JPH0739437B2 - 抗菌性のペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、バクテリオシンであ
るペプチドに関するものである。特にこの発明は、特定
のアミノ酸配列を有する化学的に純粋な形のものであっ
て、ペジオコックス・アシディラクティシィ（Ｐｅｄｉ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）ＮＲＲＬ
−Ｂ−１８０５０から単離されるバクテリオシンより抽
出されるペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ブフニア等（Ｂｈｕｎｉａ，Ａ．Ｋ．
ｅｔ ａｌ：Ｊ． Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏ． ２，
３１９−３２２（１９８７）、及びＢｈｕｎｉａ，Ａ．
Ｋ．ｅｔ ａｌ：Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂａｃｔ ６５，
２６１−２６８（１９８８））はペジオコックス・アシ
ディラクティシィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄ
ｉｌａｃｔｉｃｉ）株Ｈがバクテリオシン、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ法によって測定された分子量が約２７００Ｄａ
（Ｂｈｕｎｉａ，１９８８）であるペジオシン（Ｐｅｄ
ｉｏｃｉｎ）Ｈ、を生産したと報告している。しかし報
告されている活性スペクトルはスタフィロコックス・ア
ウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ）のものを含み、本発明に係るバクテリオシンの特性
と異なる。

【０００３】タグ等はバクテリオシンを分類している
（Ｔａｇｇ，Ｊ．Ｒ． ｅｔ ａｌ：Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ． Ｒｅｖ．４０，７２２−７５６（１９７６））。
ランチバイオチック類（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）
は、グラム陽性菌のバクテリオシンの部類のものであ
る。それはランチオニン架橋とデヒドロアラニン残基と
の存在を特徴としている。また小さな塩基性タンパク質
である。増殖培地から単離された本発明のバクテリオシ
ンはアミノ酸側鎖の何れの翻訳後修飾も示さず、したが
って寸法と電荷においてはランチバイオチック類タンパ
ク質の特性と一致するけれどもランチバイオチックとし
て分類しえないものである。またランチバイオチック類
のいくつかについてそのアミノ酸配列が知られている
が、同配列は本発明のバクテリオシンのアミノ酸配列に
類似していない。

【０００４】フーバー等（Ｈｏｏｖｅｒ，Ｄ．Ｇ． ｅ
ｔ ａｌ：Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ． ５１，２９−
３１（１９８８））は、以下ＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０
と記載するものと本質的に同一のものであるペジオコッ
クス・アシディラクティシィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ
ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）ＮＲＲＬ−Ｂ−５６２７
を含む発酵ソーセージから単離された複数のペジオコッ
クス株中の５．５ＭＤａに関連したバクテリオシン活性
について、報告している。グラハムとマクケィ（Ｍｃｋ
ａｙ）（Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．Ｃ． ｅｔ ａｌ：Ａｐｐ
ｌ． Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏ． ５０，５３２−５３４
（１９８５））はバクテリオシンの生産を、ペジオコッ
クス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅ
ｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＦＢＢ−６３中の１０．５ＭＤａ
プラスミドと関連させている。デッセルとクレンハマー
（Ｄａｅｓｃｈｅｌ，Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ｋｌａｅｎｈ
ａｍｍｅｒ，Ｔ．Ｒ．：Ａｐｐｌ． Ｅｎｖ． Ｍｉｃ
ｒｏ． ５０，１５３８−１５４１（１９８５））は、
ペジオコックス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＦＢＢ−６１及びＬ７
２３０中のバクテリオシン生産情報は１３．６ＭＤａプ
ラスミドによってエンコードされていると、報告してい
る。これらのバクテリオシンは何れも、精製して配列決
定をすることをされていない。バクテリオシンは精製に
よって構造上の変化を受け易いことからして、精製が困
難である。

