JPH0736760B2 - プロテインｃの定量測定法及び活性化剤調製物 - Google Patents

プロテインｃの定量測定法及び活性化剤調製物

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JPH0736760B2 JP61122398A JP12239886A JPH0736760B2 JP H0736760 B2 JPH0736760 B2 JP H0736760B2 JP 61122398 A JP61122398 A JP 61122398A JP 12239886 A JP12239886 A JP 12239886A JP H0736760 B2 JPH0736760 B2 JP H0736760B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はチモーゲン プロテインＣ（Protein C）を定
量的に測定する方法及びこの方法を実施するための活性
化剤調製物に関する。
従来の技術 プロテインＣは、ヒト及び哺乳動物の血漿中に含有され
る止血系のチモーゲン（zymogen）であり、これはトロ
ンビンと不溶性血管壁蛋白質トロンボモジュリンとの錯
体により限定された蛋白質分解により活性化されて、セ
リンプロテイナーゼである活性化プロテインＣ（プロテ
インCa＝活性化されたプロテインＣ＝APC）にされる。
活性化プロテインＣ（プロテインCa）は、一方で凝固因
子Ｖ（アクセレリン）及びVIII（抗血友病因子Ａ）の加
水分解作用をし、他方で、繊維素溶解の活性化作用をす
る。プロテインＣの作用は、プロテインＳ（Protein
S）、リン脂質及びカルシウムによって増大され、特異
的な血漿中に含有される抑制剤により抑制される。
この特性及び作用に基づき、プロテインＣは止血の調節
時に中心的地位を占め、血管損傷個所での止血に悪影響
をせずに、無傷の血管の領域での凝固を阻止する。
プロテインＣは、分子量約60000の糖蛋白質であり、こ
れは、ビタミンＫとの関係で肝臓内で合成される。その
分子内にカルシウムの結合及び酸素−リン脂質錯体の形
成に必要である数個のγ−カルボキシグルタミン酸基を
有する。ビタミンＫ−拮抗剤を用いる抗凝固薬療法は、
同様に酵素活性を有するアルカルボキシ−プロテインＣ
（Acarboxy−Protein C:これはプロテインＣからGla残
基を欠いたもの）を合成し、これは同様に、酵素活性を
有するが、リン脂質及びカルシウムによって強められる
ことができない。
遺伝による又は取得したプロテインＣの不足又は分子的
変形は、ヒトにおいては高い血栓症傾向をもたらす。
プロテインＣの詳細な記載は、キジール（Kisiel）Ｗ及
びデビイ（Davie）E.W.によるプロテインＣ、メソッズ
・イン・エンツイモロジイ（Protein C,Methods in Enz
ymology）80、320〜332項（1981）及びウイット（Wit
t）I.のプロテインＣ−アイン・ノイアー・ファクター
・デル・ヘモスターゼ（Protein C−Ein neuer Faktor
der Haemostase）、L.ロカ（Roka）及びR.スパヌス（Sp
anuth）（発行）のノイエ・アスペクテ・イン・デル・
ゲリヌングスデイアグノステイク（Neue Aspects in de
r Gerinnungsdiagnostik;Stuuugart,New York;Schattau
er Verlag）１〜16項（1984）に認められる。
プロテインＣは、その定量測定を免疫学的方法で可能に
する抗原特性を有する。
免疫結合した免疫吸着法（ELISA、I.ウイットの前記文
献参照）では、プロテインＣ測定は、特異的にプロテイ
ンＣに対する抗体を、ウサギの免疫化により得、これを
プラスチック製担体に結合させ、試料を抗体負荷担体と
接触させることにより行ない、この際、抗原プロテイン
Ｃは抗体により結合される。これに続いて、ペルオキシ
ダーゼと結合した、吸着されたプロテインＣのなお遊離
の抗原性決定子に結合する抗体を過剰で添加する。過剰
の標識された抗体の洗浄の後に、免疫吸着により結合さ
れたペルオキシダーゼ活性をｏ−フェニレンジアミンを
用いて測定する。結合したペルオキシダーゼ活性は、試
料中のプロテインＣ−濃度に比例する。市場で、ELISA
−法によるプロテインＣ−測定のための試験組成物が入
手される（ELISA−Protein C、ベーリンガーマンハイム
BRD）。
免疫電気泳動法［R.M.ベルチナ（Bertina）トロンボシ
ス・アンド・ヘモスタシス（Thrombosis ＆ Haemostasi
s）48（１）、（1982）１〜５頁］によれば、プロテイ
ンＣに対する抗体をアガロース溶液中に入れ、これか
ら、プレートを注型し、この抗体プレート上に試料をの
せ、これを適当な装置中で数時間直流にかける。このゲ
ルプレートから、沈殿しなかった蛋白質を洗浄除去し、
生じたロケット状沈降帯域をアミドブラックでの着色に
より可視にする。沈降帯域の長さは、試料のプロテイン
Ｃ濃度に比例する。プロテインＣ−測定のための既製の
抗体プレートは市場で入手でき、例えばアセラ −プレ
ート・プロテインＣ（Assera−Plate Protein C;Diagno
stica Stago Asnieres Frankreich）である。
プロテインＣは、更にラジオ免疫原理によっても測定で
き、ここでは、特異的抗−プロテインＣ−抗体を放射性
同位元素例えば125Iで標識し、試料中のプロテインＣへ
のその結合を放射線学的に測定する。プロテインＣ−測
定のラジオ免疫学的方法は、K.イケダ（IKEDA）及びJ.
ステンフロ（STENFLO）によるトロンボシス・リサーチ
（Thrombosis Research）39、297〜306項（1985）中に
記載されている。
しかしながら、プロテインＣ−測定のための前記の免疫
学的方法には多くの欠点が付随している。まず、特異的
な抗体の製造のためのプロテインＣの高精製された調製
物が必要である。それというのも、血漿蛋白質による抗
原の汚染は、広すぎる結合力の抗体を生じ、これは試料
中の誤まった高いプロテインＣ濃度を示すからである。
免疫学的方法は、更に、患者の状態が一方でその経費を
正当化し、他方でその実際の使用に、長い待機時間を許
す問題を生じるような操作、装置及び時間の多大な経費
を必要とする。最後に、免疫学的プロテインＣ−測定の
診断能力は、この方法は、活性化可能な酵素的に機能化
しうるプロテインＣと並んでその病理学的形も、消費さ
れ、阻害剤に結合し、失活された酵素も検出するので、
それだけ限定される。
その測定が、その抗原特性を用いてではなく、その酵素
機能で測定することができる際に、プロテインＣの経費
がかかる精製並びに、抗体調製物の製造が不要となり、
機能性プロテインＣに対して特異的になる。
プロテインＣは、このチモーゲンを活性化し、生じる酵
素活性を天然又は合成基質で測定する方法で機能的に測
定されうる。
キジール及びデヴイの方法［Kisiel W.及びDavie.E.W.
