JPH07330620A

JPH07330620A - 血漿蛋白質の連続分画方法および装置

Info

Publication number: JPH07330620A
Application number: JP6125511A
Authority: JP
Inventors: Makoto Baba; 誠馬場; Masaji Suzuki; 正司鈴木
Original assignee: NIPPON SEIYAKU KK
Current assignee: NIPPON SEIYAKU KK
Priority date: 1994-06-07
Filing date: 1994-06-07
Publication date: 1995-12-19

Abstract

(57)【要約】【目的】血漿蛋白質を連続的に分画する装置を提供す
る。【構成】上部を撹拌領域（８）とし下部を滞留領域
（９）とした反応容器（７）、該反応容器（７）に血漿
蛋白質含有溶液（１）、沈殿剤（２）、緩衝液（３）を
それぞれ一定速度で連続的に供給する手段（４，５，
６）、一定時間滞留した反応液を供給速度に応じて反応
容器下部より連続的に取り出す手段（１０）、取り出さ
れた反応液を析出した血漿蛋白質（１３）と血漿蛋白質
含有溶液（１４）に分離する手段（１１）、および分離
された血漿蛋白質含有溶液を次工程に給送する手段（１
２）からなることを特徴とする血漿蛋白質の連続分画装
置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血漿から沈殿法により
血漿蛋白質を連続的に分画する方法およびその装置に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】血漿中に含まれる、アルブミン、免疫血
清グロブリン、抗血友病因子およびプロトロンビン複合
体等の血漿蛋白質は、血液製剤として極めて有用な蛋白
質であり、近年その需要は増大する傾向にある。

【０００３】これらの血漿蛋白質のうち、例えばアルブ
ミンと免疫血清グロブリンを製造するには、ヒトの血液
から細胞成分を取り除いて血漿を得た後、血漿を冷エタ
ノール沈殿法または熱変性法等によりアルブミンと免疫
血清グロブリンを分画して製造する方法が一般的であ
る。

【０００４】冷エタノール沈殿法は、コーンにより１９
４０年代に開発された古典的な血漿蛋白質の分画方法
（E.K.Cohn,et.al,J.Am.Chem.Soc.,68,469(1946)）であ
り、エタノールを加えることにより溶液の誘電率を下
げ、各蛋白質の等電点における溶解度の低下を利用して
分画精製するものであって、安全性が高く、実績もある
優れた血漿蛋白質の分画精製方法である。

【０００５】また、近年になり、血漿蛋白質の連続分画
方法として、血漿、沈殿剤および緩衝液を循環反応させ
る方法が提案されている（特公平３−７２６０６号公
報、特公平４−６４７０７号公報）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、コーン
の冷エタノール沈殿法は、分画する蛋白質により、各々
独立した多段階の精製工程を、バッチ処理しなければな
らない。すなわち、冷エタノール沈殿法の各工程は、所
定のタンクに前工程を終了した反応液を入れ、次いでエ
タノールを加え、最後に緩衝液によりｐＨを調整して熟
成した後、沈殿分離した血漿蛋白質を遠心分離する必要
があるため、各工程をバッチ処理して目的の血漿蛋白質
を得るには、長時間を要し、極めて作業効率が低いもの
であった。また、特公平３−７２６０６号の循環反応に
よる血漿蛋白質の連続分画方法は、反応液を沈殿剤等と
混合してから目的とする血漿蛋白質を沈殿させるまでの
熟成工程は反応液の混合容器とは別な設備を必要として
いる。

【０００７】また、特公平４−６４７０７号の方法は、
同一容器内で混合と熟成を行うものであるが、得られる
血漿蛋白質の精製度が不十分であり、好ましい方法では
ない。

