JPH0767696A - バックグランド発光の低減法 - Google Patents
バックグランド発光の低減法Info
- Publication number
- JPH0767696A JPH0767696A JP22101893A JP22101893A JPH0767696A JP H0767696 A JPH0767696 A JP H0767696A JP 22101893 A JP22101893 A JP 22101893A JP 22101893 A JP22101893 A JP 22101893A JP H0767696 A JPH0767696 A JP H0767696A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peroxidase
- luminescence
- acid
- salt
- measurement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジオン誘導
体及び酸化剤を用いて酸化触媒であるヘム又はペルオキ
ダーゼをそれらの触媒作用による発光反応に基づいて測
定する場合の、バックグランド発光の低減法の提供。 【構成】特定の化学式で示される官能基又はその塩を構
造中に含み、且つ水酸基を有する芳香族炭化水素を構造
中に含まない、キレ−ト作用を有する化合物の１種以上
の共存下で測定を実施することにより、ヘム又はペルオ
キシダ−ゼの測定におけるバックグランド発光を低減す
る。
体及び酸化剤を用いて酸化触媒であるヘム又はペルオキ
ダーゼをそれらの触媒作用による発光反応に基づいて測
定する場合の、バックグランド発光の低減法の提供。 【構成】特定の化学式で示される官能基又はその塩を構
造中に含み、且つ水酸基を有する芳香族炭化水素を構造
中に含まない、キレ−ト作用を有する化合物の１種以上
の共存下で測定を実施することにより、ヘム又はペルオ
キシダ−ゼの測定におけるバックグランド発光を低減す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジオン誘導体及び酸化剤を用いて、酸化
触媒であるヘム又はペルオキダーゼをそれらの触媒作用
による発光反応に基づいて測定する場合の、バックグラ
ンド発光の低減法に関するものである。
１，４−フタラジオン誘導体及び酸化剤を用いて、酸化
触媒であるヘム又はペルオキダーゼをそれらの触媒作用
による発光反応に基づいて測定する場合の、バックグラ
ンド発光の低減法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】生体中の極微量物質の定量には、近年酵
素免疫測定法（ＥＩＡ）が用いられるようになってきた
が、標識酵素の測定には蛍光基質を用いることが主流と
なっている。しかし蛍光物質の測定では、励起光の影響
等で必ずしも高感度測定が容易ではなく、より高感度な
測定が可能な発光基質を用いた酵素免疫測定法（ＣＬＥ
ＩＡ）が提案されている。
素免疫測定法（ＥＩＡ）が用いられるようになってきた
が、標識酵素の測定には蛍光基質を用いることが主流と
なっている。しかし蛍光物質の測定では、励起光の影響
等で必ずしも高感度測定が容易ではなく、より高感度な
測定が可能な発光基質を用いた酵素免疫測定法（ＣＬＥ
ＩＡ）が提案されている。
【０００３】ＣＬＥＩＡに用いられる酵素として、アル
カリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等が挙げられ
るが、アルカリフォスファターゼに使用される発光基質
の場合、ジオキセタン構造を含む発光基質の燐酸基を加
水分解する事により不安定化し、分解する際に発光する
ように設計されている。
カリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等が挙げられ
るが、アルカリフォスファターゼに使用される発光基質
の場合、ジオキセタン構造を含む発光基質の燐酸基を加
水分解する事により不安定化し、分解する際に発光する
ように設計されている。
【０００４】ペルオキシダーゼの場合、単独でルミノー
ルを過酸化水素等の酸化剤と反応させると、酵素の絶対
量として数フェントモル程度までは短時間の発光が認め
られるが、それ以下の量になるとバックグランド発光に
隠されてしまい、測定が難しい。この問題に対しＴｈｏ
ｒｐｅ等は、フェノール誘導体やヒドロキシベンゾチア
ゾール等の化合物（エンハンサー）を上記の系に添加す
る事により発光が著しく増強し、且つ発光が長時間持続
する事を報告している（Methods in Enzymology 133, p
331-353, 1986 年）。これら一連のエンハンサーは、酸
化剤とルミノールを混合した際に発生するバックグラン
ド発光を低下させると同時に、ペルオキシダーゼ等の触
媒による発光をを増強する効果があり、これによりペル
オキシダーゼは数１０アトモル程度まで測定できるよう
になっている。ペルオキダーゼを標識に使ったＣＬＥＩ
Ａにおいては、この増強反応を利用して従来より高感度
に種々の測定項目が定量できるようなった。
ルを過酸化水素等の酸化剤と反応させると、酵素の絶対
量として数フェントモル程度までは短時間の発光が認め