によるプロテインＣ・メソッズ・イン・エンツイモロジ
イ（Protein C Methods in Enzymology）80−320〜332
項（1981）］によれば、クロマトグラフィ−フラクショ
ン中のプロテインＣは、指示薬反応としてのヒトクエン
酸塩血漿のカオリン−ケファリン−凝固時間の使用下に
測定される。第１工程で、プロテインＣ含有試料をトロ
ンビンと共に30〜60分間インキュベーションすることに
より活性化し、その後、過剰のトロンビンを抗トロンビ
ンIII及びヘパリンの添加により中和する。第２工程
で、活性化混合物の少量に正常血漿を加え、この凝固系
を塩化カルシウム、ケファリン及びカオリンの添加によ
り活性化し、凝固するまでの時間を測定する。活性化プ
ロテインＣ（プロテインCa）により作用された第Ｖ因子
及び第VIII因子の分解は、プロテインＣ不含の対照試験
と比べて凝固時間の延長の原因となり、この延長は、試
料のプロテインＣ含分に比例する。
この方法は、特異的に、機能化可能なプロテインＣを特
異的に検出するが、これは、血漿中に含まれるプロテイ
ンＣ−抑制物質が、酵素を、それがトロンビン活性化に
より形成されるよりも迅速に失活するので、抑制剤不含
のプロテインＣ調製物に対してのみ使用できる。
フランシス及びパッチの方法（R.B.FRANCIS及びM.J.PAT
CHのA functionalassay for Protein C in human Plasm
a.Thromb. Res.32、605〜613（1983））によれば、プロ
テインＣ抑制剤による障害は排除され、この際、試料も
しくは試験すべき患者血漿を、プロテインＣを吸収する
ために、溶液中に抑制剤が残留している間にクエン酸バ
リウムで処理する。遠心分離された吸着質からモルホリ
ノエチル硫酸ナトリウムでの処理によるプロテインＣを
溶離させ、洗浄し、α−トロンビンとの60分間のインキ
ュベーションにより部分的に活性化する。更に、トロン
ビンを抗トロンビンIII及びヘパリンで失活させ、更に
ヘパリンを硫酸プロタミンで中和する。このようにして
予備調製された試料中のプロテインＣ−活性を、ヒト正
常血漿で、カオリン−ケファリン−凝固時間の延長の測
定により測定する。
正常血漿の稀釈系及びこれで得られた凝固時間から、患
者血漿中のプロテインＣ含分を、標準の百分率で読みと
ることができる較正曲線をつくる。
スランシス及びパッチの方法の特別な欠点は、煩雑性及
びトロンビンとの長いインキュベーション時間である
が、これは、使用実験指示では37℃まで４時間のインキ
ュベーションが必要であるので、当面のプロテインＣ量
を完全には活性化しない。
ベルチナ等による論文［R.M.BERTINA、A.W.BROEKMANS、
C.KROMMENHOEK−van ES and A.vanMYLN−GAARDENによる
ザ・ユース・オブ・ア・ファンクショナル・アンド・イ
ムノロジカル・アセイ・フォア・プラズマ・プロテイン
Ｃイン・ザ・スタデイ・オブ・ザ・ヘテロゲナイテイ・
オブ・コンジエニタル・プロテインＣデフィシエンシイ
・トロンボシス・アンド・ヘマトスタシス（The use of
a functional and immunological assay for plasma p
rotein C in the stndy of the heterogeneity of cong
enital protein C deficiency.Thrombosis and Haemost
asis）51、１〜５（1984）］には、カオリン−ケファリ
ン−凝固時間の複合抑制の代りにクロモゲン基質の直接
分解を指示反応として使用する患者血漿中のプロテイン
Ｃ−測定方が記載されている。この処方によれば、患者
血漿からのプロテインＣを水酸化アルミニウムへ吸着さ
せ、エチレンジアミンテトラ酢酸で溶離させることによ
り分離し、37℃で45分間トロンビンで活性化し、トロン
ビンを抗トロンビンIII及びヘパリンで抑制し、最後
に、活性化プロテインＣ（プロテインCa）を、合成色原
性基質ピログルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン
−ｐ−ニトロアニリドからのｐ−ニトロアニリン離脱を
測定することにより測定する。
血漿中の機能性プロテインＣ−測定のためのすべての文
献に記載の方法で使用された吸着相及びトロンビンでの
活性化は、測定精度及び測定速度に不利に作用する。
吸着及び溶離は定量的に進行する温度及び時間に関係す
る事象ではなく、その実施は、標準化されるべきであ
り、相応して適格な人材を必要とする。更に、溶離のた
めに使用される物質は、試験媒体の電解質組成を変え、
これにより基質の反応に影響を及ぼす。
トロンビンは、プロテインＣを徐々にかつ不完全に活性
化し、これは、活性化の後に抗トロンビンIII及びヘパ
リンによる又はヒルジンにより抑制すべきであり、これ
により、それ自体では基質と反応して天然基質の使用の
際に誤まった低い、又は合成基質の使用に際に誤まった
高いプロテインＣ値を見せかけることはない。しかしな
がら、添加された抗トロンビン及びヘパリンは、その側
でカオリン−ケファリン−凝固時間を延長して誤まった
高い結果の原因とならないが、凝固法でプロテインＣを
測定すべき際には、ヘパリンを硫酸プロタミンで中和す
べきである。プロテインＣの光度測定のための活性化剤
としてのトロンビンの使用は、更に、プロテインＣ−活
性の測定のために使用される色原性基質がトロンビンそ
のもので分解されないか又は僅かにのみ分解されること
を前提とする。
従来、トロンビンを用いるプロテインＣ−活性化のため
の実際に使用可能な良好な変形法は公知ではない。トロ
ンビンによる活性化はトロンボモジュリンにより著るし
く促進されるが、この水溶性蛋白質は現在までに既製の
形で提供されていない。
この凝固系及びプロテインＣ以外の、それ自体は天然又
は合成基質と反応するはずのプロテイナーゼが活性化さ
れるはずであるので、血漿中へのカルシウムの同様に促
進性の添加を行なうことはできない。
ラッセル−マムシ（Russll−Viper）の毒から単離され
た第Ｘ因子−活性化剤は、キジール及びデビイ（KISIEL
und DAXIE）によればそのプロテイナーゼ活性により、
プロテインＣに対する活性化作用により優れているが、
この活性化は、トロンビンによるよりもなおゆっくり進
行し、従って、プロテインＣの測定のために使用するこ
とができない。同様に、プロテインＣの蛋白質分解活性
化作用をするトリプシンは、それが、非特異的なプロテ
イナーゼとして、多くの他の血漿チモーゲンを活性化又
は不活性化し、更に、使用基質と反応するので、使用す
ることができない。
トロンビン類似の基質特異性を有するプロテイナーゼ例
えばフィブリノペプチドＡ分解性のボトロプス・アトロ
ックス毒（Bothrops atrox−Gift）からのバトロキソビ
ン（Batroxobin）又はアグキストロドン・ロドストマ毒
（Agist−rodon rhodostoma＝Gift）からのアンクロド
（Ancrod）、α−トロンビンアグキストロドン・コント
ルトリクス毒からのフィブリノペプチドＢを分解する酵
素、B.アトロックス毒からの血小板活性化酵素トロンボ
サイチンは、プロテインＣを活性化せず、スタフィロコ
アグラーゼにより、プロトロンビンから形成されたトロ
ンビンコアグラーゼ又はプロトロンビンからのエカリン
により形成されたメイゾトロンビン（Maizothrombin）
は、トロンビンと類似の特性を有し、従って、これに比
べて利点を示さない。
発明を達成するための手段 意外にも、銅色頭毒蛇マムシ（アグキストロドン・コン
トルトリクス）の毒からの蛋白質（例えばトロンビン様
作用をフィブリノーゲン及び血小板に及ぼさないが、ト
ロンビンとは逆にフィブリノーゲンからフィブリノペプ
チドＡもＢも離脱せず、血小板の所で凝集反応も遊離反
応も開始しない）は、精製プロテインＣの非常に強力か
つ迅速な活性化作用をすることが判明した。更に、この
蛇毒蛋白質は、当面のプロテインＣが実際に作用するこ
とができないか又は血漿−プロテインＣ−抑制剤により
抑制することのできない活性化生成物が生じて、吸着に
よるプロテインＣと抑制剤との煩雑な分離の必要がなく
なる程度に稀釈された血漿中のプロテインＣを活性化す
ることができることが判明した。更に、プロテインＣ−
活性化性蛇毒蛋白質は、検出可能な蛋白質活性に影響を
及ぼさず、従って天然又は合成基質をも侵さないことが
