培 養物を、培養の最後の２時間、１２．５　ｕ　Ｃｉ　／　ｍｌの〔３Ｈ〕プロリ ン（１２５ｍＣｉ／ｍモル）によりパルスした。細胞を等張緩衝液（１４６ｍＭ のＮａＣ１，１１ｍＭのテキストロース、３５１のトリス−ＨＣｌ　、ｐＨ７， ４）によりすすぎ、そして０．５％（Ｖ／Ｖ）のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０Ｘ−１ ００（Ｓｉにおいて凍結−融解することによって溶解した。そのホモジネートを ３倍に希釈し、１０％トリクロロ酢酸により沈殿せしめ、そして酸沈澱可能な材 料を遠心分離により集めた。ベレ７）を、アセトン抽出し、乾燥せしめ、０．５ Ｍの酢酸に再溶解し、そしてＮａＯＨにより中和した。コラゲナーゼ消化性タン パク質及び非コラーゲンタンパク質に結合される〔３Ｈ〕プロリンの量を記載の ようにして測定した（２３）。

アルカリ夾ス１１うぴ一ゼアソセイー ０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００における音波処理に続＜２ｃｍ２の培養物か ら調製された抽出物における酵素活性を測定した。ｐ−ニトロフェニルホスフェ ートの加水分解を、３０分後、４１０ｎｍで測定しく１２）　；データを、ｍｇ タンパク質／分／開放されるｐ−ニトロフェノールのｎモルとして表わされる。

尾　に・　るＴＧＦ−３の　・ ＴＧＦ−β様活性を骨細胞により生成し、そして多量が細胞外骨マドリンクスに 見出され、これはこの組織においてＴＧＦ−βの重要な生理学的機能を示唆する （２）。ＴＧＦ−βは培養されたう７）胎児骨細胞において細胞複製及びコラー ゲン生成を刺激しく３．４．５）、そしてラット胚間充繊細胞の軟骨形成を誘発 する（１７）。さらに、ＴＧＦ−β様゛活性を存する分子は、骨の再吸収の後、 インビトロで開放され、そして骨形成の連結された工程と改造（ｒｅｍｏｄｅｌ ｉｎｇ）の間の再吸収との間のリンクをもたらすことができる。

この例においては、規則的なコラゲナーゼ消化による切除された骨断片からの種 々の細胞集団を単離され（２，３）、その集団は、骨芽細胞表現型に関連する生 化学的特徴、たとえばタイプ■コラーゼン生成、高められたアルカリホスファタ ーゼ活性及びオステオカルシン合成（第１２Ａ、Ｂ、Ｃ図）を有する骨形成細胞 のために富化された集団を開放した。

特定のレセプターに結合される組換えＴＧＦ−β３は、１１２Ａ、Ｂ。

Ｃズに示されるように２３時間の処理の後、ＤＮＡ合成の二相刺激効果を有し、 コラーゲン合成を増強し、そして骨芽細胞富化培養物におけるアルカリホスファ ターゼ活性を低めた。ＴＧＦ−β３及びＴＧＦ　−β１のタンパク質濃度がＣｏ １１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）からの コロイド状金アッセイ及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での銀染色の両者を 用いて正常化される場合、ＴＧＦ−β３はＴＧＦ−β１よりも有意により可能性 があり、そして約３〜５倍低い濃度が、すべての３種の上記生物学的活性におい て、類似する半分の最大効果のために必要とされた。これらの結果は、ＴＧＦ− β３が骨細胞増殖及び機能の可能性ある刺激物であることを示す。

監鉦」１び　二の　に・　るＴＧＦ−の六ＴＧＦ−β３の利用性は、末梢神経の 再生を促進し、そして中框神経系における再生現象を促進することによって神経 学的疾患の修復に拡大する。　ＴＧＦ−β１は、短期Ｓｃｈｗａｎｎ細胞のＤＮ Ａ合成を刺激するように思える（５０）。短期Ｓｃｈｗａｎｎ細胞に対するその 効果に比べＴＧＰ−Ｒ３が哺乳類神経系に選択的に発現されることを示す。

途を有する。

おける内皮細胞増殖に関する機能障害の１ｉｉ１節へのＴＧＦ−Ｒ３の利用性を 拡張する。

９：インビトロにお番る　Ｒ１１塁２いてのＴＧＦ−３の一リンパ球を、Ｆｉｃ ｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　Ｉｎｃ、）を用いて完全な血液から分離した。分離されたリンパ球を、１０ ％ＦＣ３及びＩＬ２　（Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ−Ｂｉｏｔｅｓｔ　Ｄｉａｇｎｏ ｓｔｉｃｓ）を含むＲＰＭＩ培地を含むＴ２５フラスコ中で培養した。細胞を、 Ｔ−リンパ球を増殖するようにこの培地に維持した。１０ｍ１の培地における活 性的に増殖するＴ−細胞（２，２Ｘ１０’個の細胞／　ｍ　ｌ　）を、８Ｈｇ／ ｍｌのＴＧＦ−Ｒ３を有する及びそれを有さないＴ２５フラスコに配置した。細 胞増殖を、４０倍での顕微鏡試験により決定し、そしてＣｏｕ　１　ｔｅｒカウ ンターを用いて定量化した。５日後、未処理のＴ細胞は、たぶん単一の細胞が分 離を伴わないと複数倍に分割するので、多数の凝集体（０，２ｃｍ”の場におい て約１６）を形成したことが観察された。Ｃｏｕｌ　ｔｅｒカウンターによる定 量化は、４．１５Ｘ１０″−個の細胞／　ｍ　］を示した。　８Ｈｇ／Ｉｌｌで のＴＧＦ−Ｒ３により処理された細胞は、ひじょうに少数の小さな凝集体を形成 し、そして３．２Ｘ１０’個の細胞／ｍｌであった。ＴＧＦ−Ｒ３は、新鮮なヒ トＴ細胞の増殖を阻害し、これはそれが免疫抑制であることを示す。細胞介在免 疫及び炎症応答に対するＴＧＦ−Ｒ３の効果は、疾患、たとえば免疫機能障害、 炎症、敗血性ショックの制御へのＴＧＦ−Ｒ３の利用性を示唆する。

１０：　とじてのＴＧＦ−３の これらの実験のための原理は、化学療法の間、免疫システムを保護し、従って怒 染を防止し、そして治療において化学療法のより高い用量の使用をさらに可能に するために、インビボでのＴＧＦ−Ｒ３の使用を可能にする条件を定義すること である。