られるが、それ以下の量になるとバックグランド発光に
隠されてしまい、測定が難しい。この問題に対しＴｈｏ
ｒｐｅ等は、フェノール誘導体やヒドロキシベンゾチア
ゾール等の化合物（エンハンサー）を上記の系に添加す
る事により発光が著しく増強し、且つ発光が長時間持続
する事を報告している（Methods in Enzymology 133, p
331-353, 1986 年）。これら一連のエンハンサーは、酸
化剤とルミノールを混合した際に発生するバックグラン
ド発光を低下させると同時に、ペルオキシダーゼ等の触
媒による発光をを増強する効果があり、これによりペル
オキシダーゼは数１０アトモル程度まで測定できるよう
になっている。ペルオキダーゼを標識に使ったＣＬＥＩ
Ａにおいては、この増強反応を利用して従来より高感度
に種々の測定項目が定量できるようなった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前述のようなアルカリ
フォスファターゼ測定に使用される発光基質の場合、ア
ルカリフォスファターゼの至適ｐＨにおいて、これら発
光基質の燐酸エステルの非酵素的な加水分解が起こりや
すく、これに由来するバックグランド発光が生じやすい
という課題がある。バックブランド発光が生じると、微
量のアルカリフォスファターゼに由来する微小な発光が
バックグランドと区別できないため、測定感度を高める
ことができないのである。
フォスファターゼ測定に使用される発光基質の場合、ア
ルカリフォスファターゼの至適ｐＨにおいて、これら発
光基質の燐酸エステルの非酵素的な加水分解が起こりや
すく、これに由来するバックグランド発光が生じやすい
という課題がある。バックブランド発光が生じると、微
量のアルカリフォスファターゼに由来する微小な発光が
バックグランドと区別できないため、測定感度を高める
ことができないのである。
【０００６】またペルオキシダーゼ測定に使用される発
光基質やエンハンサ−についても、微量のペルオキシダ
ーゼを測定しようとする場合には前記アルカリフォスフ
ァターゼの場合と同様の課題がある。例えエンハンサー
を添加しても、依然バックグランド発光が高いレベルに
あるため、そのレベル以下の発光はとらえる事が出来な
いためである。
光基質やエンハンサ−についても、微量のペルオキシダ
ーゼを測定しようとする場合には前記アルカリフォスフ
ァターゼの場合と同様の課題がある。例えエンハンサー
を添加しても、依然バックグランド発光が高いレベルに
あるため、そのレベル以下の発光はとらえる事が出来な
いためである。
【０００７】このように、この高いバックグランド発光
を低く抑える方法の開発が高感度測定を達成するために
は不可欠であった。
を低く抑える方法の開発が高感度測定を達成するために
は不可欠であった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、ルミノー
ル、酸化剤及びエンハンサーからなる系におけるバック
グランド発光の低減法について鋭意研究した結果、本発
明を完成した。すなわち本発明は、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジオン誘導体を酸化剤存在下、ヘム又は
ペルオキシダ−ゼで処理することで生じる発光を、以下
の化式５〜８（但しＸはＨ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ｎ＝１〜
３）で示される官能基又はその塩を構造中に含み、且つ
水酸基を有する芳香族炭化水素を構造中に含まない、キ
レ−ト作用を有する化合物の１種以上の共存下で測定す
ることを特徴とする、ヘム又はペルオキシダ−ゼの測定
におけるバックグランド発光の低減法である。以下本発
明を詳細に説明する。
ル、酸化剤及びエンハンサーからなる系におけるバック
グランド発光の低減法について鋭意研究した結果、本発
明を完成した。すなわち本発明は、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジオン誘導体を酸化剤存在下、ヘム又は
ペルオキシダ−ゼで処理することで生じる発光を、以下
の化式５〜８（但しＸはＨ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ｎ＝１〜
３）で示される官能基又はその塩を構造中に含み、且つ
水酸基を有する芳香族炭化水素を構造中に含まない、キ
レ−ト作用を有する化合物の１種以上の共存下で測定す
ることを特徴とする、ヘム又はペルオキシダ−ゼの測定
におけるバックグランド発光の低減法である。以下本発
明を詳細に説明する。
【０００９】
【化５】
【００１０】
【化６】
【００１１】
【化７】
【００１２】
【化８】
【００１３】ルミノールに代表される２，３−ジヒドロ
−１，４−フタラジオン誘導体と過酸化水素等の酸化剤
を弱アルカリ性の溶液中で混合すると、ヘムやペルオキ
シダーゼといった酸化触媒を添加しなくとも、あるレベ
ルの発光が認められる。これが本発明でいうバックグラ
ンド発光である。このバックグランド発光は、反応系内
に微量に存在する金属イオンに起因するものであること
が確認された。従って本発明は、前記４種類の官能基又