【０００５】ペジオコックス・アシディラクティシィ
（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃ
ｉ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０由来のバクテリオシン
は、ゴンザレツ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）の米国特許Ｎｏ．
４，８８３，６７３に記載されているように公知であ
る。生産された本バクテリオシンは、増殖培地中におい
ても増殖培地から硫酸アンモニウム沈澱法で抽出した後
でも不純な形のものであった。精製バクテリオシンは約
３２，０００ＡＵ／ｍｌまでの活性度を有していた。こ
のバクテリオシンは純粋でないと検定された。また本バ
クテリオシンは１９８８年１月２５日付のバンデンバー
グ（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈ）の米国特許出願Ｎｏ．０
７／１４８，０４４に記載されているように（特開平２
−５８４５号公報参照）、約１６，５００の見掛の分子
量をもつと、測定された。問題は本バクテリオシンがな
お不純のものであることからして、化学的な合成手段に
よって合成できない点にあった。不純物の存在からし
て、不純なバクテリオシンの使用にあたり様々な結果が
生じていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがってこの発明の
目的とするところは、ペプチドであるところの純粋で化
学的に特定されたバクテリオシンを提供するにある。ま
たこの発明は、化学合成法によって製造可能であるペプ
チドを提供することも目的とする。他の目的は以下の記
述と本発明ペプチドのトリプシン消化によるフラグメン
トのアミノ酸配列を示す図１とを参照することによっ
て、明白に理解される。

【０００７】

【一般的な説明】この発明は、アミノ酸配列が Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ− １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ− １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １８ Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ− １９ ２０ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５ ２６ ２７ Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ− ２８ ２９ ３０ ３１ ３２ ３３ ３４ ３５ ３６ Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ ３７ ３８ ３９ ４０ ４１ ４２ ４３ ４４ であって、Ｃｙｓ９とＣｙｓ１４間及びＣｙｓ２４とＣ
ｙｓ４４間にジスルフィド結合を有するペプチドに係
る。

【０００８】本発明のペプチドは４６２９の分子量を有
し、この分子量は増殖培地から抽出されたままの不純な
バクテリオシンの見掛けの分子量の約１／３である。本
バクテリオシンは約５０，０００ＡＵ／ｍｌのＡＵ値を
有し、これは不純なバクテリオシンのＡＵ値よりもずっ
と高い。

【０００９】本発明のペプチドは、化学的な手段によっ
て合成することができる。固相ペプチド合成法（ＳＰＰ
Ｓ）は、個々のアミノ酸を特定の配列で化学的に結合す
ることによってペプチドを合成する方法である。本方法
はＣｈｅｍ． Ａｎａｌ．Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．第１０章、５０７−５３４頁（１９８３
年発行）に記載されている。合成は固体支持体に対し共
有的に取付けられたＣ末端アミノ酸から開始される。次
のアミノ酸がＣ末端アミノ酸位置で活性化されＮ末端で
の反応を阻止されて、第２のアミノ酸のＣ末端と第１の
アミノ酸のＮ末端との間で共有結合（ペプチド結合の形
成）が生じる。結合の完了後に第２のアミノ酸のＮ末端
が保護解除され、第３のアミノ酸から合成サイクルが再
開される。最終のアミノ酸（ペプチドのＮ末端）の付加
後にペプチドを固体支持体から脱離させ、種々の側鎖保
護を除去する。

【００１０】ＳＰＰＳの当初のメリフィールド（Ｍｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄ）法では固体支持体は普通、スチレンと
ジビニルベンゼンとのクロロメチル化共重体である。こ
の支持体からの脱離によってＣ末端で遊離酸基が与えら
れる。ペプチドアミドの製造には４−メチル−ベンジル
ヒドラミン樹脂が用いられる。結合中におけるＮ末端の
保護はｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢＯＣ）基によって
得られる。この保護基は無水の塩酸を用いて除去され、
生じる塩酸アミンはトリエチルアミンを用いて中和され
る。次のｔ−ＢＯＣアミノ酸がジシクロヘキシルカルボ
ジィミドまたはジイソプロピルカルボジィミドを用いて
活性化され、先のアミノ酸へ結合される。この過程は各
次のアミノ酸に対し繰返される。ペプチド−樹脂の切断
と側鎖の保護解除は無水のフッ酸を用いて同時に行なわ
れ、ペプチドまたはペプチドアミドが与えられる。

