JPH07325083A - 糖タンパク質の特定糖鎖割合の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 特定糖タンパク質の糖鎖総量を別途測定する
必要がなく、試料中の特定糖タンパク質の全糖鎖量に対
する特定糖鎖量の割合を簡便かつ迅速に測定することが
できる特定糖タンパク質の特定糖鎖量の割合の測定方法
を提供する。 【構成】 特定糖タンパク質３のタンパク質部分に特異
的親和性を有する抗体２の一定量が固定された固相１
と、前記特定糖タンパク質３を含有する試料の液相とを
接触させて、抗体２に該特定糖タンパク質３を飽和状態
まで捕捉させ、次いで該糖タンパク質３の特定糖鎖４に
対して親和性を有する標識物７で標識化されたレクチン
６を結合させ、その標識物量を測定し、該標識物量を、
特定糖鎖の割合が既知である標準試料を用いて求めてお
いた該標識物量と特定糖鎖の割合との関係を示す検量値
データと比較することにより特定糖鎖割合を求める。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特定糖タンパク質の全
糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖タンパク質は、アミノ酸を構成成分と
するタンパク質と糖を構成成分とする糖鎖が結合した天
然高分子であり、生体内に存在するタンパク質の大部分
は糖タンパク質である。糖タンパク質の糖鎖は、ガラク
トース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、フコ
ース等の糖が分枝状に連結したものであり、その糖鎖構
造は生体内の生合成や代謝に際して各物質の目印となる
重要な役割を果たしている。この糖タンパク質の糖鎖構
造と疾患との関係が詳細に研究され、癌や慢性関節リウ
マチにて健常人と異なった糖鎖構造を有する糖タンパク
質の出現が報告されるようになり、臨床診断に際しても
糖鎖構造分析は重要となりつつある。以下、慢性関節リ
ウマチを例として臨床診断の現状と疾患に伴う糖鎖構造
変化について詳細に説明する。

【０００３】慢性関節リウマチ（以下ＲＡと略す）は、
多発性の関節炎を主とする疾患であり、膠原組織の炎症
性変化を示す自己免疫疾患の一種である。ＲＡの診断
は、臨床的特長を主として、これに免疫学的要因として
のリウマチ因子（以下ＲＦと略す）量が加味されて行わ
れている（廣瀬俊一、医学と薬学 ３０巻、３３ページ
１９９３年）。

【０００４】ＲＦはヒト免疫グロブリンＧ（以下ＩｇＧ
と略す）の一部の部位を抗原として認識する抗体である
ことが知られており、ＲＦ測定にはヒトＩｇＧをラテッ
クスに吸着させた試薬と患者血清とを混合し、凝集反応
を調べるシンガー・プロッツ（Ｓｉｎｇｅｒ・Ｐｌｏｔ
ｚ）法やヒト免疫グロブリンをヒツジ赤血球に吸着させ
た試薬と患者血清とを混合し、凝集性を見るワーラー・
ローズ（Ｗａａｌｅｒ・Ｒｏｓｅ）法などが用いられて
いる。しかしＲＦは、肝疾患、癌患者など他の疾患患者
にも高頻度に存在し、健常人の３〜７％にも確認される
ことより、ＲＡ患者におけるＲＦ存在の特異性は低い。
したがって、臨床現場でＲＡ診断の指標として測定され
ているＲＦは、必ずしもＲＡに特異性の高い診断指標と
なっていない。

【０００５】最近、血清中のＩｇＧに存在する糖鎖につ
いて詳細に研究が行われ、ＩｇＧ上糖鎖末端ガラクトー
ス残基の存在率がＲＡ患者で有意に減少している事が報
告された（R.B. Parekh et al. Nature 316 452 (198
5) ）。すなわち、ＩｇＧの糖鎖末端ガラクトース残基
が２分子とも欠損している割合は、健常人では全糖鎖の
約２５％であるのに対し、ＲＡ患者では約５０％にまで
増加していたと報告された。そして、糖鎖末端ガラクト
ース残基が欠損することにより、ＩｇＧに抗原性があら
われ、ＲＦを導くことが予想されている。更にこの糖鎖
末端ガラクトースの欠損は、ＲＡの薬物治療が原因とな
って生じた２次的な現象ではなく、ＲＡ患者に普遍的に
起こる特異的な現象である事が指摘されている。（信沢
孝一編集「複合糖質」蛋白質核酸酵素 臨時増刊号 第
１９２４〜１９６２頁 平成３年８月１０日発行 共立
出版（株））。よって、ＩｇＧの糖鎖末端ガラクトース
欠損の検出はＲＡ診断の新しい指標となる可能性が有る
として、その測定法の開発が期待されている。

【０００６】以上のように、病態と糖タンパク質の糖鎖
構造変化に密接な関係を見いだせる場合、特定糖タンパ
ク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合の測定値は臨
床判断に有用な指標となる可能性が有るとして、定量方
法の開発が進められている。

【０００７】糖タンパク質の糖鎖を測定する方法として
は、薄相クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ガスクロ
マトグラフィー、液体クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィーなどがあり（新生化学実験講座
３糖質Ｉ、糖タンパク質、１９９０年５月２１日発行、
東京化学同人）、広く糖タンパク質の糖鎖解析に利用さ
れているが、測定感度、操作性、検体処理時間などを考
慮すると、これらの方法をそのまま臨床検査法として利
用することは困難である。この問題を解決する方法とし
て、レクチンを利用する測定方法が考えられた。レクチ
ンは、特定の糖鎖構造を認識して特異的な親和性を示す
タンパク質であり、糖鎖認識能については成書（新生化
学実験講座３糖質Ｉ、糖タンパク質、１９９０年５月２
１日発行、東京化学同人、第９〜１８頁）に詳しく説明
されている。

【０００８】特開昭６１−２０８６７公報は、目的の糖
タンパク質に特異的親和性を有する抗体で特定糖タンパ
ク質を濃度依存的に捕捉し、捕捉された特定糖タンパク
質の糖鎖量を標識レクチンで検出する抗体−レクチンの
サンドイッチ法を報告しているが、実施例１．Ｖ．標準
の尿の調製にて、標準品を緩衝液で希釈調製しているこ
とから解るように、本法は抗原濃度に依存する糖残基量
を測定する方法であり、抗原の全糖鎖量に対する特定糖
鎖量の割合を測定する方法ではない。

【０００９】特開平４−１３０２７４公報は、特定糖タ
ンパク質の糖鎖と親和性のあるレクチンで目的の糖タン
パク質を濃度依存的に捕捉し、さらに目的の糖タンパク
質の糖鎖と親和性を有する標識レクチンで検出するレク
チン−レクチンサンドイッチ法を提案しているが、レク
チンの反応は抗原抗体反応と比較して特異性が低く、特
定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合を
正確に測定することは不可能である。

