JPS63219376A - プロテア−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を用いて
高力価のプロテアーゼを効率良く製造する方法に関する
。

〔従来の技術〕

、　　プロテアーゼは蛋白質又はその部分加水分解物に
作用してペプチド結合を分解する加水分解酵素であって
、医薬、醸造食品、洗剤等に広く利用さている。

従来、微生物によるプロテアーゼの生産に関する研究は
、プロテアーゼ生産能の高い微生物のスクリーニング法
もしくはその育種法に主眼がおかれていた。又培養条件
に関する研究も、その多くは培地の組成、特に培地に無
機塩を添加するもの（例えば特公昭５０−２２１１１号
公報等）や培地中の窒素源の種類（例えば特開昭５１−
９５１８０号公報等）、炭素源の種類（例えば特公昭５
２−１２７９７号公報等）等や、培養方法、特に酸素移
動速度を制御するもの（特公昭５２−４３９１６）や、
溶存酸素分圧を０．２０ａｔｍ以上に制御するもの（特
公昭５３−２７７８９）等に限られており、しかもこれ
らは何れも回分式製造法に限られていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来のプロテアーゼ製造に関する提案方法では、何れも
回分式製造法であったことに主として起因して、プロテ
アーゼ産生期は菌体が増殖した後の定常期に限られてお
り、しかも定常期において培地中の炭素源、窒素源を制
御することが著しく困難であったため、プロテアーゼの
工業的採取期が短く、しかも得られるプロテアーゼ力価
も比較的低いものであると言う問題点があった。

また、前記の酸素移動速度を制御する方法においては、
単位菌体当りの菌体呼吸速度（酸素吸収速度）が増加し
て培養条件の酸素供給速度を上回り、菌体増殖が酸素供
給速度の制限を受ける結果、プロテアーゼ生産性が低下
するという問題点があった。更に、溶存酸素分圧のみを
制御する方法においても、プロテアーゼ活性が一定の所
でとどまり、さらに高活性を求めることができないとい
う問題点があった。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、これらの先願及び従来方法の持つ問題点を克
服するために研究が成された結果、完成されたものであ
る。

本発明は、プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液体培
地に培養してプロテアーゼを製造するに際し、増殖末期
以降において培養液の溶存酸素濃度を２．０■７１以上
に維持すると共に、大豆粉を含む液体培地を連続的又は
断続的に加えて培養することを特徴とするプロテアーゼ
の製法である。

本発明において用いられる微生物は、アスペルギルス属
、ペニシリウム属、ムコール属、またはリゾプス属等に
属するプロテアーゼ生産能を有する糸状菌であり、具体
的にはアスペルギルス・ソーヤ（Ｉ　ＡＭ　２７０３）
、アスペルギルス・ソーヤ（ＩＡＭ　２６３１）、アス
ペルギルス・オリゼー（ＩＡＭ２６０９）、アスペルギ
ルス・オリゼー（Ｉ　Ｆ　Ｏ４１７６）、アスペルギル
ス・タマリ　（Ｔ　ＡＭ　２１５６）、ペニシリウム・
クリソゲナム（ＨＵ　Ｔ　４０１９）、ペニシリウム・
ルテウム（Ａ　ＨＵ　８０２２）、ムコール・ラセモサ
ス（Ａ　ＨＵ　６００２）、ムコール・ヒエマリス（Ｈ
ＵＴ　１１３１）、リゾープス・フォルモサエンシス（
ＩＦ　Ｏ４７３２）、リゾープス・ジャバニカス（ＩＦ
Ｏ５４４１）　）などが挙げられる。

本発明に用いられるプロテアーゼ生産能を有する糸状菌
は雑菌汚染防止の観点から耐塩性を有するものであるこ
とが望ましい（耐塩性の目安としては食塩５％以上、好
ましくは食塩１０％以上である）。

本発明において、大豆粉を含む液体培地を添加するまで
の培養、即ち単に菌体を増殖するための培養を、以下単
に前培養と言う。

そして前培養に使用する培地としては、従来プロテアー
ゼ生産能を有する糸状菌の液体培養法において用いられ
る液体培地であれば何れを用いてもよい、即ち、培地の
炭素源としては、例えばグルコース、可溶性澱粉、シュ
クロース、デキストリン、セルロース、グリセリン、敵
等が、窒素源としては、例えば大豆粉、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、ヌカ、カゼイン、ポリペプトン、グ
ルテン等が、無機塩としては、例えば各種リン酸塩、硫
酸塩、塩酸塩等が用いられ、さらに必要によりビタミン
類、核酸等を適宜加えた液体培地が用いられる。