インビトロでの　８ ヒト骨髄及び末梢血液を、外因性ＴＧＦ−β３の存在及び不在下で異なった造血 系の増殖のために評価する。幹細胞培養物を、十分に分化された成熟細胞からパ ージする。特に、バッフィコート細胞を、遠心分離により集め（８００ｒｐｍ、 １０分、５°ＣＬＩＯ％の熱不活性化されたＦｅ２を含むＭｃＣｏｙ培地（完全 培地）に懸濁する。血小板をＰｅｒｃｏｌｌグラジェント遠心分離（１，０５０ ｇ　／　ｍｌ　；　Ｐｈａｒ＋ｎａｃｉａ）により除去し、そして低密度の小さ な未発達の細胞集団を、Ｐｅｒｃｏｌｌグラジェント（１，０７５ｇ　／ｍｌ　 ）上での再遠心分離の後に得る。Ｂ−及びＴ−リンパ球、顆粒球、単球及びより 分化された赤芽集団の個々の集団を、水上で３０分間、成熟細胞表面エピトープ に対して向けられたモノクローナル抗体（抗−８１、抗−３４、抗−ＬＹＴ３、 抗−Ｍｙ４、抗−門ｙ８、抗−９０３、抗−Ｎ９０１、抗−Ｌｅｕｌ及び抗−グ リコホリンＡ（ＲＩＯ）及び−ＥＭ−Ｇｌｌ）により２Ｘ１０”個の低密度細胞 をバンニングすることによって免疫消耗することができる（５）。細胞を冷たい 完全培地で２度洗浄し、そして前駆細胞についてアッセイする（４８．４９）。

未発達の幹細胞集団を、５％ＣＯ□に維持された４重培養で、１０ｐＭ、１１０ ０ｐ及び１ｏｏｏｐ門のＴＧＦ−Ｒ３の存在下で、門ｏＴ−リンパ球ならし培地 、コロニー刺激因子の源（４４）を含む又は含まないメチルセルロース支持体（ ３５１ｍＩＩｌのＬｕｘ培養プレート中、Ｔｓｃｏｖｅ変性ダルヘンコ培地（Ｉ ＭＤＭ　；　Ｇ　ｒ　ｂｃｏ）、２４％ＦＣ３，０，８％の透析されたウシ血清 アルブミン、１００μＭのβ−メルカプトエタノール及び１．３％のメチルセル ロース）において増殖せしめる。

種々の造血系のコロニー形成単位を、３．７．１４及び２１日目間顕微鏡により 計数する。この実験の例は第１３図に示される。個々のコロニーを、ガラススラ イド上にアスピレートし、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｅ−ｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａにより 選択的に染色し、そして好中球、単球又は好酸球の存在を観察する。これらの実 験は、ＴＧＦ−Ｒ３の増殖阻害作用がＴＧＦ〜β３の与えられた用量で系統特異 的であるがどうかの決定し、そして与えられた細胞型の阻害のために必要とされ るＴＧＦ−Ｒ３の投与量の決定を当業者に可能にする。

一般的に、成熟特異的細胞表面エピトープの外観により分析される場合、より小 さな造血前駆体は、より未発達の前駆体幹細胞を示し、そしてより大きな細胞は 通常より成熟性である。記載されるように免疫消耗により得られた富化された前 駆体集団を、Ｐｅｒｃｏｌｌグラジェント遠心分離によりサイズ選択し、そして 異なった大きさの細胞集団を、３．７．１４及び２１日目間、勤ならし培地及び ＴＧＦ〜β３と組合して、特異的系統について評価することができる。初期幹細 胞集団（ＨＰＰ−ＣＦＵ又はＣＦＵ−Ａ）、前駆細胞（ＣＦＵ−Ｅ、　ＣＦＵ− ＧＥＭＭ、　ＢＦＵ−Ｅ。

ＣＦＵ−門Ｋ）、プレーＢコロニー、Ｂ−コロニー、Ｔコロニー、細胞溶解性Ｔ 細胞についてのアッセイ、及び抗原刺激アッセイを現在、十分に開発する。

登盪上及 正常な及び悪性結腸器官培養物に対するＴＧＦ−Ｒ３の増殖阻害効果を、化学療 法薬物による患者の処理において胃腸毒性を減じる化学保護剤としてＴＧＦ−Ｒ ３を確立する観点により評価することができる。

分化の種々の段階における結腸細胞の増殖を、結腸生検器官培養物への〔３Ｈ） −チミジンの結合、続く損なわれていない陰窩の断片化及び染色により測定する 。ＩＩＩＩＩｌＯ生検の検体を、ＤＭＥＭ、１Ｈ％ＦＣ３溶液（３７°Ｃ）によ り軽く洗浄する。３ミクロンの断片を、放射性ラベルの不均等な分布を回避する ために切断する。１０ｐＭ、１１００ｐ及び１ＨＭでのＴＧＦ−Ｒ３とのプレイ ンキュヘーションを、数回にわたって行なう。

結腸検体を、ＩμＣｉ／ｍｌのＣ″Ｈ）−チミジン（２０Ｃｉ　／　ｍモル）及 び２−１のＤＭＥＭ　＋　１０％を含む、５％ＣＯ□により３７℃で平衡化され たインキュベーターにおいて１時間ラベル化する。断片を洗浄し、１０％ホルマ リンに固定し、埋封し、そして結腸陰窩の形態を暴露するために縦に切断する０ 組織断片を液体エマルジョンにより被覆し、そしてオートラジオグラフィー処理 する。

陰窩発達の種々の段階での細胞の増殖指数を、暴露された銀粒子の顕微鏡による 計数化により決定する。通常、４以上の粒子ををする細胞は陽性として評価する 。正常な＆ＩＩｌ＠においては、陰窩の低部の１Ｘ３部分のみ（幹細胞集団を含 む）がラベルされる。隣接する組織は内部対照として作用する。結腸陰窩細胞上 での分化マーカーの出現が、サイトケリチン及び結腸特異的抗原（胎児）に対す る利用できるモノクローナル抗体を用いてモニターされる。