【００１１】メリフィールド法に対する改良は、低収率
を生じさせる特定の問題を解決することに向けられてい
る。不十分な収率は、長い配列を有するペプチドの製造
を制約する主な要因である。このような改良の一例は、
９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護
基の使用である。Ｆｍｏｃ保護基は、ピペリジンのよう
なアミンを用いる処理によって除去される酸安定基を附
与する。Ｆｍｏｃを用いることにより、保護解除を酸で
はなく塩基を用いて行なえることからして収率を改善で
きる。当初のメリフィールド法における酸保護解除剤の
使用はペプチド−樹脂結合の尚早な切断をもたらし、収
率の低下を招いていた。

【００１２】

【詳細な説明】本発明に係るバクテリオシンＰＡ−１を
相当の努力と数多くの失敗を重ねた後に、ゲル濾過法と
イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相液体クロマト
グラフィーによって均一質のものに精製した。ＰＡ−１
のアミノ酸配列は、ペジオコックス・アシディラクティ
シィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉ
ｃｉ）ＰＡＣ１．０中のバクテリオシン活性に関連す
る。６．２メガダルトンプラスミドのＤＮＡ配列の読取
り枠に対応することを見出した。配列データからしてＰ
Ａ−１は、４６２９ダルトンの分子量を有する塩基性タ
ンパク質であると結論された。４個のシスティン残基の
存在からして、２個のジスルフィド架橋が存在する可能
性が浮び上った。トリプシン処理フラグメントの分析に
よってＣｙｓ−９とＣｙｓ−１４間、及びＣｙｓ−２４
とＣｙｓ−４４間にジスルフィド結合が存在することが
示された。精製バクテリオシンは後述するようにリステ
リア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏ
ｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）その他の細菌に対し活性であっ
た。

【００１３】

【実施例１】増殖培地、バクテリオシンの生産、及び活
性の測定：ＭＲＳブロス（アメリカ合衆国、ミシガン
州、デトロイトのＤｉｆｃｏ社製）中で生育させたＰＡ
Ｃ１．０株の８時間齢培養物の１容量％を、４％の酵母
エキス（英国、バシングストークのＯｘｏｉｄ社製）を
補充したＭＲＳブロスの１リットルに植菌し、３５℃で
１８時間静置培養した。４℃において１５分間、１６，
３００×ｇで遠心分離処理して細胞を除去した。上澄液
を０．２０ミクロンのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
社製）で濾過し、使用するまで−２０℃で凍結して保存
した。バクテリオシンの生産を、ペジオコックス・ペン
トサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａ
ｃｅｕｓ）ＦＢＢ６３指示細胞を植菌した軟寒天被覆の
ＭＲＳ平板上に５μｌの系列２倍希釈物を滴下すること
によって、検定した。１ＡＵは指示細胞の密生地中に明
白な抑制領域を生じさせる最高希釈物の５ｍｌと定義さ
れている。

【００１４】ＰＡ−１の精製：上澄液をゲル濾過に先立
ち、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．０へと中和し
た。中和上澄液の４５０ｍｌ画分を、０．０５Ｍの２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（アメ
リカ合衆国、オハイオ州、クリーブランドのＲｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社製）、ｐＨ６．０に対し平
衡化したＳｐｅｃｔｒａ／Ｇｅｌ ＡｃＡ ２０２（登
録商標）ゲル濾過樹脂（アメリカ合衆国、カリホルニア
州、ロスアンゼルスのＳｐｅｃｔｒｕｍ社製）の５ｃｍ
×５５ｃｍカラムにかけた。同じ緩衝液を用いて活性物
を溶出した。最初に溶出液を完全に排出させ、引続いて
６回の完全排出を繰返えした。活性分画を集め、０．０
５ＭのＭＥＳ，ｐＨ６．０に対し再平衡化した２．５ｃ
ｍ×９０ｃｍのＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標名）コ
ラム（アメリカ合衆国、ニュージャージー州、ピスカタ
ウエイのＰｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけた。活性物
を、１Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０５ＭのＭＥＳ，
ｐＨ６．０により直線グラジェント溶出した。活性留分
を集め、１００Ｄａ分子量を遮断する透析管（Ｓｐｅｃ
ｔｒａ−Ｐｏｒ６−商標名。前出のＳｐｅｃｔｒｕｍ社
製）を用いて１０倍過剰量の水に対し透析した。透析物
の体積を、固体の２０ＫＤａポリエチレングリコール
（Ｃａｒｂｏｗａｘ（カーボワックス）−商標名。Ｕｎ
ｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ社製）に対し透析管を直接にさ
らすことによって１２分の１に減少させ、さらに次いで
真空遠心分離（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ−商標名。アメリカ
合衆国、ニュージャージー州、ファーミングデールのＳ
ａｖａｎｔ社製）によって３．５分の１に減らした。濃
縮されたＰＡＣ−１を、０．１％のトリフルオロ酢酸で
平衡化した１．０ｃｍ×２５ｃｍＣ１８逆相カラム（ア
メリカ合衆国、カルホルニア州、ヘスペリアのＶｙｄａ
ｃ社製）にかけた。活性物を４５％のアセトニトリルに
より、１．５ｍｌ／分の速度で３０分間、直線グラジエ
ント溶出した。活性画分を、ペジオコックス・ペントサ
セウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅ
ｕｓ）ＦＢＢ６３の細胞を含む軟寒天被覆のＭＲＳ平板
上に直接に滴下することにより検定した。活性画分を真
空遠心分離によって乾燥し、−２０℃で貯蔵した。

