JPH07313183A

JPH07313183A - 糖質又は複合糖質の製造方法

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Publication number: JPH07313183A
Application number: JP8460195A
Authority: JP
Inventors: Chiyan Fuan Chien; チャンファンチェン; Chiyuan Rii Yuan; チュアンリーユアン; Kaoru Takegawa; 薫竹川; Shojiro Iwahara; 章二郎岩原; Akihiro Kondo; 昭宏近藤; Ikunoshin Katou; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1994-03-30
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 1995-12-05
Anticipated expiration: 2015-01-24
Also published as: JP3002113B2

Abstract

(57)【要約】【目的】リモデリング糖鎖の加水分解生成物の生じな
い、糖質又は複合糖質の製造方法を提供する。【構成】グリコシダーゼによるリモデリング反応を用
いる糖質又は複合糖質の製造方法において、当該反応を
水溶性ケトン類及び／又はジオキサンを含有する水性溶
媒中で行う工程を包含する糖質又は複合糖質の製造方
法。グリコシダーゼの例にはエンドグリコシダーゼ例え
ばエンド−Ａ又はエンド−Ｍがある。当該ケトンの例に
はアセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトンがあ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はグリコシダーゼの糖転移
活性を利用して、リモデリングした糖質又は複合糖質の
製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖タンパク質の糖鎖は、免疫第２メッセ
ンジャー系のような各種の生物活性において重要な役割
を演じている。それ故、糖タンパク質の糖鎖の修飾、又
は置換は製薬工業において有用である。その理由は、こ
の技術によって、標的細胞に到達させることができる
か、又は薬効を持続させることができる、新しいタイプ
の医薬を創製することができるからである。この糖タン
パク質の糖鎖の修飾、又は置換を行うには化学的な方法
と酵素的方法がある。通常化学反応は有機溶媒、又は過
酷な条件を必要とするので、糖タンパク質の変性を起こ
すことがある。一方、酵素を用いる方法は通常、緩衝液
等の水溶液中で実施されるので、タンパク質を変性させ
ない。酵素法のもう一つの利点は、酵素が非常に特異的
に作用するという点である。現在広く用いられている酵
素法による糖鎖のリモデリングの手法は、Ｄ．Ｈ．ジョ
ジアッセ（Ｄ．Ｈ．Joziasse) ら〔ヨーロピアンジャ
ーナルオブバイオケミストリー（Eur. J. Bioche
m.) 、第１９１巻、第７５〜８３頁（１９９０）〕が記
載しているように、エキソグリコシダーゼ又はグリコシ
ルトランスフェラーゼを用いたものであり、糖鎖の非還
元末端からの逐次変換である。また、エンドグリコシダ
ーゼを用いた糖転移反応の報告は、Ｒ．Ｂ．トリムブル
（Ｒ．Ｂ．Trimble)ら〔ジャーナルオブバイオロジ
カルケミストリー（Ｊ．Biol. Chem.)、第２６１巻、
第１２０００〜１２００５頁（１９８６）〕のフラボバ
クテリウムメニンゴセプチカム（Flavobacterium men
ingosepticum)由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼＦ（エンド−Ｆ）に関するものと、Ｒ．
Ｍ．バーデールス（Ｒ．Ｍ．Bardales) ら〔ジャーナル
オブバイオロジカルケミストリー、第２６４巻、
第１９８９３〜１９８９７頁（１９８９）〕のデイプロ
コッカスニューモニエ（Diplococcus pneumoniae) 由
来のエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに
関するものである。前者はグリセロールがアクセプター
となるという報告であり、後者は、グリセロール、トリ
ス、ｐ−ニトロフェノール、セリン、スレオニンがアク
セプターとなるという報告である。一方、糖質や複合糖
質が直接アクセプターとなる糖鎖のリモデリング機構の
報告としては、特開平５−６４５９４号公報に記載のア
ルスロバクタープロトホルミエ（Arthrobacter proto
phormiae) 由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミ
ニダーゼＡ（エンド−Ａ）に関するものと、生化学、第
６５巻、第１０１４頁（１９９３）に記載のムコール
ヒエマリス（Mucor hiemalis) 由来のエンド−β−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼＭ（エンド−Ｍ）に関する
ものがある。

【０００３】前述のように、糖鎖をリモデリングした複
合糖質の安定性や生物活性が天然の複合糖質に比して増
強されれば、医薬品に応用した場合非常に有用である。
しかし、従来のエキソグリコシダーゼ又はグリコシルト
ランスフェラーゼを用いたリモデリングの手法では糖残
基１つ１つについて、酵素反応を行わなければならず、
反応ステップが多くなり大変煩雑である。また、前述の
エンド−Ｆやディプロコッカスニューモニエ由来のエ
ンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを用いた
糖転移反応の場合も、糖質や複合糖質がアクセプターと
なるものではない。一方、エンド−Ａやエンド−Ｍを用
いる糖転移反応は、糖質や複合糖質が直接アクセプター
となる糖鎖のリモデリング反応であり、現在、最も簡便
で、実用的な糖鎖のリモデリング方法である。糖鎖のリ
モデリングに使用されるエンド−Ａはアルスロバクター
プロトホルミエＡＫＵ０６４７（ＦＥＲＭＢＰ
−４９４８）によって生産され、該酵素は下記式（化
１）のオリゴマンノース型の糖鎖の矢印の部分を分解す
る。