はその塩を構造中に含み、且つ水酸基を有する芳香族炭
化水素を構造中に含まない、キレ−ト作用を有する化合
物の１種以上を共存させることによりバックグランド発
光を低減するものである。
−１，４−フタラジオン誘導体と過酸化水素等の酸化剤
を弱アルカリ性の溶液中で混合すると、ヘムやペルオキ
シダーゼといった酸化触媒を添加しなくとも、あるレベ
ルの発光が認められる。これが本発明でいうバックグラ
ンド発光である。このバックグランド発光は、反応系内
に微量に存在する金属イオンに起因するものであること
が確認された。従って本発明は、前記４種類の官能基又
はその塩を構造中に含み、且つ水酸基を有する芳香族炭
化水素を構造中に含まない、キレ−ト作用を有する化合
物の１種以上を共存させることによりバックグランド発
光を低減するものである。
【００１４】このような性質を持つ化合物としては、例
えば、trans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetra
acetic acid monohydrate 及びその塩、N,N-Bis(2hydro
xyethl)glycine及びその塩、1,3-Diamino-2-hydroxypro
pane-N,N,N',N'-tetraaceticacid 及びその塩、Diethyl
enetriamine-N,N,N',N'',N''-pentaacetic acid及びそ
の塩、Ethylenediamine-N,N'-diacetic acid及びその
塩、Ethylenediamin-N,N'-dipropionic acid,dihydroch
loride及びその塩、N-(2-Hydroxyethyl)ethylenediamin
e-N,N',N'-triacetic acid及びその塩、O,O'-Bis(2-ami
noethyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraacetic acid
及びその塩、1,6-Hexamethylethylenediamine-N,N,N',
N'-tetraacetic acid及びその塩、N-(2-Hydroxyethyl)i
minodiacetic acid及びその塩、Iminodiacetic acid及
びその塩、1,2-Diaminopropane-N,N,N',N'-tetraacetic
acid 及びその塩、Nitrilotriacetic acid 及びその
塩、Nitrilotriporopionic acid 及びその塩、Triethyl
enetetramine-N,N,N',N'',N''',N'''-hexaacetic acid
及びその塩、N-(2-acetoamido)iminodiacetic acid及び
その塩、O,O'-Bis(2-aminophenyl)ethyleneglycol-N,N,
N'.N'-teraacetic acid 及びその塩、クエン酸及びその
塩等が例示できる。
えば、trans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetra
acetic acid monohydrate 及びその塩、N,N-Bis(2hydro
xyethl)glycine及びその塩、1,3-Diamino-2-hydroxypro
pane-N,N,N',N'-tetraaceticacid 及びその塩、Diethyl
enetriamine-N,N,N',N'',N''-pentaacetic acid及びそ
の塩、Ethylenediamine-N,N'-diacetic acid及びその
塩、Ethylenediamin-N,N'-dipropionic acid,dihydroch
loride及びその塩、N-(2-Hydroxyethyl)ethylenediamin
e-N,N',N'-triacetic acid及びその塩、O,O'-Bis(2-ami
noethyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraacetic acid
及びその塩、1,6-Hexamethylethylenediamine-N,N,N',
N'-tetraacetic acid及びその塩、N-(2-Hydroxyethyl)i
minodiacetic acid及びその塩、Iminodiacetic acid及
びその塩、1,2-Diaminopropane-N,N,N',N'-tetraacetic
acid 及びその塩、Nitrilotriacetic acid 及びその
塩、Nitrilotriporopionic acid 及びその塩、Triethyl
enetetramine-N,N,N',N'',N''',N'''-hexaacetic acid
及びその塩、N-(2-acetoamido)iminodiacetic acid及び
その塩、O,O'-Bis(2-aminophenyl)ethyleneglycol-N,N,
N'.N'-teraacetic acid 及びその塩、クエン酸及びその
塩等が例示できる。
【００１５】系内に添加する化合物の濃度としては、0.