ＴＧＦ−β３の化学保護効果のだめのインビトロモデルを確立するために、毒性 のために必要とされる器官培養物又は分散された混合細胞培養物における細胞毒 性薬物の用量を評価する。器官培養物は、前記のようにして調製される（４５） 。親培養物を、５−Ｆ１ａ度の範囲でインキュベートし、そして増殖を〔３Ｈ〕 −チミジン結合及び部分的オートラジオグラフィーにより測定する。分散された 混合細胞結腸培養物を得るために、生検材料を０．５ｃｍ２以上に切断し、リン 酸緩衝溶液（ＰＢＳ　）により洗浄し、精細に滴定し、遠心分離し、すすぎ、洗 浄しく５Ｘ）、そしてＬｅｉｂｕｗｉｔｚ培地Ｌ］、５及び０．しｍＭの最終Ｃ ａ”°濃度、１０％ウシ胎児血清、１００単位のペニシリン、５０μｇ／ｍｌの ストレプトマイシン、２５μｇ１０＋１のゲンタマイシン、２１のグルタミン、 ｌｎｇ／＋ｍｌの上皮成長因子（ＥＧＦ）　、２０μｇ　／ｍｌのインスリン、 １０μｇ／ｌｌ１１のトランスフェリン、２５且Ｍの亜セレン酸ナトリウムを含 む懸濁変性ＭＥ？Ｉ　（ＳＭＥＭ　）の混合物において培養し、そしてコラーゲ ン（タイプり被覆された培養プレート上で増殖する（４６．４７）　。

５−ＦＵ？ＩＡ度の範囲でコラーゲン被覆カバースリップ上で増殖された結腸細 胞を、〔３Ｈ〕−チミジン（０，２μＣｉ／■ｌ）中で３０分間インキュベート し、洗浄し、そして新鮮な培地において一晩追走する。

細胞を洗浄し、固定し／染色し、カバースリップを液体写真エマルジョンに浸し 、そしてオートラジオグラフィー処理する。増殖を暴露された銀粒子を計数する ことによって測定する。

インビトロでのＴＧＦ−β３の化学保護を、結腸器官又は細胞培養物にある範囲 のＴＧＦ−β３用量、続いて毒性用量で又は近くでの５−ＦＵを予備添加し、そ して細胞回復の測定として細胞毒性薬物への暴露の後、ある期間で〔３Ｈ〕−チ ミジンによりラベルすることによって測定する。

化学保護剤として作用するＴＧＦ−β３は、正常な骨髄及び腸陰窩細胞の高い増 殖速度を阻害する。従って、ＴＧＦ−β３は、従来の化学療法の生命危機性副作 用を低め、そしてより多量の投与量手段の使用を可能にし、そして結腸保全性を 維持し、そして感染を予防する。

インビトロでの インビトロでの化学保護剤としてのＴＧＦ−β３を評価するために、次の実験を 行なった。

ミンク細胞を、１０％ウシ胎児血清により補充されたＤＭＥＭ　１００μｌを含 む９６−ウェルプレートに、１０３個の細胞／ウェ゛ルで接種した。

処理された細胞を含むウェルは２５μｌのＴＧＦ−β３　（５０且ｇ／ｌｌ１） を受けた。ＴＧＦ−β３と共に２４時間のインキュベーションした後、２５μｌ のコルヒチン又はビンブラスチンを添加した。さらに２４時間後、培地を除き、 そして細胞をダルベツコＰＢＳにより１度洗浄し、そして新鮮な完全培地を添加 した。細胞をさらに７日間インキュベートした。

細胞増殖を、５−１：”’Ｉ）ヨード−２′デオキシウリジン（”’Ｉ　ＩＩｄ Ｒ）の摂取により定量化し、これは前記のように細胞増殖の量を示す。第１４図 に見られるように、種々の用量の化学療法剤（すなわちビンブラスチン及びコル ヒチン）と共にインキュベーションする前、ＴＧＦ−β３と共にプレインキュベ ートされた細胞は、ＴＧＦ−一β３なしに化学療法剤と共にインキュベートされ た細胞に比較して”’ＵｒｄＲのより多い摂取を有意に示した。従って、ＴＧＦ −β３と共にプ！ノインキュベートされた細胞は、化学療法剤の毒性効果から保 護された。類似する効果が、化学療法薬物としてアドリアマイシンを使用する場 合に観察された。この化学保護効果はまた、他の化学療法薬物、たとえば５−フ ルオロウラシル及びエトポシドに関しても可能であるが、但しこれだけには限定 されない。

効果的な化学保護剤であるＴＧＦ−β３ためには、腫瘍の増殖が正常な組織の増 殖よりも低く阻害されるべきであるように思われる。

これは、！Ｉ瘍がＴＧＦ−β３の増殖阻害効果に対して生まれつき耐性であるた めに又はインビボでの分化効果を可能にする薬物動力学を通して達成され得る。

次の実験は、インビボでの化学保護剤のためのＴＧＦ−β３の効能を示すために 使用される段階を詳細する。

なマウスの４、　′　び 増大する用量のＴＧＦ−β３の急性投与が、正常なりａｌｂ／ｃマウスにおける 毒性（生存性、体重の低下）のために調査される。種々の血液学的パラメーター 、前駆細胞アッセイ及び免疫機能アッセイが取られる。

造血幹細胞区画の状態（骨髄、牌臓及び循環並びに細胞周期状態における合計数 ）を、インビボＣＦＵ−Ｓアッセイ、並びにインビトロＣＦＵ−ＧＥＭＭ及び高 増殖可能（ＨＰＰ）　ＣＦＵアッセイを用いて決定する。赤血球（ＢＦＵ−Ｅ、 　ＣＦＵ−Ｅ）　、骨髄（ＣＦＵ−Ｇ？Ｉ、　ＣＦＵ−Ｍ、　ＣＦＵ−Ｇ）及び 巨核球／血小板シリーズ（ＣＦＵ−ＭＫ）のための前駆細胞をアッセイする。リ ンパ機能を、Ｂ−及びブレＢ−リンパ球コロニーアッセイ、等により測定する。

組織における骨髄及びリンパ細胞のサブセットを、系統−特異的ＭＡｂを用いて ＦＡＣＳ分析により決定する。−ＢＳ、血小板、赤血球計数（ＲＢＣ）及びヘマ トクリットを、尾の静脈血からくり返して測定する。血清サンプルを得、そしＴ 　ＴＧＦ−β、　Ｇ−Ｃ５Ｆ、　ＧＭ−Ｃ５Ｆ。

