JPH0739393A - ペルオキシダーゼ及びそれと同等な触媒作用を有する物質の定量方法 - Google Patents
ペルオキシダーゼ及びそれと同等な触媒作用を有する物質の定量方法Info
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- JPH0739393A JPH0739393A JP22659293A JP22659293A JPH0739393A JP H0739393 A JPH0739393 A JP H0739393A JP 22659293 A JP22659293 A JP 22659293A JP 22659293 A JP22659293 A JP 22659293A JP H0739393 A JPH0739393 A JP H0739393A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ペルオキシダーゼを過酸化水素の存在下に酸
化発色試薬で測定する方法で、感度の高い蛍光性化合物
を生じる酸化発色試薬を提供する。 【構成】 一般式 【化１】 （Ｒ1 はアルキル、Ｒ2 は水素又はアルキル）で示され
るp-ヒドロキシアセトアニリド誘導体（例えば4-アセト
アミドフェノール）を酸化発色試薬として用い、蛍光強
度によってペルオキシダーゼ濃度を定量測定する。 【効果】 本発明の酸化発蛍光試薬は精製が容易で安定
であり、蛍光測定におけるバックグラウンドが低く、高
感度でペルオキシダーゼ濃度を測定できる。
化発色試薬で測定する方法で、感度の高い蛍光性化合物
を生じる酸化発色試薬を提供する。 【構成】 一般式 【化１】 （Ｒ1 はアルキル、Ｒ2 は水素又はアルキル）で示され
るp-ヒドロキシアセトアニリド誘導体（例えば4-アセト
アミドフェノール）を酸化発色試薬として用い、蛍光強
度によってペルオキシダーゼ濃度を定量測定する。 【効果】 本発明の酸化発蛍光試薬は精製が容易で安定
であり、蛍光測定におけるバックグラウンドが低く、高
感度でペルオキシダーゼ濃度を測定できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はペルオキシダーゼ（以下
ＰＯＤと略す）及びそれと同等な触媒作用を有する物質
の定量方法に関し、特に過酸化水素とＰＯＤ又はそれと
同等な触媒作用を有する標識物質の存在下で酸化発蛍光
試薬を用いてＰＯＤ及びそれと同等の触媒作用を有する
物質を測定する方法に関するものである。
ＰＯＤと略す）及びそれと同等な触媒作用を有する物質
の定量方法に関し、特に過酸化水素とＰＯＤ又はそれと
同等な触媒作用を有する標識物質の存在下で酸化発蛍光
試薬を用いてＰＯＤ及びそれと同等の触媒作用を有する
物質を測定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】一般に、酵素試薬あるいは抗体を用いる
臨床検査法は酵素の基質特異性あるいは抗体の抗原特異
性のために極めて選択性の高い分析法であり、複雑な生
体マトリックスの影響を受けることなく各種の生体成分
を容易に定量できるため重要な手法となっている。酵素
のうちＰＯＤやアルカリホスファーゼは各種のタンパク
等の標識剤として広範囲に用いられており、抗体にこう
したＰＯＤやアルカリフォスターゼを標識しておき目的
とする化合物（抗原）に作用させたのち酸化発色系ある
いは酵素基質を用いることにより高感度に目的化合物
（抗原）の定量を行なうことができる。
臨床検査法は酵素の基質特異性あるいは抗体の抗原特異
性のために極めて選択性の高い分析法であり、複雑な生
体マトリックスの影響を受けることなく各種の生体成分
を容易に定量できるため重要な手法となっている。酵素
のうちＰＯＤやアルカリホスファーゼは各種のタンパク
等の標識剤として広範囲に用いられており、抗体にこう
したＰＯＤやアルカリフォスターゼを標識しておき目的
とする化合物（抗原）に作用させたのち酸化発色系ある
いは酵素基質を用いることにより高感度に目的化合物
（抗原）の定量を行なうことができる。
【０００３】従来用いられてきたＰＯＤ測定試薬として