01mMから5mM 、好ましくは0.05mMから1.0mM が良い。こ
れ以上の濃度で使用する場合、ヘムやペルオキシダーゼ
等の触媒活性に由来する発光を阻害する場合があるた
め、実施に先立ち、予備的実験を行い、添加濃度条件を
決定しておくと良い。
01mMから5mM 、好ましくは0.05mMから1.0mM が良い。こ
れ以上の濃度で使用する場合、ヘムやペルオキシダーゼ
等の触媒活性に由来する発光を阻害する場合があるた
め、実施に先立ち、予備的実験を行い、添加濃度条件を
決定しておくと良い。
【００１６】前記のような官能基を有する化合物であっ
ても、Ethylenediaminehydroxyphenylacetic acid 及び
その塩のように水酸基を有する芳香族炭化水素を構造中
に含むキレート剤は、ヘムやペルオキシダーゼ等の触媒
活性に由来する発光を阻害する場合がある。
ても、Ethylenediaminehydroxyphenylacetic acid 及び
その塩のように水酸基を有する芳香族炭化水素を構造中
に含むキレート剤は、ヘムやペルオキシダーゼ等の触媒
活性に由来する発光を阻害する場合がある。
【００１７】本発明で用いられる２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジオン誘導体として、例えばルミノール
及びその誘導体、イソルミノール及びその誘導体、7-Di
methylaminonaphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydra
zide等が例示できる。酸化剤としては、例えば、過酸化
水素、過ほう酸ソーダ等が例示できる。
１，４−フタラジオン誘導体として、例えばルミノール
及びその誘導体、イソルミノール及びその誘導体、7-Di
methylaminonaphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydra
zide等が例示できる。酸化剤としては、例えば、過酸化
水素、過ほう酸ソーダ等が例示できる。
【００１８】バックグランド発光のみを低減する目的で
はエンハンサーを加える必要がないが、バックグランド
発光がより低い事が望ましい状況、即ち極低濃度のヘム
又はペルオキシダーゼの測定を行う場合、エンハンサー
を併用すると効果的である。エンハンサーは、例えばｐ
位置換フェノール誘導体（ｐヨードフェノール、４−フ
ェニルフェノール他）、２−ヒドロキシケイヒ酸、ホタ
ルルシフェリン及びその誘導体、６−ヒドロキシベンゾ
チアゾール、４−（４−ヒドロキシフェニル）チアゾー
ル等を例示できる。
はエンハンサーを加える必要がないが、バックグランド
発光がより低い事が望ましい状況、即ち極低濃度のヘム
又はペルオキシダーゼの測定を行う場合、エンハンサー
を併用すると効果的である。エンハンサーは、例えばｐ
位置換フェノール誘導体（ｐヨードフェノール、４−フ
ェニルフェノール他）、２−ヒドロキシケイヒ酸、ホタ
ルルシフェリン及びその誘導体、６−ヒドロキシベンゾ
チアゾール、４−（４−ヒドロキシフェニル）チアゾー
ル等を例示できる。
【００１９】本発明は、種々の起源のペルオキシダーゼ
について適用可能であるが、特に西洋ワサビ由来のペル
オキシダーゼに好適である。西洋ワサビペルオキシダー
ゼのアイソマーの中では、特に塩基性アイソマーに好適
であり、この時のpHとしては弱アルカリ性、pH8.0 から
pH9.5 が良く、緩衝液としてはトリスヒドロキシメタン
等のアミン系又はほう酸系等が好ましい。
について適用可能であるが、特に西洋ワサビ由来のペル
オキシダーゼに好適である。西洋ワサビペルオキシダー
ゼのアイソマーの中では、特に塩基性アイソマーに好適
であり、この時のpHとしては弱アルカリ性、pH8.0 から
pH9.5 が良く、緩衝液としてはトリスヒドロキシメタン
等のアミン系又はほう酸系等が好ましい。
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、系内のバックグランド
発光を低減し得、しかも酸化触媒に由来する発光は阻害
することのない、即ちバックグランド発光のみを特異的
に低減したヘム又はペルオキシダ−ゼの測定が可能であ
る。本発明を用いればバックグランド発光が従来に比べ
て低く抑えれるため、従来バックグランド発光に埋もれ
ていたヘム又ははペルオキシダーゼによるシグナル発光
を高感度に測定できる。また本発明は、ペルオキシダー
ゼ等を抗体の標識物として使用した、増強発光エンザイ
ムイムノアッセイ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ−ＣＬＥＩＡ）に
応用することが可能である。この場合、単にペルオキシ
ダーゼ等の測定にとどまらず、種々の生体微量物質の高
感度測定に応用できる。
発光を低減し得、しかも酸化触媒に由来する発光は阻害
することのない、即ちバックグランド発光のみを特異的
に低減したヘム又はペルオキシダ−ゼの測定が可能であ
る。本発明を用いればバックグランド発光が従来に比べ
て低く抑えれるため、従来バックグランド発光に埋もれ
ていたヘム又ははペルオキシダーゼによるシグナル発光
を高感度に測定できる。また本発明は、ペルオキシダー
ゼ等を抗体の標識物として使用した、増強発光エンザイ
ムイムノアッセイ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ−ＣＬＥＩＡ）に
応用することが可能である。この場合、単にペルオキシ
ダーゼ等の測定にとどまらず、種々の生体微量物質の高
感度測定に応用できる。
【００２１】
【実施例】以下、実施例を示して本発明をより具体的に
説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものでは
ない。
説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものでは
ない。
【００２２】実施例１ 0.2mM ４−フェニルフェノール、1.0mM 過酸化水素、0.