判明した。これとは反対に、トロンビンは、合成基質に
分解作用を、かつ天然基質に凝固作用を及ぼし、正確に
測定した量の特異的抑制剤の添加によりトロンビンの不
所望の作用を消すはずの結果を有する。結局、この活性
化剤で、慣用の自動装置を用いてプロテインＣを機能的
に測定可能にするように迅速にプロテインＣを活性化で
きることが判明した。
ところで、本発明はプロテインＣ含有媒体中のプロテイ
ンＣの測定法に関し、この方法は次の特徴を有する：前
記媒体に、毒蛇マムシ（アグキストロドン・コントルト
リクス）の毒又はマムシ（アグキストロドン・コントル
トリクス）の毒と免疫学的に交叉反応をする種類の蛇毒
又は前記の毒から得られるプロテインＣを活性化する活
性化剤調製物を、チモーゲンプロテインＣが最大に活性
化されて活性化プロテインＣ（プロテインCa）−活性を
有するプロテイナーゼになるまで作用させ、生じた活性
化プロテインＣ（プロテインCa）の量を、合成色原性基
質へのこの活性化プロテインＣ（プロテインCa）の触媒
的加水分解により生じる発色性又は蛍光性分解生成物の
量を光度測定により、又は活性化プロテインＣ（プロテ
インCa）により作用される天然基質の凝固時間の延長を
測定することにより測定するか、又は前記媒体に合成色
原性基質及び前記毒又は前記活性化剤調製物を添加し、
前記基質からの発色性又は蛍光性分解生成物の加水分解
的遊離を光度測定により追跡し、基質加水分解の観察最
大速度から、前記媒体のプロテインＣの含分を計算す
る。
ヒトクエン酸塩血漿中のプロテインＣ−活性化の特異性
は、特異的な蛋白質分解酵素基質及び−抑制剤を用い
て、かつ因子欠落血漿の測定により実施した。本発明に
よる活性化剤調製物と共に血漿をインキュベーションす
ることにより、血漿カリクレイン基質Bz−Ｌ−Pro−Ｌ
−Phe−Ｌ−Arg−pNA、Xa因子−基質CH3SO2−Ｄ−Leu−
Gly−Ｌ−Arg＝pNA又はプラスミン基質Tos−Gly−Ｌ−P
ro−Ｌ−Lys−pNAを分解する酵素は活性化されない。色
原性基質Ｈ−Ｄ−CHG−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA及びＨ−
Ｄ−Pro−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNAを測定すると、本発明
の活性化剤調製物での活性化の後に、正常血漿及びVI
I、XI又はＸ因子の欠けている血漿中に同じ大きさのア
ミド分解活性が認められ、本発明の活性化剤調製物によ
り、プロテインＣ不含のヒト血漿中では、プロテインＣ
基質2AcOH−Ｈ−Ｃ−Pro−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA及び2
AcOH−Ｈ−Ｄ−Lys（Cbo）−Ｌ−Pro−LArg−pNAを分解
する活性を得ることができなかった。色原性基質Ｈ−Ｄ
−Pro−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNAの測定により、血漿から
の本発明による活性化剤で生ぜしめられたプロテインＣ
−活性は、特異的なトロンビン−抑制剤ヒルジンの添加
により又は多価のヒト尿トリプシン抑制剤の添加により
抑制されない。本発明によるプロテインＣ−活性化剤と
のインキュベーションの前の血漿への多価プロテイナー
ゼ抑制剤アプロチニンの添加は、色原性プロテインＣ−
基質の分解を完全に阻止する。活性化の後又は存在基質
分解の工程でのアプロチニンの添加は、反応を直ちにか
つ完全に抑制する。相応して、精製され、不溶のトロン
ビンを用いて活性化ヒトプロテインＣ（ヒトプロテイン
Ca）もアプロチニンにより完全に抑制される。この結果
は、本発明による活性化剤が特異的にプロテインＣを活
性化し、この際、トロンビン、プラスミン、Xa因子、血
漿カリクレインの形成も、他の色原性活性化プロテイン
Ｃ（プロテインCa）−基質を分解する酵素活性も生じな
いことを立証している。本発明による活性化剤及び色原
性基質を用いる血漿中のプロテインＣ−測定の精度は、
更に、添加されたプロテインＣに応じた生理学的血漿プ
ロテインＣ−濃度の増加（Aufstockung）により立証で
きた。増加された血漿中に認められるプロテインＣの含
分は、生理学的及び添加されたプロテインＣ量の合計に
相当した。更に、本発明によるプロテインＣ−測定法の
機能性は、プロテインＣ−不含の、及び正常のヒト血漿
の混合物中の活性測定並びに、抗−プロテインＣ−抗体
の増加性添加を用いる正常ヒト血漿の活性測定により立
証することができた。
さらに、本発明は、蛇毒から得られる、ヒト及び背椎動
物例えば羊、牛、鳥、豚、兎及び鶏のプロテインＣを活
性化プロテインＣ（プロテインCa）に変える特性を有す
る活性化剤調製物に関する。
本発明によるプロテインＣ−活性化剤調製物を製造する
ための出発物質としては、ソレノグリフエン蛇（Soleno
glyphen Schlangen即ち、運動性の管状毒歯を有するも
の）の毒、クサリヘビ類（Viperidae）殊にガラガラヘ
ビ類（Cro−talinac）及びマムシ類（Dreiecbskoepfe,A
gkistroden）に属するものの毒が好適である。殊に、A.
コントルトリクス（A.Contortrix）種、その亜種例えば
A.コントルトリクス・コントルトリクス（A.Contortrix
contortrix）、A.コントルトリクス・ラチシンクツス
（A.Contortrix laticinctus）、A.コントルトリクス・
モケゾン（A.Contortrix mokeson）、A.コントルトリク
ス・フアエオガステル、A.コントルトリクス・ピクチガ
ステル（A.Contortrix pictigaster）の毒並びにA.コン
トルトリクスの毒との免疫的に交叉反応する種類例えば
A.ピスシボルス（A.piscivorus）、その亜種例えばA.ピ
スシボルス・ピスシボルス（A.piscivorus piscivoru
s）、A.ピスシボルス・コナンテイ（A.piscivorus cona
nti）A.ピスシボルス・ロイコストマ（A.piscivorusleu
costoma）の毒及びA.ビリネアッス（A.bilineatus）
種、及びその亜種例えばA.ビリナエッス・ビリネアッ
ス、A.ビリネアッス・タイロリ（A.bilineatus taylir
i）及びA.ビリネアッス・ルセロルス（A.bilineatus ru
sseolus）の毒が好適である。
蛇類の動物学的分類に関する概要は、G.アンダーウッド
（UNDERWOOD）によるクラシフイケーション・アンド・
デイストリビューション・オブ・ベノマス・スネークス
・イン・ザ・ワールド（Classification and distribut
ion of venomous snakes in the world,In:C.Y.LEE Sna
ke venoms15〜40頁、Berlin,Heidelberg.New,York;Spri
nger−Verlag（1979））に認められ、種々の蛇類の毒と
免疫化哺乳動物の血清からの抗体との間に免疫学的交叉
反応の説明は、S.A.ミントン（MINTON）によるコモン・
アンチゲンス・イン・スネーク・ヴェノムス（Common a
ntigens in snake venoms,前記文献847〜862頁）に存在
する。
蛇毒からのプロテインＣ−活性化剤の単離及び精製は、
蛋白質分離の公知方法例えば分別エタノール−又は硫酸
アンモニウム沈殿、モレキュラーシーブ系又はイオン交
換体系での高圧−又は低圧−クロマトグラフィを用いる
か又は親和性クロマトグラフィ、調製用電気泳動により
又は前記技術の数種の組合せにより行なうことができ
る。蛋白質分離法に関する実際の概要は、R.スコープス
（SCOPES）によるプロテインＣ・ピウリフイケーション
（Protein purification,New York,Heidelberg.Berlin;
Springer−Verlag（1982））に認められる。
本発明による活性化剤調製物は、例えば前記定義の蛇毒
例えばA.コントルトリクス毒の蛋白質の結合に好適な孔
度を有する陰イオン交換体例えば網状化ジエチルアミノ
エチルデキストラン（DEAE−Sephadrex Ａ−50）又は
ジエチルアミノエチルセルロースでのクロマトグラフィ
及び中性pH及び増加性イオン濃度を有する燐酸ナトリウ
ム緩衝液での溶離、限外濾過によるプロテインＣ活性化