はo-フェニレンジアミンなどの酸化発色試薬が一般的
で、過酸化水素の存在下で酸化縮合させ縮合体をを測定
することでＰＯＤ又は過酸化水素を検出するものであ
る。酸化発色試薬としてはo-フェニレンジアミン以外
に、フェノール、 N,N,-ジメチルアニリン、4-クロロフ
ェノール、N-エチル- N-スルホプロピルアニリン、N-エ
チル-N-(2-ヒドロキシ- 3-スルホプロピル)-m-トルイジ
ンなどが用いられている。
はo-フェニレンジアミンなどの酸化発色試薬が一般的
で、過酸化水素の存在下で酸化縮合させ縮合体をを測定
することでＰＯＤ又は過酸化水素を検出するものであ
る。酸化発色試薬としてはo-フェニレンジアミン以外
に、フェノール、 N,N,-ジメチルアニリン、4-クロロフ
ェノール、N-エチル- N-スルホプロピルアニリン、N-エ
チル-N-(2-ヒドロキシ- 3-スルホプロピル)-m-トルイジ
ンなどが用いられている。
【０００４】近年、p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸
（以下ＨＰＰＡと略す）を用い、過酸化水素とＰＯＤの
存在下で蛍光性化合物を生じることを利用した酸化発蛍
光法が開発されきた。本方法はpMレベルのＰＯＤの定量
に用いることができる高感度な分析法と称されている。
（以下ＨＰＰＡと略す）を用い、過酸化水素とＰＯＤの
存在下で蛍光性化合物を生じることを利用した酸化発蛍
光法が開発されきた。本方法はpMレベルのＰＯＤの定量
に用いることができる高感度な分析法と称されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＨＰＰ
Ａはその精製が難しく、蛍光のバックグラウンドが低い
ものを得難いことと、検出感度に及ぼすロット間の差が
大きいことなど数多くの問題点を抱えている。
Ａはその精製が難しく、蛍光のバックグラウンドが低い
ものを得難いことと、検出感度に及ぼすロット間の差が
大きいことなど数多くの問題点を抱えている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記のような現状のも
と、本発明者等はこれらの欠点をなくし、さらに優れた
酸化発蛍光試薬を開発するため鋭意研究を重ねた結果、
本発明を完成したものである。
と、本発明者等はこれらの欠点をなくし、さらに優れた
酸化発蛍光試薬を開発するため鋭意研究を重ねた結果、
本発明を完成したものである。
【０００７】すなわち本発明は、過酸化水素とＰＯＤ又
はそれと同等な触媒作用を有する標識物質の存在下で酸
化発蛍光試薬を用いてＰＯＤ又はそれと同等の触媒作用
を有する物質を測定する方法において、酸化発蛍光試薬
として、次の一般式（１）、
はそれと同等な触媒作用を有する標識物質の存在下で酸
化発蛍光試薬を用いてＰＯＤ又はそれと同等の触媒作用
を有する物質を測定する方法において、酸化発蛍光試薬
として、次の一般式（１）、
【０００８】
【化２】
【０００９】（式中、Ｒ1 はアルキル基、Ｒ2 は水素又
はアルキル基である）で示されるp-ヒドロキシアセトア
ニリド誘導体を用いることを特徴とするペルオキシダー
ゼ及びそれと同等な触媒作用を有する物質の定量方法で
ある。
はアルキル基である）で示されるp-ヒドロキシアセトア
ニリド誘導体を用いることを特徴とするペルオキシダー
ゼ及びそれと同等な触媒作用を有する物質の定量方法で
ある。
【００１０】本発明において使用する上記一般式（１）
で示される化合物は、p-ヒドロキシアニリンを基本骨格
とする化合物を出発物質として合成するすることができ
る。
で示される化合物は、p-ヒドロキシアニリンを基本骨格
とする化合物を出発物質として合成するすることができ
る。
【００１１】例えば、4-アセトアミドフェノール（Ｒ1
：ＣＨ3 ，Ｒ2 ：Ｈ）［後記の化合物（Ａ）］は4-ア
ミノフェノールに無水酢酸を作用させて合成することが
できる。また、3-メチル-4 -プロピオニルアミノフェノ
ール（Ｒ1 ：Ｃ2 Ｈ5 ，Ｒ2 ：ＣＨ3 ）［後記化合物
（Ｅ）］は3-メチル- 4-アミノフェノールに無水プロピ
オン酸を作用させて合成することができる。水からの再