Ｍ−Ｃ５Ｆ、　ＩＬ−１，３，４，５及びＴＮＦについてバイオアッセイ及びラ ジオイムノアッセイによりアッセイする。好中球機能アッセイは、４７且及びイ ンビトロでの走化性、殺細菌能力及び複数のサイトカインのためのレセプター発 現を包含する。

化学療法剤の細胞毒性効果から造血幹細胞を保護するＴＧＦ−β３の能力を動物 モデルで評価する。未処理のＢＡＬＢ／　Ｃマウス又はＴＧＦ−β３により予備 処理されたグループは、５−ＦＵ（１５０霧ｇ／ｋｇ）の−回のｉ、ｖ、用量を 受ける。続く実験において、シクロホスファミド（２００霞ｇ／ｋｇ）、ビンブ ラスチン（２，５ｍｇ／ｋｇ）　、アドリアマイシン（２，５ａ＋ｇ／ｋｇ）又 はメトトレキセート（１５０ｍｇ／　ｋｇ　）が使用される。末梢循環血液細胞 及び種々の造血前駆細胞、たとえばＣＦＵ−５，ＣＦＵ−ＧＭ。

ＨＰＰ−ＣＦＵ−Ｃ，ＢＰ［Ｉ−Ｅ、　ＣＦＵ−−Ｋ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭの数 を決定する。

実験は、ＴＧＦ−Ｂ　３　（７）用量の変更（０，１，０，５，２，０，５，０ 及び１０．０μｇ／動物）並びに化学療法に関してのＴＧＦ−β３投与の時間の 変更（化学療法の４８時間、２４時間又は１２時間前）を包含する。

ＴＧＦ−３の゛ ＴＧＦ−β３の化学半減期を、内部的にラベルされたＴＧＦ−β３（３５Ｓシス テインにより代謝的にラベルされた）又は”’Ｉ　ＴＧＦ−β３を用いて、ｉ、 ｖ、、　ｉ、ｐ、、及びＳ、Ｃ，路を通しての注入（０，１〜１０μｇ／マウス ）に続いてマウスの血清において決定する。ラベルされた物質の組織分布を、肺 臓、肺臓及び骨髄部位上で、特定の強調を伴って種々の器官において測定する。

インビボにおけるＴＧＦ−β３の生物学的半減期が許容できないぐらい短いこと が見出される場合、直接的な肺臓的注入（体避を通して）による局部的な投与が 使用され、又は大腿動脈中への注入を包含する、Ｇｏｅｙなど（７）により報告 されている手術技法が使用される。この後者のアプローチは、骨髄へのＴＧＦ− β１の局在化において効果的であることが報告されており、初期幹細胞及び前駆 細胞増殖の阻害をもたらす。

・な　モールにおしる　゛　びＴＧＦ−３臨床学的癌治療へのプレ臨床学的実験 結果の変換は、使用される実験モデルの適切性にひじょうに依存する。長期移植 されたネズミ腫瘍モデル及びヌードマウスにおける異種移植片ヒト腫瘍モデルの 明白な欠点のために、ＣＤＦＩ乳腫瘍モデルを選択することが好ましい。

ＣＤＦＩは、ヒト乳癌に対して活性的であると思われる薬物に対して、化学療法 感受性において１００％相互関係を示す。

必要ではないが、前記実験により投薬の最適なパラメーター及び予定関係を同定 することが好ましく、すなわちＴＧＦ−β３がこのモデルにおいて試験されるこ とが好ましい。はとんどの計画された研究は、自発的な乳腫瘍の第１世代同系移 植を用いて行なわれる。寿命の決定の他に、治療の効果が、腫瘍増殖速度、部分 的又は完全な後退及び自発的な転移（組織学的に又は組織再移植により決定され る）に基づいて決定される。ＴＧＦ−β３は、化学療法の毒性に対する耐性を（ づ与する、造血前駆体及び幹細胞増殖に対する可逆性細胞増殖抑制性ブロックを 仲介するその能力について試験される。

これらの実験は、ＴＧＦ−β３がインビボで化学保護剤として作用できる条件を 定義する。これらの条件は、細胞毒性化学療法の前、適切な量のＴＧＦ−β３を 患者に投与するために当業者により使用される。

１１：　の　におけるＴＧＦ−３の 自己由来の骨髄移植は、患者の骨髄が、造血幹細胞毒性を減じるために化学療法 の前、除去される方法である。自己由来の骨髄移植はまた、ｅｘビボで骨髄を処 理するために４−ヒドロペルオキシシクロホスファミドを用いて、急性非リンパ 性白血病を有する患者においても行なわれて来た（２１）　。

１つの１！様において、ＴＧＦ−β３は、血液−骨腫瘍細胞を有する患者におい て、インビボで骨髄の化学療法の前、骨髄幹細胞集団の増殖を阻害するために使 用される。簡単に言及すれば、ＴＧＦ−β３は、当業者によって決定されるよう に、正常な造血細胞を阻害するのに十分な濃度（たとえば１〜１１０００ｐ　） で患者の骨髄と接触せしめられる。　ｅｘビボでの骨髄及びＴＧＦ−β３の効果 に対して耐性の腫瘍細胞集団のＴＧＦ−β３処理の後、一定時間で（典型的には ６〜２４時間又は医者により決定されるような時間ではあるが、しかしそれだけ には限定されない）、細胞は、細胞毒性化学療法剤（たとえばアドリアマイシン 、５−フルオロウラシル及びビンブススチン）により処理される。その処理され た骨髄は医者により決定された時間で患者に戻され、そして正常な造血細胞がＴ ＧＦ−β３の増殖阻害効果から回復し、そして増殖し、従って患者の造血システ ムの成分を再構成する。

他方、骨髄細胞は、上記のようにＴＧＦ−β３により処理され、そして骨髄細胞 は、白血病性細胞集団が増殖し、そして最終的に分化し続け、そして正常な細胞 集団が増殖を阻止されるように、前記（１１８）のようにしてｅｘビポで培養さ れる。この手段での連続した培養は、白血病性細胞集団の最終的な増殖の阻止及 び正常な細胞集団の富化をもたらす、さらに、正常な細胞集団の富化は、造血細 胞増殖因子、たとえばＧＭ−Ｃ５Ｆ及びＩＬ−３と正常な細胞集団とを接触する ことによって促進され得る。このようにして処理された、実質的に白血病性細胞 を有さない骨髄が患者に戻される。