【００１０】ＲＡ関連のレクチンを用いた特定糖鎖濃度
測定方法に関し、特開平３−７３８５７公報は、糖鎖の
末端ガラクトース残基が欠損したＩｇＧ量を測定する方
法を提案している。この方法は、プロテインＡあるいは
プロテインＧを固相に固定し、固相を血清と反応させて
ＩｇＧを濃度依存的に捕捉し、更に標識コンカナバリン
Ａまたは標識レンズカリナリスアグルチニンなどの標識
レクチンを作用させて、結合した標識物を定量する方法
である。しかし、プロテインＡやプロテインＧはＩｇＧ
とのみ親和性を示すため、他種の糖タンパク質に関して
用いることはできない。

【００１１】また、特開平５−８７８１４公報は、糖鎖
の末端にガラクトース残基を含有する糖鎖量の測定方法
を提案している。すなわち抗ＩｇＧ抗体の活性フラグメ
ントを固定した固相に、血清を反応させてＩｇＧを濃度
依存的に捕捉し、これに標識レクチンを作用させてＩｇ
Ｇ糖鎖の末端ガラクトース残基に結合させ、結合した標
識物を定量する方法である。この方法は、該特許公開公
報の実施例１のリウマチ患者と正常人血清の実測結果
（該特許公開公報の図２）が示すように、各測定試料
（血清）にて固相に捕捉されるＩｇＧ総量が異なる。す
なわち、抗原抗体反応により捕らえられるＩｇＧ量は、
測定試料（血清）中のＩｇＧ濃度に依存していることが
示されている。この方法にてＩｇＧの全糖鎖量に対する
特定糖鎖量の割合を測定するには、該実施例１のごと
く、別途何等かの方法にて予めＩｇＧ濃度測定し、各測
定試料のＩｇＧ濃度を一定濃度に調製しなくてはならな
い。

【００１２】これらの方法は、固相上に特定糖タンパク
質を濃度依存的に捕捉し、捕捉された特定糖タンパク質
の糖鎖にレクチンを介して結合する標識物量を測定する
方法であり、測定試料中の特定糖タンパク質濃度が増減
すれば結合する標識物量も影響を受ける。よって、臨床
診断的に重要となる特定糖タンパク質の特定糖鎖含有割
合は、固相に捕捉された特定糖タンパク質の糖鎖全量を
別途に測定し、［レクチンの結合した糖鎖量／全糖鎖
量］として算出する必要性がある。

【００１３】谷口らは、糖タンパク質の糖鎖の抗体−レ
クチン酵素免疫測定法に関して報告している（生物物理
化学．35巻3 号，第45〜50頁，1991年）。この方法は、
固相に固定した抗体にて特定糖タンパク質を濃度依存的
に捕捉し、これに酵素標識したレクチンを反応させて結
合する酵素量を測定する方法であり、特定糖タンパク質
の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合の変化を調べるに
は、酵素標識した２種以上のレクチンを用いて同一試料
を測定し、各レクチンの反応程度を結合した酵素活性の
比率として比較する必要があるため、複数のレクチンに
対して検量線を別途に作製する等の煩雑な操作を伴う。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】以上に説明したよう
に、薄相クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ガスクロ
マトグラフィー、液体クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィーなどの方法では、特定糖タンパ
ク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合を測定するに
は操作性がわるく、検体処理時間が極めて長く臨床現場
などの検査などにはとても応用できないと言う問題があ
る。また、レクチンを用いた前述した従来法を応用して
特定糖タンパク質の特定糖鎖含有割合を測定しようとす
ると、これらの方法はいずれも固相上に捕捉される特定
糖タンパク質の量が、各測定試料中に含まれる特定糖タ
ンパク質の濃度に応じて変化するため、［レクチンの結
合した糖鎖量／全糖鎖量］を知るためには、いちいち固
相に捕捉された特定糖タンパク質の糖鎖全量を別途に測
定する必要がある。或いは検査対象である試料中の特定
糖タンパク質の濃度が常に一定になるように試料の濃度
を調整する必要があり、そのためにはいちいち試料中の
特定糖タンパク質の濃度を測定しなければならないと言
う問題があった。

【００１５】以上の様に、従来技術では簡便操作にて特
定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合を
測定することはできない。本発明では、これらの従来法
の欠点に鑑み、免疫学的手法とレクチンの親和性を組み
合わせ使用し、その度に固相に捕捉された特定糖タンパ
ク質の糖鎖全量を別途に測定したり、或いは検査対象で
ある試料中の特定糖タンパク質の濃度が常に一定になる
ように試料の濃度を調整するとか、別途試料中の特定糖
タンパク質の濃度を測定の度に測定するとか言う手間の
かかる操作を改良し、より簡便な操作で特定糖タンパク
質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合を測定する方法
を提供することを目的とするものである。

【００１６】また、そのほか後述する本発明の好ましい
態様に於いては、前記目的のほか、それぞれ更に次のよ
うな目的を有する。即ち、更に本発明は、よりノイズが
少なく、また、測定の幅の広い特定糖タンパク質の全糖
鎖量に対する特定糖鎖量の割合を測定する方法を提供す
ることを目的とするものである。

【００１７】更に本発明の別の目的は、病気の診断に有
用な特定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の
割合を測定する方法を提供することを目的とするもので
ある。

【００１８】更に本発明の別の目的は、高感度で容易に
検出できる特定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖
鎖量の割合を測定する方法を提供することを目的とする
ものである。

【００１９】

【課題を解決するための手段】前記課題を達成するため
に、本発明の糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖
量の割合を測定する方法は次の構成を有するものであ
る。

【００２０】（１）（ａ）特定糖タンパク質のタンパク
質部分に特異的親和性を有する抗体および／または該抗
体の活性フラグメントの一定量を固定した固相と、前記
特定糖タンパク質を含有する試料の液相とを接触させる
ことにより、該固相上の該抗体および／または該抗体の
活性フラグメントに該特定糖タンパク質を飽和状態まで
捕捉させた後、固相と液相を分離し、次いで分離した固
相と該糖タンパク質の特定糖鎖に対して親和性を有する
標識化されたレクチンを含有する液相を接触させ、該固
相上に捕捉されている特定糖タンパク質の特定糖鎖に標
識化されたレクチンを結合させ、次いで固相と液相を分
離し、分離した固相にレクチンを介して結合している標
識物量を測定し、該標識物量を （ｂ）一定量の該特定タンパク質が含有する全糖鎖量に
対する特定糖鎖の割合が既知である標準試料を用いて前
記（ａ）と同様の方法により同様の標識物量の測定を行
い、その結果に基いてあらかじめ作成された該標識物量
と該特定タンパク質が含有する全糖鎖量に対する特定糖
鎖の割合との関係を示す検量値データと比較することに
より前記試料に含有されている該特定糖タンパク質の全
糖鎖量に対する特定糖鎖割合を決定することを特徴とす
る特定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割
合の測定方法。

【００２１】（２）固相に固定した抗体および／または
該抗体の活性フラグメントが、測定対象となる特定糖鎖
を含まない抗体および／または該抗体の活性フラグメン
トである前記（１）項に記載の特定糖タンパク質の全糖
鎖量に対する特定糖鎖割合の測定方法。