5mM ルミノールNa塩及び0.1mM の表１に示した化合物を
含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）溶液を調製し、バ
ックグランド発光（カウント／分）を測定した。比較の
ため、４−フェニルフェノール、過酸化水素、ルミノー
ルNa塩以外は含まない0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）
溶液を調製し、同様にバックグランド発光を測定した。
発光測定は市販の測定装置（アロカ社製ＢＬＲ−３０
１）を使用し、それぞれ200 μl の試料について、試薬
調製後30秒から1 分間の発光量を積算した。結果を表１
に示す。なお表１において、CyDTA はTrans-1,2-Diamin
ocyclohexane-N,N,N',N'-tetraacetic acid,monohydrat
e を、DHEGはN,N-Bis(2hydroxyethl)glycineを、EDDAは
Ethylenediamine-N,N'-diacetic acidを、EDTAはEthyle
nediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acidを、EGTAはO,O'
-Bis(2-aminoethyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraac
etic acid を、IDA はIminodiacetic acidを、NTA はNi
trilotriaceticacid を、Arg.はアルギニンを、Asp.は
アスパラギン酸を、Cys.はシスチンを、Glu.A はグルタ
ミン酸を、His.はヒスチジンを、Orn.はオルニチンを、
Tyr.はチロシンを、2,3DCPyri.は2,3-Dicarboxypyridin
e を、NM2,3DCPyri.は1-2,3-dicarboxypyridine を、2,
3DCPyra は2,3-Dicarboxypyradine をそれぞれ示す。こ
れら化合物のうち、CyDTA 、DHEG、EDDA、EDTA、EGTA、
IDA 、NTA は本発明の化合物としての性質を満たすも
の、すなわち前述の官能基又はその塩を構造中に含み且
つ水酸基を有する芳香族炭化水素を構造中に含まないキ
レ−ト作用を有する化合物である。
5mM ルミノールNa塩及び0.1mM の表１に示した化合物を
含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）溶液を調製し、バ
ックグランド発光（カウント／分）を測定した。比較の
ため、４−フェニルフェノール、過酸化水素、ルミノー
ルNa塩以外は含まない0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）
溶液を調製し、同様にバックグランド発光を測定した。
発光測定は市販の測定装置（アロカ社製ＢＬＲ−３０
１）を使用し、それぞれ200 μl の試料について、試薬
調製後30秒から1 分間の発光量を積算した。結果を表１
に示す。なお表１において、CyDTA はTrans-1,2-Diamin
ocyclohexane-N,N,N',N'-tetraacetic acid,monohydrat
e を、DHEGはN,N-Bis(2hydroxyethl)glycineを、EDDAは
Ethylenediamine-N,N'-diacetic acidを、EDTAはEthyle
nediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acidを、EGTAはO,O'
-Bis(2-aminoethyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraac
etic acid を、IDA はIminodiacetic acidを、NTA はNi
trilotriaceticacid を、Arg.はアルギニンを、Asp.は
アスパラギン酸を、Cys.はシスチンを、Glu.A はグルタ
ミン酸を、His.はヒスチジンを、Orn.はオルニチンを、
Tyr.はチロシンを、2,3DCPyri.は2,3-Dicarboxypyridin
e を、NM2,3DCPyri.は1-2,3-dicarboxypyridine を、2,
3DCPyra は2,3-Dicarboxypyradine をそれぞれ示す。こ
れら化合物のうち、CyDTA 、DHEG、EDDA、EDTA、EGTA、
IDA 、NTA は本発明の化合物としての性質を満たすも
の、すなわち前述の官能基又はその塩を構造中に含み且
つ水酸基を有する芳香族炭化水素を構造中に含まないキ
レ−ト作用を有する化合物である。
【００２３】表１からは、CyDTA 、DHEG、EDDA、EDTA、
EGTA、IDA 又はNTA を添加した場合に、無添加又はその
他を添加した場合と比較して明らかにバックグランド発
光が低減されていることがわかる。
EGTA、IDA 又はNTA を添加した場合に、無添加又はその
他を添加した場合と比較して明らかにバックグランド発
光が低減されていることがわかる。
【００２４】
【表１】
【００２５】実施例２ 実施例１においてバックグランド発光の低減が認められ
た化合物、CyDTA 、DHEG、EDDA、EDTA、EGTA、IDA 又は
NTA について、これら化合物がペルオキシダ−ゼの触媒
作用を妨害しないか否か試験した。
た化合物、CyDTA 、DHEG、EDDA、EDTA、EGTA、IDA 又は
NTA について、これら化合物がペルオキシダ−ゼの触媒
作用を妨害しないか否か試験した。
【００２６】0.2mM ４−フェニルフェノール、1.0mM 過
酸化水素、0.5mM ルミノールNa塩及び0.1mM の表２に示
した化合物を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）溶液
を調製し、250 アトモル（10μl ）の西洋ワサビペルオ
キシダ−ゼ溶液を添加した。添加後30秒から1 分間の発