このうち、窒素源として、プロテアーゼ活性を著しく高
める効果のある大豆粉が好ましい。なお、大豆粉の他に
前記の窒素源を併用してもよい。

前記した液体培地に、プロテアーゼ生産能を有する糸状
菌菌体を接種した後、液体培養する。このときの培養温
度、培地のｐＨ１通気量などの培養条件は使用する菌株
、培地組成などによって変わるが、通常培養温度は２５
〜４０℃、培地のｐＨは６〜８、通気量は０．１〜２　
Ｖ、Ｖ、Ｍ程度である。

かくして、培養初期の誘導期を経て、増殖期に移行する
と、菌体は著しく増殖する。通常、培養開始後ｌ〜４日
程度で増殖は止まり、増殖末期以降はほぼ定常期に移行
する。

本発明においては、増殖末期以降において培養液の溶存
酸素濃度を２．　Ｏｔｇｌ　１以上、好ましくは２．５
〜１５■どｌに維持する。維持法としては、通気ガスを
培養液中に攪拌混合してやればよい。但し、攪拌速度が
高回転になると、撹拌羽根による菌体のせん断等の物理
的影響が現われる可能性があるので、その影響が現われ
ないように通気ガス量、通気ガスの種類及び攪拌羽根の
形状等を決めた方が良い。溶解効率等の面から、通気ガ
スとして、純酸素ガスや酸素富化空気を用いることが好
ましい。

さらに本発明においては、増殖期末期以降、即ち、酵素
産生期に大豆粉を含む培養液を連続的又は断続的に加え
る。

このとき、必要に応じ大豆粉のほかに他の蛋白質原料、
例えば分離大豆蛋白、ミルクカゼイン、卵アルブミン、
牛血清アルブミン、小麦グルテン、ペプトン、ソイトー
ン等の１種もしくは２種以上のものを併用してもよい。

この大豆粉を含む液体培地には、必要によりグルコース
、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、可溶性澱
粉、デキストリン、セルロース、小麦等の糖質原料、更
に各種リン酸塩、硫酸塩、塩酸塩等の無機塩類、ビタミ
ン類、核酸等を加えてもよい。

本発明において、増殖期末期以降の培養液に大豆粉を含
む液体培地を添加するのは、次の理由による。

培養液中、菌体の増殖とともに微量生産されるプロテア
ーゼ、ペプチダーゼ等により培養初期に含まれるプロテ
アーゼ生産の誘導物質である蛋白質が分解されてアミノ
酸となるため、蛋白質が殆どもしくは全く存在せず、プ
ロテアーゼ生産の誘導作用を受は難いため、増殖末期以
降においては高活性のプロテアーゼの生産は到底達成さ
れない。

そこで、プロテアーゼの生産を高めるには増殖末期以降
において、大豆粉を含む液体培地を培養液に加えればよ
いわけである。

なお、この増殖期末期以降に大豆粉を含む培養液を添加
する際、培養液中の窒素濃度を０．０５〜０゜３０％（
Ｗ／Ｖ）、かつ、糖濃度０．１０％　（Ｗ／Ｖ）以下に
維持する（以下、単に炭素律速と言うことがある。）か
、又は、培養液中の窒素濃度を０．０５％（Ｗ／Ｖ）未
満に維持する（以下、単に窒素律速と言うことがある。

）ことにより、プロテアーゼ活性を更に高められるので
好ましい。

先ず、増殖期末期以降に、炭素律速となるように大豆粉
を含む液体培地を添加する手段としては、培地の組成、
添加速度、添加割合などの調整その他適宜の手段を選ぶ
ことができるが、その好ましい手段の一例を述べると次
のとおりである。

先ず、糖源は糸状菌によって分解されて単糖類となり、
これがプロテアーゼ生産の抑制因子となるため、菌体自
身の炭素、窒素、およびリンの組成を考慮して培地中の
糖源の含有割合を蛋白質やリンに比べて低くする必要が
ある。そこで、増殖末期以降に培養液に添加する大豆粉
を含む液体培地の組成を決めるにあたっては、予めこの
液体培地に使用するプロテアーゼ生産能を有する糸状菌
を実験的に培養し、糖源が完全に消費された時に残存す
る窒素濃度が０．０６〜０．３％（Ｗ／Ｖ）となるよう
に糖源と蛋白質及びその他の炭素源の配合比を決め、こ
のように配合比を決めた大豆粉を含む液体培地を上記し
た増殖末期以降の培養液に糖濃度が０．１０％（Ｗ／Ｖ
）以下、好ましくは０．０５％（Ｗ／Ｖ）以下となるよ
うに添加すると、培養液中の窒素濃度は０．０６〜０．
３０％（Ｗ／Ｖ）の範囲に保持される。

また、上記大豆粉を含む液体培地に糖を含ませていない
場合には、培養液中の窒素濃度が　０．０６〜０．３０
％（Ｗ／Ｖ）の範囲となるように大豆粉を含む培地を添
加すればよい。