【００２２】（３）特定糖タンパク質を含有する試料
が、採取された尿、血液、血漿、血清から選ばれた１種
であって、固相に固定化した抗体および／または該抗体
の活性フラグメントのすべてに特定糖タンパク質が結合
する濃度以上で該特定糖タンパク質を含有する試料であ
る前記（１）項または（２）項に記載の特定糖タンパク
質の全糖鎖量に対する特定糖鎖割合の測定方法。

【００２３】（４）標識化されたレクチンが、酵素また
はビオチンのいずれかで標識されたレクチンである前記
（１）〜（３）項のいずれかに記載の特定糖タンパク質
の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合の測定方法。

【００２４】本発明者等は、特定糖タンパク質の全糖鎖
量に対する特定糖鎖量の割合を簡便に測定すべく鋭意研
究を重ねた結果、まず、測定しようとする特定糖タンパ
ク質のタンパク質部分に特異的親和性を有する一定量の
抗体および／または該抗体の活性フラグメント（抗体の
抗原認識部位を含む抗体の断片を言う）が固定された固
体の担体などの不溶化した固相に、特定糖タンパク質を
含有する試料溶液の液相を反応させ、抗原抗体反応を飽
和状態まで行うことによって前記特定糖タンパク質の一
定量を固相に捕捉し、固相と液相を分離し、固相に捕ら
えられた特定糖タンパク質の特定糖鎖に親和性を有する
標識化されたレクチンを反応させ、特定糖鎖残基部分に
標識物を結合させ、固相に結合した標識物量を測定し、
その標識物量から、あらかじめ特定糖鎖量割合がわかっ
ている標準試料を用いて作成してある標識物量と特定糖
鎖の割合との関係を示す検量線などの検量値データを用
いて、試料中の特定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特
定糖鎖量の割合が簡単に測定できることを見い出し前記
本発明に至ったものである。

【００２５】通常、糖タンパク質の含有する糖鎖種と数
は、糖タンパク質種により一定であるが、疾病によりそ
の糖鎖構造が変化する場合、特定糖タンパク質に含有さ
れる全糖鎖数は変化しないが糖鎖種の割合が変化するこ
とになる。そこで測定の対象となる特定の糖タンパク質
のタンパク質部分に特異的親和性を有する抗体および／
またはその活性フラグメントの一定量を固定した固相を
用いて測定対象試料中に含まれる特定糖タンパク質と本
発明の抗原抗体反応を飽和状態まで進めると、測定試料
（血液、血清等）中より固相上に特定糖タンパク質が一
定量捕らえられることになり、この事は、特定糖タンパ
ク質由来の限られた糖鎖種を一定数固相に捕捉すること
と等しい。そして、この固相に特定糖鎖種を認識して結
合する標識レクチンを反応させれば、結合する標識物量
は固相に捕捉された全糖鎖数に対する特定糖鎖数、すな
わち特定糖鎖割合を反映する事になる。

【００２６】以下、更に具体的に本発明の詳細を説明す
るが、下記に挙げる具体的物質および物質群などは例示
であって、なんらこれのみに限定する事を意味するもの
ではない。

【００２７】本発明で使用する抗体は、その由来を特に
限定されるものではなく、ほ乳類等（たとえばマウス、
ラット、ウサキなど）に特定糖タンパク質またはその精
製物を抗原として投与し、免疫して得られた抗血清、腹
水液などをそのまま用いるか、あるいは従来の方法であ
る塩析法、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、電気泳動法、アフィニティークロマトグラフィーな
どで精製してポリクローナル抗体として用いることがで
きる。あるいは、抗原で感作した哺乳類等の抗体産生細
胞（脾臓細胞、リンパ節細胞など）とミエローマ細胞と
から雑種細胞（ハイブリドーマ）を得て調製したモノク
ローナル抗体または従来公知の塩析法、各種クロマトグ
ラフィーにより調製したモノクローナル抗体を用いるこ
とができる。

【００２８】これらの抗体は抗体分子自体を使用しても
よく、また、これらの抗体を酵素処理して得られるＦａ
ｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）2 といった抗体の活性
フラグメント（抗体の抗原認識部位を含む抗体の断片を
言う）を使用しても良い。

【００２９】固相の担体形状としては、使用目的に応じ
た適宜の形状を選定すればよく、たとえば、ビーズ状、
テストプレート状、チューブ状、ディスク状、スティッ
ク状、ラテックス状などが例示できる。また、その素材
としては、通常の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）用担体とし
て用いられるもの、たとえば、ガラス、多糖類（セルロ
ース、デキストラン、デンプン、デキストリンなど）ま
たはその誘導体、シリカゲル、多孔性セラミックス、金
属酸化物、各種合成樹脂（たとえばプロピレン、塩化ビ
ニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、アクリル酸、
アクリル酸エステル、メタクリル酸、メタクリル酸エス
テル、スチレン、メチルスチレン、ブタジエン、イソプ
レン、アクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロ
ニトリルなどの重合物もしくは共重合物）、またはこれ
らに公知の手段によりスルホン基、アミノ基などの反応
性官能基を導入したものなどが挙げられる。

【００３０】これらの固相となる担体の形状や大きさは
測定対象が同一の糖タンパク質の場合にはできるだけ同
一形状で同一の大きさの担体を用いる事が、この各担体
の上にそれぞれ同一種類の一定量の前記抗体および／ま
たはその活性フラグメントを固定する場合に極めて操作
が楽になるので好ましい。もちろんその大きさや形状が
多少異なっても使用可能であるが、その場合にはこれら
の各担体の上にそれぞれ同一種類の一定量の前記抗体お
よび／またはその活性フラグメントが固定されるよう
に、これらの抗体の適用量が一定量になるよう配慮すれ
ばよい。

【００３１】固相である担体への抗体の固定方法は、物
理的吸着法、共有結合法、架橋法等の固定化酵素におけ
ると同様の方法を応用すればよく、たとえば、千畑一郎
編「固定化酵素」（昭和５０年３月２０日、（株）講談
社発行）第９〜７５頁などに記載の公知の手法が応用で
きる。

【００３２】各担体の上にそれぞれ同一種類の一定量の
抗体および／またはその活性フラグメントを固定するに
は、担体形状が例えばビーズ状、ディスク状、スティッ
ク状、ラテックス状など容器としての機能を持たない形
状の担体の場合で、それぞれ担体の形状や大きさが同じ
担体を用いる場合には、一定濃度の抗体および／または
その活性フラグメントを含む液中に浸してしまって抗体
および／またはその活性フラグメントの固定化操作を行
う方法が簡便である。しかし、各それぞれの担体に、同
一濃度の抗体および／またはその活性フラグメントを含
む液を一定量づつ適用する方法を採用してもよい。ま
た、担体形状が例えばテストプレート状、チューブ状な
ど容器としての機能を持つ形状の担体の場合には、通
常、各担体に同一濃度の抗体および／またはその活性フ
ラグメントを含む液を一定量づつ入れて固定化操作を行
うのが一般的である。しかし、いずれの担体において
も、各担体にそれぞれ実質的に同一量の抗体および／ま
たはその活性フラグメントが固定される方法であれば固
定化方法はいかなる方法でもよく、何等上記の例示した
方法に限られるものではない。

