JPH0731468A - 糸状菌の連続液体培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 プロテアーゼを効率よく、安定的に長期間
に渡って生産させることを目的とする。 【構成】 プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液体
培地に接種し、連続的に糸状菌を培養する方法におい
て、液体培地として炭素と窒素との比（Ｃ／Ｎ比）が実
質的に同じ比を有し、濃度の異なる二種以上の培地、及
びさらに必要により炭素源または窒素源から選ばれた一
種類以上の栄養源を併用し、培養中の溶存酸素濃度及び
／またはｐＨを一定に保持しながら培養することを特徴
とする、糸状菌の連続液体培養法に関するものである。 【効果】 本発明により、プロテアーゼを効率よく、
長期間（例えば、６０日間以上）に渡って安定的に産生
させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、プロテアーゼを効率よ
く、安定的に長期間に渡って生産させることを目的とし
た糸状菌の液体培養法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、糸状菌を液体培養するに当たり、
プロテアーゼを効率よく生産させる工夫が種々報告され
ている（例えば、特開昭６０ー１４１２８２号公報、特
開昭６２ー１２６９７５号公報、特開昭６２ー２４８４
８１号公報、特開昭６２ー２４８４８５号公報、特開昭
６３ー７１１６９号公報、特開昭６３ー２１９３７６号
公報、特開昭６３ー２４８３９０号公報、特開平１ー２
９６９７８号公報、特開平３ー２７７２８０号公報など
参照）。

【０００３】上記従来法の中でも、特開昭６２ー２４８
４８５号公報に記載の方法が本発明方法と最も関連する
ものと思われるが、該公報に記載の方法は短期間の培養
（例えば、７日間）におけるプロテアーゼの生産性を改
善せしめる方法であって、該公報には、長期間に渡って
プロテアーゼを効率よく、安定的に生産させることに関
しては全く記載されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】液体培地を用いてプロ
テアーゼ生産能を有する糸状菌を培養した場合、培養液
の溶存酸素濃度とｐＨが培養当初の値から変動（減少も
しくは上昇）し、プロテアーゼの生産量が低下し、プロ
テアーゼを長期に渡って安定的に生産できないという問
題があった。この問題点を解決するため、培養槽内の攪
拌回転数の調節を行いながら溶存酸素濃度を調節した
り、アルカリもしくは酸を添加して培地のｐＨを調整す
る手段が従来採用されてきた。しかしながら、攪拌翼を
高速に回転させることにより糸状菌の菌糸が損傷を受
け、プロテアーゼ生産量が低下したり、アルカリもしく
は酸の添加により、培養液中の一部の培養環境が一時的
に急激に変化し、糸状菌のプロテアーゼ生産能に悪影響
を及ぼすなどの問題点が指摘されていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来
法の問題点を克服するため、鋭意研究を重ねた結果、プ
ロテアーゼを産生させる本培養の工程において、炭素と
窒素との比（Ｃ／Ｎ比）が実質的に同じ比を有し、濃度
の異なる二種類以上の培地、さらに必要により炭素源ま
たは窒素源から選ばれた一種類以上の栄養源を併用し、
培養中の溶存酸素濃度及び／またはｐＨを一定に保持し
ながら培養することにより、効率よく、長期間に渡って
安定してプロテアーゼを産生させることができることを
見いだし、本発明を完成させた。

【０００６】すなわち、本発明は、プロテアーゼ生産能
を有する糸状菌を液体培地に接種し、連続的に糸状菌を
培養する方法において、液体培地として炭素と窒素との
比（Ｃ／Ｎ比）が実質的に同じ比を有し、かつ濃度の異
なる二種類以上のものを使用し、培養中の溶存酸素濃度
もしくはｐＨを一定に保持しながら培養することを特徴
とする、糸状菌の連続液体培養法（本発明方法１）に関
するものである。また、本発明は、プロテアーゼ生産能
を有する糸状菌を液体培地に接種し、連続的に糸状菌を
培養する方法において、液体培地として炭素と窒素との
比（Ｃ／Ｎ比）が実質的に同じ比を有し、濃度の異なる
二種以上の培地、および炭素源または窒素源から選ばれ
た一種類以上の栄養源を併用し、培養中の溶存酸素濃度
およびｐＨを一定に保持しながら培養することを特徴と
する、糸状菌の連続液体培養法（本発明方法２）に関す
るものである。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
使用する糸状菌は、プロテアーゼ生産能を有するもので
あれば特に限定されない。具体的には、アスペルギルス
属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、ムコール属、リ
ゾープス属などに属するプロテアーゼ生産能を有する糸
状菌、例えば、アスペルギルス・オリゼーＩＦＯ４３４
８、アスペルギルス・ソーヤＩＡＭ２７０３、アスペル
ギルス・タマリＩＡＭ２１５６、ペニシリウム・ルテウ
ムＡＨＵ８０２２、ムコール・ラセムサスＡＨＵ６００
２、リゾープス・ジャパニカスＩＦＯ５４４１などを使
用することができる。これらの糸状菌の中で、耐塩性
（たとえば、食塩５％以上の濃度下でも生育可能）のも
のは、雑菌汚染防止の観点から好ましいものである。