一方、増殖末期以降に、窒素律速となるように液体培地
を添加する方法としては、添加する大豆粉を含む液体培
地の組成を、菌体自身のＣ，Ｎ、Ｐの組成に比して、Ｎ
を少なくする方法が挙げられる。

先ず、Ｎ源は糸状菌によって分解されてアミノ酸となり
、これがプロテアーゼ生産の抑制因子となるため、菌体
自身の炭素、窒素、およびリンの組成を考慮して培地中
のＮｉｆｆ１の含有割合を糖やリンに比べて低くする必
要がある。そこで、増殖末期以降に培養液に添加する大
豆粉を含む液体培地の組成を決めるにあたっては、予め
液体培地に使用するプロテアーゼ生産能を有する糸状菌
を実験的に培養し、Ｃ源、Ｐ源及びその他の栄養源に比
し、Ｎ源が完全に消費されるように糖源、その他の栄養
源と蛋白質の配合比を決め、このように配合比を決めた
大豆粉を含む液体培地を上記した増殖末期以降の培養液
に窒素濃度が０．０５％（Ｗ／Ｖ）未満となるように添
加すると、培養液中の窒素濃度は０．０５％（Ｗ／Ｖ）
未満の範囲に保持される。

いずれの方法においても増殖末期以降の培養液への大豆
粉を含む液体培地の添加は連続的もしくは断続的に添加
することができる。

そして増殖末期以降に大豆粉を含む液体培地を添加して
行なう培養は、該液体培地を連続的に添加し培養液を連
続的に取り出して連続培養するか、または該液体培地を
断続的に添加し培養液を断続的に取り出すというように
培養するか、または該液体培地を連続的もしくは断続的
に添加して流加培養することにより実施される。

上記のようにする以外は、連続培養法、流加培養法は常
法に準じて行なうことができる。なお、大豆粉を含む液
体培地を断続的に添加し培養液を断続的に取り出す培養
では、添加量と取り出し量は同じであっても異なってい
てもよく、また添加時期と取り出し時期は同時であって
も異なっていてもよい。

また、大豆粉を含む液体培地を連続的又は断続的に添加
して培養する場合、上記したいずれの培養においても、
通常温度は２５〜３５℃、培地のｐＨは６〜８程度であ
る。

上記のようにして得られた培養終了液よりプロテアーゼ
を回収する手段としては、例えば常法により培養液を濾
過して菌体を分離し、更に必要により透析、塩析、イオ
ン交換樹脂、ゲル濾過等により精製する方法等が挙げら
れる。

〔作　用〕

本発明において、増殖末期以降において培養液の溶存酸
素濃度を２．０ｍｇ／ｌ以上に維持しながら大豆粉を含
む液体培地を連続的又は断続的に加えることにより、増
殖末期以降における菌体濃度を高（維持し、プロテアー
ゼ活性も高く維持することができる。さらに、好ましく
は炭素又は窒素律速にすることにより、プロテアーゼ生
産を抑制する単糖類又はアミノ酸等が培養液中に著しく
少量となるため、プロテアーゼ生産を著しく促進させる
ことになる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、著しく高力価のプロテアーゼを効率良
く得ることが出来るので、本発明は産業上極めて有意義
である。

以下に実施例を掲げて更に本発明を説明する。

〔実施例〕

実施例１ 大豆粉１．６χ（Ｗ／Ｖ）、可溶性澱粉５．０χ（Ｗ／
Ｖ）１ＭｇＳＯ４・７ＨｚＯＯ，５Ｘ（Ｗ／Ｖ）、　Ｋ
ＨｚＰＯ４０，５Ｘ（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．０３χ
（Ｗ／Ｖ）、　ＺｎＣ１ｚ　　Ｏ，０１χ（Ｗ／Ｖ）、
　ＣａＣ１ｚ　０．０２％（Ｗ／Ｖ）及びＮａＣ１１０
，０χ（Ｗ／Ｖ）を含有する液体培地（ｐＨ６，５）を
２１ミニジヤーに１．５１仕込んだ後、オートクレーブ
で加熱殺菌し、その後、該培地にアスペルギルス・オリ
ゼー（Ｉ　Ａ　Ｍ　２６０９）の胞子懸濁液を接種しく
胞子数１０“個／ｄ）、攪拌速痩２５０〜４００ｒｐＨ
ｌで培養した。培養中のｐＨは６．５となるように５　
Ｎ−ＨｔＳＯ，及び５　Ｎ−ＮａＯＨで制御した。

８０時間後、増殖末期となったので、連続培養に入った
。即ち、先ず、該培地に純酸素を吹き込み、攪拌速度を
４００〜７００ｒｐｍにして、培養液中の溶存酸素濃度
が常に０〜２■／β未満、２．５■／β前後及び１５■
／ｌ前後となるように制御した。