【００３３】固相に固定した抗体および／または該抗体
の活性フラグメントは測定対象となる特定糖鎖を含まな
い抗体および／または該抗体の活性フラグメントである
ことが測定の際のノイズを少なくでき、測定の幅が広が
るので好ましい。ここで測定対象となる特定糖鎖を含ま
ない抗体および／または該抗体の活性フラグメントと
は、固相に固定された抗体および／または該抗体の活性
フラグメントに含有されている特定糖鎖構造を分解する
事により特定糖鎖を含まない抗体および／または該抗体
の活性フラグメントとした場合も当然含まれる意味であ
る。

【００３４】固相に固定した抗体および／または該抗体
の活性フラグメントに含有されている糖鎖構造を分解す
る場合は、ノイラミニダーゼやβ−ガラクトシダーゼ等
の酵素反応を利用して行うこともできるが、該固相を過
ヨウ素酸水溶液に浸すことにより糖鎖構造を酸化分解す
る化学反応が好ましく行われる。

【００３５】レクチンとしては、目的の糖鎖構造を認識
して結合するものを用いればよく、たとえば、ヒママメ
レクチン、ヒイロチャワンタケレクチン、マッシュルー
ムレクチン、コンカナバリンＡ、ドリコスクレクチン、
チョウセンアサガオレクチン、レンチルレクチン、ロー
タスレクチン、イヌエンジュレクチン、インゲンマメレ
クチン、ピーナッツレクチン、エンドウマメレクチン、
アメリカヤマゴボウレクチン、ダイズレクチン、ニホン
ニワトコレクチン、ハリエニシダレクチン、小麦胚芽レ
クチンなどが例示される。

【００３６】レクチンと標識物を結合させて、標識化さ
れたレクチンを作製するには、架橋剤として、グルタル
アルデヒド、過ヨウ素酸、マレイミド化合物（Ｎ−スク
シミジル−２−マレイミドアセテート、Ｎ−スクシニミ
ジル−４−マレイミドブチレート、Ｎ−スクシミジル−
４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−
カルボキシレート、Ｎ−スルホスクシニミジル−４−
（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カル
ボキシレートなど）、ジマレイミド化合物（Ｎ，Ｎ’−
オキシジメチレンマレイミド、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレ
ンジマレイミドなど）等が使用できる。

【００３７】レクチンを標識化するための標識物として
は、酵素（たとえば、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキ
シダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキ
シダーゼ、グルコース−６ーリン酸デヒドロゲナーゼ
等）あるいはビオチンなど何らかの方法で比較的容易に
検出可能なものを使用すればよい。そのほか放射性同位
元素、補酵素、蛍光色素、化学発光物質などの標識物を
用いてもよいが、高感度で容易に検出しやすい点で、酵
素あるいはビオチンが特に好ましい。

【００３８】標識物として酵素あるいはビオチンが高感
度で特に好ましい理由は、酵素の触媒作用（例えば発色
酵素基質を用いた場合、酵素１分子が複数の基質分子に
作用し、酵素分子数の数倍の基質を発色させる増幅効果
がある。）やビオチンのこの種の標識物として使用する
場合の良く知られているＡＢＣ法（アビジン−ビオチン
−コンプレックス法）ではビオチンとアビジンの重合物
（アビジン１分子はビオチン４分子と結合可能であり、
ビオチンの２分子架橋物とアビジンを共存させるとビオ
チン・アビジン重合体が形成される。例えば酵素標識ア
ビジンを用いて作成したビオチン・アビジン重合体は多
数の酵素を含有する。この酵素標識アビジン・ビオチン
重合体は、まだ他のビオチンとも結合可能であるので、
ビオチンの結合した固相に接触させることにより、固相
に結合しているビオチン量と比例した量の酵素標識ビオ
チン・アビジン重合体が固相に結合する。すなわち固相
のビオチン１分子に多数の酵素が結合するので、その酵
素の触媒作用を利用する。）の使用が可能であり、酵素
量を比較的容易に測定可能な検出系（例えば吸光度測
定、蛍光測定、発光測定等）を用いて高感度に検出でき
るからである。

【００３９】標識化については１９８７年５月１５日医
学書院発行 石川榮治、河上忠、宮井潔編集「酵素免疫
測定法」第３版 第７５〜１５１頁ないしは千畑一郎
「固定化酵素」（昭和５０年３月２０日、（株）講談社
発行）第９〜７５頁などに準じた方法が応用できる。

【００４０】測定対象となる試料（被検体）としては、
測定の必要とされる糖タンパク質を含有するものであれ
ば特に限定はなく、たとえば、尿、血液、血漿、血清な
どの糖タンパク質を含有する生体由来の試料またはその
糖タンパク質の精製した溶液が挙げられる。特に尿、血
液、血漿、血清などの糖タンパク質を含有する生体由来
の試料を用いる場合には、例えば慢性関節リウマチや癌
などの病気の診断に適用でき好ましい。

【００４１】該試料の特定糖タンパク質の全糖鎖量に対
する特定糖鎖量の割合を測定するには、固相に固定した
特定糖タンパク質のタンパク質部分に特異的親和性を有
する一定量の抗体および／または該抗体の活性フラグメ
ントのすべてに特定糖タンパク質が結合する濃度以上で
特定糖タンパク質を含有する試料を用いることが肝要で
ある。 尿、血液、血漿、血清などの生体由来の試料な
どは特定糖タンパク質の含有濃度はほぼ一定の範囲にあ
るので、一度調査しておけばどの程度の量の抗体および
／または該抗体の活性フラグメントが固定された固相を
用意しておけば、固相に固定した前記一定量の抗体およ
び／または該抗体の活性フラグメントのすべてに特定糖
タンパク質が結合する濃度以上で特定糖タンパク質を含
有する試料に相当し、該固相上の該抗体および／または
該抗体の活性フラグメントに該特定糖タンパク質を飽和
状態まで捕捉させ得る状態とし得るかは容易に判定し得
るのである。

【００４２】また、標識化されたレクチンを糖タンパク
質の糖鎖に結合させるには、通常ｐＨ６〜９の範囲の燐
酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等の溶液として使用す
る。以下、本発明の理解を容易にするため、図３に本発
明法および図４に特開平５−８７８１４公報に記載され
た方法を簡略モデル図として示し比較する。

【００４３】図３、図４において、１は固相、２は特定
糖タンパク質のタンパク質部分に特異的親和性を有する
抗体、３は糖タンパク質、４、５はいずれも糖タンパク
質の糖鎖を示しているが、４は特定のレクチンと結合し
得る特定糖鎖、５は特定のレクチンと結合しない糖鎖、
６はレクチン、７は標識物を示している。