光を実施例１と同様に測定した。結果を表２に示す。表
２から、CyDTA 、DHEG、EDDA、EDTA、EGTA、 IDA又はNT
A がバックグランド発光の低減効果を有し、しかもペル
オキシダ−ゼの酸化作用を妨害しないことがわかる。
酸化水素、0.5mM ルミノールNa塩及び0.1mM の表２に示
した化合物を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）溶液
を調製し、250 アトモル（10μl ）の西洋ワサビペルオ
キシダ−ゼ溶液を添加した。添加後30秒から1 分間の発
光を実施例１と同様に測定した。結果を表２に示す。表
２から、CyDTA 、DHEG、EDDA、EDTA、EGTA、 IDA又はNT
A がバックグランド発光の低減効果を有し、しかもペル
オキシダ−ゼの酸化作用を妨害しないことがわかる。
【００２７】
【表２】
【００２８】実施例３ 表３に示した化合物を0.1mM 又は1mM 濃度で使用した以
外は実施例１と同様の操作を行い、バックグランド低減
効果を調査した。結果を表３に示す。なお表３において
ADA はN-(2-acetoamido)iminodiacetic acidを、DSはDe
xtran Sulfatesodiumを、MOPSは3-(N-Morpholino)Propa
ne-sulfonic Acid を、2,2Bipy は2,2Bipyridy を、ο-
Phnはο-Phenanthrolinをそれぞれ示す。なお、表３に
おいて、ADA 又はクエン酸は本発明の化合物としての性
質を満たすものすなわち前述の官能基又はその塩を構造
中に含み、且つ水酸基を有する芳香族炭化水素を構造中
に含まないキレ−ト作用を有する化合物である。
外は実施例１と同様の操作を行い、バックグランド低減
効果を調査した。結果を表３に示す。なお表３において
ADA はN-(2-acetoamido)iminodiacetic acidを、DSはDe
xtran Sulfatesodiumを、MOPSは3-(N-Morpholino)Propa
ne-sulfonic Acid を、2,2Bipy は2,2Bipyridy を、ο-
Phnはο-Phenanthrolinをそれぞれ示す。なお、表３に
おいて、ADA 又はクエン酸は本発明の化合物としての性
質を満たすものすなわち前述の官能基又はその塩を構造
中に含み、且つ水酸基を有する芳香族炭化水素を構造中
に含まないキレ−ト作用を有する化合物である。
【００２９】表３からは、ADA 、クエン酸又はDSを添加
した場合に、無添加又はその他を添加した場合と比較し
て明らかにバックグランド発光が低減されていることが
わかる。
した場合に、無添加又はその他を添加した場合と比較し
て明らかにバックグランド発光が低減されていることが
わかる。
【００３０】
【表３】
【００３１】実施例４ 実施例３において使用したADA 、DS及びクエン酸につい
て、これら化合物が実際にペルオキシダ−ゼの触媒作用
を妨害しないか否か試験した。
て、これら化合物が実際にペルオキシダ−ゼの触媒作用
を妨害しないか否か試験した。
【００３２】0.2mM ４−フェニルフェノール、1.0mM 過
酸化水素、0.5mM ルミノールNa塩及び0.1mM の表４に示
した化合物を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）溶液
を調製し、250 アトモル（10μl ）の西洋ワサビペルオ
キシダ−ゼ溶液を添加し、添加後30秒から1 分間の発光
を実施例１と同様に測定した。結果を表４に示す。
酸化水素、0.5mM ルミノールNa塩及び0.1mM の表４に示
した化合物を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）溶液
を調製し、250 アトモル（10μl ）の西洋ワサビペルオ
キシダ−ゼ溶液を添加し、添加後30秒から1 分間の発光
を実施例１と同様に測定した。結果を表４に示す。
【００３３】表４から、本発明の化合物であるADA 及び
クエン酸はバックグランド発光の低減効果を有し、かつ
ペルオキシダ−ゼの酸化作用を妨害しないことがわかる
が、DSではバックグランド発光の低減効果が認められる
もののペルオキシダ−ゼの酸化作用をも妨害しているこ
とがわかる。
クエン酸はバックグランド発光の低減効果を有し、かつ
ペルオキシダ−ゼの酸化作用を妨害しないことがわかる
が、DSではバックグランド発光の低減効果が認められる
もののペルオキシダ−ゼの酸化作用をも妨害しているこ
とがわかる。
【００３４】
【表４】
【００３５】実施例５ 甲状腺刺激ホルモン（TSH ）に対するモノクローナル抗
体をペプシン消化してＦ（ａｂ）’2 化した後、ゲルろ
過及び疎水クロマトグラフにより精製し、ジチオスレイ
トールにより還元してＦａｂ化した。Ｆａｂ化フラグメ
ントはゲルろ過により精製し、これにＳＭＣＣ（Succin
imidyl4 -(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxyl
ate ）で修飾した西洋ワサビペルオキシダーゼを加え37
℃で1 時間反応させた後、ゲルろ過により酵素標識抗体
（コンジュゲート）画分を分取した。
体をペプシン消化してＦ（ａｂ）’2 化した後、ゲルろ
過及び疎水クロマトグラフにより精製し、ジチオスレイ
トールにより還元してＦａｂ化した。Ｆａｂ化フラグメ
ントはゲルろ過により精製し、これにＳＭＣＣ（Succin
imidyl4 -(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxyl
ate ）で修飾した西洋ワサビペルオキシダーゼを加え37
℃で1 時間反応させた後、ゲルろ過により酵素標識抗体
（コンジュゲート）画分を分取した。
【００３６】分取したコンジュゲートはUV280nm の吸収
を測定した後、4 ℃にて保存した。反応容器に抗TSH Ｆ
（ａｂ)2化抗体を固相化した磁性ビーズ（φ＝1.4mm ）
12個を入れ、これにTSH ゼロ血清又は既知濃度（4.81μ
IU／ml）血清100 μl を加え、37℃5 分間撹拌しながら