フラクションの脱塩及び引続く凍結乾燥により製造する
ことができる。
このようにして製造した活性化剤調製物（1ml当り２μ
ｇの濃度で、ヒトフリブリノーゲンで試験）は、10分以
内に凝固作用をせず、加熱されなかった繊維素プレート
で15時間内に繊維素溶解は認められなかった。
合成色原性基質Ｈ−Ｄ−Pro−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNAで
測定すると、精製ヒトプロテインＣは、pH8、イオン濃
度0.15及び37℃で、試験混合物1ml当り蛋白質２μｇの
濃度で、最大10分間以内に活性化される。
活性化剤調製物のプロテインＣ−活性化作用は、pH8で1
ml当りフルオル燐酸ジイソプロピル2.5μモルと共に15
時間インキュベーション又はpH7で1ml当ヨードアセタミ
ド1mgと共に15時間インキュベーションすることにより
又は1ml当りエチレンジアミンテトラ酢酸−２ナトリウ
ム塩0.05μモルの添加により低減されない。活性化剤調
製物のプロテインＣ−活性化作用は、更に、トロンビン
抑制剤抗トロンビンIII、ヘパリン及びヒルジンによっ
ても多価蛋白質抑制剤アプロチニンによっても抑制され
ない。
本発明による活性化剤調製物は、次のようにしても得ら
れる：蛇毒を水性媒体中に溶かし、この溶液から、分別
アルコール沈殿、分別塩沈殿又は予備精製された毒フラ
クションの調製のための酸性pHでの熱処理により不所望
の毒成分を除去し、得られる予備精製された毒フラクシ
ョンを、蛋白質の結合に好適な孔度を有する陰イオン交
換体例えば網状化ジエチルアミノエチルデキストラン又
はジエチルアミノエチルセルロースでのクロマトグラフ
ィにかけ、中性pHでかつ増加性イオン濃度での燐酸ナト
リウム緩衝液で溶離させ、更に、陽イオン交換体例えば
網状化カルボキシメチルデキストラン又はカルボキシメ
チルセルロースでのクロマトグラフィにかけ、酸性pHで
の酢酸ナトリウム緩衝液で溶離させ、プロテインＣ−活
性化溶離液を超遠心により濃縮し、この濃縮物を分子篩
ゲル例えば網状化デキストランゲルでのクロマトグラフ
ィにより、溶離剤としての稀酢酸水の使用下に脱塩及び
最終精製し、引続き凍結乾燥させる。
このようにして製造した活性化剤調製物は、次の特徴を
有する：即ち、これは、水性反応混合物1ml当り0.1〜0.
5μｇの濃度、pH6.8及び20〜40℃の温度で、正常ヒトク
エン酸塩血漿0.05ml中に含有されるプロテインＣを高々
10分以内に最大に活性化し、これは、試験混合物1ml当
り５μｇの濃度で10分以内にヒトフイブリノーゲンの凝
固作用も、15時間以内のヒトフイブリンの溶解作用もせ
ず、これは、プロトロンビン及び凝固因子を活性化せ
ず、れは、プロテインＣ−不含の血漿から、アミド分解
性活性を産出せず、そのプロテインＣ活性化作用は、1m
l当りフルオル燐酸ジイソプロピル2.5μモルと共にpH8
での15時間のインキュベーション又は1ml当りヨードア
セタミド1mgと共にpH7でインキュベーション又は1ml当
りエチレンジアミン四酢酸−２ナトリウム塩0.05μモル
の添加によって低下されず、プロテインＣ活性化作用
は、トロンビン抑制剤例えば抗トロンビンIII、ヘパリ
ン及びヒルジンによっても、多価プロテイナーゼ抑制剤
アプロチニンによっても抑制されず、これは、pH3〜８
で70℃に10分間加熱するか又は、pH2〜８で20〜25℃で2
4時間貯蔵することによっても、そのプロテインＣ活性
化作用を損失せず、これは、pH9で１時間の後に著るし
い活性低下を示し、これは、1ml当りドデシル硫酸ナト
リウム４％又は乳酸マンガン−（II）５μモルの添加の
後にそのプロテインＣ活性化作用を失ない、これは、pH
7でジチオスレイトールでの24時間処理により、僅かに
活性を損失し、これは、多価のアメリカアナマムシ（am
ericanisch Grubenottern）に対する抗血清に対して中
和され、これは、ジチオスレイトールでの還元及びポリ
アクリルアミドゲル電気泳動でのドデシル硫酸ナトリウ
ムの存在におけるアルキル化及びクマシイブルー（Coom
assieblau）での着色の後に、分子量39000±3000に相当
する相対的電気泳動移動度を有する特有の帯域を有し、
これは、分析的超遠心で、分子量36800±５％に相当す
る2.65±３％の沈殿定数（S20w）を有し、これは、分子
量37000にお相当する比容量（Kav）を有する網状化デキ
ストランゲル（Sephadex Ｇ−100）の目盛付カラムで
溶離され、これは、等電性焦点合せにより測定された3.
0±0.2の特定の等電点を有し、その１％が水溶液中、28
0nm及び層厚1cmにおける特殊吸光度（A280 1cm１％）13.
5±0.5を有し、炭水化物の含分20±３％を有し、これ
は、１μg/ml（試験バッチ）の濃度で、特許請求の範囲
第５項又は第６項の色原体基質とのpH7〜8.5及び37℃で
のインキュベーションで、405nm及び層厚1cmで測定した
吸光度の１分当り0.01％より大きい増加を起こさせず、
これは、ウサギに体重1kg当り80Uの適用量での静脈適用
の後に、血漿中の活性部分トロンボプラスチン時間を当
初値の少なくとも２倍だけ延長し、これは、体重1kg当
り80Uの静脈内適用の後のウサギの急性毒性性症状及び
挙動障害は起こさず、ウサギにおける数回のその皮下適
用は、抗体の形成を刺激し、この活性化剤調製物に対し
て免疫化されたウサギの血清内に含有される抗体は、抗
原と免疫拡散で検出可能な沈殿性コンプレックスを形成
する。
この活性化剤調製物は、。遺伝学的に単一の（クローン
化された）微生物例えば遺伝子操作によりプロテインＣ
−活性化剤のバイオ合成可能にされたエセリキア・コリ
ー（Echerichia Coli）又はサッカロミセス・セレビジ
アエ（Sac−charomyces cerevisiae）の培養物から得ら
れる。
当該微生物の遺伝学的変換プログラムは、自体公知の方
法で、そのエルビン形成性を有するデソキシリボ核酸
（DNA）をプロテインＣ−活性化剤の生合成のためのプ
ログラムを有するDNA−連鎖（遺伝子）との組換えによ
り達成することができる。
プロテインＣ−活性化剤の生合成のプログラムを有する
遺伝子を得るために、プロテインＣ−活性化剤の１次構
造の前形成の後に、その塩基配列が生合成時に活性化剤
のアミノ酸配列を指令するようにDNA鎖を合成すること
ができ、更に、DNA−鎖は科学的処置により、必要な塩
基順序が生じるように変性することができるか又は、プ
ロテインＣ−活性化剤の生合成のためのプログラムを維
持する蛇類の細胞からの天然遺伝子を単離することがで
きる。
遺伝子技術の基本原理は、E.L.ウインナッカ−（WINNAC
KER）によるゲン・ウント・クローン（Gene und Klone;
Weinheim、VCA−Verlag、1985）に記載されている。
本発明による活性化剤調製物は、背椎動物の生組織中の
プロテインＣを活性化することもできる。ウサギに活性
化剤調製物を静脈内に注射し、この注射の前及び後に、
血漿中の活性化された部分トロンボプラスチン時間を測
定して、凝固時間の明白な延長を測定する。活性化され
た部分トロンボプラスチン時間のこの延長は、凝固時間
の間のVa因子及びVIIIa因子の崩壊に帰因する。
どの動物も、この活性化剤調製物の毒性作用の徴候を示
さなかった。この結果は、本発明による活性化剤調製物
は、プロテインＣの測定のため以外に、実験動物でのプ
ロテインＣ作用に関する薬物学的操作にも使用すること
ができることを示している。この活性化剤調製物は、更
に、医学及び獣医学において、抗血栓症に有効な薬剤と
して使用可能である。
凝固試験でのＶ及びVIII因子の不活性化に対する活性化
プロテインＣ（プロテインCa）の作用の測定のための天
然基質として、ヒト又は哺乳動物の新鮮、凍結又は凍結
乾燥血漿に慣用のカルシウムイオン結合性添加物例えば
クエン酸塩又はシュウ酸塩又は加熱、pH−変換又は酵
素、吸着剤又は蛋白質沈殿剤での処理により抑制剤又は
プロテインＣ測定のために関係しない成分の除かれた血
漿調製物と共に使用することができる。血漿から製造さ
れた凝固因子濃縮物又は治療の目的に使用されるその副
生成物も更に因子欠如血漿も使用することができる。
活性化プロテインＣ（プロテインCa）の活性を直接光度
測定するための合成基質としては、オリゴペプチド殊
に、Ｃ−末端アルギニンが酵素的に活性化プロテインＣ
（プロテインCa）により分解可能なアミド結合を介して
