JPH0740952B2 - 清澄化された澱粉加水分解物の製造方法およびそれに用いるのに適当な新規の酵素組成物 - Google Patents
清澄化された澱粉加水分解物の製造方法およびそれに用いるのに適当な新規の酵素組成物Info
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- JPH0740952B2 JPH0740952B2 JP61240223A JP24022386A JPH0740952B2 JP H0740952 B2 JPH0740952 B2 JP H0740952B2 JP 61240223 A JP61240223 A JP 61240223A JP 24022386 A JP24022386 A JP 24022386A JP H0740952 B2 JPH0740952 B2 JP H0740952B2
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C13—SUGAR INDUSTRY
- C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
- C13K1/00—Glucose; Glucose-containing syrups
- C13K1/06—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of starch or raw materials containing starch
- C13K1/08—Purifying
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、炭水化物源のある種の水溶液の改善された精
製方法、澱粉加水分解物、特小麦澱粉加水分解物の濾過
性の改善、それによって得られる濾過液の清澄さの改善
そしてかかる改善を達成するのに適する酵素組成物に関
する。
製方法、澱粉加水分解物、特小麦澱粉加水分解物の濾過
性の改善、それによって得られる濾過液の清澄さの改善
そしてかかる改善を達成するのに適する酵素組成物に関
する。
炭水化物源の水溶液は、天然に産する炭水化物含有物質
を処理して有用な生成物をもたらす工業界においてしば
しば出会うものである。かゝる処理の例には、炭水化物
を酵素により分解する工業的な反応またはかゝる分解を
化学的な作用に置き変えた類似の処理がある。かゝる処
理の生成物は、濾過によって分離される懸濁副生成物よ
り成る水溶液の状態でしばしば得られる。かゝる濾過に
おいて、濁った液から濾過液を得ることがしばしば困難
であることであるという問題にしばしば遭遇する。本発
明者は、これらの問題がある種のリン含有化合物が水溶
液中に存在することによって引き起こされることを発見
した。本発明はかゝる化合物を処理して、水溶液の濾過
性を改善する方法である。
を処理して有用な生成物をもたらす工業界においてしば
しば出会うものである。かゝる処理の例には、炭水化物
を酵素により分解する工業的な反応またはかゝる分解を
化学的な作用に置き変えた類似の処理がある。かゝる処
理の生成物は、濾過によって分離される懸濁副生成物よ
り成る水溶液の状態でしばしば得られる。かゝる濾過に
おいて、濁った液から濾過液を得ることがしばしば困難
であることであるという問題にしばしば遭遇する。本発
明者は、これらの問題がある種のリン含有化合物が水溶
液中に存在することによって引き起こされることを発見
した。本発明はかゝる化合物を処理して、水溶液の濾過
性を改善する方法である。
本発明者は、本発明の方法が特に、炭水化物が加水分解
法に委ねた澱粉である水溶液に適用できることを見出し
た。本発明の方法および方法条件が他の炭化水素から誘
導される水溶液に適用できるとはいえ、本発明の方法の
便宜の為に、この明細書では以降、澱粉について説明す
る。
法に委ねた澱粉である水溶液に適用できることを見出し
た。本発明の方法および方法条件が他の炭化水素から誘
導される水溶液に適用できるとはいえ、本発明の方法の
便宜の為に、この明細書では以降、澱粉について説明す
る。
澱粉はα−グルコシド結合によって互いに結合されたグ
ルコピラノース単位で形成された高分子量炭化水素であ
る。この重合体は加水分解によって分解され、低分子量
のオリゴ糖類および最終的には単量体単位のグルコーゼ
が得られる。この加水分解は酸、または酵素によって触
媒作用をされ得る。この酸およびα−アミラーゼはα−
Ｄ−（１−＞４）−グルコシド結合を加水分解すること
によって澱粉分子を多かれ少なかれ任意に分解する。β
−アミラーゼはその作用において更に特別なものであ
る。即ち、澱粉またはオリゴ糖類を直接的にマルトース
に分解する。一方、グルコアミラーゼはＤ−グルコース
（デキストリン）を分解することができる。脱枝酵素、
例えばプルラナーゼは、アミロペクチン澱粉成分の加水
分解を促進するのに用いることができる。
ルコピラノース単位で形成された高分子量炭化水素であ
る。この重合体は加水分解によって分解され、低分子量
のオリゴ糖類および最終的には単量体単位のグルコーゼ
が得られる。この加水分解は酸、または酵素によって触
媒作用をされ得る。この酸およびα−アミラーゼはα−
Ｄ−（１−＞４）−グルコシド結合を加水分解すること
によって澱粉分子を多かれ少なかれ任意に分解する。β
−アミラーゼはその作用において更に特別なものであ
る。即ち、澱粉またはオリゴ糖類を直接的にマルトース
に分解する。一方、グルコアミラーゼはＤ−グルコース
（デキストリン）を分解することができる。脱枝酵素、