反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行い、0.1M NaCl 、50mMト
リス緩衝液、0.5 ％Tween 20（pH8.5 ）を含む溶液で洗
浄し、先に調製したコンジュゲート（希釈液にて200 倍
希釈したもの）100 μl 加え、更に37℃10分間反応させ
た。次いでＢ／Ｆ分離後洗浄を5 回行った後、発光検出
器（アロカ社製ＢＬＲ−３０１）にセットし、0.2mM 4-
Phenylphenol、1.0mM 過酸化水素、0.5mM ルミノ−ルNa
塩、0.1mM CyDTA 、0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）を
含む発光試薬200 μl を加え、添加後30秒から1 分間の
発光量を実施例１と同様にして積算した。なお測定は、
同一の被検液について5 回ずつ行った。測定結果（平均
値、標準偏差、変動値、２ＳＤ法による検出下限界濃度
を表５に示す。
を測定した後、4 ℃にて保存した。反応容器に抗TSH Ｆ
（ａｂ)2化抗体を固相化した磁性ビーズ（φ＝1.4mm ）
12個を入れ、これにTSH ゼロ血清又は既知濃度（4.81μ
IU／ml）血清100 μl を加え、37℃5 分間撹拌しながら
反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行い、0.1M NaCl 、50mMト
リス緩衝液、0.5 ％Tween 20（pH8.5 ）を含む溶液で洗
浄し、先に調製したコンジュゲート（希釈液にて200 倍
希釈したもの）100 μl 加え、更に37℃10分間反応させ
た。次いでＢ／Ｆ分離後洗浄を5 回行った後、発光検出
器（アロカ社製ＢＬＲ−３０１）にセットし、0.2mM 4-
Phenylphenol、1.0mM 過酸化水素、0.5mM ルミノ−ルNa
塩、0.1mM CyDTA 、0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）を
含む発光試薬200 μl を加え、添加後30秒から1 分間の
発光量を実施例１と同様にして積算した。なお測定は、
同一の被検液について5 回ずつ行った。測定結果（平均
値、標準偏差、変動値、２ＳＤ法による検出下限界濃度
を表５に示す。
【００３７】表５からCyDTA 添加系のＳ／Ｎ比（陽性血
清での発光量／ゼロ血清の発光量）は851 であるのに対
し、CyDTA 非添加系でのＳ／Ｎ比は147 であり、Ｓ／Ｎ
比的に約6 倍改善されたことがわかる。またCyDTA を添
加した場合の検出下限界濃度は0.004 であるのに対し、
これを添加しなかった場合では0.017 であり、検出下限
界濃度も約6 倍改善されたことがわかる。
清での発光量／ゼロ血清の発光量）は851 であるのに対
し、CyDTA 非添加系でのＳ／Ｎ比は147 であり、Ｓ／Ｎ
比的に約6 倍改善されたことがわかる。またCyDTA を添
加した場合の検出下限界濃度は0.004 であるのに対し、
これを添加しなかった場合では0.017 であり、検出下限
界濃度も約6 倍改善されたことがわかる。
【００３８】
【表５】
Claims (1)
- 【請求項１】 ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジオ
ン誘導体を酸化剤存在下、ヘム又はペルオキシダ−ゼで
処理することで生じる発光を、以下の化式１〜４（但し
ＸはＨ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ｎ＝１〜３）で示される官能
基又はその塩を構造中に含み、且つ水酸基を有する芳香
族炭化水素を構造中に含まない、キレ−ト作用を有する
化合物の１種以上の共存下で測定することを特徴とす
る、ヘム又はペルオキシダ−ゼの測定におけるバックグ
ランド発光の低減法。 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22101893A JPH0767696A (ja) | 1993-09-06 | 1993-09-06 | バックグランド発光の低減法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22101893A JPH0767696A (ja) | 1993-09-06 | 1993-09-06 | バックグランド発光の低減法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767696A true JPH0767696A (ja) | 1995-03-14 |
Family
ID=16760199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22101893A Pending JPH0767696A (ja) | 1993-09-06 | 1993-09-06 | バックグランド発光の低減法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0767696A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7078181B2 (en) | 2000-06-09 | 2006-07-18 | Promega Corporation | Kits for increasing luminescence assay sensitivity |
| US7879540B1 (en) | 2000-08-24 | 2011-02-01 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
| US8008006B2 (en) | 2004-09-17 | 2011-08-30 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
| JP2014039486A (ja) * | 2012-08-21 | 2014-03-06 | Eiken Chemical Co Ltd | Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸を用いる発光増強方法 |