【００１５】

【実施例２】精製バクテリオシンの分析

【００１６】アミノ酸の分析：加水分解試料を、真空脱
水による乾燥、０．１ｍｌの６ＮＨＣｌ中への再懸濁、
再乾燥、及びＲｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ（商標名）加熱
ブロック（アメリカ合衆国、イリノイ州、ロックフォー
ドのＰｉｅｒｃｅ社製）内で２４時間、真空中１００℃
におき８ｍｍ×６０ｍｍの加水分解管（上出のＰｉｅｒ
ｃｅ社製）中で加水分解することによって得た。Ｐｉｃ
ｏ−Ｔａｇ誘導体化システム（アメリカ合衆国、マサチ
ュウセッツ州、ミルフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の
Ｗａｔｅｒｓ事業部製）を用いその指示に従ってイソチ
オシアン酸フェニル（ＰＩＴＣ）誘導体を生成させ、こ
のＰＩＴＣ誘導体を、逆相カラムとして附属のＰｉｃｏ
−Ｔａｇカラムの代りに０．４５ｃｍ×２５ｃｍのＣ１
８カラム（前出のＶｙｄａｃ社製）を用いた点を除いて
はＰｉｃｏ−Ｔａｇプロトコールに従って２５４ｎｍで
検出した。

【００１７】アミノ酸の配列決定：配列情報を、気相シ
ーケンサー（ｇａｓ ｐｈａｓｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）
ＡＢＩ ４７５Ａ（アメリカ合衆国、カリホルニア州、
フォスター・シティのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｉｎｃ．製）を用いＡＢＩによって提供された
プロトコールに従って取得した。Ｃ末端領域の配列を決
定するためにタンパク質を先ずＭｅｔ−３１で、８０％
のギ酸中に２ｍｇ／ｍｌのブロモシアン溶液を加えたも
のによって常温で１晩おくことにより切断した。配列情
報は残基１及び３２で同時に取得され始めた。

【００１８】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動：
ゲルを、アクリルアミドの１２．５％の固定濃度或は１
０％から２５％までの直線的な濃度勾配として調整し
た。架橋剤はピペラジンジアクリルアミド（アメリカ合
衆国、カルホルニア州、リッチモンドのＢｉｏＲａｄ社
製）を用いた。ゲルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌ
ｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ及び次いでの銀染色（上出の
ＢｉｏＲａｄ社製）によって染色するか、或は指示株Ｆ
ＢＢ−６３細胞を含む軟寒天でゲルを覆うことにより活
性分析を行なう（Ｂｈｕｎｉａ，１９８７）ために染色
しなかった。