色原性基と結合しているジー又はトリペプチジル−Ｌ−
アルギニン誘導体及びその無機酸又は有機酸との塩が好
適である。
殊に式： ［式中ｎは３又は４の数を表わし、R2は水素又はａ）炭
素原子数２〜６の直鎖又は分枝鎖のアルカノイル基、
ｂ）炭素原子数２〜４のω−カルボキシル−、ω−メト
キシカルボニル−又はω−エトキシカルボニルアルカノ
イル基、ｃ）炭素原子数１〜４の直鎖又は分枝鎖のアル
コキシカルボニル基、ｄ）炭素原子数１〜２のアルキル
スルホニル基又はｅ）非置換の又は置換されたベンジル
オキシカルボニル基を表わし、R3は、水素又はR2のａ）
〜ｆ）で定義されたと同じ基を表わし、更に、ｎ＝３で
ある場合にアミジノー又はトジルアミジノ基を表わし、
R1はｐ−ニトロフェニルアミノ−、１−又は２−ナフチ
ルアミノ−、４−メトキシ−２−ナフチルアミノ−、４
−メチルクマリル−（７）−アミノ−、1,3−ジ（メト
キシカルボニル）−フェニル−（５）−アミノ−、シン
ノニルアミノ−又はニトロシンノニルアミノ基を表わ
す］の化合物又は無機酸又は有機酸とのその塩を使用す
ることができる。
このような合成基質の例としては、Ｈ−Ｄ−Pro−Ｌ−P
ro−Ｌ−Arg−pNA、Ｄ−pyroglu−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−p
NA、Ｈ−Ｄ−Lys（ε−Cbo）−Ｌ−Pro−Arg−pNA−、
Ｈ−Ｄ−Lys−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA及びこれらの塩、
殊にそれらの塩酸塩及び酢酸塩が挙げられる。
本発明によるプロテインＣを活性化する活性化剤調製物
（蛇毒蛋白質）は、トロンビンとは反対に、決して検出
可能なプロテイナーゼ活性を示さず、従って合成プロテ
インＣ−基質を分解することもできないから、本発明方
法による活性化プロテインＣ（プロテインCa）の測定の
ためには、血漿中のプロテインＣの測定のための慣用の
光度測定法では使用不可能であるような基質も使用でき
る。それというのも、これらは、活性化プロテインＣ
（プロテインCa）によってだけではなく、活性化のため
に使用されたトロンビンによっても分解されるからであ
る。
合成基質のこれらの概念には、例えば、次の化合物が当
てはまる： 2AcOH・Ｈ−Ｄ−CHG−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA、2AcOH・
Ｈ−Ｄ−CHG−Ｌ−Ala−Ｌ−Arg−pNA、Tos−Gly−Ｌ−
Pro−Ｌ−Arg−pNA・AcOH及びフェニルスルホニル−Gly
−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA・AcOH。
前記式中で用いた略字は次のものを意味する:Ala＝アラ
ニン、Arg＝アルギニン、Cbo＝カルボベンゾキシ、CHG
＝シクロヘキシルグリシン、Lys＝リジン、pNA＝ｐ−ニ
トロアニリド、Pro＝プロリン、pyroglu＝ピログルタミ
ン酸。
本発明による方法は、更に、プロテインＣ−抑制剤の活
性を定量的に測定することを可能にし、ここでは、公知
量のプロテインＣに抑制剤含有試料を混合し、更に、プ
ロテインＣを活性化剤調製物で、活性化プロテインＣ
（プロテインCa）に変じ、測定した反応時間から、抑制
されなかった活性化プロテインＣ（プロテインCa）−活
性を合成又は天然の基質を用いて測定し、予め存在した
活性化プロテインＣ（プロテインCa）−活性と残留活性
化プロテインＣ（プロテインCa）−活性との差から抑制
剤含量を計算する。
不溶性担体に共有結合した活性化剤調製物もプロテイン
Ｃ含有媒体中のプロテインＣを活性化することができ、
活性化の後に、非常に好適かつ完全に水性媒体から除く
ことができるから、不溶性活性化剤調製物は、活性化プ
ロテインＣ（プロテインCa）の取得のために使用するこ
とができる。プロテインＣ含有媒体としては、例えばヒ
ト及び背椎動物の血漿及び血漿フラクション、ヒト胎盤
のエキス並びにプロテインＣを生産することのできる原
核及び真核性の細胞の培養物の培養液及び抽出物が好適
である。プロテインＣ−活性化剤の不溶化のために、自
体公知の方法［R.スコープス（SCOPES）によるプロテイ
ン・ピウリフイケーション、プリンシプルス・アンド・
プラクテイス（Protein Purification,Prin−ciples an
d Practice;New York,Heidelberg,Berlin:Springer Ver
lag）（1982）113〜117頁］で、例えばCNBr−セファロ
ース、プトレシンアガロース又はエプシロンアミノカプ
ロイルアガロースに結合することができる。
不溶化された活性化剤調製物によるプロテインＣの活性
化は、回分法によるか又は不溶化された活性化剤の充填
されたカラムの使用下に連続的貫流法で行なうことがで
きる。活性化プロテインＣ（プロテインCa）の単離及び
精製は、自体公知の方法で行なうことができる［W.キジ
ール（KISIEL）及びE.W.デビイ（DAVIE）によるプロテ
インC.メソッズ・イン・エンツイモロジイ（Protein C,
Methods in Enzymology）80、320〜332頁（1981）参
照］。
実施例 例１ マムシ毒からプロテインＣ−活性化剤調製物の製造 マムシ毒（Agkistrodon contortrix−Gift）200mgを0.0
15M燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）1ml中に溶かし、遠
心し、上澄みを同じ緩衝液で平衡化された、DEAE−セフ
ァデックス Ａ−50（網状化されたジエチルアミノエチ
ルデキストラン）を有する2.6×90cmのカラム上に装入
する。0.015M燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）と0.015M
燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）中の0.4M塩化ナトリウ
ムとからの混合直線勾配溶液で溶離させ、各20mlのフラ
クションを集めた。市販のヒト血漿からのクエン酸バリ
ウム−溶離液（1ml当り1mU、Plasma Barium Citrate El
uate、Sigma−Chemie GmbH社、西ドイツ。ミュンヘン）
を試料と共に37℃で15分間インキュベートし、その0.1m
lをヒト正常血漿0,1mlにピペット導入し、混合物に、37
℃でケファリン−エラグ酸試薬（Kephelin−Ellagsaeuu
reagenz;Actin 、Dade,Aguada,Puerto Rico,U.S.A.）
O.1ml及び0.025M塩化カルシウム0.1mlを添加し、直ちに
ストップウオッチを始動させ、凝固までの時間を測定す
ることにより、個々のフラクションのプロテインＣ−活
性化作用を測定した。このプロテインＣ−活性化剤を含
有する試料は、34秒の凝固時間（溶離液なしの対照）を
活性化剤含量に応じて60〜90秒まで延長する作用をす
る。
第１図は、DEAE−セファデックス Ａ−50でのクロマト
グラフィによるマムシ毒からのプロテインＣ−活性化剤
の単離を示す図である。
プロテインＣ活性化作用は、フラクション40〜45で得ら
れた（第１図参照）。８個のクロマトグラフィチャート
から集められた活性溶離液を限外濾過により濃縮し、塩
不含になるまで洗浄し、0.1Mグリシン（pH7.4）中に入
れ、凍結乾燥させた。蛋白質含有率16.5％の凍結乾燥物
830mgが得られた。
得られた活性化剤調製物５μｇ（蛋白質0.825μｇ）
は、37℃、pH8.0で7.5分以内に、合成色原性基質2AcOH
・Ｈ−Ｄ−Pro−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNAで測定した精製
ヒトプロテインC40mUの最大活性化作用をした。
例２ 精製プロテインＣの光度測定 クエン酸バリウム吸着及び引続く溶離、網状化ジエチル
アミノエチル−アガロースでのクロマトグラフィ、硫酸
デキストラン−アガロースでのクロマトグラフィ及び調
製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離され精
製された1ml当り1.1mgの蛋白質を含有するヒトプロテイ
ンＣの出発溶液から、0.1Mトリス−HCl−緩衝液（pH8.