【０００４】

【化１】

【０００５】このエンド−Ａは下記式（化２）の転移反
応を行う。

【０００６】

【化２】Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ＋Ｚ → Ｘ−
ＧｌｃＮＡｃ−Ｚ＋Ｙ

【０００７】この転移反応において、Ｘは糖質を示し、
酵素としてエンド−Ａを用いる場合、Ｘとしてはマンノ
ース、グルコース等より構成されるホモオリゴマー、マ
ンノース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン等の
２成分以上より成るヘテロオリゴマーによく作用する。

【０００８】Ｙは糖質又は複合糖質であり、本発明のエ
ンド−Ａを用いる場合、グルコース、マンノース、Ｎ−
アセチルグルコサミン等の単糖、これらの２糖以上のホ
モオリゴマー、これらの２成分以上より成るヘテロオリ
ゴマー等の糖質によく作用し、またその末端にＡｓｎ
や、Ａｓｎを介しポリペプチドが結合した複合糖質、そ
の末端にＴｈｒ又はＳｅｒや、Ｔｈｒ又はＳｅｒを介し
ポリペプチドが結合した複合糖質等でもよい。

【０００９】また、エンド−Ａを用いた転移反応のアク
セプターのＺとしては、その非還元末端にＣ−４位が遊
離の糖を有する糖質又は複合糖質をアクセプターとする
場合よく反応する。該アクセプターのＣ−４位が遊離の
糖の中でもそのＣ−４位及びＣ−５位がグルコースと同
じ立体配座をもつものが特によく、グルコース、グルコ
サミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、マン
ノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、アロース等の単
糖、又はこれらの糖を非還元末端とする糖質、又は複合
糖質によく作用する。またこれらの糖質のα−及びβ−
メチルグリコシド、又はα−及びβ−ｐ−ニトロフェニ
ルグリコシド、グルコース−１−リン酸、マンノース−
１−リン酸等の糖質にも作用する。エンド−Ａを用いた
糖鎖の転移反応は、通常、原料の糖質又は複合糖質、エ
ンドグリコシダーゼ、及び緩衝液を含む出発溶液に、ア
クセプターの糖質又は複合糖質を加えて行われる。この
転移反応は、出発溶液に有機溶媒、無機塩等を加えて疎
水性状態としてもよく反応し、有機溶媒として、例えば
メタノールを用いれば、水難溶性の糖質又は複合糖質を
使用することができる。エンド−Ａの場合、４０％メタ
ノールの存在下でもよく反応し、５０％メタノールの存
在下でも約８０％の相対活性を示す。また、ＤＭＳＯ
（ジメチルスルホキシド）やＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド）なども用いることができる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】前述のように酵素法に
よる糖鎖のリモデリングは、反応条件が温和なことと、
酵素の特異性を利用し得るという点で有用性が高い。し
かしながらエキソグリコシダーゼやエンドグリコシダー
ゼを用いた糖鎖のリモデリング反応においては、生成す
るリモデリング糖鎖がグリコシダーゼにより加水分解さ
れ、本来の目的に望ましくない加水分解生成物が見出さ
れる。本発明の目的はリモデリング糖鎖の加水分解生成
物の生じない、糖質又は複合糖質の製造方法を提供する
ことにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば本発
明は糖質又は複合糖質の製造方法に関し、グリコシダー
ゼによるリモデリング反応を用いる糖質又は複合糖質の
製造方法において、当該リモデリング反応を水溶性ケト
ン類及び／又はジオキサンを含有する水性溶媒中で行う
工程を包含することを特徴とする。

【００１２】本発明者らはグリコシダーゼを用いる糖質
又は複合糖質のリモデリング反応を、特定の水溶性有機
溶媒の存在下で行うことにより、該反応が効率よく進行
し、かつ、リモデリング生成物のグリコシダーゼによる
加水分解が抑制され、目的のリモデリング生成物が収率
よく製造できることを見出し、本発明を完成した。

【００１３】本発明において使用するグリコシダーゼと
しては、例えば前出ヨーロピアンジャーナルオブバ
イオケミストリー記載のエキソグリコシダーゼがあり、
エンドグリコシダーゼとしては、前出のエンド−Ｆ、デ
ィプロコッカスニューモニエ由来のエンド−α−Ｎ−
アセチルガラクトサミニダーゼ、エンド−Ａ、エンド−
Ｍ等がある。これらのグリコシダーゼから選択されるグ
リコシダーゼの存在下、本発明は下記式（化３）：