【０００８】本発明が解決しようとする課題は、従来の
冷エタノール沈殿法や循環反応法の欠点を解消すること
であり、本発明の目的は、効率よく血漿蛋白質を連続的
に分画精製する方法と装置を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、従来の冷エタノー
ル沈殿法の各反応工程において、上部を撹拌領域とし、
下部を滞留領域とした反応容器を用い、反応容器上部の
反応混合物に、血漿蛋白質含有溶液（血漿または前工程
の上清液）、沈殿剤および緩衝液の供給量を一定速度で
連続的に供給し、反応液を反応容器下部の滞留部内で一
定時間滞留させ、この供給量に相当する反応混合物を反
応容器下部より一定速度で取り出したのち分離し、分離
した血漿蛋白質含有溶液を次工程に送ることにより、各
工程を連続的に処理できることを見いだし、本発明を完
成するに至った。

【００１０】すなわち、本発明は、（１）複数の反応容
器を用いて、血漿蛋白質含有溶液に沈殿剤および緩衝液
を混合して溶解度の異なる個々の血漿蛋白質を逐次的に
沈殿分離して血漿蛋白質を分画精製する方法において、
反応容器内の血漿蛋白質含有溶液、沈殿剤および緩衝液
からなる反応混合物に、血漿蛋白質含有溶液、沈殿剤お
よび緩衝液をそれぞれ一定速度で連続的に供給・混合
し、所定のｐＨで一定時間滞留した反応液を供給速度に
応じて連続的に取出し、取り出された反応液を析出した
血漿蛋白質と血漿蛋白質含有溶液に分離し、分離された
血漿蛋白質含有溶液を次工程に給送することからなる工
程を連続して逐次的に行うことを特徴とする血漿蛋白質
の連続分画方法、（２）上部を撹拌領域とし下部を滞留
領域とした反応容器、該反応容器に血漿蛋白質含有溶
液、沈殿剤、緩衝液をそれぞれ一定速度で連続的に供給
する手段、滞留領域に一定時間滞留した反応液を供給速
度に応じて反応容器下部より連続的に取り出す手段、取
り出された反応液を析出した血漿蛋白質と血漿蛋白質含
有溶液に分離する手段、および分離された血漿蛋白質含
有溶液を次工程に給送する手段からなることを特徴とす
る血漿蛋白質の連続分画装置用ユニットを発明の要旨と
するものである。

【００１１】図１は、本発明の血漿蛋白質分画方法と血
漿蛋白質分画装置用ユニットの原理を説明する概念図で
ある。

【００１２】反応容器７は、上部が撹拌領域８に、下部
が滞留領域９となっている。定量供給手段４，５，６に
より血漿蛋白質含有溶液１（第１段の分画工程では血漿
を用い、第２段以降の分画工程では前工程の分離上清液
を用いる）、沈殿剤２および緩衝液３は、反応容器７の
上部から一定速度で供給される。供給された血漿蛋白質
含有溶液１、沈殿剤２および緩衝液３は、反応容器７の
上部の撹拌領域８で混合され、所定のｐＨに調整され、
特定の血漿蛋白質が析出し、他の血漿蛋白質は反応溶液
に残存する。反応液は、滞留領域９で一定時間滞留し熟
成された後、反応容器７の下部から定量取出し手段１０
により、取り出される。反応液を取り出す速度は、血漿
蛋白質含有溶液１、沈殿剤２および緩衝液３の供給合計
量と略同じとする。取り出された反応液は、分離手段１
１により析出した血漿蛋白質１３と血漿蛋白質含有溶液
（上清）１４に分離される。分離した血漿蛋白質含有溶
液（上清）１４は、一時貯留小タンクに貯留後定量供給
手段１２により次工程に給送される。次工程の分画装置
は、前工程と同一の構成のものを用いればよく、前工程
で分離された血漿蛋白質含有溶液（上清）の流出ライン
を次工程の分画装置の血漿蛋白質含有溶液供給手段に接
続すればよい。