0）で稀釈系を調整した。
フォトメータキュベット中に、例１で製造したプロテイ
ンＣ−活性化剤0.025mg/mlの溶液0.200mlをプロテイン
Ｃ稀釈物0.010mlと共に加え、37℃で7.5分間インキュベ
ートし、トリス−イミダゾール緩衝液（pH8.4、イオン
濃度0.3）1.390ml及び色原性基質2AcOH・Ｈ−Ｄ−Pro−
Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA0.400mlを、１当り４μモルで添
加し、遊離したｐ−ニトロアニリンにより作用された40
5nmでの吸光度増加（ΔＡ）を連続的に記録することに
よりこの稀釈物のプロテインＣ含分を測定した。
単位時間当りの吸光度増加から、試料のプロテインＣ含
量を次式により計算した。
Ｖ＝テスト量 ｖ＝試料量 ε＝ｐ−ニトロアニリンのミリモル吸光係数 Ｕ＝国際酵素単位（標準条件下で１分当り基質１μモル
を変換する酵素量） 測定された活性化プロテインＣ（プロテインCa）により
作用された基質分解は、試料のプロテインＣ含分に比例
している（第１表参照）。
例３ 血漿中のプロテインＣの光度測定 ヒトクエン酸塩血漿のプロテインＣ含分を次のようにし
て測定する：測光用キュベット中にプロテインＣ−活性
化剤（例１で製造、0.025mg/ml）0.200mlを血漿0.050ml
と共に加え、37℃で7.5分間インキュベートし、トリス
−HCl−イミダゾール緩衝液（pH8.4、イオン濃度0.3）
1.550ml及び色原性基質2AcOH・Ｈ−Ｄ−CHG−Ｌ−Pro−
Ｌ−Arg−pNA（４μモル/ml）0.200mlを添加し、遊離さ
れたｐ−ニトロアニリンで作用された405nmにおける吸
光度増加を連続的に記録した。
例２に記載の式から、血漿1ml当り0.90UのプロテインＣ
含分が計算された。
例４ 凝固法による血漿中のプロテインＣの測定 活性化された部分トロンボプラスチン時間測定用の試薬
（Actin 、DADE、Aguada、puerto、Rico、U.S.A.）0.1
ml血漿0.1ml及び例１で得られた活性化剤（200μg/ml）
0.1mlを37℃で60秒間インキュベートし、塩化カルシウ
ム溶液（0.025M）0.1mlを加え、ストップウオッチで凝
固開始までの時間を測定した。
プロテインＣ−欠損血漿に関するモデルとして、正常血
漿に市販の抗プロテインＣ−抗体調製物（Merz und Dad
e,Duedingen、CH）を種々の量で加えた。
正常血漿の凝固は、プロテインＣの活性化により数倍延
長され、抗−プロテインＣの添加は、使用量に関連して
凝固時間を短縮する（第２表）。
例５ 例１で得た活性化剤100mgを生理塩化ナトリウム溶液100
ml中に溶かし、NaOH（1N）を用いてpH値を7.4に調整
し、この溶液を孔度0.22μの膜フィルターを通して滅菌
濾過する。
ウサギ３匹に、体重1kg当りこの溶液1mlを静脈注射し
た。この注射前及び注射30分後に、実験動物の血漿試料
中の活性化された部分トロンボプラスチン時間を測定し
た。各動物で、凝固時間の著るしい延長が観察され、ど
の動物も毒性作用の症状を示さなかった。
この実験の結果を第３表にまとめる。
例６ マムシ毒からの高精製プロテインＣ−活性化剤調製物の
製造 マムシ毒1gを水100mlに溶かし、ｏ−燐酸（1N）の添加
によりこの溶液のpH値を3.0に調整し、この酸性毒溶液
を70±２℃の水溶中に10分間保持し、引続き20℃まで冷
却し、苛性ソーダ（1N）でpH値を7.2に調整し、混濁溶
液を遠心し、上澄みを蒸留水で100mlの量まで稀釈し
て、予備精製された毒フラクションを得た。
この予備精製された毒フラクションを0.015M燐酸ナトリ
ウム緩衝液（pH6.8）で平衡化されたDEAE−セファデッ
クス Ａ−50を有する2.6×90cmのカラム上に装入し、
0.015M燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）及び0.015M燐酸
ナトリウム緩衝液（pH6.8）中の0.4M塩化ナトリウムの
混合された直線状勾配溶液で溶離し、各20mlのフラクシ
ョンを集めた。個々のフラクションのプロテインＣ−活
性化作用は次のようにして測定した：ヒトクエン酸塩血
漿0.1mlに試料（1:350で水中に稀釈されたフラクショ
ン）0.1ml及びケファリン−エラグ酸試薬（Actin ）0.
1ml及び0.025M塩化カルシウム溶液0.1mlを添加し、直ち
にストップウオッチを始動させ、凝固するまでの時間を
測定した。プロテインＣ−活性化剤含有試料は、34秒の
凝固時間を活性化剤含分に応じて200秒までの延長する
作用をした。
プロテインＣ活性化フラクションを集め、限外濾過によ
り、溶離液の1/10まで濃縮し、0.05M酢酸ナトリウム緩
衝液（pH5.0）中に入れて100mlにし、0.05M酢酸ナトリ
ウム緩衝液（pH5.0）に平衡化されたCM−セファデック
ス Ｃ−50のカラム状に装入し、0.05M酢酸ナトリウム
緩衝液（pH5.0）及び0.05M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.