【００１４】

【化３】Ａ−Ｂ＋Ｃ → Ａ−Ｃ＋Ｂ

【００１５】（式中Ａは糖質、Ｂは糖質又は複合糖質、
Ｃは糖質又は複合糖質を示す）で表される転移反応を行
うが、本発明においては、式（化３）の生成物であるＡ
−Ｃの加水分解が抑制された条件下で行う。なお、前記
式（化３）中の基Ａで表される糖質の例には、単糖、２
糖以上のオリゴマー、又はそれらの末端にＧｌｃＮＡｃ
が結合したものが挙示される。例えば、酵素としてエン
ド−Ａを用いる場合、ＡとしてはＸ−ＧｌｃＮＡｃがあ
り、この場合に、Ｘとしてはマンノース、グルコース等
より構成されるホモオリゴマー、マンノース、グルコー
ス、Ｎ−アセチルグルコサミン等の２成分以上より成る
ヘテロオリゴマーが例示される。また、酵素としてエン
ド−Ｍを用いる場合、ＡとしてはＸ′−ＧｌｃＮＡｃが
あり、この場合に、Ｘ′としては、上記のようなホモオ
リゴマー、マンノース、グルコース、Ｎ−アセチルグル
コサミン、ガラクトース等の２成分以上より成るヘテロ
オリゴマーが例示される。また、前記式（化３）中の基
Ｂ又はＣで表される糖質又は複合糖質の例には、単糖、
２糖以上のオリゴマー、又はそれらの末端に特定のアミ
ノ酸を結合したもの、若しくは該アミノ酸を介してポリ
ペプチドが結合したもの、更には、特定のアミノ酸、若
しくは該アミノ酸にポリペプチドが結合したものがあ
る。例えば、本発明のエンド−Ａ又はエンド−Ｍを用い
る場合、Ｂ又はＣの例には、グルコース、マンノース、
Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコース、
フルクトース、キシロース、ｐ−ニトロフェニルグリコ
シド誘導体、メチルグリコシド誘導体等の単糖、これら
の２糖以上のホモオリゴマー、これらの２成分以上より
成るヘテロオリゴマー等の糖質があり、またその末端に
Ａｓｎや、Ａｓｎを介しポリペプチドが結合した複合糖
質、その末端にＴｈｒ又はＳｅｒや、Ｔｈｒ又はＳｅｒ
を介しポリペプチドが結合した複合糖質等でもよい。

【００１６】この条件は、上記式（化３）で表されるリ
モデリング反応を選択された水溶性有機溶媒の存在下で
行うことで達成される。水溶性有機溶媒としては、水溶
性ケトン類及び／又はジオキサンを使用すれば良く、こ
れらの溶媒を含有する水性溶媒中でリモデリング反応を
行う。水溶性ケトン類としては、アセトン、メチルエチ
ルケトン、ジエチルケトンを使用することができる。

【００１７】リモデリング反応を行う水性溶媒中の水溶
性ケトン類、ジオキサンの添加量は、リモデリング生成
物のグリコシダーゼによる加水分解を抑制し、かつ、リ
モデリング生成物が効率よく得られる量であれば良い。
例えばアセトンの場合、アセトンを含む水性溶媒中の酵
素安定性、リモデリング反応効率より、５０Ｖ／Ｖ％以
下で添加、使用するのが良い。またジオキサンの場合
も、同様の理由により５０Ｖ／Ｖ％以下で添加、使用す
るのが良い。

【００１８】本発明の転移反応は、通常、原料の糖質又
は複合糖質、グリコシダーゼ、及び緩衝液を含む出発溶
液に、アクセプターの糖質又は複合糖質を加えて行われ
る。原料又はアクセプターの使用量は特に制限されず、
その飽和量まで使用できるが、アクセプターが過剰に存
在する状態が好ましく、通常、２００ｍＭ以上のアクセ
プターを使用する。しかしながら、本発明においては１
０ｍＭ程度のアクセプター濃度でも、反応は進行し、溶
解性の劣るアクセプターや、量的に使用し難いアクセプ
ターを使用するリモデリング反応において、顕著な効果
を有する。次にグリコシダーゼの使用量は特に制限され
ず広い範囲から適宜選択できるが、出発溶液１ｍｌ当
り、通常０．１ｍＵ以上、より好ましく３ｍＵ〜１０Ｕ
程度使用すれば良い。緩衝液としては、ｐＨが５〜１１
程度の好適な緩衝液を用いれば良く、通常はｐＨ６付近
の酢酸緩衝液中で反応を行う。

【００１９】以下、グリコシダーゼとしてエンド−Ａ、
原料の複合糖質としてＭａｎ₉ＧｌｃＮＡｃＧｌｃＮＡ
ｃ−Ａｓｎ〔バイオカーブケミカルズ（Biocarb Chemic
als)社製：以下Ｍ₉ＧＮ₂Ａｓｎと略す〕、Ｍａｎ₆Ｇ
ｌｃＮＡｃＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ（バイオカーブケミカ
ルズ社製：以下Ｍ₆ＧＮ₂Ａｓｎと略す）、アクセプタ
ーとしてＧｌｃＮＡｃ（和光純薬社製）を例として用
い、本発明を更に詳細に説明する。

【００２０】

【表１】表１ ────────────────────────────── エンド−Ａ３ｍＵＭ₉ＧＮ₂Ａｓｎ３ｎｍｏｌＧｌｃＮＡｃ１０μｍｏｌ２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）２０μｌ（溶媒２５％含有）反応温度３７℃ 反応時間１０分 ──────────────────────────────