【００１３】上記工程を連続して逐次的に行うことによ
り、所望の血漿蛋白質を連続的に分画精製することが可
能となる。また、上記のユニットを複数個直列に連結す
れば、血漿蛋白質の連続分画装置とすることができる。

【００１４】本発明方法において、第１段の分画工程で
用いられる血漿蛋白質含有溶液は血漿であるが、ヒトの
血液から細胞成分を除いた血漿であれば、抗凝固剤はい
ずれでもよい。

【００１５】本発明方法の各工程において用いられる沈
殿剤は、特定の蛋白質の溶解度を低下することができ、
分画精製された血漿蛋白質から容易に取り除くことので
きるものであれば特に限定されないが、例えば、エタノ
ール、アセトン等が挙げられるが、エタノールが実績も
あり取り扱い易く最も好ましい。

【００１６】本発明の各工程において用いられる緩衝液
は、ｐＨおよびイオン強度の調整目的で加えるものであ
り、例えば酢酸またはリン酸緩衝液があるが、製品中へ
の混入を考慮すれば酢酸緩衝液が好ましい。

【００１７】各分画工程の反応液のｐＨは、従来の冷エ
タノール沈殿法に従って調整すればよく、例えば、表１
に示したように各分画工程の反応液のｐＨに調整すれ
ば、従来法と同じ各血漿蛋白質を分画することができ
る。

【００１８】本発明方法の、各分画工程では、各反応容
器には、常に一定量の反応混合物があり、反応容器の上
部から、血漿（第１段の分画工程）または前段の上清液
（第２段以降の分画工程）が沈殿剤および緩衝液と共に
一定速度で連続的に供給され、反応液は反応容器の撹拌
領域で撹拌混合され、滞留領域で一定時間滞留熟成さ
れ、反応容器の下部から反応液を供給量に相当する量を
連続的に取り出すことを特徴としており、各分画工程を
同時に運転することにより、目的の血漿蛋白質を連続的
に分画することができる。

【００１９】各分画工程において、連続的に供給された
血漿蛋白質含有溶液（血漿または前段の上清液）は、撹
拌領域で沈殿剤および緩衝液と共に撹拌装置により撹拌
されて、不溶性の血漿蛋白質を析出した反応液となり、
一定時間反応容器内の滞留領域に滞留した後、反応容器
の下部から連続的に取り出される。供給と取出しを一定
速度で連続的に行うには、定量ポンプを用いればよい。

【００２０】反応液を反応容器内に一定時間滞留させる
のは、不溶性の血漿蛋白質の生成を完全に行うためであ
り、滞留時間は、約３〜７時間である。反応液を一定時
間滞留させるためには、反応容器内の上部に撹拌領域を
設け、反応容器の下部に滞留領域を設ければよい。反応
容器内に撹拌領域と滞留領域を設けるための手段は特に
限定されないが、例えば、撹拌翼を設けた撹拌軸に撹拌
翼の下に円板状の邪魔板を設ける方法、反応容器の内壁
に邪魔板を設ける方法がある。

【００２１】反応液を、反応容器内に一定時間滞留させ
るためには、反応容器内において上部の撹拌領域の反応
液と下部の滞留領域の反応液が混合することを極力避け
ねばならない。そのためには、反応容器は、直径に対す
る高さの比率を約１．５以上とすることが好ましい。ま
た、沈殿生成が遅い工程では、容量の大きな反応容器を
用いて貯留液量を多くすると共に、セライト等の吸着剤
を使用すればよい。

【００２２】本発明の血漿蛋白質の連続分画方法は、血
漿蛋白質の変性を避けるため、各工程の氷結点に近い−
２℃〜−７℃の低温下で行うことが好ましい。

【００２３】各分画工程において、一定時間滞留した後
に連続的に取り出された反応液は、遠心分離等の分離手
段により、不溶性の血漿蛋白質と、上清液に分離され
る。分離された上清液は工程毎に定められた沈殿剤およ
び緩衝液と共に、次の分画工程へ連続的に供給される。
上清液を次工程へ安定的に供給するために、遠心分離し
た上清液を小タンクに一時的に貯留することが好まし
い。各分画工程毎に、遠心沈殿物を処理する間は、反応
容器下部からの反応液の取出しは停止されるが、反応容
器はある程度余裕をもたせておくため処理中の間も前工
程からの供給作業を中止する必要はない。