【０００８】本発明方法においては、本発明方法、すな
わちプロテアーゼを産生させるための本培養を開始する
前に、予め菌体を増殖させて必要な菌体濃度を確保する
ための前培養を行う。この前培養は、糸状菌の液体培養
に通常用いられる液体培地に糸状菌菌体または胞子を接
種し、目的とする菌体濃度が得られるまで、通常は定常
期になるまで行う。すなわち、前培養に使用する培地の
炭素源としてはグルコース、可溶性デンプン、サッカロ
ース、デキストリン、グリセリンなど、窒素源としては
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、大豆分離タ
ンパク質、グルテン、ポリペプトン、ソイトンなどをそ
れぞれ使用することができる。また、各種ビタミン、各
種無機塩類、核酸系化合物など微生物の生育に必要な微
量栄養素も必要により使用してもよい。

【０００９】前培養に用いる培地のＣ／Ｎ比は、使用す
る糸状菌の種類に応じて任意に設定すればよい。例え
ば、糸状菌としてアスペルギルス属に属する糸状菌を使
用する場合には、培地のＣ／Ｎ比を５〜５０、好ましく
は１０〜３０の範囲に設定することにより、アスペルギ
ルス属に属する糸状菌を効果的に増殖させることができ
る。糸状菌の培養条件は、培養温度は２０〜４０℃、培
地ｐＨは３〜８、通気量は０．１〜２ｖｖｍの各範囲内
より適宜選定することができる。培養方法は、回分式、
連続式のいずれの方式を採用してもかまわない。

【００１０】上記前培養で得られた培養物をそのまま使
用し、または菌体のみを分離して使用してプロテアーゼ
を産生させるための本培養を行う。本発明方法１は、本
培養に用いる液体培地として、炭素と窒素との比（Ｃ／
Ｎ比）が実質的に同じ比を有するが、濃度の異なる二種
類以上の培地を使用することを特徴の一つとしている。
なお、本明細書において、「実質的に同じ」とは、対象
となる数値が基準となる数値の±５％の範囲内に含まれ
ることを意味する。

【００１１】本培養に使用する液体培地中の各種栄養源
は、糸状菌が利用できるものであればいずれのものであ
ってもよい。そのような栄養源を具体的に例示すれば、
炭素源としてはグルコース、可溶性デンプン、サッカロ
ース、デキストリン、グリセリン、醤油油など、窒素源
としてはペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、
糠、大豆分離タンパク質、カゼイン、グルテン、ポリペ
プトン、ソイトンなどをそれぞれ使用することができ
る。また、各種ビタミン、各種無機塩類、核酸系化合物
など微生物の生育に必要な微量栄養素も必要により使用
してもよい。

【００１２】培地のＣ／Ｎ比は、前培養の時と同様に使
用する糸状菌に応じて適宜設定すればよい。たとえば、
アスペルギルス属に属する糸状菌を用いてプロテアーゼ
を産生させようとする場合には、培地のＣ／Ｎ比を６〜
３０、好ましくは１２〜２０の範囲内に設定する。培地
中の炭素または窒素の濃度も使用する糸状菌に応じて適
宜設定すればよい。たとえば、アスペルギルス属に属す
る糸状菌を用いてプロテアーゼを産生させようとする場
合には、培地中の炭素濃度を０．０５〜１０％（Ｗ／
Ｖ）、好ましくは０．１〜５．０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内
に設定する。また、窒素濃度は、炭素濃度が決まれば、
上記Ｃ／Ｎ比に対応して自動的に設定される。このよう
にして、培地の濃度及びＣ／Ｎ比を上記範囲内から適宜
選定したら、まず最初の培地を常法により調製する。