【００２１】表１で示す反応条件下で各種溶媒を用い、
各種有機溶媒がエンド−Ａのリモデリング反応に及ぼす
影響を検討した結果を表２に示す。表２に示すように、
アセトンの存在下、基質はエンド−ＡによりＭａｎ₉Ｇ
ｌｃＮＡｃ（以下Ｍ₉ＧＮと略す）とＧｌｃＮＡｃ−Ａ
ｓｎ（以下Ａｓｎ−Ｇｎと略す）に切断され、そのＭ₉
ＧＮがアクセプターのＧｌｃＮＡｃに転移され、リモデ
リング糖鎖であるＭａｎ₉ＧｌｃＮＡｃＧｌｃＮＡｃ
（以下Ｍ₉ＧＮ₂と略す）が１００％生成しており、ア
セトンは従来知られているＤＭＦやＤＭＳＯより優れ
た、リモデリング反応用有機溶媒である。なお、表２
中、ＴＨＦはテトラヒドロフランを示す。

【００２２】

【表２】表２ ─────────────────────────── 溶媒Ｍ₉Ｇｎ₂（％） ─────────────────────────── 水３７ＤＭＦ５３ＤＭＳＯ７０アセトン１００ＣＨ₃ＣＮ９ＴＨＦ１３ ───────────────────────────

【００２３】次に、アセトンを含有する水性溶媒中での
エンド−Ａの安定性を図１に示す。すなわち図１は、各
アセトン濃度の２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）２０
μｌ中で３ｍＵのエンド−Ａを３７℃でそれぞれの時間
プレインキュベートした後、１μｌのプレインキュベー
ション溶液を、３ｎｍｏｌのＭ₉ＧＮ₂Ａｓｎを含有す
る２５ｍＭ酢酸緩衝液２０μｌに添加し、３７℃、１０
分反応し、エンド−Ａの活性を測定したものであり、縦
軸は無処理のエンド−Ａの活性を１００％とした場合の
各処理酵素の相対活性（％）、横軸はプレインキュベー
ション時間（分）を示す。図１に示されるようにエンド
−Ａは３０％アセトンを含有する水性溶媒中において極
めて安定である。

【００２４】次に、糖鎖のリモデリング反応には通常ア
クセプターが過剰に存在することが好ましいが、本発明
におけるリモデリング反応とアクセプター濃度との関係
を図２に示す。すなわち図２は、３０％アセトンの存在
下、各濃度のＧｌｃＮＡｃを用い、表１に記載の条件に
準じ反応を行い、Ｍ₉ＧＮ₂の生成量と、Ｍ₉ＧＮの生
成量をＨＰＡＥＣ／ＰＡＤシステム〔ダイオネックス
（Dionex) 社製〕で測定したものであり、縦軸はＰＡＤ
レスポンス、横軸はＧｌｃＮＡｃ濃度（Ｍ）を示す。図
２に示すように、３０％アセトンの存在下、ＧｌｃＮＡ
ｃ濃度２５ｍＭにおいてもＭ₉ＧＮ₂の生成が充分行わ
れている。更にＧｌｃＮＡｃ濃度２００ｍＭ以上では、
リモデリング糖鎖の加水分解は充分に抑制され、Ｇｌｃ
ＮＡｃ濃度５００ｍＭにおいては、該加水分解による生
成物Ｍ₉ＧＮの生成は完全に抑制されている。

【００２５】次にアセトンを含有する水性溶媒、及び非
含有の水性溶媒中でのエンド−Ａによるリモデリング糖
鎖の生成を図３に示す。すなわち図３は、アセトン０
％、３０％、４０％、５０％存在下、表１に記載の条件
に準じ反応を行い、経時的に、Ｍ₉ＧＮ₂Ａｓｎ、Ｍ₉
ＧＮ₂、Ｍ₉ＧＮ、Ａｓｎ−ＧＮの量を測定したもので
あり、縦軸は各物質の％、横軸は反応時間（分）を示
す。図３に示すように３０〜５０％の各アセトンの存在
下においてＭ₉ＧＮの生成は全く認められない。またア
セトン非存在下でＭ₉ＧＮ₂の生成は３０分において約
５０％であるのに対し、３０％アセトン存在下ではＭ₉
ＧＮ₂の生成量は１００％に到達している。更にアセト
ンを含有反応液中でのアクセプターの検討を行うため、
アセトンの存在下（Ｌ−Ｆｕｃ及びＬ−Ｇａｌの時は３
５％、他は３０％）、３ｎｍｏｌのＭ₉ＧＮ₂Ａｓｎ、
４μｍｏｌのアクセプター、１ｍＵのエンド−Ａを含有
する２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）２０μｌを３７
℃で、Ｌ−Ｆｕｃ及びＬ−Ｇａｌの時は１５分、他は１
０分間反応し、リモデリング糖鎖生成率を測定した。そ
の結果を表３に示す。表３に示すように、Ｍａｎ、Ｌ−
Ｆｕｃ、Ｌ−Ｇａｌ、Ｆｒｕ、Ｘｙｌ、２−デオキシ
（deoxy)−Ｇｌｃ（シグマ社製）、６−デオキシ−Ｇｌ
ｃ（シグマ社製）、メチル (methyl) α−ＧｌｃＮＡｃ
（シグマ社製）、３−Ｏ−Ｍｅ−Ｇｌｃ（シグマ社製）
に対して糖転移反応が起こっていることがわかる。