１２：　執ＴＧＦ−３か′−れるＴＧＦ−３のプロＬ厘夏主嬰 ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域は、成熟ＴＧＦ−β３に関係し、そして成Ｐ　Ｔ ＧＦ−β３の生物学的活性及び半減期を変性する。ヌクレオチド位置２６３〜２ ６５でのメチオニンから開始して位置１１６０〜１１６２でのアルギニンにより 終結するＴＧＦ−β３前駆体をコードする核酸は、位置１１６３〜１１６５で翻 訳終結コドン（ＴＧＡ、　ＴＡＧ、　ＴＡＡ）を導入するために第１図における 核酸の変異誘発により構築される。得られた核酸は、発現ベクター中に挿入され 、そして追加の選択マーカーと共に、前記のようにして適切な宿主細胞にトラン スフェクトされる。ＴＧＦ−β３のプロ領域タンパク質がこの培養培地から回収 される。このタンパク質は成ｐ　ＴＧＦ−β３を結合し、そしてそれによって、 成熟ＴＧＦ−β３の半減期及び生物学的活性を隔絶し、そして変性する。

ＴＧＦ−３プロ令　ンパク　に・　るＴＧＦ−３の　人アッセイＴＧＦ−β３又 は成熟ＴＧＦ−β３へのＴＧＦ−β３プロ領域の結合は、次のようにして測定さ れる。”Ｊ　ＴＧＦ−β３を、ラベルされていないＴＧＦ−β３又は変異体ＴＧ Ｆ−β３を含むＰＢＳ中において精製されたＴＧＦ−３３１０領域と共に氷上で ５時間インキュベートする。非特異的結合を、４００倍のモル過剰のラベルされ ていない増殖因子を用いて決定する。”Ｊ　ＴＧＦ−β３へのＴＧＦ−β３プロ 領域の架橋は、ＰＢＳ中、１／４体積の５ｍＭのビス（スルホスクシンイミジル ）スヘレート（ＢＳ’　；　Ｐｉｅｒｃｅ）の添加により達成され、そしてその 反応は１／２０体積の２．５Ｍのグリシンの添加により、４°Ｃで２分後、停止 さ一１／ れる。同体積の５０５−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（２×）が、煮沸水浴中で３分 間加熱されたサンプルに添加される。

電気泳動を先のサンプルに対して行ない、そして脱色されたゲルを乾燥せしめ、 そして増強スクリーンを用いて一７０°ＣでＸ−線フイルムに暴露する。他方、 抗Ｉ−ＴＧＦ−β３を用いて、架橋を伴って又は伴わないで”Ｊ　ＴＧＦ−β複 合体により複合体化されたＴＧＦ−β３プロ領域を免疫沈殿せしめ、そしてガン マカウンターにより直接的に定量化する。

１３：　ＴＧＦ−Ａ　ンパク　によるＴＧＦ−のＴＧＦ−β３が二官能価増殖因 子であることは当業者に明らかである。本明細書に開示される実験は、ＴＧＦ− β３が、他の外因性要因の暴露時間及び濃縮に依存して同じ標的細胞を阻害し、 又は刺激することを示す。細胞増殖及び分化の可能性あるモジュレータ−として 、ＴＧＦ−β３レベル、及びそれらの他の因子に対してＴＧＦ−β３への標的細 胞の暴露の調節は、正常な組織の機能及び成長のために重要である。

特に本明細書において、ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域、及び成熟ＴＧＦ−βに対 して向けられた抗体は、組織的なＴＧＦ−βを中和し、又はそのクリアランスを 変性するために、医薬的に適切な量で適切なキャリヤーと共に患者に投与され得 、それによって過剰のＴＧＦ　−βに関連する疾患又は症状を有する患者を処理 する。過剰のＴＧＦ　−βに関連する疾患の例は、結合組織疾患（たとえば線維 形成及び硬化症）、免疫抑制、心筋性虚血症、筋障害性疾患、高レベルのＴＧＦ −βに関連する一定の癌（たとえば多形性グリア芽腫）、神経性炎症、ＡＩＤＳ ウィルス感染及びアテローム硬化症を包含するが、しかしこれだけには限定され ない。

さらに、ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域は、成Ｗ！ＴＧＦ−βの投与のためのビー クルとして使用され得、それによって、成熟ＴＧＦ−βの半減期及び生物学的活 性を変性する。

１４：　に・　るＴＧＦ−３のｔ ＴＧＦ−β３は、単独で又は他の分子と組合して、細胞増殖を増強する。たとえ ば、ＴＧＦ−β３はＤＮＡ合成に対して直接的に影響を及ぼすことができる。他 方、ＴＧＦ−β３は、細胞増殖を促進するために他の因子により相剰作用される 。従って、インビトロ又はインビ±で繊維芽細胞と接触される場合、ＴＧＦ−β ３は、結合組織修復、皮膚化学的修復及び創傷の治癒を促進するように作用する 。

参照文献 １　、　Ｂａｒｋｅｒ、　Ｃ，Ｒ，＋　Ｗｏｒｍａｎ、　ｃ、ｐ、　ａｎｄ　Ｓ ＋ｗｉｔｈ、　Ｊ、Ｌ（１９７５）　ハ赳匹旦■３　、　Ｃｅｎｔｒｅｌｌａ、 　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ、　８５　：　５８８９４　、　Ｃｅｎｔｒｅｌｌａ、　ｅｔ　ａｌ、（１９ ８７）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋、　２６２　：　２８６９　；５　、　Ｃｅ ｎｔｒｅｌｌａ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１１ ９　：　２３０６）６　、　Ｇｅｎｔｒｙ、　Ｌ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８ ７）　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、７　：　３４１８−３４２７゜７　、　Ｇ ｏｅｙ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、（１９８９）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ＋、　１４３　： 　８７７−８８０゜８　、　Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、Ｌ、　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅ ｒ　Ｅｂ、　Ａ、Ｊ、　（１９７３）　■皿旦■５２　：　４５６−４５７゜ ９　、　Ｈａｒｌｏｗ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ、（１９８８）　Ｉｎ　 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