【００４４】図３（Ａ）および図４（Ａ）は、固相１に
固定した抗体２と、抗原である特定糖タンパク質３の抗
原抗体反応を示している。図４（Ａ）に示される特開平
５−８７８１４公報の方法では、固相１に固定された抗
体２のうち特定糖タンパク質濃度に依存した量が抗体と
反応するのに対して、図３（Ａ）に示された本発明方法
では固相１に固定した全ての抗体２と特定糖タンパク質
３を反応させる。特定糖タンパク質３と該抗体２の反応
は、糖鎖構造の差異に関係なく、特定糖タンパク質３の
タンパク質部分を認識して進むので、該抗原抗体反応を
飽和状態まで進めることにより固相１上に捕捉される特
定糖タンパク質３の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合
は、試料中に存在する特定糖タンパク質の全糖鎖量に対
する特定糖鎖量の割合と同じになる。一方、特定糖鎖濃
度の測定法である特開平５−８７８１４公報の方法にて
本発明法と同様に抗原抗体反応を飽和状態まで行うこと
は、糖鎖濃度測定可能範囲の上限を越え、測定不可能と
なることを意味する。

【００４５】なぜならば、この方法は特定糖鎖濃度の測
定を目的としているので、固相１に固定された一定数の
抗体２が飽和しない範囲で特定糖タンパク質３を抗体２
に結合させる必要があるからである。すなわち測定対象
試料中の特定糖タンパク質３の濃度が大きい場合には、
特定糖タンパク質３が全抗体２の内の全数よりは少ない
範囲でかなり多くの抗体２に結合し、試料中の特定糖タ
ンパク質３の濃度が小さい場合には、特定糖タンパク質
３が全抗体２の内の全数よりは少ない範囲で前者の場合
よりはより少なめの数の抗体２に結合する。こうするこ
とによって試料中の特定糖タンパク質３の濃度の測定が
できるが、もし試料中の特定糖タンパク質３の濃度が大
きい場合にも小さい場合にも共に固相１に固定された抗
体２が飽和する濃度以上の試料を用いた場合には、いず
れの場合も特定糖タンパク質３が固相１に固定された抗
体２のすべてに結合してしまうため、この両者は同一の
濃度であると判定される事になり、従って抗原抗体反応
を飽和状態まで行うことは、糖鎖濃度測定可能範囲の上
限を越え、糖鎖濃度の測定が不可能となるのである。

【００４６】以上が、既知の特定糖鎖濃度測定法と本発
明の方法が異なる第一点である。以上の抗原抗体反応に
より特定糖タンパク質３を固相１上に捕らえた後、固相
と液相を分離することにより、他の共存物と特定糖タン
パク質３とを分離することができる。

【００４７】図３（Ｂ）と図４（Ｂ）は固相上に捕らえ
た特定糖タンパク質３の特定糖鎖４と標識レクチン溶液
の液相を接触させる反応を示している。図４（Ｂ）の特
開平５−８７８１４公報の方法では、抗原抗体反応にて
特定糖タンパク質濃度に依存した量の特定糖タンパク質
３が抗体２により固相１上に捕捉されるため、特定糖タ
ンパク質３上の特定糖鎖４に結合するレクチン６も特定
糖タンパク質濃度に依存して増減する。一方、図３
（Ｂ）に示されている抗原抗体反応を飽和状態まで進め
る本発明方法では、固相１上に一定量の特定糖タンパク
質３を捕えているので、固相１に捕捉した特定糖タンパ
ク質３の特定糖鎖４に結合する標識レクチン量は、特定
糖タンパク質一定量当りの特定糖鎖量、すなわち特定糖
タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合に比例
する。本発明はこの原理を利用して、特定糖タンパク質
の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合を測定する事を目
的としたものである。一方、特開平５−８７８１４公報
の方法は、本来、糖鎖濃度測定法であるので、本発明の
目的を達成できないのである。

【００４８】また、本発明方法と特開平５−８７８１４
公報の方法が異なる更なる点は、測定に際して測定試料
と同様の方法で測定される標準物質（標準試料）であ
る。特開平５−８７８１４公報の方法の標準物質は、特
定糖鎖濃度既知であれば良いが、本法の標準物質は特定
糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合が既
知でなくてはならない。本法の標準物質の特定糖鎖割合
の分析は、成書（新生化学実験講座３糖質Ｉ、糖タンパ
ク質、１９９０年５月２１日発行、東京化学同人）に記
載の何れかの方法を用いて行えばよいが、高速液体クロ
マトグラフィーにより正確な分析を行うことが好まし
い。このように標準物質となる特定糖鎖割合の異なる２
つ以上、好ましくは３つ以上の試料で多ければより好ま
しいが、かかる複数の標準試料の当該特定糖タンパク質
の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合を上述した高速液
体クロマトグラフィーその他の適宜の手段によりあらか
じめ分析しておく。このようにして得られた、いくつか
の特定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割
合が既知の標準物質を用い、本発明と同様の手法、すな
わち当該特定糖タンパク質のタンパク質部分に特異的親
和性を有する抗体および／または該抗体の活性フラグメ
ントの一定量を固定した固相と、前記特定糖タンパク質
を含有する特定糖鎖量の割合が既知の標準試料の液相と
を接触させることにより、該固相上の該抗体および／ま
たは該抗体の活性フラグメントに該特定糖タンパク質を
飽和状態まで捕捉させた後、固相と液相を分離し、次い
で分離した固相と該糖タンパク質の特定糖鎖に対して親
和性を有する標識化されたレクチンを含有する液相を接
触させ、該固相上に捕捉されている特定糖タンパク質の
特定糖鎖に標識化されたレクチンを結合させ、次いで固
相と液相を分離し、分離した固相にレクチンを介して結
合している標識物量を測定する。その結果、特定糖鎖量
の割合に応じた標識物量（標識物量は例えば吸光度など
で調べるので、仮にここでは標識物量を吸光度と言う指
標に置き換えて説明する。もちろん標識物の種類に応じ
て吸光度以外のものが指標になることがある事は当然で
ある。）、すなわち該特定糖タンパク質の特定糖鎖量の
割合に応じた吸光度などの検量値データが得られる。こ
の検量値データは、例えば後述する図１に示すような検
量線に加工しておく事が便利である。このような検量
線、すなわち、吸光度と該特定糖タンパク質の特定糖鎖
量の割合との関係を示すグラフをあらかじめ作成してお
けば、測定したい試料を前述した本発明方法に従って測
定し、その試料の標識物量（例えば吸光度の値）を検出
すれば、前記検量線などの検量値データから、容易に該
特定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖割合を知
ることができるのである。

【００４９】このように検量線などの検量値データさえ
作成されていれば、本発明の実質的な操作、すなわち固
相上に該特定糖タンパク質を飽和状態まで捕捉させ、固
相と液相を分離し、次いで分離した固相と該糖タンパク
質の特定糖鎖に対して親和性を有する標識化されたレク
チンを含有する液相を接触させ、次いで固相と液相を分
離し、分離した固相にレクチンを介して結合している標
識物量を測定する操作は比較的短時間ででき、従って数
多くの試料の測定も容易になり、臨床現場などの短時間
で多くの試料の測定を行う必要のある場合に、極めて有
用な測定方法を提供できるのである。

【００５０】以上、本発明においては該抗原抗体反応を
飽和状態とする反応条件を採用し、更に特定糖タンパク
質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合が既知の標準物
質を用いることによって、初めて特定糖タンパク質の全
糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合が直接測定できる。