【００２４】アルブミン等の溶解性の高い血漿蛋白質
は、上清液側を移行しながら、次工程へ進む。各分画工
程で遠心分離された不溶性の血漿蛋白質は、蛋白質の種
類により、廃棄もしくは更に精製して有用な血漿蛋白質
とすることができる。

【００２５】本発明の血漿蛋白質分画方法は、前述した
ように血漿蛋白質の溶解度の差を利用して特定の蛋白質
の沈殿を生成させ、これを遠心分離または濾過により分
離し目的の血漿蛋白質を精製する方法であれば、いずれ
の製造方法にも適用できる。例えば、コーンの冷エタノ
ール法により本発明方法を実施するための分画条件と各
分画工程で得られる血漿蛋白質の用途を表１に例示す
る。

【００２６】

【表１】

【００２７】図２に、本発明ユニットをコーンの冷エタ
ノール法の第１分画工程に用いる場合の好ましい装置例
を図示する。

【００２８】図２中の符号のうち図１と同一のものは説
明を省略する。ただし、定量供給手段４，５，６，１２
および定量取出し手段１０は、定量ポンプを用いてい
る。また、図２の装置は、第１段の分画工程に用いるも
のであるため、血漿蛋白含有溶液は、血漿である。血
漿、沈殿剤および緩衝液は、ために噴霧化して供給す
る。反応容器７中に撹拌領域８と滞留領域９を設けるた
めに、撹拌棒１５に撹拌翼１６を取り付けたうえ、さら
に撹拌翼１６の下部に反応容器７の内径よりやや小さな
円板状の邪魔板１７を設けている。従って、邪魔板１７
の上部では、血漿、沈殿剤および緩衝液からなる反応液
は十分に混合されるが、邪魔板１７の下部では、撹拌作
用が及ばないため、反応液は滞留し、フィブリノーゲン
が完全に析出する。滞留領域９で一定時間滞留した反応
液はバルブ１９を介して定量ポンプ１０により原料供給
量に応じて一定速度で連続的に取り出され、遠心分離器
１１に送られ、析出した血漿蛋白質１３からなる分離物
と、未析出の血漿蛋白質を含有する血漿蛋白質含有溶液
１４に分離される。分離された血漿蛋白質含有溶液１４
は、小タンク２０に一時的に貯留された後、バルブ２１
を介して、定量ポンプ１２により第２分画工程の反応容
器へ給送される。

【００２９】本発明装置の材質は、血漿や不溶性血漿蛋
白質を変性させないものであれば特に限定されないが、
例えばステンレス、ガラス、ホーロー等の材質を挙げる
ことができる。

【００３０】血漿（前工程の上清液）、沈殿剤および緩
衝液の供給量と、反応混合物の取出し量が、略同一であ
るため、各分画工程の反応容器の反応混合物の量は一定
に保たれる。溶解度の高い血漿蛋白質は、遠心上清液側
に移行しながら、分画工程を進むことになる。

【００３１】各分画工程で遠心分離された沈殿物は、分
画成分により、フィブリノーゲン（第１工程の沈殿
物）、γ−グロブリン若しくはトロンビン（第２工程の
沈殿物）、アルブミン（第５工程の沈殿物）の原料とし
て用いることができる。各血漿蛋白質の精製方法は、公
知の精製方法に従えばよい。