結晶及び活性炭処理により精製する。
：ＣＨ3 ，Ｒ2 ：Ｈ）［後記の化合物（Ａ）］は4-ア
ミノフェノールに無水酢酸を作用させて合成することが
できる。また、3-メチル-4 -プロピオニルアミノフェノ
ール（Ｒ1 ：Ｃ2 Ｈ5 ，Ｒ2 ：ＣＨ3 ）［後記化合物
（Ｅ）］は3-メチル- 4-アミノフェノールに無水プロピ
オン酸を作用させて合成することができる。水からの再
結晶及び活性炭処理により精製する。
【００１２】このようにして得られた化合物（１）のう
ち代表的な化合物（Ａ）〜（Ｆ）を以下に示す。
ち代表的な化合物（Ａ）〜（Ｆ）を以下に示す。
【００１３】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【００１４】
【実施例】次に実施例をあげて、各種のp-ヒドロキシア
セトアニリド誘導体を用いたＰＯＤ定量法を説明する
が、本発明はその要旨を満たすかぎり、以下の実施例に
よって制約されるものではない。
セトアニリド誘導体を用いたＰＯＤ定量法を説明する
が、本発明はその要旨を満たすかぎり、以下の実施例に
よって制約されるものではない。
【００１５】実施例１ （ＰＯＤ標準液による検量線の作成）化合物（１）を用
い、ＰＯＤ（わさび製、活性度193U/mg 、和光純薬工業
株式会社製）の濃度変化に伴う蛍光強度の変化を観察し
た。試薬は以下のものを用いた。基質には化合物（Ａ）
〜（Ｄ）及びＨＰＰＡを用いた。
い、ＰＯＤ（わさび製、活性度193U/mg 、和光純薬工業
株式会社製）の濃度変化に伴う蛍光強度の変化を観察し
た。試薬は以下のものを用いた。基質には化合物（Ａ）
〜（Ｄ）及びＨＰＰＡを用いた。
【００１６】測定用緩衝液：50mMリン酸緩衝液、pH:7.
6、塩化ナトリウム濃度：5.7g/L。 基質液：25mM p- アルキルアミドフェノール／測定用緩
衝液。 酵素希釈液： 0.2％ウシ血清アルブミン／測定用緩衝
液。 過酸化水素溶液：20mM過酸化水素／測定用緩衝液。 酵素液： 0.1〜10nMＰＯＤ（分子量44,000）／酵素希釈
液。 標準液：1ppm硫酸キニーネ。
6、塩化ナトリウム濃度：5.7g/L。 基質液：25mM p- アルキルアミドフェノール／測定用緩
衝液。 酵素希釈液： 0.2％ウシ血清アルブミン／測定用緩衝
液。 過酸化水素溶液：20mM過酸化水素／測定用緩衝液。 酵素液： 0.1〜10nMＰＯＤ（分子量44,000）／酵素希釈
液。 標準液：1ppm硫酸キニーネ。
【００１７】測定用緩衝液 4ml、基質液 400μl 及び過
酸化水素溶液 200μl を混合し、37℃の水浴に 5分間浸
してから、酵素液 5μl を加えて37℃に10分間保った後
の蛍光強度を各蛍光極大波長で測定した。各化合物につ
いての蛍光励起波長及び発光波長を表１に示す。
酸化水素溶液 200μl を混合し、37℃の水浴に 5分間浸
してから、酵素液 5μl を加えて37℃に10分間保った後
の蛍光強度を各蛍光極大波長で測定した。各化合物につ
いての蛍光励起波長及び発光波長を表１に示す。
【００１８】
【表１】 化合物 励起波長(nm) 蛍光波長(nm) （Ａ） 326 432 （Ｂ） 328 432 （Ｃ） 328 432 （Ｄ） 355 432 （Ｅ） 328 432 （Ｆ） 328 432 ＨＰＰＡ 322 411
【００１９】各化合物についてＰＯＤ濃度の変化により
得られた値から作成した検量線を図１に示す。図１から
各化合物とも 0.1〜100pM のＰＯＤ濃度範囲で良好な直
線性を示すことがわかる。また、比較のために用いたＨ
ＰＰＡの検出感度より数倍い高く、蛍光ブランクも低い
ことが明らかである。
得られた値から作成した検量線を図１に示す。図１から
各化合物とも 0.1〜100pM のＰＯＤ濃度範囲で良好な直
線性を示すことがわかる。また、比較のために用いたＨ
ＰＰＡの検出感度より数倍い高く、蛍光ブランクも低い
ことが明らかである。
【００２０】実施例２ （ＰＯＤの測定）化合物（Ａ）を用い未知濃度のサンプ
ルのＰＯＤ量を測定した。
ルのＰＯＤ量を測定した。
【００２１】測定用緩衝液：50mMリン酸緩衝液、pH:7.