【００５１】

【作用】

（１）本発明は、固相に固定した一定量の抗体および／
または該抗体の活性フラグメントのすべてに特定糖タン
パク質が結合する濃度以上で特定糖タンパク質を含有す
る試料を用いることにより、抗原抗体反応が飽和状態ま
で進み、固相に結合する特定糖タンパク質量は一定とな
る。通常、糖タンパク質の糖鎖種と数は、糖タンパク質
種により定まっており、固相に一定量の特定糖タンパク
質を捕捉することは、限られた糖鎖種を一定量捕らえる
ことと等しい。そして、この固相に特定糖鎖種を認識し
て結合する標識レクチンを反応させれば、結合する標識
物量は固相に捕捉された全糖鎖数に対する特定糖鎖数、
すなわち特定糖鎖割合を反映する。よって、特定糖タン
パク質の糖鎖総量を試料毎に別途測定することなく、特
定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合を
直接測定することができる。また、かかる操作は前述の
特定糖タンパク質の糖鎖総量を試料毎に別途測定すると
言う余分な工程を必要とせず、しかも比較的短時間でで
きるので、より簡便な操作で特定糖タンパク質の全糖鎖
量に対する特定糖鎖量の割合を測定する方法を提供でき
る。

【００５２】（２）また、固相に固定した抗体および／
または該抗体の活性フラグメントが、測定対象となる特
定糖鎖を含まない抗体および／または該抗体の活性フラ
グメントである本発明の好ましい態様によれば、よりノ
イズが少ない特定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定
糖鎖割合の測定方法を提供でき、また、測定の幅を広げ
る事ができる。

【００５３】例えば吸光度計にて吸光度を測定する場
合、吸光度計の性能として可能な吸光度測定範囲は機器
により定まっている（吸光度０〜２．４まで測定可能な
機種が一般的である）。本発明の測定試料の吸光度測定
値は、測定試料と盲検の吸光度差として求めるので、盲
検の吸光度（ノイズ）が小さいほど測定試料の吸光度の
計測可能な範囲が広くなる。（例えばノイズの吸光度が
２．０である場合、吸光度０〜２．４が測定可能な吸光
度計を用いて測定できる吸光度範囲は、２．０〜２．４
となる。これに対して、ノイズの吸光度が０．１である
場合の測定可能な吸光度範囲は、０．１〜２．４の範囲
となる。また、特定糖鎖割合１％当りの吸光度変化量を
一定とした場合、同一吸光度計を用いて測定可能な特定
糖鎖割合の範囲は、ノイズの吸光度が小さい方が広くな
る。つまり、特定糖鎖割合の高い試料まで測定でき
る。） （３）また、特定糖タンパク質を含有する試料が、採取
された尿、血液、血漿、血清から選ばれた１種であっ
て、固相に固定化した抗体または該抗体の活性フラグメ
ントのすべてに特定糖タンパク質が結合する濃度以上で
該特定糖タンパク質を含有する試料である本発明の好ま
しい態様によれば、これらの試料は、患者の試料採取時
の特定糖鎖割合を反映するので、健常人の標準的な特定
糖鎖割合と比べてその割合の増減により容易に病気の診
断に適用する事ができる特定糖タンパク質の全糖鎖量に
対する特定糖鎖割合の測定方法を提供できる。

【００５４】（４）また、標識化されたレクチンが、酵
素またはビオチンのいずれかで標識されたレクチンであ
る本発明の好ましい態様によれば、前述した酵素の触媒
作用などによる増幅効果などにより、高感度でより容易
に検出できる特定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定
糖鎖量の割合の測定方法を提供できる。

【００５５】

【実施例】以下に本発明の理解を容易にするため、実施
例を挙げて説明するが、本発明はこの実施例のみに限定
されるものではない。

【００５６】実施例１ （ＩｇＧ糖鎖割合標準物質の作製）市販のヒトＩｇＧを
0.1M 酢酸緩衝液（pH 5）にて溶解（10 mg/ml）しノイ
ラミニダーゼを加えて３７℃、６５時間放置後、凍結保
存する（試料１）［レクチンが結合可能な特定糖鎖を有
する特定糖タンパク質］。試料１の一部を融解し、β−
ガラクトシダーゼを加えて３７℃、４８時間放置する
（試料２）［試料１のレクチンが結合可能な特定糖鎖を
酵素でダイジェストして得たものであり、レクチンが結
合可能な特定糖鎖の含有量が試料１より少ない特定糖タ
ンパク質］。試料１及び２を硫酸アンモニウムの分画沈
澱法により精製し、添加した酵素を除去する。試料１及
び２のタンパク質濃度を紫外光（２８０ｎｍ）吸収法に
より定量し、同一に調製する。タンパク質濃度を合わせ
た試料２に対して試料１を２５、５０、７５（v/v%）で
混合し、混合試料を作製した。

【００５７】試料１及び２の糖鎖分析は、高速液体クロ
マトグラフィーにより行う。すなわち、成書（高橋禮子
編著「糖蛋白質糖鎖研究法」平成元年９月１日発行 学
会出版センター出版）の高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）により特定糖鎖割合を測定した。詳細に
は、試料１及び２を各々をヒドラジン分解して糖鎖を切
り出し、２−アミノピリジンで標識後、逆相クロマトグ
ラフィーにて分析し、クロマトグラムより全糖鎖量に対
する糖鎖末端に２個のガラクトースを含有する糖鎖（特
定糖鎖）の割合を算出した。試料１及び２をＨＰＬＣに
て糖鎖分析した結果、全糖鎖量に対する該糖鎖の割合
は、それぞれ３１．７％及び７．０％であった。この試
料１及び２を標準試料とした。

【００５８】実施例２ （抗ヒトＩｇＧ抗体固定マイクロプレートの作製）ヤギ
抗ヒトＩｇＧ抗体を生理食塩水に溶解し（10μg/ml）、
多数の同じ形で同じ大きさのウェルを有するマイクロプ
レートの各ウェルに100 μｌづつ分注した。これを４
℃、２４時間放置後、精製水にて洗浄し、１(w/v%)ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を300 μｌづつ分注し
て３時間室温放置した。放置後、マイクロプレートを精
製水にて洗浄し、0.1(w/v%) 過ヨウ素酸ナトリウム含有
50mMクエン酸緩衝液（pH 4）を200 μｌづつ分注し、４
℃、３０分間静置し、精製水により洗浄した後測定に用
いた。

【００５９】実施例３ （マイクロプレートへのＩｇＧ捕捉量の確認）実施例２
で作製した抗ヒトＩｇＧ抗体固定マイクロプレートに、
試料希釈用液［0.05(v/v%)ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレートを含む10mMリン酸緩衝液 pH7.4］50μ
ｌを分注し、ヒト血清を生理食塩水で１／１，１／２，
１／４倍希釈した測定試料を各々20μｌ添加し、室温で
１時間振盪した。マイクロプレートを生理食塩水で３回
洗浄した後、特定糖タンパク質（この場合はヒトＩｇ
Ｇ）のタンパク質部分を認識して結合するペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体溶液（0.2μg／ml、試料希釈
用液で希釈）を各々50μl 添加し、１時間反応させた。
生理食塩水にて５回洗浄後、固相に結合しているペルオ
キシダーゼの酵素活性を測定するために、ｏ−フェニレ
ンジアミン（1mg/ml）および過酸化水素水［0.015(v/v
％) ］を含むリン酸−クエン酸緩衝液（pH 4.8）を50μ
ｌ添加し、２０分間室温で反応させた。２Ｎ硫酸の50μ
l を加えて反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定し
た。各測定試料の吸光度測定値を表１に示す。