同時に、前述と同一の液体培地を希釈率０．０２Ｖ／Ｖ
　−ｈｒの割合でミニジャーの供給口より連続的に供給
し、その取出口より供給量と同量の培養液を連続的に採
取した。連続培養中の温度は３０℃、培地ｐＨは６．５
に維持した。

液体培養開始後の培養液中の窒素濃度は０．０２５〜０
．０３％（Ｗ／Ｖ）に維持された。

採取した培養液中のプロテアーゼ力価（Ｐ、Ｕ、／ｄ）
をアンソン−萩原変法により測定した。結果を第１図に
示す。

上記第１図から、本発明方法では、プロテアーゼ活性が
高く維持されているのに対し、溶存酸素濃度が２■／ｌ
未満となると、本発明に比してプロテアーゼ活性が劣る
ことがわかる。

実施例２ 大豆粉２．０χ（Ｗ／Ｖ）、可溶性澱粉１．０χ（Ｗ／
Ｖ）９ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，５χ（Ｗ／Ｖ）、　Ｋ
ＨｇＰＯ４ｏ、ｓχ（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．０３
χ（Ｗ／Ｖ）、ＺｎＣ１ｚ　Ｏ，０１χ（Ｗ／Ｖ）、　
ＣａＣ１ｔ　Ｏ，０２Ｘ　（Ｗ／Ｖ）及びＮａＣ１１０
，０Ｘ（Ｗ／Ｖ）を含有する液体培地（ｐＨ６，５）を
オートクレーブで常圧で加熱殺菌し、２１ミニジヤーに
１．５１仕込んだ後、該培地にアスペルギルス・オリゼ
ー（Ｉ　ＡＭ　２６０９）の胞子懸濁液を接種しく胞子
数１０６個／ｍＺ）　、００２■／Ｉｌ、攪拌速度４０
０ｒｐｍで培養した。培養中のｐＨは６．５となるよう
に５　Ｎ　１ｈｓＯ４及び５Ｎ−Ｎ’ａＯＨで制御した
。

４８時間後、増殖末期となったので、連続培養に入った
。即ち、先ず、該培地に純酸素を吹き込み、攪拌速度を
５００〜７００ｒｐｍにして、培養液中の溶存酸素濃度
が常にＯ■／ｌ．３■／ｌ１５■／ｌとなるように制御
しつつ３種の連続培養を行なった。

同時に、蛋白質原料〔１，０χ（Ｗ／Ｖ）澱粉、　２．
０Ｘ（Ｗ／Ｖ）大豆粉、０，５χ（Ｗ／Ｖ）ＫＨ２ＰＯ
４，０，０５χ（Ｗ／Ｖ）　Ｍｇ５ｏ、。

０．０１（Ｗ／Ｖ）　ＣａＣ１ｚ、０．０３χ（Ｗ／Ｖ
）酵母エキスを含有するｐＨ６，５の液体培地をオート
クレーブで常圧加熱殺菌したもの〕を希釈率０．０２Ｖ
／Ｖ　−ｈｒの割合でミニジャーの供給口より連続的に
供給し、その取出口より供給量と同量の培養液を連続的
に採取した。連続培養中の温度は３０℃、培地ｐＨは６
．５に維持した。

液体培養開始後の培養液中の１１Ｍ９８度は０．１％（
−／Ｖ）以下、窒素濃度は０．０５〜０．２０％（Ｗ／
Ｖ）　ニ維持された。

採取した培養液中のプロテアーゼ力価（Ｐ、Ｕ、／−）
をアンソン−萩原変法により測定した。連続培養開始後
１０日目の活性を第１表に示す。

（本頁、以下余白） 第１表 上表より明らかな如く、本発明方法ではプロテアーゼ活
性が著しく上昇することが認められた。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の実施例及び比較例の結果を示すものであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液体培地に培
   養してプロテアーゼを製造するに際し、増殖末期以降に
   おいて培養液の溶存酸素濃度を２．０ｍｇ／ｌ以上に維
   持すると共に、大豆粉を含む液体培地を連続的又は断続
   的に加えて培養することを特徴とするプロテアーゼの製
   造法。 ２）増殖末期以降において、培養液中の窒素濃度を０．
   ０５〜０．３０％（Ｗ／Ｖ）、糖濃度を０．１０％（Ｗ
   ／Ｖ）以下に維持しつつ培養する特許請求の範囲第１項
   記載の製造法。 ３）増殖末期以降において、培養液中の窒素濃度を０．
   ０５％（Ｗ／Ｖ）未満に維持しつつ培養する特許請求の
   範囲第１項記載の製造法。 ４）プロテアーゼ生産能を有する糸状菌が耐塩性菌であ
   る特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載
   の製造法。 ５）純酸素ガス又は酸素富化空気を用いて溶存酸素濃度
   を２．０ｍｇ／ｌ以上に維持するものである特許請求の
   範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の製造法。