【００３２】第５工程で分離されたペースト状の沈殿物
は蒸留水に溶解し、ｐＨ５．２のエタノールの１０％溶
液とした後濾過し、濾過液を限外濾過膜処理してエタノ
ールを除き、アルブミン含量を２０または２５％になる
ように濃縮し、安定剤等を加えて調整し、無菌濾過分注
し、６０℃で１０時間加熱する。

【００３３】従来の冷エタノール沈殿法では、工程の進
行とともに液量が増大するが、本発明方法でも、工程の
進行とともに液量が増大する。そのため、各分画工程の
反応容器の容量は、工程が進む程に大きくする必要があ
る。

【００３４】以下、実施例としてコーンの６法によるア
ルブミンの製造に本発明の方法および装置を用いた例を
示す。

【００３５】

【実施例】図３に示すように、本発明の反応装置を直列
に５基連結し、コーンの６法による冷エタノール沈殿法
の条件に従って、血漿蛋白質を連続的に分画精製した。

【００３６】実施例１（第１分画工程）先ず、図４に示した補助反応容器を可
動状態にし０℃に冷却した血漿（１００Ｋｇ／ｈｒ）と
９５％エタノール１０Ｋｇ／ｈｒ）を噴霧状態で滴下し
て十分に撹拌しながら混合した。この反応溶液のｐＨは
常時７．０になるように自動的に緩衝液で調整した。

【００３７】このようにあらかじめ調整された反応液を
第１工程の反応容器７₁に標準液量（約０．５ｍ³）にな
るまで順次送り込み、標準液量に達した後は、血漿（１
００Ｋｇ／ｈｒ）、エタノール（１０Ｋｇ／ｈｒ）、反
応液のｐＨを７．０に保持する緩衝液を第１工程の反応
容器上部から滴下し、反応容器下部のバルブを開け、反
応混合物を定量ポンプで１１０Ｋｇ／ｈｒの速度で取出
し、遠心分離器に送り遠心分離した。反応容器は、図２
に示したように邪魔板を撹拌翼の下部に設け、反応容器
上部を撹拌領域に、反応容器下部を滞留領域とした。反
応液の温度は−２℃に、ｐＨは７．０に保持した。

【００３８】分離した析出血漿蛋白質は、フィブリノー
ゲンの精製に使用した。上清の血漿蛋白質含有溶液は、
小タンクに一時貯留した後、定量ポンプにより第２工程
の反応容器へ給送した。

【００３９】（第２分画工程〜第４分画工程）各分画工
程の反応容器７₂〜７₄には、最初の作業開始時だけは第
１工程と同様に補助反応容器で調製した反応混合物を各
反応容器に規定量仕込んでおいた。

【００４０】反応容器上部から、前工程の上清液、沈殿
剤および緩衝液を定量ポンプで連続的に供給し、反応容
器下部から反応混合物を供給量に相当する量を定量ポン
プで連続的に取出し、遠心分離した。遠心上清液を、小
タンクに一時貯留した後、定量ポンプで次の分画工程の
反応容器に給送した。

【００４１】（第５分画工程）補助反応容器を使用して
第４分画工程の遠心上清液を緩衝液でｐＨ４．８に調整
しながら反応容器７₅に規定量に達するまで加えた後、
反応容器上部から、前工程の上清液、沈殿剤および緩衝
液を定量ポンプで連続的に供給し、反応容器下部から反
応混合物を供給量に相当する量を定量ポンプで連続的に
取出し、遠心分離した。

【００４２】取り出した反応液は、遠心分離し、沈殿物
と上清液に分離した。得られた沈殿物は、純度９６％以
上のアルブミンペーストであった。

【００４３】得られたアルブミンペーストを蒸留水に溶
解し、エタノール１０％、ｐＨ５．２とした後濾過し、
濾過液を限外濾過膜で処理してエタノールを除去した
後、アルブミン含有量を２０または２５％に濃縮し、安
定剤を加えて調整し、無菌濾過分注し、６０℃１０時間
の加熱処理を行って、人血清アルブミンを得た。この人
血清アルブミンは、我が国の生物学的製剤基準収載の
「人血清アルブミン」の基準に適合するものであった。