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Ｅ坦（３）　：　１０４２゜ ３３、　Ｊ、Ｋｅｓｋｉ−Ｏｈｔａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）　Ｊ、Ｃｅ１１ ．Ｂｉｏｌ、　１０３　：　４４５゜３４、　Ｌ、Ｒ，Ｅｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔ ｈ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１　（２６） 　：　１２３６２K ３５、　Ｊ、Ｋｅｓｋｉ−Ｏｈａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｃ、　４７　（２４）　：　６４５１゜３６、　Ｋ、ＦＩａｎｄｅｒｓ　ｅ ｔ　ａｌ、（１９８７）ムＣｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｓ　Ｓｕ　１．　ｐｐ、５８ ゜３７、　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ＋　Ｓ、Ｌ、（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、＋　８４　：　６８５１゜３８、　Ｍｏｒｒｉ ｓｏｎ、　Ｓ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、　５０７　：　１８７゜３９、　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ、Ｌ、　ｅｔ 　ａｌ、（１９８Ｂ）　Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、　３４　：　１６６８゜４０、　 Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ ｏｎ）、　３１２　：　６０４゜４１、　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、Ｊ、　ｅ ｔ　ａｌ、（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、　’１Ｊｊｊ　： 　２６８−２７０゜ ４２、　Ｏｉ、　Ｖ、Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０ ７　：　１３６−１４０゜４３、　Ｏｆ＋　Ｖ、Ｔ、、　ａｎｄ　Ｍｏｒｒｉｓ ｏｎ、　Ｓ、Ｌ、（１９８６）　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　４　：　２１４ ゜４４、　Ｇｏｌｄｅ、　Ｄ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７、５９３−５９７゜ ４５、　Ｓｈａｍｓｕｄｃｌｉｎ、　Ａ、Ｍ、（１９９０）　Ｉｎ　：　Ｃｏ１ ｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ、、　Ｍ、Ｍｏｙｅｒａｎｄ　Ｇ、Ｐｏ５ｔｅ ＋　ｐｌ）　１３７−１５３．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ。

４６、　Ｗｏｎｇ、　ｅｔ　ａｌ　（１９７５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７２　：　３１６７−３１７１４７、　Ｍｏｙｅｒ、 門ｅｔ　ａｌ、（１９９０）　Ｉｎ　’Ｃｏ１ｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ ’　Ｅｄ、　Ｍ、Ｍｏｙｅｒａｎｄ　Ｇ、Ｐｏ５ｔｅ、ｐｐ、８５−１３６．　 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

４８、５ｔｒｉｆｅ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ ｅｓ、　４８．１０３５−１０４１゜４９、５ｔｒｉｆｅ、　Ａ、　（１９８７ ）　Ｂｌｏｏｄ　６９　：　１５０８−１５２３゜５０、　Ｄａｖｉｓ、　Ｊ、 Ｂ、　ａｎｄ　５ｔｒｏｏｂｅｒｔ、　Ｐ、　（１９９０）　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏ、、旦叶１３５３゜ ５１、　Ｗｉｌｃｏｘ、　Ｊ、Ｎ、　ａｎｄ　Ｄｅｒｙｎｃｋ、　Ｒ，（１９８ Ｂ）　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８　：１９０１゜ ５２、　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｎ、Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８８）　Ｇ ｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ、上：　９１−９９゜５３、　Ｆｌｏｒｉｎｉ、　Ｊ 、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　（１９８６）　Ｊｏｕｒｎ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 　２６１　：　１６５０９゜５４、　Ａｓ５ｏｉａｎ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８ ３）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５８　：　７１５５５５、　Ｗｒａｎｎ、 　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　ヒμＬムロ　：　１６３３−１６３６゜ Ｆ工αスＥ２ ＦＩＧＵＲＥ　３ Ｆ工α升匡　４ ｒ工αコ２５Ａ ＴＧＦ−β１標準の量（ｎｇ） ＦＸαコＬＥ５Ｂ 、０１　．１　１　１０　１００ ならし培地の量（β１） ＦＴα爪Ｅ６ ＦＺＧＵＲＥ　７ ｃｆ ＦＩＧＵＲＥ　１０Ａ ＦＩＧＵＲＥ１０Ｂ 日ＧＵＲＥ１０Ｇ ＦＩＧυＲε１０Ｄ ＦＩＧＵＲＥ　ＩＩＡ ウサギポリクローナル抗−β３Ｖ及び抗−ＴＧＦ−βｅｒｓｕｓ ＴＧＦ−（＄３ ７ＧＦ−１３３（ｎｇ／ｍ１） ＦＩＧＵＲＥ　ＩＩＢ ウサギポリクローナル抗−β３ｖ及び抗−ＴＧＦ−βｅｒｓｕｓ ＴＧＦ−８１ ７ＧＦ−８１（ｎｇ／ｍｌ） ＦＩＧＵＲＥ　ＩＩｃ ウサギポリクローナル抗−β３ｖ及び抗−ＴＧＦ−βＴＧＦ−１３２ ＴＧＦ−８２（ｎｇ／ｍす ＦＩＧＵＲＥ　１２Ａ ロロ母［１１口母■ ＦＩＧＵＲＥ　１４ コルヒチンからのミンク細胞のＴＧＦ−β３化学保護コルヒチン（ｎｇ／ｍｌ） ビンブラスチンからのミンク細胞のＴＧＦ−β３化学保護要約書 本発明は、（１）（ａ）ヒトＴＧＦ−β３に特異的に結合し、そして（ｂ）ＴＧ Ｆ−β↓又はＴＧＦ−β２との交叉反応性を実質的に示さない抗体及び（２）Ｔ ＧＦ−β前駆体のプロ領域に対して向けられた抗体を供給する。さらに、本発明 は、ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域を含んで成る医薬組成物を供給する。また、本 発明は、ＴＧＦ−β３に関与する疫病の診断、検出及び処理方法も提供する。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年１２月２ヲ日