【００２６】

【表３】表３ ────────────────────────────── アクセプターリモデリング糖鎖生成率（％） ────────────────────────────── ＧｌｃＮＡｃ９６．５Ｍａｎ８６．７Ｌ−Ｆｕｃ２５．６Ｌ−Ｇａｌ１９．３Ｆｒｕ６．３Ｘｙｌ２４．２２−デオキシ−Ｇｌｃ９０．９３−デオキシ−Ｇｌｃ０．０６−デオキシ−Ｇｌｃ７７．３メチルα−ＧｌｃＮＡｃ９４．３３−Ｏ−Ｍｅ−Ｇｌｃ３６．１ ──────────────────────────────

【００２７】次に、ジオキサンを含有する水性溶媒、及
び非含有の水性溶媒中でのエンド−Ａによるリモデリン
グ糖鎖の生成を図４に示す。すなわち図４はジオキサン
０％、２０％、３０％存在下でのリモデリング反応を経
時的に測定したものであり、縦軸はリモデリング糖鎖の
生成率（％）を、横軸は反応時間（分）を表わす。図４
に示すように３０％ジオキサンの存在下でリモデリング
反応は効率よく進行し、リモデリング糖鎖の加水分解も
抑制されている。

【００２８】図５は、アクセプター濃度と、生成するリ
モデリング糖鎖の関係を示す図であり、縦軸はリモデリ
ング糖鎖の生成率（％）を、横軸はアクセプター濃度
（Ｍ）を示す。図５に示すようにアクセプター濃度１０
ｍＭにおいても、リモデリング反応は進行し、約５０％
のリモデリング糖鎖の生成率を示す。更にアクセプター
濃度１００ｍＭ以上では、リモデリング糖鎖生成率は１
００％に達し、リモデリング糖鎖の加水分解は完全に抑
制されている。

【００２９】以上、グリコシダーゼによる糖質の転移反
応は、その反応液に選択された水溶性有機溶媒、アセト
ン、ジオキサンを添加することにより、リモデリング効
率が顕著に向上する。なお、上記アセトン、ジオキサン
はそれぞれ単独で使用しても良いが、アセトン、ジオキ
サンを組合せ使用しても良い。

【００３０】アセトン及び／又はジオキサン存在下での
リモデリング反応は通常室温〜６０℃程度、好ましくは
３０〜４０℃程度の温度下及びｐＨ５〜１１程度のｐＨ
条件下に行われ、その反応条件にもよるが、転移反応は
通常５分〜５時間程度、好ましくは１０〜６０分程度で
終了する。生成するリモデリングした糖質又は複合糖質
は反応副生成物を含有せず、公知の手段に従って反応終
了液から容易に分離・精製することができる。例えば、
ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂カ
ラムクロマトグラフィー等により反応終了液から、リモ
デリングした糖質又は複合糖質を分離し、更に濃縮、脱
塩、凍結乾燥等を行えばよい。

【００３１】本発明によれば、低アクセプター濃度でも
リモデリング反応が進行し、溶解性の低いアクセプター
や、量的に制限のあるアクセプターを用いても効率よく
リモデリング生成物を得ることができる。またアセト
ン、ジオキサンはＤＭＳＯ、ＤＭＦと比較し、リモデリ
ングの反応速度が早く、また、沸点も低いためリモデリ
ング反応液からの留去も容易で、リモデリング反応の促
進物質として極めて有用である。

【００３２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００３３】実施例１エンド−Ａの糖鎖転移反応に
おける添加する有機溶媒の検討２５ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中にそれぞれ２５
％の有機溶媒（ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、ＣＨ₃Ｃ
Ｎ、ＴＨＦ）と３ｎｍｏｌのＭ₉ＧＮ₂Ａｓｎ、及び５
００ｍＭのＧｌｃＮＡｃを含むように反応液を調製し、
３ｍＵのエンド−Ａをそれぞれに入れ（総容量２０μ
ｌ）、３７℃にて１０分間インキュベーションした後、
反応液を減圧下エバポレーションにより乾固した。この
乾固物を水に再溶解後ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤシステムにて
分析し、結果を表２に示した。表２に示すように、アセ
トン存在下でＭ₉ＧＮ₂の生成率は１００％を示した。

【００３４】実施例２種々の濃度のアセトンを含む
反応液中でのエンド−Ａの安定性の検討２５ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中にそれぞれ０
％、３０％、４０％、４５％、及び５０％のアセトンを
含むように反応液を調製し、３ｍＵのエンド−Ａをそれ
ぞれに入れ（総容量２０μｌ）、３７℃にて０分、５
分、１０分、２０分、及び３０分間プレインキュベーシ
ョンした。その反応液からそれぞれ２μｌ取り、別に用
意した３ｎｍｏｌのＭ₉ＧＮ₂Ａｓｎを含む２５ｍＭの
酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に入れ、３７℃にて１０分間
インキュベーションした。３分間、１００℃の加熱処理
を行った後、反応液の１／４量をＨＰＡＥＣ／ＰＡＤシ
ステムにて分析しその残存活性をチェックした。図１
は、アセトン含有反応液中でのプレインキュベーション
時間（分、横軸）と相対活性（％、縦軸）との関係を示
す図であり、３０％アセトン中ではほとんど失活しない
ことがわかる。