-
1993
- 1993-09-06 JP JP22101893A patent/JPH0767696A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7078181B2 (en) | 2000-06-09 | 2006-07-18 | Promega Corporation | Kits for increasing luminescence assay sensitivity |
| US7108996B2 (en) | 2000-06-09 | 2006-09-19 | Promega Corporation | Method for increasing luminescence assay sensitivity |
| US7118878B1 (en) | 2000-06-09 | 2006-10-10 | Promega Corporation | Method for increasing luminescence assay sensitivity |
| US7879540B1 (en) | 2000-08-24 | 2011-02-01 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
| US7906282B2 (en) | 2000-08-24 | 2011-03-15 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
| US8008006B2 (en) | 2004-09-17 | 2011-08-30 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
| JP2014039486A (ja) * | 2012-08-21 | 2014-03-06 | Eiken Chemical Co Ltd | Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸を用いる発光増強方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU727445B2 (en) | Detection of organic compounds through regulation of antibody-catalyzed reactions | |
| US7563566B2 (en) | Stabilization of H2O2 under alkaline conditions for use in luminescence, fluorescence and colorimetric assays for enhanced detection of peroxidase type assays | |
| JP5171958B2 (ja) | カスケード酵素免疫測定法 | |
| CN114236122A (zh) | 试剂盒及其制备方法和应用 | |
| US20090111091A1 (en) | Specimen pretreatment liquid, kit for measuring virus, and method for detecting virus | |
| CN110865182B (zh) | 一种阻断剂及其在免疫检测中的应用 | |
| US5948630A (en) | Method and composition for reducing the effects of endogenous alkaline phosphatase | |
| JPH0767696A (ja) | バックグランド発光の低減法 | |
| CA1134744A (en) | Peroxidase determination by emission of light | |
| US7067275B2 (en) | Bioanalytical measuring method for determining catalases and peroxidases, as well as conjugates, substrates, activators and inhibitors thereof | |
| JPS5852640B2 (ja) | ペルオキシダ−ゼ活性の測定方法 | |
| JP5997446B2 (ja) | 甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬およびその用途 | |
| JP6182896B2 (ja) | イムノアッセイ方法 | |
| EP0682254A1 (en) | Enzyme linked chemiluminescent assay | |
| JP2533236B2 (ja) | カルシウムイオン測定用試薬 | |
| JP3315775B2 (ja) | 標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析方法 | |
| JP3746381B2 (ja) | 化学発光酵素免疫測定方法 | |
| JP2002323495A (ja) | 標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析方法 | |
| JP3815905B2 (ja) | 酵素免疫測定法 | |
| JPH07170999A (ja) | カルシウムイオン測定用試薬 | |
| KR20250016161A (ko) | TRACP-5b 의 측정 방법 및 그것을 위한 키트 | |
| JPS6340857A (ja) | Ｓｈ化合物の定量方法 | |
| JP3745112B2 (ja) | 化学発光酵素免疫測定方法 | |
| SELF et al. | Enzyme amplification: A means to develop fast ultrasensitive | |
| JPH0739393A (ja) | ペルオキシダーゼ及びそれと同等な触媒作用を有する物質の定量方法 |