0）中の4.0M塩化ナトリウムからの混合された直線勾配
溶液で溶離させ、各20mlのフラクションを集め、これを
前記方法でプロテインＣ−活性化作用に関して試験し
た。
プロテインＣ活性化フラクションを一緒に混合し、限外
濾過によりその量を1/25まで濃縮し、蒸溜水中の１％酢
酸で25mlにし、水中の１％酢酸で平衡化されたセファデ
ックス Ｇ−100のカラム上に装入し、１％酢酸で溶離
させ、各20mlのフラクションを集め、これを再び先に記
載の方法で、プロテインＣ−活性化作用に関して試験し
た。
プロテインＣ−活性化フラクションを集め、凍結乾燥さ
せた。塩不含の活性化剤調製物が得られ、これは、ポリ
アクリルアミドゲル−電気泳動で１個の特有帯域を有
し、1mg当り35UのＣ蛋白質活性化作用を有した。
プロテインＣ−活性化剤１単位（Ｕ）は、正常なヒトク
エン酸塩血漿1ml中に含有されるプロテインＣの量を標
準条件下に完全に活性化する量である。
例７ 活性化プロテインＣ（プロテインCa）の取得 例６による活性化剤調製物25mgを0.1M重炭酸ナトリウム
緩衝液（pH8.3、NaCl0.5モル）100ml中に溶かした。こ
の溶液に、CNBr−セファローゼ4B（CNBr−Sepharose 4
B、AB Pharmacia、Uppsala、Ｓ）（これは予め0.001N塩
酸中で洗浄した）5gを添加した。この混合物を20〜25℃
で２時間攪拌した。反応終了後に、混合物をガラスフィ
ルター濾過器G3を通して濾過し、濾過した不溶化された
活性化剤調製物を前記組成の重炭酸ナトリウム緩衝液各
30mlで５回洗浄した。すべての場合に存在する反応性CN
Br−基の飽和のために、不溶化された活性化剤調製物
を、前記組成の重炭酸ナトリウム緩衝液中の0.5％エタ
ノールアミン100mlと共に２時間攪拌し、再び、ガラス
フィルター濾過器上に集め、更に重炭酸ナトリウム各30
0mlで３回洗浄した。
蒸溜水100ml中に溶かしたヒト血漿（Sigma−Chemie Gmb
H、西ドイツ、ミュンヘン）からの硫酸バリウム−溶離
液１単位を孔径0.4μの膜フィルターを通して濾過し
た。Ｄ−Lys（Cbo）−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNAを用いて
測定された1ml当りプロテインC0.9Uを含有するこの溶液
に、不溶化された活性化剤調製物を加え、室温で２時間
攪拌し、更にガラスフィルター濾過器を通して濾過し
た。濾液は、活性化プロテインＣ（プロテインCa）0.95
Uを有した。
【図面の簡単な説明】
第１図はDEAE−セファデックス Ａ−50のクロマトグラ
フィによるマムシ毒からのプロテインＣ−活性化剤の単
離を示す曲線である。

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】プロテインＣ含有媒体中のプロテインＣを
    定量測定するために、前記媒体に、マムシ毒又はマムシ
    毒と免疫学的に交叉反応する蛇類の毒又は前記の毒から
    得られ、プロテインＣを活性化する活性化剤調製物を、
    このチモーゲン プロテインＣを最大に活性化して活性
    化プロテインＣ（プロテインCa）−活性を有するプロテ
    イナーゼにするまで作用させ、生じる活性化プロテイン
    Ｃ（プロテインCa）の量を、合成色原性基質上へのこの
    活性化プロテインＣ（プロテインCa）の触媒的加水分解
    作用により生じる発色性又は蛍光性の分解生成物の量の
    測光法により又は、活性化プロテインＣ（プロテインC
    a）により作用された天然基質の凝固時間の延長の測定
    により測定するか又は、前記媒体に、合成色原性基質及
    び前記の毒及び前記の活性化剤調製物を添加し、前記基
    質からの発色性又は蛍光性分解生成物の加水分解的遊離
    を測光法により追跡し、観察された基質加水分解の最大
    速度から、前記媒体のプロテインＣの含分を計算するこ
    とを特徴とする、プロテインＣの定量的測定法。
  2. 【請求項２】プロテインＣ含有媒体として血漿又はその
    フラクション、精製プロテインＣの溶液、プロテインＣ
    −吸着体の溶離液、臓器抽出物、組織培養濾液及び−抽
    出物又は遺伝学的に変性されたプロテインＣを生じる微
    生物の培養物の培養液及び抽出物を使用する、特許請求
    の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】合成色原性基質として、活性化プロテイン
    Ｃ（プロテインCa）により分解可能な色原性基をアミド
    結合により結合しているオリゴペプチドを使用する、特
    許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】合成基質として式： ［式中ｎは３又は４の数字であり、R2は水素又はａ）炭
    素原子数２〜６の直鎖又は分枝鎖のアルカノイル基、
    ｂ）アルカノイル中の炭素原子数２〜４のω−カルボキ
    シル−、ω−メトキシカルボニル−又はω−エトキシカ
    ルボニルアルカノイル基、ｃ）アルコキシ中の炭素原子
    数１〜４の直鎖又は分枝鎖のアルコキシカルボニル基、
    ｄ）アルキル中の炭素原子数１〜２のアルキルスルホニ
    ル基、ｅ）非置換又は置換ベンゾイル基又はｆ）核中で
    非置換の又は置換されたベンゾイルオキシカルボニル基
    を表わし、R3は、水素又はR2のａ）〜ｆ）で定義された
    １個の基を表わし、ｎ＝３である場合にはアミジノ−又
    はトジルアミジノ基を表わし、R1はｐ−ニトロフェニル
    アミノ−、１−又は２−ナフチルアミノ−、４−メトキ
    シ−２−ナフチルアミノ−、４−メチルクマリル−
    （７）−アミノ−、1,3−ジ（メトキシカルボニル）−
    フェニル−（５）−アミノ−、シンノニルアミノ−又は
    ニトロシンノニルアミノ基を表わす］の化合物又は、前
    記定義の化合物と無機酸又は有機酸との塩を使用する、
    特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項記
    載の方法。
  5. 【請求項５】合成基質として、Ｈ−Ｄ−Pro−Ｌ−Pro−
    Ｌ−Arg−pNA、Ｌ−Pyroglu−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA、
    Ｈ−Ｄ−Lys（ε−Cbo）−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA又は
    Ｈ−Ｄ−Lys−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNAの水溶性塩を使用
    する、特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか
    １項記載の方法。
  6. 【請求項６】合成基質として、次の化合物:2AcOH・Ｈ−
    Ｄ−CHG−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA、2AcOH・Ｈ−Ｄ−CHG
    −Ｌ−Ala−Ｌ−Arg−pNA、Tos−Gly−Ｌ−Pro−Ｌ−Ar
    g−pNA・AcOH及びフェニルスルホニル−Gly−Ｌ−Pro−
    Ｌ−Arg−pNA・AcOHの１種を使用する、特許請求の範囲
    第１項から第３項までのいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】凝固試験での因子Ｖ及びVIIIの不活性化を
    介して活性化プロテインＣ（プロテインCa）の作用を測
    定するための天然の基質として、ヒト又は背椎動物の新
    鮮、凍結又は凍結乾燥された血漿を慣用のカルシウムイ
    オン結合性添加物例えばクエン酸塩、酸塩又はエチレ
    ンジアミンテトラ酢酸塩と共に、又は加熱、pH−変動又
    は酵素、吸着剤、蛋白質沈殿剤での処理により阻害剤又
    はプロテインＣ測定のために重要でない成分を除いた血
    漿調製物を使用する、特許請求の範囲第１項又は第２項
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】ヒト及び背椎動物のチモーゲン プロテイ
    ンＣを活性化プロテインＣ（プロテインCa）−活性を有
    するプロテイナーゼに変える特性を有し、マムシ毒から
    又はマムシ毒と免疫学的に交叉反応する蛇類の毒から、
    蛋白質の結合により好適な孔度を有する陰イオン交換体
    でのクロマトグラフィ及び中性pH値及び増加性イオン濃
    度での燐酸ナトリウム緩衝液による溶離、限外濾過によ
    る活性フラクションの脱塩及び引続く凍結乾燥により得
    られる活性化剤調製物。
  9. 【請求項９】水性媒体中での蛇毒の溶解、この溶液から
    の分別アルコール沈殿、分別塩沈殿又は酸性pH値での熱
    処理による不所望な毒成分の除去による予備精製した毒