【００１９】ジスルフィド結合の帰属：ＰＡ−１の配列
中に４個のシスティン残基が存在することからして、２
個のジスルフィド結合が存在する可能性がある。エルマ
ン試薬（Ｅｌｌｍａｎ′ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）（ＤＴＮ
Ｂ。Ｓｉｇｍａ社製）を用いた遊離スルフヒドリル残基
の検定によって遊離スルフヒドリル基が存在しないこと
が示され、ＰＡ−１中には２個のジスルフィド結合が存
在すると結論された。これらのジスルフィド連鎖中に含
まれるシスティン残基の特定については後に述べる。

【００２０】ＰＡ−１の配列中おけるリジン残基の分布
は、トリプシン消化物が単独のシスティン残基を含む３
個のペプチドフラグメントを提供するといったものであ
る。トリプシン消化によって生成されるジスルフィド結
合ペプチドは、還元されて成分フラグメントを生じさせ
る。各フラグメントのアミノ酸分析を配列データからの
計算値と比較して、トリプシン処理ペプチドについての
フラグメントの特定が行なわれる。この方法でジスルフ
ィド結合配置の明白な帰属を決定できる。

【００２１】トリプシンによるＰＡ−１の切断によって
表１（図１も参照）に示すように、３個のペプチド鎖と
２個の単独アミノ酸が生成すると予測される。表１及び
後掲の表２、表４において略記号は次の通りである。Ｄ
＝Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｎ＝Ａｓｎ（アスパラギ
ン）、Ｅ＝Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｑ＝Ｇｌｎ（グル
タミン）、Ｈ＝Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｒ＝Ａｒｇ（ア
ルギニン）、Ｔ＝Ｔｈｒ（トレオニン）、Ａ＝Ａｌａ
（アラニン）、Ｐ＝Ｐｒｏ（プロリン）、Ｙ＝Ｔｙｒ
（チロシン）、Ｖ＝Ｖａｌ（バリン）、Ｍ＝Ｍｅｔ（メ
チオニン）、Ｃ＝Ｃｙｓ（システィン）、Ｉ＝Ｉｌｅ
（イソロイシン）、Ｌ＝Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｆ＝Ｐｈ
ｅ（フエニルアラニン）、Ｋ＝Ｌｙｓ（リジン）、Ｗ＝
Ｔｒｐ（トリプトファン）。

【００２２】

【表１】 トリプシンによる切断フラグメント 配列 注釈 Ｋ Ｔ１ ＹＹＧＮＧＶＴＣＧＫ Ｃｙｓ−９ Ｔ２ ＨＳＣＳＶＤＷＧＫ Ｃｙｓ−１４ Ｔ３ ＡＴＴＣＩＩＮＮＧＡＭＡＷＡＴＧＧＨＱＧＮＨＫ Ｃｙｓ−２４ Ｃ Ｃｙｓ−４４

【００２３】トリンプシン消化を、５０μｇの精製ＰＡ
−１を１重量％のトリプシン（ＴＰＣＫｏ Ｓｉｇｍａ
社製）と３７℃で１晩、０．１ｍＭの塩化カルシウムを
含む５０μｌ，ｐＨ８の炭酸水素アンモニウム緩衝液中
で反応させることによって行なった。反応混合物を４．
５×２５ｃｍのＣ−１８逆相カラム（前出のＶｙｄａｃ
社製）にかけた。２２０ｎｍでの吸収を監視することに
よりピークを検出した。

【００２４】真空中１１０℃での６Ｎ ＨＣｌを用いた
１晩の蒸気相加水分解後にアミノ酸分析を実施した。Ｐ
ＴＣアミノ酸誘導体を、７０％のエタノール中で１０％
のＰＩＴＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と反応させることによ
り作成した。ＰＴＣアミノ酸の分析を、酢酸ナトリウム
−アセトニトリル溶媒を用いて０．４５×１５ｃｍの逆
相Ｃ−１８カラム（Ｖｙｄａｃ社製）で実施した。アミ
ノ酸加水分解物標準品を、前出のＰｉｅｒｃｅ社から購
入した。