6、塩化ナトリウム濃度：5.7g/L。 基質液：25mM化合物（Ａ）／測定用緩衝液。 過酸化水素溶液：20mM過酸化水素／測定用緩衝液。 標準液：1ppm硫酸キニーネ。 酸素希釈液： 0.2％ウシ血清アルブミン／測定用緩衝
液。 サンプル：0.1mg POD 付加アビジン（シグマ社製）／10
ml酸素希釈液。
6、塩化ナトリウム濃度：5.7g/L。 基質液：25mM化合物（Ａ）／測定用緩衝液。 過酸化水素溶液：20mM過酸化水素／測定用緩衝液。 標準液：1ppm硫酸キニーネ。 酸素希釈液： 0.2％ウシ血清アルブミン／測定用緩衝
液。 サンプル：0.1mg POD 付加アビジン（シグマ社製）／10
ml酸素希釈液。
【００２２】測定用緩衝液 4ml、基質液 400μl 及び過
酸化水素溶液 200μl を混合し37℃水浴で 5分間浸し、
サンプル溶液 5μl を加え37℃に10分間一定温度に保っ
た後、励起波長326nm 、蛍光波長432nm 、1ppm硫酸キニ
ーネを標準液として蛍光強度を測定した。その結果相対
蛍光強度が5.62を示し、図１の検量線からサンプル溶液
のＰＯＤ濃度として 1×10-11Mが求められた。
酸化水素溶液 200μl を混合し37℃水浴で 5分間浸し、
サンプル溶液 5μl を加え37℃に10分間一定温度に保っ
た後、励起波長326nm 、蛍光波長432nm 、1ppm硫酸キニ
ーネを標準液として蛍光強度を測定した。その結果相対
蛍光強度が5.62を示し、図１の検量線からサンプル溶液
のＰＯＤ濃度として 1×10-11Mが求められた。
【００２３】
【発明の効果】本測定方法は合成が容易で再結晶により
容易に精製でき、且つ安定な化合物であるp-ヒドロキシ
アセトアニリド誘導体（１）を蛍光基質として用いるの
で、蛍光測定におけるバックグラウンドが低く、ＰＯＤ
測定の感度がＨＰＰＡを用いた場合より数倍ないし十数
倍高く、且つ発蛍光波長がＨＰＰＡよりも長波長側にあ
るためサンプルからの蛍光の妨害を受け難いという多く
の利点を有する。
容易に精製でき、且つ安定な化合物であるp-ヒドロキシ
アセトアニリド誘導体（１）を蛍光基質として用いるの
で、蛍光測定におけるバックグラウンドが低く、ＰＯＤ
測定の感度がＨＰＰＡを用いた場合より数倍ないし十数
倍高く、且つ発蛍光波長がＨＰＰＡよりも長波長側にあ
るためサンプルからの蛍光の妨害を受け難いという多く
の利点を有する。
【図１】本発明の化合物（Ａ）〜（Ｄ）及びＨＰＰＡに
ついての検量線である。
ついての検量線である。
Claims (1)
- 【請求項１】 過酸化水素とペルオキシダーゼ及びそれ
と同等な触媒作用を有する標識物質の存在下で酸化発色
試薬を用いてペルオキシダーゼ又はそれと同等の触媒作
用を有する物質を測定する方法において、酸化発蛍光試
薬として、次の一般式（１）、 【化１】 （式中、Ｒ1 はアルキル基、Ｒ2 は水素又はアルキル基
である）で示されるp-ヒドロキシアセトアニリド誘導体
を用いることを特徴とするペルオキシダーゼ及びそれと
同等な触媒作用を有する物質の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22659293A JPH07108238B2 (ja) | 1993-08-02 | 1993-08-02 | ペルオキシダーゼ及びそれと同等な触媒作用を有する物質の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22659293A JPH07108238B2 (ja) | 1993-08-02 | 1993-08-02 | ペルオキシダーゼ及びそれと同等な触媒作用を有する物質の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0739393A true JPH0739393A (ja) | 1995-02-10 |
| JPH07108238B2 JPH07108238B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=16847604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22659293A Expired - Fee Related JPH07108238B2 (ja) | 1993-08-02 | 1993-08-02 | ペルオキシダーゼ及びそれと同等な触媒作用を有する物質の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07108238B2 (ja) |
-
1993
- 1993-08-02 JP JP22659293A patent/JPH07108238B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07108238B2 (ja) | 1995-11-22 |
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