    フラクションの調製、得られた予備精製された毒フラク
    ションの、蛋白質の結合に好適な孔度を有する陰イオン
    交換体でのクロマトグラフィ及び中性pH値で増加性イオ
    ン濃度での燐酸ナトリウム緩衝液を用いる溶離による更
    なる精製、引続く陽イオン交換体でのクロマトグラフィ
    及び酸性pH値での酢酸ナトリウム緩衝液を用いる溶離、
    プロテインＣ−活性化溶離液の限外濾過による濃縮、脱
    塩及び分子篩ゲルでのクロマトグラフィ、溶離剤として
    の稀酢酸水の使用下での濃縮物の最終精製及び引続く凍
    結乾燥により得られた、高度に精製された特許請求の範
    囲第８項記載の活性化剤調製物。
  10. 【請求項１０】試験混合物1ml当り蛋白質２μｇの濃度
    で、pH8及びイオン濃度0.15及び37℃で、正常ヒトクエ
    ン酸塩血漿0.05ml中に含有されるプロテインＣを、最大
    10分以内で活性化し、試験混合物1ml当り蛋白質２μｇ
    の濃度で、ヒトフィブリノーゲンの10分以内での凝固も
    15時間以内でのヒトフィブリンの溶解もせずに作用し、
    そのプロテインＣ活性化作用は、pH8で1ml当りジイソプ
    ロピルフルオル燐酸塩2.5μＭとの15時間のインキュベ
    ーションによって又は、pH7で1ml当りヨードアセタミド
    1mgとの15時間のインキュベーション又は、1ml当りエチ
    レンジアミン四酢酸−２ナトリウム塩0.05μモルの添加
    によっても低下されず、このプロテインＣ活性化作用
    は、トロンビン阻害剤抗トロンビンIII、ヘパリン及び
    ヒルジンによっても、多価プロテイナーゼ阻害剤アプロ
    チニンによっても抑制されない、特許請求の範囲第８項
    記載の活性化剤調製物。
  11. 【請求項１１】水性反応混合物1ml当り0.1〜0.5μｇの
    濃度、pH6〜８及び20〜40℃の温度で、正常ヒトクエン
    酸塩血漿0.05ml中に含有されるプロテインＣを最大10分
    間以内に最大活性化し、試験混合物1ml当り５μｇの濃
    度で、10分以内のヒトフィブリノーゲンの凝固も、15時
    間以内でのヒトフィブリンを溶解する作用もせず、プロ
    トロンビン及び凝固因子Ｘを活性化せず、プロテインＣ
    −不含の血漿からアミド分解活性を生ぜず、そのプロテ
    インＣ活性化作用は、pH8で、1ml当りジイソプロピルフ
    ルオル燐酸塩2.5μモルとの15時間インキュベーション
    又はpH7で1ml当りヨードアセタミド1mgとのインキュベ
    ーション又は、1ml当りエチレンジアミン四酢酸−２ナ
    トリウム塩0.05μモルの添加により低下されず、プロテ
    インＣ活性化作用は、抗トロンビンIII、ヘパリン及び
    ヒルジンのようなトロンビン阻害剤によっても、多価プ
    ロテイナーゼ阻害剤アプロチニンによっても抑制され
    ず、pH3〜８で70℃に10分間加熱することによるか又はp
    H2〜８で20〜25℃で24時間貯蔵の際にもそのプロテイン
    Ｃ活性化作用を損失せず、pH9で１時間後には著るしい
    活性低下を示し、1ml当りドデシル硫酸ナトリウム４％
    又は乳酸マンガン−（II）５μモルの添加の後にそのプ
    ロテインＣ活性化作用を失なわず、pH7でのジスレイト
    ールでの24時間処理により、僅かに活性を損失し、多価
    のアメリカ・アナマムシ（americanische grubenotter
    n）に対する抗血清により中和され、ジチオスレイトー
    ルでの還元及び引続くドデシル硫酸ナトリウムの存在に
    おけるポリアクリルアミドゲル電気泳動でのヨードアセ
    タミドを用いるアルキル化及びクマシーブルーでの着色
    の後に、分子量39000±3000に相当する相対的電気泳動
    移動度の固有帯域を有し、分析的超遠心で分子量36800
    ±５％に相当する2.65±３％の沈殿定数（S20w）を有
    し、分子量37000に相当する比容量（Kav）を有する網状
    化されたデキストランゲル（セファデックス Ｇ−10
    0）の較正カラムで溶離され、等電性集束により測定さ
    れた3.0±0.2の等電点を有し、280nm及び層厚1cmでの１
    ％水溶液中の特異吸着性（A280 1cm１％）は13.5±0.5で
    あり、20±３％の炭水化物を含有し、試験バッチ１μg/
    mlの濃度で、合成基質としてのＨ−Ｄ−Pro−Ｌ−Pro−
    Ｌ−Arg−pNA、Ｌ−Pyroglu−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA、
    Ｈ−Ｄ−Lys（ε−Cbo）−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA又は
    Ｈ−Ｄ−Lys−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNAの水溶性塩又は2A
    cOH・Ｈ−Ｄ−CHG−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA、2AcOH・Ｈ
    −Ｄ−CHG−Ｌ−Ala−Ｌ−Arg−pNA、Tos−Gly−Ｌ−Pr
    o−Ｌ−Arg−pNA.AcOH及びフェニルスルホニル−Gly−
    Ｌ−Pro−Ｌ−Arg−pNA.AcOHと共に、pH7〜8.5及び37℃
    でインキュベーションする際に、405nm及び層厚1cmで、
    測定吸光が0.01/minより大きく増大せず、ウサギ体重1k
    g当り80Uの用量での静脈内適用の後に、血漿中の活性化
    された部分トロンボプラスチン時間が当初値の少なくと
    も２倍延長され、体重1kg当り80Uの静脈内適用の後に、
    急性毒性症状を示さず、ウサギでの挙動障害を起こさ
    ず、ウサギでのその数回の皮下適用は、抗体の形成を促
    進し、活性化剤調製物に対して免疫化されたウサギの血
    清中に含有された抗体は、抗原と、免疫拡散により検出
    可能な沈殿性錯体を形成する特性を有する、特許請求の
    範囲第９項記載の活性化剤調製物。
  12. 【請求項１２】遺伝物質がその活性化剤が宿主細胞から
    得られるように変えられているクローン化された微生物
    の培養液又は培養物から得られる、特許請求の範囲第８
    項又は第９項に記載の活性化剤調製物。
  13. 【請求項１３】生きている背椎動物の血液中のプロテイ
    ンＣを活性化する特性を有する、特許請求の範囲第８項
    又は第９項の活性化剤調製物。
  14. 【請求項１４】医薬品中で抗血栓症作用成分として使用
    される、特許請求の範囲第８項又は第９項記載の活性化
    剤調製物。
  15. 【請求項１５】プロテインＣ含有水性媒体から活性化さ
    れたプロテインＣを得る場合に、ヒト及び背椎動物のチ
    モーゲン プロテインＣを活性化プロテインＣ（プロテ
    インCa）−活性を有するプロテイナーゼに変える特性を
    有し、マムシの毒から又はマムシ毒と免疫学的に交叉反
    応するヘビ類の毒から、蛋白質の結合に好適な孔度を有
    する陰イオン交換体でのクロマトグラフィ及び中性pH値
    及び増加性イオン濃度での燐酸ナトリウム緩衝液での溶
    離及び限外濾過による活性フラクションの脱塩及び引続
    く凍結乾燥により得た、活性化剤調製物又は水性媒体中
    での蛇毒の溶解、この溶液からの分別アルコール沈殿、
    分別塩沈殿又は酸性pH値での熱処理による不所望な毒成
    分の除去による予備精製した毒フラクションの調製、得
    られた予備精製された毒フラクションの、蛋白質の結合
    に好適な孔度を有する陰イオン交換体を用いる陰イオン
    交換体でのクロマトグラフィ及び中性pH値で増加性イオ
    ン濃度での燐酸ナトリウム緩衝液を用いる溶離による更
    なる精製、引続く陽イオン交換体でのクロマトグラフィ
    及び酸性pH値での酢酸ナトリウム緩衝液を用いる溶離、
    プロテインＣ活性化溶離液の限外濾過による濃縮、脱塩
    及び分子篩ゲルでのクロマトグラフィ、溶離剤としての
    稀酢酸水の使用下での濃縮物の最終精製及び引続く凍結
    乾燥により得られた、高度に精製された活性化剤調製物
    を不溶化のために、水不溶性担体に結合させ、不溶化さ
    れた活性化剤調製物をプロテインＣの活性化のためにプ
    ロテインＣ含有水性媒体に作用させ、プロテインＣを活
    性化プロテインＣ（プロテインCa）に変換の後に、この
    不溶化された活性化剤調製物を水性媒体から取り出し、
    この活性化プロテインＣ（プロテインCa）を公知方法で
    水性媒体から単離することを特徴とする、活性化プロテ
    インＣ（プロテインCa）の取得法。
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