【００２５】粗トリプシン消化物を逆相ＨＰＬＣカラム
にかけ、アセトニトリルを用いて溶出した。表２に示す
ように２つの主なピーク（ピーク７及び１０）が得ら
れ、さらに試験するために単離した。２つのピークのそ
れぞれからの試料を還元し、還元産物を逆相ＨＰＬＣに
よって分離した。ピーク７のペプチドフラグメントの還
元によっては２つのピークが得られ、同ペプチドフラグ
メントがジスルフィド結合によって結び付いた２個のペ
プチドから成るものであったことが示された。アミノ酸
分析の結果はピーク７ａの組成がペプチドＴ１の算出組
成と一致し、ピーク７ｂの組成がペプチドＴ２の算出組
成と一致することを示した。また非還元のピーク７は、
７ａと７ｂの合計とのみならずＴ１とＴ２の合計とも合
致した。Ｔ１とＴ２がジスルフィド結合によって連結さ
れていることからして、本結合はＴ１からのＣｙｓ−９
とＴ２からのＣｙｓ−１４間に存在するに相違ない。

【００２６】

【表２】

【００２７】したがって第２のジスルフィド結合はＣｙ
ｓ−２４とＣｙｓ−４４間に存在するに違いない。この
第２の結合の還元によっては、Ｃｙｓ−４４に対するペ
プチド結合がトリプシン切断によって開裂することから
してクロマトグラム中に単独のピークのみを生ぜしめさ
せることになろう。２２０ｎｍでの検出はペプチド結合
に対しては感応するが、単独のアミノ酸に対してはそう
でない。ピーク１０を還元し再クロマトグラフィーし
て、単一のピークを得た。アミノ酸分析によりトリプシ
ン消化によるフラグメントＴ３との強い類似性が示され
た。フラグメントＴ３がＣｙｓ−２４を含むことから、
このフラグメントの還元物が複数ピークを生じさせたと
すればＣｙｓ−９或はＣｙｓ−１４に対するジスルフィ
ド結合が検出されたということによる。還元後に単一の
ピークが得られたことからして、Ｃｙｓ−２４はＣｙｓ
−４４に対しジスルフィド結合していると認められる。

【００２８】Ｔ１に対応するペプチド７ａは、１個を越
えるリジン残基を含むかのように思わせる。非還元のペ
プチド７も、２ではなく２．６モルのリジンを含むかの
ように明白な矛盾を示す。これらの結果は、Ｎ末端リジ
ン残基がトリプシンの作用に対し耐性であることによっ
て説明できる。これはＮ末端が、折りたたみによって移
動性が阻害されうるけれども自由に移動可能な領域であ
ることが多いことから実際上、驚くべき結果ではない。
Ｎ末端リジン残基はこの移動性によって、トリプシンに
対し結合するのが困難となりうる。またアミノ末端アミ
ノ基はｐＨ８で若干正に帯電しえ、これによってもトリ
プシンとの結び付きが抑制されうる。

【００２９】粗細菌培養地をＡｃＡ２０２ゲル濾過樹脂
で処理し、バクテリオシン活性分を最初カラムの全容積
について溶出し、次いで数回のカラム全容積についての
溶出を繰返えした。このゲル濾過媒体の遮断寸法が２０
ＫＤａであることからして、粗培地中のＰＡ−１活性分
の見掛けの分子量はほぼ２０ＫＤａである。この結果は
また、１０ＫＤａメンブレンを用いた接線流濾過（ｔａ
ｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）中、及び６
ＫＤａの繊維孔径のものを用いる中空繊維膜濾過（ｈｏ
ｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
中にも観察された。全ての場合に粗培地中のＰＡ−１活
性は、１０ＫＤａよりも大きな見掛け分子量と関連して
いた。以前のゲル濾過についての研究時に精製ＰＡ−１
は、検量したゲル濾過カラムから見掛け分子量１６，５
００で溶出した。カチオン交換樹脂からの溶出及び透析
後にＰＡ−１活性分は、ＡＣ２０２カラムからずっと遅
く溶出する。表３は種々の留分の活性度を示している。

【００３０】

【表３】 ペジオシンＰＡ−１の精製 精製法 比活性度 収率（％） 精製比 上澄液 １０７ １００ １ ゲル濾過 １６６ ５０ ２．２ イオン交換 １３３０ ９．４ １２．５ 透析 ６７００ ７．０ ６３ ＨＰＬＣ ５００００ ０．６ ４７０