【００１３】次に、本発明方法１においては、上記の先
に調製した培地とはＣ／Ｎ比が実質的に同じであるが、
濃度の異なる培地をもう一種以上調製する必要がある。
その際、次に調製する培地は、先に調製した培地だけを
用いて連続的に培養した時、培養液中の溶存酸素濃度も
しくはｐＨが変化（上昇もしくは低下）するが、その変
化を逆の変化（低下もしくは上昇）を導けるような濃度
を有していなければならない。したがって、本培養の前
に予備試験を行い、上記条件を満足する濃度範囲を予め
決めておくことが肝要である。一般に、そのような条件
を満足する濃度範囲は、使用する微生物によっても異な
るが、アスペルギルス属に属する糸状菌を用いた場合に
は、最初に調製した培地の濃度の０．１〜１０倍程度で
ある。このような培地は、例えば、栄養源ごとの炭素及
び窒素の各含有量を予め分析しておき、所定のＣ／Ｎ比
および濃度に応じて、各種栄養源を適宜組み合わせるこ
とにより、容易に調製することができる。

【００１４】本発明方法１のもう一つの特徴は、上記の
二種以上の培地を切り換えながら連続的に使用し、培養
中の溶存酸素濃度もしくはｐＨを一定に保持しながら培
養することにある。すなわち、培養液中の溶存酸素濃度
もしくはｐＨをモニターしながら、培養液中の溶存酸素
濃度もしくはｐＨが所定の値より高くなった時には先に
使用した倍地よりも濃度の高い培地に切り換え、逆に所
定の値より低くなった時には切り換え前の培地を供給し
て培養を行うことにより、培養中の溶存酸素濃度もしく
はｐＨを一定に保持することができる。また、上記の場
合とは逆に、培養液中の溶存酸素濃度もしくはｐＨが所
定の値より低くなった時には先に使用した培地よりも濃
度の低い培地に切り換え、逆に所定の値より高くなった
時には切り換え前の培地を供給して培養すればよい。

【００１５】培養中のその他の条件は、糸状菌を用いて
プロテアーゼを産生させる時に採用される通常の条件を
適宜選択して用いればよい。たとえば、溶存酸素濃度と
しては、０ｐｐｍ以上、好ましくは４〜６ｐｐｍに調節
する。また、ｐＨは３〜８、好ましくは５〜７に調節す
る。

【００１６】次に、本発明方法２は、上記の本発明方法
１をさらに改良したものであって、本発明方法１におけ
る培地以外にさらに炭素源または窒素源から選ばれた一
種類以上の栄養源を併用し、培養中の溶存酸素濃度およ
びｐＨを一定に保持しながら培養することを特徴とする
ものである。培養に使用する栄養源としては、上記の培
地を調製する際に使用するものと同一のものを例示する
ことができる。培養方法は、本発明方法１を実施しなが
ら、溶存酸素濃度またはｐＨが所定の値より変動した場
合、栄養源を添加して溶存酸素濃度とｐＨの両方を所定
の値に維持しながら培養すればよい。なお、本発明方法
２におけるその他の方法条件は、本発明方法１と同じで
ある。

【００１７】上記のようにして得られた培養終了液より
プロテアーゼを回収する手段としては、例えば、常法に
より培養液を濾過して菌体を分離し、さらに必要により
透析、塩析、イオン交換樹脂、ゲル濾過などのより精製
する方法などがあげられる。

【００１８】

【発明の効果】本発明は、簡便な方法により溶存酸素濃
度及び／またはｐＨを一定の値に保持しながら糸状菌を
培養する方法であり、プロテアーゼを効率よく、長期間
（例えば、６０日間以上）に渡って安定的に産生させる
ことができ、産業上極めて有意義である。

【００１９】

【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
する。 実施例１ （１）前培養 ５％（Ｗ／Ｖ）可溶性デンプン、１％（Ｗ／Ｖ）ソイト
ン、０．０３％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、０．５％（Ｗ／
Ｖ）リン酸１カリウム、５．０％（Ｗ／Ｖ）食塩を含有
する液体培地（ｐＨ６．３）３リットル（Ｌ）を３種の
ジャーファーメンターに投入し、常圧で加熱殺菌したの
ち該培地にアスペルギルス・オリーゼＩＦＯ４３４８の
胞子懸濁液を接種（胞子数１×１０⁶個／ｍｌ）し、通
気量１ｖｖｍ、攪拌数４００ｒｐｍ、培養温度３０℃で
培養を行った。培養開始後４８時間経過時以降次のよう
にして３種の連続培養を行った。

【００２０】（２）本培養 試験−１（本発明方法１） 上記した前培養液に以下の２種の液体培地−１または−
２を希釈率０．０１５ｈｒ^-1でジャーファーメンターの
供給口より連続的に供給し、培養液量が３Ｌとなるよう
に保持しつつ攪拌回転数４００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ
で連続培養を行った。なお、溶存酸素濃度５ｐｐｍ以下
の時は、液体培地−１が供給され、溶存酸素濃度５ｐｐ
ｍ以上のときには、液体培地−２が供給されるようにし
た。この手段により、溶存酸素濃度は５±０．１ｐｐｍ
の範囲で制御できた。