【００６０】

【表１】

【００６１】表１の各吸光度測定値はどの場合もほぼ同
様である。すなわち、試料中のヒトＩｇＧ濃度が変化し
てもどの場合も同様にマイクロプレート上に一定量のヒ
トＩｇＧが捕捉されていることを示している。

【００６２】これは、抗原抗体反応を飽和状態まで進め
た結果であり、抗原抗体反応が１時間以内に飽和状態に
なることが確認できた。また、このような予備実験によ
り、試料が固相に固定化した抗体および／または該抗体
の活性フラグメントのすべてに特定糖タンパク質が結合
する濃度以上で該特定糖タンパク質を含有する試料であ
るかどうか、容易に判定出来、一度判定したらその後は
どの試料に対してはどの程度の量の抗体および／または
該抗体の活性フラグメントが固定された固相を用い、ど
の程度の時間反応させたらよいかの関係が明確に樹立さ
れる事になる。

【００６３】すなわち、例えば臨床検査で血清を試料と
する場合には、どの固相を用いてどの程度の反応時間を
行えば、抗原抗体反応を飽和状態まで進めることができ
るかを明白にする事ができる。

【００６４】実施例４ （糖鎖末端に２個のガラクトースを含有する糖鎖の割合
変化に伴う吸光度測定値の変動）実施例２で作成したマ
イクロプレートに、試料稀釈用液50μｌを分注し、これ
に実施例１で調製した各混合試料と試料１及び２のそれ
ぞれを別々に20μｌ添加した後、室温で１時間振盪し
た。生理食塩水にて３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識
ヒママメレクチン１２０［（株）ホーネンコーポレーシ
ョン製］の0.1μg/ml溶液［0.05(V/V%)ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート含有１０ｍＭリン酸緩衝
液（pH7.4）］を 50μｌ分注し、１時間反応させた。以
後実施例３と同様な方法で操作しマイクロプレート用の
吸光度計を用いて吸光度を測定した。尚、盲検は測定試
料に代えて生理食塩水を用いて並行して同様操作するこ
とにより行った。

【００６５】表２は、各試料の吸光度測定結果、実施例
１にて確認した試料１及び２の特定糖鎖割合［表２
の（）内］、及び各混合試料の特定糖鎖割合の理論値
［試料１及び２を混合した後の特定糖鎖割合を計算によ
り算出した値であり、例えば試料２に対して試料１を２
５(V/V%)混合した場合、7.0（試料２の特定糖鎖割合）
×0.75（試料２の混合比率）＋31.7（試料１の特定糖鎖
割合）×0.25（試料１の混合比率）＝13.2となる。］を
示している。

【００６６】

【表２】

【００６７】注1：（）内は、実施例１の高速液体クロ
マトグラフィーでの測定値。 注2：ΔA492nmは、各試料と盲検の吸光度（A492nm）の
差を示す。 表２に示した試料１及び２の吸光度測定値（ΔA492nm）
と実施例１で確認した特定糖鎖割合の関係を図１に示
す。図１は実質上、全糖鎖量に対する特定糖鎖（この場
合は糖鎖末端に２個のガラクトースを含有する糖鎖）の
割合と吸光度の関係を示す検量線を示す事になる。

【００６８】表２に示した試料１及び２の吸光度測定値
（ΔA492nm）と特異糖鎖割合は良好な直線関係を示し
た。すなわち図１に示した直線は、ヒトＩｇＧの特定糖
鎖割合（この場合は、ヒトＩｇＧの全糖鎖量に対する糖
鎖末端に２個のガラクトースを含有する糖鎖の割合）が
31.7%まで直線的に吸光度変化する事を示している。こ
の検量線を用いれば、特定糖鎖割合未知の測定試料の吸
光度測定値（ΔA492nm）より特定糖鎖割合を確定するこ
とができるし、例えば表２に示した混合試料の吸光度測
定値（ΔA492nm）より特定糖鎖割合を算出することもで
きる。

【００６９】表３は、図１を用いて表２に示した各混合
試料の吸光度測定値（ΔA492nm）から特定糖鎖割合に変
換した結果である。

【００７０】

【表３】

【００７１】表３に示した各混合試料の特定糖鎖割合
は、表２に示した該当混合試料の特定糖鎖割合と近似値
を示すことから、図１の様な検量線を用いて各混合試料
の吸光度測定値（ΔA492nm）より導き出した特定糖化割
合は正しいと言える。

【００７２】したがって図１に示したような検量線を検
量値データとして保有している場合には、同様の糖タン
パク質を含有する試料について同様の測定をし、得られ
た吸光度の値から図１の検量線を使用する事により当該
試料中の全糖鎖量に対する特定糖鎖（この場合は糖鎖末
端に２個のガラクトースを含有する糖鎖）の割合がただ
ちにわかる事になる。

【００７３】実施例５ （健常人血清ＩｇＧとＲＡ患者血清ＩｇＧとの測定値の
差異）健常人血清４検体およびＲＡ患者血清３０検体を
実施例４と同様に操作して測定した結果、図２に示す様
に健常人血清とＲＡ患者血清の吸光度測定値の分布は、
明らかに異なり、ＲＡ患者血清の吸光度測定値の方が分
布として低い傾向を示した。図２は健常人血清４検体お
よびＲＡ患者血清３０検体のそれぞれのＩｇＧの実施例
４と同様の操作によって測定した各検体（試料）の吸光
度を示す図である。

【００７４】検体測定と並行して実施例４の特定糖鎖割
合既知の標準試料（試料１及び２）を測定し、検量線を
作成して使用すれば、当該検体中の全糖鎖量に対する特
定糖鎖（この場合は糖鎖末端に２個のガラクトースを含
有する糖鎖）の割合がただちに判明する。

【００７５】尚、図２の結果は、ＲＡ患者において血清
中のＩｇＧの全糖鎖量に対する特定糖鎖量（糖鎖末端に
２個のガラクトースを含有する糖鎖）の割合が健常人よ
りも低下していることを示している。

【００７６】実施例６ （ヒトトランスフェリンの特定糖鎖割合の測定）ヒトト
ランスフェリンを 0.1M 酢酸緩衝液（pH 5）に溶解後、
フコシダーゼを添加し、３７℃、２４時間反応させた。
反応終了後、トランスフェリンを精製して脱フコース処
理試料（レクチンが結合する特定糖鎖がほとんど存在し
ない試料）とした。この試料と未酵素処理（レクチンが
結合する特定糖鎖が存在する）のヒトトランスフェリン
溶液のタンパク質濃度を合わせた後、各種割合にて混合
して測定試料を調製した。