【００３１】性格付け：ＰＡ−１のアミノ酸分析の結果
を表４に、配列決定により得られたアミノ酸含有量と共
に示す。トリプトファンについては分析していない。エ
ルマン試薬（ＤＴＮＢ。Ｓｉｇｍａ社製）を用いた遊離
システィン残基の滴定によって、遊離の滴定可能なスル
フヒドリル残基は何ら顕示されない。

【００３２】

【表４】

【００３３】ジスルフィド結合の帰属：ＰＡ−１のトリ
プシン消化フラグメントのＨＰＬＣを用いた分離によ
り、４つの主なピークが与えられた。最初の溶出ピーク
分は還元すると、ＨＰＬＣによる２つのピークを生じさ
せた。これらの２つのピーク分のアミノ酸分析によって
２個のトリプシン消化フラグメントＴ１及びＴ２のアミ
ノ酸組成との強い類似性が示された。このことは、ジス
ルフィド結合がＴ１のＣｙｓ−９とＴ２のＣｙｓ−１４
間に存在することの立派な証拠である。エルマン試薬を
用いた遊離スルフヒドリル基の分析はマイナスと出、し
たがってＣｙｓ−２４とＣｙｓ−４４間の第２のジスル
フィド結合が、遊離スルフヒドリル基の欠除からして証
明される。

【００３４】配列分析：チョウ−ファスマン（Ｃｈｏｕ
−Ｆａｓｍａｎ）法による一次配列分析によって構造
は、大部分がβターン及びランダムコイルから成ること
が示された。残基２１−２５はβシートをとる傾向を示
す。

【００３５】精製バクテリオシンは、ペジオコツクス・
アシディラクティシィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃ
ｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）株ＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０中
で発現するプラスミド上のバクテリオシン活性の遺伝子
産物から抽出される。本願で開示したアミノ酸配列に対
応するＤＮＡ配列は、バクテリオシン活性の発現に必要
であることが示されたプラスミド領域中の７．５ＭＤａ
の読取り枠中に存在する。配列データから分子量は４６
２９と算出された。この値は、標準のタンパク質を用い
ＳＤＳゲルからの移動度対ｌｏｇ分子量曲線で算出した
見掛けの分子量よりも小さかった。

【００３６】

【実施例４】バクテリオシンの細菌抑制活性：バクテリ
オシンは表５に掲げる菌株を抑制するのに有効であっ
た。

【００３７】

【表５】ＰＡ−１中のバクテリオシン精製物の細菌抑制
作用 菌株 抑制 ラクトバチルス・ビファメンタム ３５４０９ ＋ ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ ＮＣＩＢ４１１４ ＋ ラクトバチルス・カゼイ ８４２ ＋ ラクトバチルス・プランタラム ＷＳＯ ＋ クトバチルス・プランタラム ８０１４ ＋ ロイコノストック・デキストラニカム Ｌｄｅ１．０ ＋ ペジオコックス・アシディラクシイティ ２５７４２ ＋ ペジオコックス・ペントサセウス ＰＭＲ２５ ＋ ペジオコックス種（ハツカダイコンから単離） ＋ ペジオコックス種（マッシュルームから単離） ＋ エンテロコックス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、キャベツから単離） ＋ リステリア・モノサイトゲネス ＋ ラクトコックス・ラクチス ＭＬ３ −

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：ペジオコックス アシディラクティシィ（Ｐｅ
ｄｉｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ） 株名：ＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０ 個体名：ＰＡＣ１．０ 配列の特徴 特徴を表わす記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：分子量４６２９ 配列

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明に係るペプチドのトリプシン消化によ
るフラグメントのアミノ酸配列を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アミノ酸配列が Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ− １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ− １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １８ Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ− １９ ２０ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５ ２６ ２７ Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ− ２８ ２９ ３０ ３１ ３２ ３３ ３４ ３５ ３６ Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ ３７ ３８ ３９ ４０ ４１ ４２ ４３ ４４ であって、Ｃｙｓ９とＣｙｓ１４間及びＣｙｓ２４とＣ
   ｙｓ４４間にジスルフィド結合を有するペプチド。