【００３５】実施例３エンド−Ａの糖鎖転移反応に
おけるアクセプターの濃度の検討糖鎖転移反応を３ｎｍｏｌのＭ₉ＧＮ₂Ａｓｎをドナー
として用い、３ｍＵのエンド−Ａを３０％のアセトンを
含む２５ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、アクセ
プターとしてのＧｌｃＮＡｃの濃度を２５ｍＭ、５０ｍ
Ｍ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、及び５００
ｍＭと変化させたそれぞれの反応を、３７℃にて１０分
間行った。１００℃３分間熱処理することにより反応を
止め、ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤシステムにて加水分解生成物
であるＭ₉ＧＮとリモデリング生成物であるＭ₉ＧＮ₂
を測定し、その結果を図２に示した。図２において縦軸
はＰＡＤレスポンスを横軸はＧｌｃＮＡｃの濃度（Ｍ）
をとってあり、２００ｍＭ以上であればほぼ完全に転移
反応が加水分解反応に優先していることがわかる。

【００３６】実施例４糖鎖転移反応生成物の経時変
化３ｎｍｏｌのＭ₉ＧＮ₂Ａｓｎと、５０ｍＭのＧｌｃＮ
Ａｃと、３ｍＵのエンド−Ａを２０μｌの２５ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ６．０）中、０〜５０％アセトン存在下、
３７℃でインキュベーションし、２分、４分、８分、１
５分、及び３０分後にそれぞれサンプリングし、ＨＰＡ
ＥＣ／ＰＡＤシステムにて分析し、結果を図３に示し
た。図３において縦軸はリモデリング糖鎖の生成率
（％）を、横軸は反応時間（分）を表す。図３に示すよ
うに、時間の経過につれて糖鎖ドナー（Ｍ₉ＧＮ₂Ａｓ
ｎ；＊）が減少し、リモデリング生成物であるＭ₉ＧＮ
₂（◇）が増加していくことがわかり、３０％アセトン
存在下において３０分後には１００％のリモデリング生
成物を得た。

【００３７】実施例５アセトン含有反応液中での各
種アクセプターへの糖鎖転移反応の検討ドナーとして３ｎｍｏｌのＭ₉ＧＮ₂Ａｓｎ、４μｍｏ
ｌのアクセプター、１ｍＵのエンド−Ａ及びアセトン
（Ｌ−Ｆｕｃ及びＬ−Ｇａｌの時は３５％、他は３０
％）を含む２０μｌの２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．
０）を３７℃で、Ｌ−Ｆｕｃ及びＬ−Ｇａｌの時は１５
分、他は１０分間インキュベートした。１００℃で３分
間熱処理することにより反応を止め、反応液を減圧下エ
バポレーションにより乾固した。この乾固物を反応液の
１／４量の水に再溶解後、ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤシステム
にて分析した。その結果を表３に示した。ただし、２−
デオキシ−Ｇｌｃと３−Ｏ−Ｍｅ−Ｇｌｃをアクセプタ
ーとしたときは反応液をグラフィタイズドカーボンカ
ラム〔シャンドンサイエンティフィック（Shondon Sc
ientific) 社製〕を用いたＨＰＬＣで分析した。表３は
ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、Ｌ−Ｆｕｃ、Ｌ−Ｇａｌ、Ｆｒ
ｕ、Ｘｙｌ、２−デオキシ−Ｇｌｃ、３−デオキシ−Ｇ
ｌｃ、６−デオキシ−Ｇｌｃ、メチルα−ＧｌｃＮＡ
ｃ、３−Ｏ−Ｍｅ−Ｇｌｃをアクセプターとしたときの
リモデリング糖鎖生成率（％）を示したものである。Ｍ
ａｎ、Ｌ−Ｆｕｃ、Ｌ−Ｇａｌ、Ｆｒｕ、Ｘｙｌ、２−
デオキシ−Ｇｌｃ、６−デオキシ−Ｇｌｃ、メチルα−
ＧｌｃＮＡｃ、３−Ｏ−Ｍｅ−Ｇｌｃに対しても糖鎖転
移反応が起こっていることがわかる。

【００３８】実施例６エンド−Ａの糖鎖転移反応に
於けるアセトン濃度の検討ドナーとして３ｎｍｏｌのＭ₉ＧＮ₂Ａｓｎ、アクセプ
ターとして４μｍｏｌのＧｌｃＮＡｃ、１ｍＵのエンド
−Ａ及びアセトンを含む２０μｌの２５ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６．０）を３７℃で１５分間インキュベートし
た。１００℃、３分間熱処理することにより反応を止
め、反応液を減圧下エバポレーションにより乾固した。
この乾固物を反応液の１／４量の水に再溶解後、ＨＰＡ
ＥＣ／ＰＡＤシステムにて分析し、その結果を図６に示
した。すなわち図６はアセトン含有反応液中のアセトン
濃度（％、横軸）とドナー（白丸印）、加水分解生成物
（黒丸印）、及びリモデリング生成物（白四角印）であ
るＭ₉ＧＮ₂の各量比（％、縦軸）との関係を示す図で
ある。アセトン濃度２０％でのリモデリング生成物の割
合が最も高いことがわかる。