【００４４】各工程の反応液量、反応条件、物質収支等
を第１表に、得られた各分画のセルローズアセテート膜
電気泳動分析の結果を表２に示す。

【００４５】

【表２】

【００４６】

【表３】

【００４７】

【発明の効果】本発明により、血漿蛋白質を連続的に分
画することが可能となり、作業工程が飛躍的に向上す
る。本発明により得られる血漿蛋白質は、従来の例エタ
ノール法により得られる血漿蛋白質と同品質のものであ
る。また、反応容器は、従来の冷エタノール法に用いた
ものを使用することができ、設備投資が少なくてすむ。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明装置の概略の説明図。

【図２】第１分画工程に用いる反応装置の一実施態様の
説明図。

【図３】実施例１で用いた反応装置の説明図。

【図４】補助反応容器の説明図。

【符号の説明】

１血漿蛋白質含有溶液２沈殿剤３緩衝液４，５，６定量供給手段７反応容器８撹拌領域９滞留領域１０定量取出し手段１１分離手段１２定量供給手段１３沈殿物１４分離上清液１５撹拌軸１６撹拌翼１７邪魔板１８マントル１９，２１バルブ２０一時貯留用小タンク

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数の反応容器を用いて、血漿蛋白質含
有溶液に沈殿剤および緩衝液を混合して溶解度の異なる
個々の血漿蛋白質を逐次的に沈殿分離して血漿蛋白質を
分画精製する方法において、反応容器内の血漿蛋白質含有溶液、沈殿剤および緩衝液
からなる反応混合物に、血漿蛋白質含有溶液、沈殿剤お
よび緩衝液をそれぞれ一定速度で連続的に供給・混合
し、所定のｐＨで一定時間滞留した反応液を供給速度に
応じて連続的に取出し、取り出された反応液を析出した
血漿蛋白質と血漿蛋白質含有溶液に分離し、分離された
血漿蛋白質含有溶液を次工程に給送することからなる工
程を連続して逐次的に行うことを特徴とする血漿蛋白質
の連続分画方法。
【請求項２】沈殿剤がエタノールである請求項１記載
の血漿蛋白質の連続分画方法。
【請求項３】血漿蛋白質の連続分画を開始する際に、
予め予備反応容器で、血漿蛋白質含有溶液、沈殿剤およ
び緩衝液を混合して調製した反応混合液を、反応容器の
規定液量まで仕込んだ後に、連続して血漿蛋白質の分画
を行うことを特徴とする請求項１記載の血漿蛋白質の連
続分画方法。
【請求項４】上部を撹拌領域とし下部を滞留領域とし
た反応容器、該反応容器に血漿蛋白質含有溶液、沈殿
剤、緩衝液をそれぞれ一定速度で連続的に供給する手
段、滞留領域に一定時間滞留した反応液を供給速度に応
じて反応容器下部より連続的に取り出す手段、取り出さ
れた反応液を析出した血漿蛋白質と血漿蛋白質含有溶液
に分離する手段、および分離された血漿蛋白質含有溶液
を次工程に給送する手段からなることを特徴とする血漿
蛋白質の連続分画装置用ユニット。
【請求項５】反応容器の高さ／直径の比が１．５以上
であることを特徴とする請求項４記載の血漿蛋白質の連
続分画装置用ユニット。
【請求項６】撹拌軸の下部に円板状の邪魔板と該邪魔
板の上部に撹拌翼をを設けて、反応容器の上部を撹拌領
域とし下部を滞留領域としたことを特徴とする請求項４
記載の血漿蛋白質の連続分画装置用ユニット。
【請求項７】請求項４，５，６に記載のユニットを、
複数個直列に連結してなることを特徴とする血漿蛋白質
の連続分画装置。