Claims (88)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）成熟ＴＧＦ−β３に特異的に結合し、そして（ｂ）ＴＧＦ−β１又は ＴＧＦ−β２との交叉反応性を実質的に示さない抗体。
2. ２．前記抗体がアミノ酸配列ＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣにより定義されるエピ トープに向けられる請求の範囲第１項記載の抗体。
3. ３．前記抗体がアミノ酸配列ＹＬＲＳＡＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡ ＳＡＳＹにより定義されるエピトープに向けられる請求の範囲第１項記載の抗体 。
4. ４．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１，２又は３のいづれか １項記載の抗体。
5. ５．前記抗体がポリクローナル抗体である請求の範囲第１，２又は３のいづれか １項記載の抗体。
6. ６．（ａ）ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域に特異的に結合し、そして（ｂ）成熟 ＴＧＦ−β３との交叉反応性を実質的に示さない抗体。
7. ７．サンプルからＴＧＦ−β３前駆体を検出するための方法であって、前記サン プルと適切な量の請求の範囲第６項記載の抗体とを、その抗体がＴＧＦ−β３前 駆体に結合するような条件下で接触せしめ、そしてＴＧＦ−β３前駆体に結合さ れる抗体を検出し、それによってサンプルからＴＧＦ−β３前駆体を検出するこ とを含んで成る方法。
8. ８．サンプルからＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域を検出するための方法であって 、前記サンプルと適切な量の請求の範囲第６項記載の抗体とを、その抗体がＴＧ Ｆ−β３前駆体のプロ領域に結合するような条件下で接触せしめ、そしてＴＧＦ −β３前駆体のプロ領域に結合される抗体を検出し、それによってサンプルから ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域を検出することを含んで成る方法。
9. ９．ヒト患者におけるＴＧＦ−βレベルの変動に関係する疾患を診断するための 方法であって、（１）患者からサンプルを得、（２）サンプル中のＴＧＦ−βの 存在を検出し、そして（３）サンプルにおけるそのＴＧＦ−βの量を決定し、そ れによって疾患を診断することを含んで成る方法。
10. １０．前記疾患がオステオポローシスである請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．前記疾患が免疫抑制疾患である請求の範囲第９項記載の方法。
12. １２．前記疾患がＡＩＤＳウィルス感染である請求の範囲第９項記載の方法。
13. １３．前記疾患が皮膚疾患である請求の範囲第９項記載の方法。
14. １４．前記疾患が心筋性虚血病である請求の範囲第９項記載の方法。
15. １５．前記疾患が筋障害性疾患である請求の範囲第９項記載の方法。
16. １６．前記疾患が結合組織疾患である請求の範囲第９項記載の方法。
17. １７．前記疾患が神経性疾患である請求の範囲第９項記載の方法。
18. １８．前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１である請求の範囲第９項記載の方法。
19. １９．前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β２である請求の範囲第９項記載の方法。
20. ２０．前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である請求の範囲第９項記載の方法。
21. ２１．前記ＴＧＦ−βレベルの変動が成熟ＴＧＦ−β３レベルの変動であり、そ して検出が、成熟ＴＧＦ−β３に特異的に結合し、そして成熟ＴＧＦ−β１又は 成熟ＴＧＦ−β２との交叉反応性を示さない抗体によりもたらされる請求の範囲 第９項記載の方法。
22. ２２．前記ＴＧＦ−βレベルの変動が成熟ＴＧＦ−β３レベルの変動であり、そ して検出が、ＴＧＦ−β３のプロ領域に特異的に結合し、そして成熟ＴＧＦ−β ３との交叉反応性を示さない抗体によりもたらされる請求の範囲第９項記載の方 法。
23. ２３．ＴＧＧ−βに関連する疾患を有する患者を処理するための方法であって、 ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ−β活性を中和する量の抗体を患者 に投与することを含んで成る方法。
24. ２４．前記疾患が癌である請求の範囲第２３項記載の方法。
25. ２５．前記疾患が関節炎である請求の範囲第２３項記載の方法。
26. ２６．前記疾患が免疫抑制疾患である請求の範囲第２３項記載の方法。
27. ２７．前記疾患がＡＩＤＳウィルス感染である請求の範囲第２３項記載の方法。
28. ２８．前記疾患が心筋性虚血症である請求の範囲第２３項記載の方法。
29. ２９．前記疾患が筋障害性疾患である請求の範囲第２３項記載の方法。
30. ３０．前記疾患が結合組織疾患である請求の範囲第２３項記載の方法。
31. ３１．前記疾患がアテローム硬化症である請求の範囲第２３項記載の方法。
32. ３２．前記疾患が神経疾患である請求の範囲第２３項記載の方法。
33. ３３．前記疾患が骨疾患である請求の範囲第２３項記載の方法。
34. ３４．前記抗体か、成熟ＴＧＦ−βを特異的に認識し、そしてＴＧＦ−β前躯体 のプロ領域との交叉反応性を実質的に示さない請求の範囲第２３項記載の方法。
35. ３５．前記抗体が、成熟ＴＧＦ−β３を特異的に認識し、そして成熟ＴＧＦ−β １又は成熟ＴＧＦ−β２との交叉反応性を実質的に示さない請求の範囲第２３項 記載の方法。
36. ３６．前記抗体が人体適応された抗体である請求の範囲第２３項記載の方法。
37. ３７．前記抗体がＦ（ａｂ）フラグメントである請求の範囲第２３項記載の方法 。
38. ３８．前記抗体がＦ（ａｂ′）２フラグメントである請求の範囲第２３項記載の 方法。
39. ３９．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２３項記載の方法。
40. ４０．前記抗体がポリクローナル抗体である請求の範囲第２３項記載の方法。
41. ４１．ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域の有効量及び適切な医薬キャリヤーを含んで 成る医薬組成物。
42. ４２．前記ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域がＴＧＦ−β１前駆体のプロ領域である 請求の範囲第４１項記載の組成物。
43. ４３．前記ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域がＴＧＦ−β２前駆体のプロ領域である 請求の範囲第４１項記載の組成物。