【００３９】実施例７糖ペプチド糖鎖のリモデリン
グ牛フィブリノゲンからキモトリプシンとトリプシンの混
合物による消化によって２本鎖コンプレックス型糖鎖を
持つ糖ペプチドを調製した。ＨＰＬＣで糖ペプチドを精
製し、そのＮ末端をナフチルアセチル基で修飾した。次
いでムコールヒエマリス（ＦＥＲＭＢＰ−４９９１）
由来のエンド−Ｍをアグリカルチュラルアンドバイ
オロジカルケミストリー（Agricultural and Biologi
cal Chemistry)、第５４巻、第９７〜１０６頁（１９９
０）に記載の方法で精製した。該酵素を用いてこの糖ペ
プチドを徹底消化した。１．２５ｍｍｏｌの糖ペプチド
と１．７７ｍＵのエンド−Ｍを含む０．１Ｍ酢酸アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３ｍｌを３７℃で一
晩インキュベートした。エンド−Ｍによる消化前後の糖
ペプチドをＨＰＬＣで分析し、その結果を図７に示す。
すなわち図７は、糖ペプチドをエンド−Ｍで消化する前
（上段）、消化後（下段）のＨＰＬＣ分析結果を示す図
であり、縦軸に蛍光強度、横軸に保持時間（分）を示
す。ＨＰＬＣカラムはＲＰ−Ｃ₃（４．６×２５０ｍ
ｍ）を用い、溶出液としてＡ液：５０ｍＭ酢酸アンモニ
ウム溶液、Ｂ液：５０％アセトニトリルを含む５０ｍＭ
酢酸アンモニウム溶液を用い、溶出は４５％Ｂ液、室
温、流速１ｍｌ／ｍｉｎで行った。糖ペプチドの検出は
励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍの蛍光検出器
で行った。図７に示すように糖ペプチドがほぼ完全に消
化されて、２本鎖コンプレックス型糖鎖が除去されたこ
とが判る。この脱糖鎖糖ペプチド〔ＧｌｃＮＡｃ−ペン
タペプチド（pentapeptide) 〕をＨＰＬＣで精製した
後、そのアミノ酸組成を調べた。その結果を図８に示
す。すなわち図８は、ＧｌｃＮＡｃ−ペンタペプチドの
アミノ酸組成分析の結果を示した図であり、縦軸に２５
４ｎｍでの紫外線吸収を、横軸に保持時間（分）を示
す。図８に示すように、ＧｌｃＮＡｃ−ペンタペプチド
のアミノ酸組成はＡｓｐ：Ｇｌｕ：Ｖａｌ：Ｌｙｓ＝
１：２：１：１であり、既に報告されているフィブリノ
ゲンのアミノ酸配列からこの糖ペプチドは下記式（化
４）：

【００４０】

【化４】Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（ＣＨＯ）−
Ｌｙｓ（配列表の配列番号１）

【００４１】（但し、ＣＨＯはＡｓｎのアミド基に結合
している糖残基を示す）であることがわかった。次にア
クセプターとして１４ｎｍｏｌのＧｌｃＮＡｃ−ペンタ
ペプチド、ドナーとして３ｎｍｏｌのＭ₉ＧＮ₂Ａｓ
ｎ、３ｍＵのエンド−Ａ及び３５％のアセトンを含む１
０μｌの５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．
０）を３７℃で１５分間インキュベートした。反応液を
図７と同じ条件でＨＰＬＣ分析に供した。その結果を図
９に示す。すなわち図９は、リモデリング反応前の糖ペ
プチド（上段）、リモデリング反応後の糖ペプチド（下
段）のＨＰＬＣによる分析結果を示す図であり、縦軸に
蛍光強度、横軸に保持時間（分）を示す。図９に示すよ
うに、リモデリング生成物と考えられるピークを確認す
ることができた。リモデリング生成物のＧｌｃＮＡｃ−
ペンタペプチドからの収率はクロマトグラムのピークの
大きさから考えて約５％であった。

【００４２】実施例８種々の濃度のジオキサンを含
む反応液中でのエンド−Ａの糖鎖転移反応の検討２５ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に４ｍＵのエンド
−Ａと１００ｍＭのＧｌｃＮＡｃをそれぞれに入れ、３
７℃にて１０分間プレインキュベーションした。その
後、反応液中にそれぞれ０％、１０％、２０％、３０
％、４０％、及び５０％のジオキサンを含むように反応
液を調製し、４ｎｍｏｌのＭ₆ＧＮ₂Ａｓｎを糖鎖ドナ
ーとして添加し（総容量４０μｌ）３７℃にて１０分間
インキュベーションし、鎖転移反応を行った。１００℃
３分間加熱処理することにより反応を止め、ＰＡ化後Ｈ
ＰＬＣにて分析した。表４に示すように、ジオキサンの
濃度が３０％以上の場合、ほぼ完全に転移反応が加水分
解反応に優先していることがわかった。なおＰＡ化は特
公平５−６５１０８号公報記載の方法にて行い、Ｍ₆Ｇ
Ｎ₂のＰＡ化物（以下、Ｍ₆ＧＮ₂−ＰＡと略す）、Ｍ
₆ＧＮのＰＡ化物（以下、Ｍ₆ＧＮ−ＰＡと略す）をそ
れぞれ分別定量した。表４のリモデリング糖鎖生成率は
下記式（数１）により求めた。