【００７７】一方、ヤギ抗ヒトトランスフェリン抗体固
定マイクロプレートを実施例２と同様の方法で作成し、
実施例４と同様の方法で各測定試料を反応させた。生理
食塩水にて３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識
ヒイロチャワンタケレクチンを反応させ、生理食塩水に
て５回洗浄後、アルカリフォスファターゼの活性を成書
（１９８７年５月１５日医学書院発行 石川榮治、河上
忠、宮井潔編集「酵素免疫測定法」第３版 第５８頁）
に従って測定した。その結果、測定試料の未酵素処理試
料割合が増すに従って実施例４と同様、吸光度測定値が
直線的に増加した。これは、ヒイロチャワンタケレクチ
ンがフコース含有糖鎖を認識して結合する結果であり、
吸光度測定値はフコース含有糖鎖割合に従って変化する
ことを確認した。

【００７８】実施例７ （α−フェトプロテインの特定糖鎖割合の測定）α−フ
ェトプロテインを 0.1M 酢酸緩衝液（pH 5）に溶解後、
フコシダーゼを添加し、３７℃、２４時間反応させた。
反応終了後、α−フェトプロテインを精製して脱フコー
ス処理試料（レクチンが結合する特定糖鎖がほとんど存
在しない試料）とした。この試料と未酵素処理の溶液
（レクチンが結合する特定糖鎖が存在する）のタンパク
質濃度を合わせた後、各種割合にて混合して測定試料を
調製した。

【００７９】一方、ヤギ抗α−フェトプロテイン抗体固
定マイクロプレートを実施例２と同様の方法で作成し、
実施例４と同様の方法で各測定試料を反応させた。生理
食塩水にて３回洗浄後、ビオチン標識レンチルレクチン
を室温にて１時間反応させ、生理食塩水にて５回洗浄し
た。更にペルオキシダーゼ標識アビジンを室温にて２０
分間反応させ、生理食塩水にて５回洗浄後、実施例３と
同様の方法で吸光度測定した。その結果、測定試料の未
酵素処理試料割合が増すに従って実施例４と同様、吸光
度測定値が直線的に増加した。これは、レンチルレクチ
ンがフコース含有糖鎖を認識して結合する結果であり、
吸光度測定値はフコース含有糖鎖割合に従って変化し
た。

【００８０】

【発明の効果】

（１）本発明は、特定糖タンパク質の糖鎖総量を別途測
定する必要がなく、試料中の特定糖タンパク質の全糖鎖
量に対する特定糖鎖量の割合を簡便かつ迅速に測定する
ことができる特定糖鎖量の割合の測定方法を提供でき
る。

【００８１】本発明によってはじめて、直接的に特定糖
タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割合を簡便
かつ迅速に測定できる方法が提供されるのである。 （２）また、固相に固定した抗体および／または該抗体
の活性フラグメントが、測定対象となる特定糖鎖を含ま
ない抗体および／または該抗体の活性フラグメントであ
る本発明の好ましい態様とすることにより、よりノイズ
が少なく、また、測定の幅の広い特定糖タンパク質の全
糖鎖量に対する特定糖鎖割合の測定方法が提供できる。

【００８２】（３）また、特定糖タンパク質を含有する
試料が、採取された尿、血液、血漿、血清から選ばれた
１種であって、固相に固定化した抗体および／または該
抗体の活性フラグメントのすべてに特定糖タンパク質が
結合する濃度以上で該特定糖タンパク質を含有する試料
である本発明の好ましい態様とすることにより、容易に
病気の診断に適用する事ができる特定糖タンパク質の全
糖鎖量に対する特定糖鎖割合の測定方法を提供できる。

【００８３】（４）また、標識化されたレクチンが、酵
素またはビオチンのいずれかで標識されたレクチンであ
る本発明の好ましい態様とすることにより、高感度で検
出の容易な特定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖
鎖量の割合の測定方法が提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例における吸光度と特定タンパ
ク質の特定糖鎖との関係を示した図。

【図２】縦軸を吸光度として健常人血清４検体とＲＡ患
者血清３０検体を本発明で測定した結果を示した図。

【図３】本発明の測定法のための反応工程の一部をモデ
ル的に示した簡略モデル図。

【図４】特開平５−８７８１４号記載の方法の説明のた
めの反応工程の一部をモデル的に示した簡略モデル図。

【符号の説明】

１ 固相 ２ 抗体 ３ 糖タンパク質 ４ 特定のレクチンと結合し得る特定糖鎖 ５ 特定のレクチンと結合しない糖鎖 ６ レクチン ７ 標識物

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）特定糖タンパク質のタンパク質部
   分に特異的親和性を有する抗体および／または該抗体の
   活性フラグメントの一定量を固定した固相と、前記特定
   糖タンパク質を含有する試料の液相とを接触させること
   により、該固相上の該抗体および／または該抗体の活性
   フラグメントに該特定糖タンパク質を飽和状態まで捕捉
   させた後、固相と液相を分離し、次いで分離した固相と
   該糖タンパク質の特定糖鎖に対して親和性を有する標識
   化されたレクチンを含有する液相を接触させ、該固相上
   に捕捉されている特定糖タンパク質の特定糖鎖に標識化
   されたレクチンを結合させ、次いで固相と液相を分離
   し、分離した固相にレクチンを介して結合している標識
   物量を測定し、該標識物量を （ｂ）一定量の該特定タンパク質が含有する全糖鎖量に
   対する特定糖鎖の割合が既知である標準試料を用いて前
   記（ａ）と同様の方法により同様の標識物量の測定を行
   い、その結果に基いてあらかじめ作成された該標識物量
   と該特定タンパク質が含有する全糖鎖量に対する特定糖
   鎖の割合との関係を示す検量値データと比較することに
   より前記試料に含有されている該特定糖タンパク質の全
   糖鎖量に対する特定糖鎖割合を決定することを特徴とす
   る特定糖タンパク質の全糖鎖量に対する特定糖鎖量の割
   合の測定方法。
2. 【請求項２】 固相に固定した抗体および／または該抗
   体の活性フラグメントが、測定対象となる特定糖鎖を含
   まない抗体および／または該抗体の活性フラグメントで
   ある請求項１に記載の特定糖タンパク質の全糖鎖量に対
   する特定糖鎖割合の測定方法。
3. 【請求項３】 特定糖タンパク質を含有する試料が、採
   取された尿、血液、血漿、血清から選ばれた１種であっ
   て、固相に固定化した抗体および／または該抗体の活性
   フラグメントのすべてに特定糖タンパク質が結合する濃
   度以上で該特定糖タンパク質を含有する試料である請求
   項１または２に記載の特定糖タンパク質の全糖鎖量に対
   する特定糖鎖割合の測定方法。
4. 【請求項４】 標識化されたレクチンが、酵素またはビ
   オチンのいずれかで標識されたレクチンである請求項１
   〜３のいずれかに記載の特定糖タンパク質の全糖鎖量に
   対する特定糖鎖量の割合の測定方法。