44. ４４．前記ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域がＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域である 請求の範囲第４項記載の組成物。
45. ４５．癌を有する患者を処理するための方法であって、癌の症状を緩和するため に請求の範囲第４１項記載の医薬組成物の有効量を患者に投与し、それによって 患者を処理することを含んで成る方法。
46. ４６．結合組織疾患を有する患者を処理するための方法であって、その症状を緩 和するために請求の範囲第４１項記載の医薬組成物の有効量を患者に投与し、そ れによって患者を処理することを含んで成る方法。
47. ４７．神経疾患を有する患者を処理するための方法であって、その症状を緩和す るために請求の範囲第４１項記載の医薬組成物の有効量を愚考に投与し、それに よって患者を処理することを含んで成る方法。
48. ４８．免疫抑制疾患を有する患者を処理するための方法であって、その症状を緩 和するために請求の範囲第４１項記載の医薬組成物の有効量を患者に投与し、そ れによって患者を処理することを含んで成る方法。
49. ４９．ＴＧＦ−βに関係する骨疾患を有する患者を処理するための方法であって 、その症状を緩和するために請求の範囲第４１項記載の医薬組成物の有効量を患 者に投与し、それによって患者を処理することを含んで成る方法。
50. ５０．心筋性虚血症を有する患者を処理するための方法であって、その症状を緩 和するために請求の範囲第４１項記載の医薬組成物の有効量を患者に投与し、そ れによって患者を処理することを含んで成る方法。
51. ５１．筋障害性疾患を有する患者を処理するための方法であって、その症状を緩 和するために請求の範囲第４１項記載の医薬組成物の有効量を患者に投与し、そ れによって患者を処理することを含んで成る方法。
52. ５２．アテローム硬化症を有する患者を処理するための方法であって、その症状 を緩和するために請求の範囲第４１項記載の医薬組成物の有効量を患者に投与し 、それによって患者を処理することを含んで成る方法。
53. ５３．関節炎を有する患者を処理するための方法であって、その症状を緩和する ために請求の範囲第４１項記載の医薬組成物の有効量を患者に投与し、それによ って患者を処理することを含んで成る方法。
54. ５４．ＡＩＤＳウィルス感染を有する患者を処理するための方法であって、その 症状を緩和するために請求の範囲第４１項記載の医薬組成物の有効量を患者に投 与し、それによって患者を処理することを含んで成る方法。
55. ５５．ＴＧＦ−βに関係する疾患を有する患者を処理するための方法であって、 その症状を緩和するために請求の範囲第４１項記載の医薬組成物の有効量を患者 に投与し、それによって患者を処理することを含んで成る方法。
56. ５６．前記疾患が結合組織疾患である請求の範囲第５５項記載の方法。
57. ５７．前記疾患が神経疾患である請求の範囲第５５項記載の方法。
58. ５８．前記神経疾患が脱髄疾患である請求の範囲第５５項記載の方法。
59. ５９．前記疾患が免疫抑制疾患である請求の範囲第５５項記載の方法。
60. ６０．前記疾患が炎症性疾患である請求の範囲第５５項記載の方法。
61. ６１．前記疾患が敗血性ショックである請求の範囲第５５項記載の方法。
62. ６２．前記疾患が骨疾患である請求の範囲第５５項記載の方法。
63. ６３．前記骨疾患が骨折である請求の範囲第５５項記載の方法。
64. ６４．前記疾患が皮膚疾患である請求の範囲第５５項記載の方法。
65. ６５．前記疾患が心筋性虚血病である請求の範囲第５５項記載の方法。
66. ６６．前記疾患が筋障害性疾患である請求の範囲第５５項記載の方法。 ６６．前記疾患がアテローム性硬化症である請求の範囲第５５項記載の方法。
67. ６７．前記疾患がＡＩＤＳウィルス感染である請求の範囲第５５項記載の方法。
68. ６８．ＴＧＦ−βに関連する疾患を有する患者を処理するための方法であって、 その症状を緩和するためにＴＧＦ−β３前駆体の有効量を患者に投与し、そして それによって患者を処理することを含んで成る方法。
69. ６９．前記疾患が癌である請求の範囲第６８項記載の方法。
70. ７０．前記疾患が結合組織疾患である請求の範囲第６８項記載の方法。
71. ７１．前記疾患が神経性疾患である請求の範囲第６８項記載の方法。
72. ７２．前記神経疾患が脱髄疾患である請求の範囲第６８項記載の方法。
73. ７３．前記疾患が免疫抑制疾患である請求の範囲第６８項記載の方法。
74. ７４．前記疾患が炎症性疾患である請求の範囲第６８項記載の方法。
75. ７５．前記疾患か敗血性ショックである請求の範囲第６８項記載の方法。
76. ７６．前記疾患が骨疾患である請求の範囲第６８項記載の方法。
77. ７７．前記骨疾患が骨折である請求の範囲第６８項記載の方法。
78. ７８．前記疾患が皮膚疾患である請求の範囲第６８項記載の方法。
79. ７９．前記疾患が心筋性虚血症である請求の範囲第６８項記載の方法。
80. ８０．前記疾患が筋障害性疾患である請求の範囲第６８項記載の方法。
81. ８１．前記疾患がアテローム性硬化症である請求の範囲第６８項記載の方法。
82. ８２．前記疾患がＡＩＤＳウィルス感染である請求の範囲第６８項記載の方法。
83. ８３．活性的に分裂する腫瘍細胞を実質的に有さない骨髄を得るための方法であ って； （ａ）正常な造血細胞を含み、そして腫瘍細胞を活性的増殖する骨髄と有効量の ＴＧＦ−βとを、その正常な造血細胞の増殖が一時的に阻害されるように接触せ しめ； （ｂ）続いて、骨髄と、腫瘍細胞の増殖が永久的に妨げられるような条件下で腫 瘍阻害薬物とを接触せしめ；そして（ｄ）正常な造血細胞の増殖を可能にするた めに骨髄を培養し、それによって、活性的に分裂する腫瘍細胞を実質的に含まな い骨髄を得ることを含んで成る方法。
84. ８４．活性的に分裂する腫瘍細胞を実質的に有さない骨髄を得るための方法であ って； （ａ）正常な造血細胞を含み、そして腫瘍細胞を活性的に増殖する骨髄と有効量 のＴＧＦ−βとを接触せしめ；（ｂ）腫瘍細胞の終結的分化及びクリアランスが 可能にされるような条件下で、段階（ａ）の骨髄をＴＧＦ−βの存在下で適切な 期間培養し；そして （ｅ）活性的に増殖する腫瘍細胞を実質的に有さない骨髄を得ることを含んで成 る方法。
85. ８５．前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１である請求の範囲第８３又は８４のいづれ か１項記載の方法。
86. ８６．前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β２である請求の範囲第８３又は８４のいづれ か１項に記載の方法。
87. ８７．前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である請求の範囲第８３又は８４項記載の 方法。
88. ８８．化学療法剤により引き起こされる正常な細胞の細胞毒性有毒化を阻害する ための方法であって、正常な細胞と有効量のＴＧＦ−β３とを、化学療法剤の存 在下での正常な細胞増殖が一時的に阻害されるような条件下で接触せしめ、それ によって正常な細胞の細胞毒性有毒化を阻害することを含んで成る方法。