【００２１】液体培地−１：１．２５％可溶性デンプ
ン、０．６％ソイトン、０．０３％酵母エキス、０．５
％リン酸一カリウム、５．０％食塩、ｐＨ６．３ 液体培地−２：３．５％可溶性デンプン、１．８％ソイ
トン、０．０３％酵母エキス、０．５％リン酸一カリウ
ム、５．０％食塩、ｐＨ６．３ 培地調製に用いた各種栄養源の元素分析値を表１に示
す。なお、液体培地−１および−２のＣ／Ｎ比はいずれ
も１４．８である。

【００２２】

【表１】

【００２３】試験−２（本発明方法１） 上記した前培養液に以下の２種の液体培地−３または−
４を希釈率０．０１５ｈｒ^-1でジャーファーメンターの
供給口より連続的に供給し、培養液量が３Ｌとなるよう
に保持しつつ、攪拌回転数４００ｒｐｍ、通気量１ｖｖ
ｍで連続培養を行った。なお、ｐＨ６．３以下の時は液
体培地−３が供給され、ｐＨ６．３以上の時には液体培
地−４が供給されるようにした。この手段により、ｐＨ
は６．３±０．１の範囲で制御できた。

【００２４】液体培地−３：１．２５％可溶性デンプ
ン、０．６％ソイトン、０．０３％酵母エキス、０．５
％リン酸一カリウム、５．０％食塩、ｐＨ６．３ 液体培地−４：３．５％可溶性デンプン、１．８％ソイ
トン、０．０３％酵母エキス、０．５％リン酸一カリウ
ム、５．０％食塩、ｐＨ６．３ なお、液体培地−３および−４のＣ／Ｎ比はいずれも１
４．８である。

【００２５】試験−３（対照） 前培養液に液体培地−５を希釈率０．０１５ｈｒ^-1の割
合でジャーファーメンターの培養液が３Ｌとなるように
保持しつつ、溶存酸素濃度５ｐｐｍとなるように攪拌回
転数を変化させ、水酸化ナトリウムまたは塩酸によりｐ
Ｈを６．３に調節し、通気量１ｖｖｍで連続培養を行っ
た。 液体培地−５：３．５％可溶性デンプン、１．８％ソイ
トン、０．０３％酵母エキス、０．５％リン酸一カリウ
ム、５．０％食塩、ｐＨ６．３

【００２６】上記した３種の連続培養液について経時的
な糸状菌菌体量、プロテアーゼ活性値を表２に示す。な
お、プロテアーゼ活性値の測定はアンソン萩原変法によ
り測定し、１分間に１μｇのチロシン様物質を遊離する
酵素量を１ユニット（ｕ）とした。表２から明らかなよ
うに、本発明方法は従来法に比べてプロテアーゼを長期
間に渡り安定して生産できることが明らかになった。

【００２７】

【表２】

【００２８】実施例２（本発明方法２） 実施例１の試験ー１の方法において、さらに炭素源とし
て醤油油を併用して溶存酸素濃度を５±０．１ｐｐｍの
範囲で、ｐＨを６．３±０．１の範囲で制御して、糸状
菌の連続培養を行った。その結果、上記表２に併記した
ように、プロテアーゼ生産量が実施例１の試験ー１の時
よりも２〜３割ほど増加し、しかも試験ー１と同様に長
期間に渡って安定してプロテアーゼを製造できることが
明きらかとなった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液
   体培地に接種し、連続的に糸状菌を培養する方法におい
   て、液体培地として炭素と窒素との比（Ｃ／Ｎ比）が実
   質的に同じ比を有し、濃度の異なる二種以上の培地を使
   用し、培養中の溶存酸素濃度もしくはｐＨを一定に保持
   しながら培養することを特徴とする、糸状菌の連続液体
   培養法。
2. 【請求項２】 プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液
   体培地に接種し、連続的に糸状菌を培養する方法におい
   て、液体培地として炭素と窒素との比（Ｃ／Ｎ比）が実
   質的に同じ比を有し、濃度の異なる二種以上の培地、お
   よび炭素源または窒素源から選ばれた一種類以上の栄養
   源を併用し、培養中の溶存酸素濃度およびｐＨを一定に
   保持しながら培養することを特徴とする、糸状菌の連続
   液体培養法。