【００４３】

【数１】リモデリング糖鎖生成率＝〔（Ｍ₆ＧＮ₂−Ｐ
Ａの生成量）／（Ｍ₆ＧＮ−ＰＡの生成量＋Ｍ₆ＧＮ₂
−ＰＡの生成量）〕×１００

【００４４】

【表４】表４ ──────────────────────────────── ジオキサン濃度（％）リモデリング糖鎖生成率（％） ──────────────────────────────── ０６０１０９０２０９４３０１００５０１００ ────────────────────────────────

【００４５】実施例９糖鎖転移反応生成物の経時変
化エンド−Ａ４ｍＵと１００ｍＭのＧｌｃＮＡｃとを２５
ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、３７℃にてプレイ
ンキュベーションした反応バイアルを３本用意した。１
０分後に最終濃度０％、２０％、３０％になるようにジ
オキサンを加えた後、糖鎖ドナーであるＭ₆ＧＮ₂Ａｓ
ｎを６μｇ添加し３７℃にて反応を行った。１０分、３
０分、６０分、９０分、１８０分、３００分後にそれぞ
れサンプリングし１００℃３分間の加熱処理後ＰＡ化を
行った。ＨＰＬＣにて分析し、Ｍ₆ＧＮ₂−ＰＡの生成
量を測定し、図４に示した。図４において縦軸は糖鎖ド
ナーに対するＭ₆ＧＮ₂−ＰＡの生成率、すなわち、リ
モデリング糖鎖生成率（％）を、横軸は反応時間（分）
を示す。図４に示すように、ジオキサン濃度が２０％、
又は０％の時はリモデリング生成物であるＭ₆ＧＮ
₂が、糖鎖ドナーであるＭ₆ＧＮ₂Ａｓｎに対して６０
％の生成収率を越えることはない。３０％のジオキサン
存在下では、６０分後には１００％のＭ₆ＧＮ₂の生成
収率を得た。また、その後２４０分間反応を続けても転
移生成物は加水分解されないことがわかった。

【００４６】実施例１０エンド−Ａの糖鎖転移反応に
おける３０％ジオキサン中でのアクセプターの濃度の検
討４ｎｍｏｌのＭ₆ＧＮ₂Ａｓｎを糖鎖ドナーとして用
い、４ｍＵのエンド−Ａを３０％のジオキサンを含む２
５ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、アクセプター
としてのＧｌｃＮＡｃの濃度を０、１０、５０、１０
０、２００、３００及び５００ｍＭと変化させた反応バ
イアルを用意し、３７℃にて１０分間インキュベーショ
ンし、糖鎖転移反応を行った。１００℃３分間加熱処理
することにより反応を止め、生成するＭ₆ＧＮ₂をＰＡ
化後、ＨＰＬＣにて分析した。その結果を図５に示す。
図５において縦軸は糖鎖ドナーに対するＭ₆ＧＮ₂−Ｐ
Ａの生成率、すなわちリモデリング糖鎖生成率（％）
を、横軸はＧｌｃＮＡｃ濃度（Ｍ）を示す。図５に示す
ように、ＧｌｃＮＡｃが１００ｍＭ以上の場合、ほぼ完
全に転移反応が加水分解反応に優先していることがわか
った。

【００４７】

【発明の効果】本発明により反応副生産物の生じないリ
モデリング糖鎖の製造方法が提供される。本発明の方法
は生体内で重要な働きを示す生理活性物質の糖鎖をリモ
デリングした物質の製造において特に有用である。

【００４８】

【配列表】

【００４９】配列番号：1 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴：４番目の Xaaは、Asn のアミド基に糖残基
が結合した Asn誘導体である。

【図面の簡単な説明】

【図１】各アセトン濃度下での酵素の安定性を示す図で
ある。

【図２】ドナー濃度と反応生成物収率との関係を示す図
である。

【図３】各アセトン濃度下での反応生成物収率と時間の
関係を示す図である。

【図４】各ジオキサン濃度下でのリモデリング生成率と
時間の関係を示す図である。

【図５】ドナー濃度とリモデリング生成率との関係を示
す図である。

【図６】アセトン濃度とドナー、加水分解物、リモデリ
ング生成物との関係を示す図である。

【図７】糖ペプチドをエンド−Ｍで消化する前と消化後
のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。

【図８】ＧｌｃＮＡｃ−ペンタペプチドのアミノ酸組成
分析の結果を示す図である。

【図９】糖ペプチドのリモデリング反応前と反応後のＨ
ＰＬＣ分析結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者岩原章二郎香川県木田郡三木町池戸3325−７ (72)発明者近藤昭宏滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者加藤郁之進滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グリコシダーゼによるリモデリング反応
を用いる糖質又は複合糖質の製造方法において、当該リ
モデリング反応を水溶性ケトン類及び／又はジオキサン
を含有する水性溶媒中で行う工程を包含することを特徴
とする糖質又は複合糖質の製造方法。
【請求項２】グリコシダーゼがエンドグリコシダーゼ
である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】エンドグリコシダーゼがエンド−Ａ、又
はエンド−Ｍである請求項２記載の製造方法。
【請求項４】水溶性ケトン類がアセトン、メチルエチ
ルケトン、ジエチルケトンである請求項１記載の製造方
法。