例えばプルラナーゼは、アミロペクチン澱粉成分の加水
分解を促進するのに用いることができる。
いわゆる澱粉シロップは、酸および／または酸素加水分
解によって澱粉から生産されそして一般にデキストロー
スおよび／またはマルトースを三量体および他のDP20ま
たはそれ以上のオリゴマー（“DP"は“重合度”であ
り、以下においてはアラビア数字で分子中の単量体単位
の数で示す）と一緒に含有している澱粉加水分解物であ
る。この加水分解物は広い組成範囲を有し、多くは透明
でありそして、殆ど無色であるシロップを必要とする多
くの用途分野を持つ。
解によって澱粉から生産されそして一般にデキストロー
スおよび／またはマルトースを三量体および他のDP20ま
たはそれ以上のオリゴマー（“DP"は“重合度”であ
り、以下においてはアラビア数字で分子中の単量体単位
の数で示す）と一緒に含有している澱粉加水分解物であ
る。この加水分解物は広い組成範囲を有し、多くは透明
でありそして、殆ど無色であるシロップを必要とする多
くの用途分野を持つ。
本発明者は、特に小麦の澱粉からかゝるシロップを製造
する際に、分解生成物が標準的な装置を用いて濾過する
ことが困難でありそして濾液が許容できない程に濁って
いるという問題に遭遇した。本発明者は、鋭意研究した
結果、かゝる問題がリン脂質の存在によって引き起こさ
れることそして濾過速度および澱粉加水分解物の清澄さ
が、ある種の酵素で処理することによって改善できるこ
とを見出した。
する際に、分解生成物が標準的な装置を用いて濾過する
ことが困難でありそして濾液が許容できない程に濁って
いるという問題に遭遇した。本発明者は、鋭意研究した
結果、かゝる問題がリン脂質の存在によって引き起こさ
れることそして濾過速度および澱粉加水分解物の清澄さ
が、ある種の酵素で処理することによって改善できるこ
とを見出した。
それ故に本発明は、不純物としてリン脂質を含む水性澱
粉加水分解物を、ろ過前に、それを、ホスホリパーゼ酵
素と、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼ酵素のいず
れか一方または双方との比が少なくとも0.05:1〜50:1、
殊に少なくとも1:1、特に少なくとも5:1、そして最も好
ましくは少なくとも10:1以下であるホスホリパーゼ酵素
を含有する酵素組成物と接触させることによって処理す
ることを特徴とする、清澄化された澱粉加水分解物の製
造方法にある。
粉加水分解物を、ろ過前に、それを、ホスホリパーゼ酵
素と、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼ酵素のいず
れか一方または双方との比が少なくとも0.05:1〜50:1、
殊に少なくとも1:1、特に少なくとも5:1、そして最も好
ましくは少なくとも10:1以下であるホスホリパーゼ酵素
を含有する酵素組成物と接触させることによって処理す
ることを特徴とする、清澄化された澱粉加水分解物の製
造方法にある。
この方法で用いる満足な酵素組成物は、ホスホリパーゼ
およびキシラナーゼおよび／またはβ−グルカナーゼ酵
素を含有し、ホスホリパーゼと、キシラナーゼおよびβ
−グルカナーゼ酵素のいずれか一方または双方との比が
0.05:1〜50:1、特に1:1〜30:1の範囲にあるものであ
る。
およびキシラナーゼおよび／またはβ−グルカナーゼ酵
素を含有し、ホスホリパーゼと、キシラナーゼおよびβ
−グルカナーゼ酵素のいずれか一方または双方との比が
0.05:1〜50:1、特に1:1〜30:1の範囲にあるものであ
る。
この方法で用いる酵素組成物は、1gの全蛋白当たり少な
くとも5000単位、殊に少なくとも15,000単位、特に少な
くとも50,000単位、更に好ましくは少なくとも100,000
単位のホスホリパーゼを含有するものが有利である。
くとも5000単位、殊に少なくとも15,000単位、特に少な
くとも50,000単位、更に好ましくは少なくとも100,000
単位のホスホリパーゼを含有するものが有利である。
ホスホリパーゼ酵素はリン脂質の加水分解に接触的作用
する酵素である。リン脂質は、二個の水酸基が長鎖の脂
肪酸によってエステル化されておりそしてホスホリル基
が極性部分とホスホ−ジエステル結合を形成するグリセ
ロホスフェートの誘導体と考えることができる。
する酵素である。リン脂質は、二個の水酸基が長鎖の脂
肪酸によってエステル化されておりそしてホスホリル基
が極性部分とホスホ−ジエステル結合を形成するグリセ
ロホスフェートの誘導体と考えることができる。
リン脂質の四個のエステル部分全部が酵素により加水分
解され易い。sn−１の位置にアシルエステルを分解する
ホスホリパーゼは、ホスホリパーゼA1と記され、そして
sn−２の位置で分解するものはホスホリパーゼA2と記さ
れる。グリセロール側でホスホ−ジエステル結合を分解
する酵素はホスホリパーゼＣと記され、そして極性側で
の分解酵素はホスホリパーゼＤである。リソ−リン脂質
（lysophospholipid）−即ち部分的に加水分解されたリ
ン脂質−の残りのアシル基を加水分解する酵素は、ホス
ホリパーゼA1またはA2と同じ種類の反応を実施しそして
ここではホスホリパーゼL1またはL2と記す。後者の酵素
類は一般にリソ−ホスホリパーゼと称される。分解する
場所を以下に図示する： 本発明の方法において有効なホスホリパーゼ酵素は、
A1、A2、L1、L2およびＣで表されるものである。若干の
A1およびA2酵素もそれぞれにL2およびL1活性を有してい
る。これらがそうでない場合には、A1＋L2またはA2＋L1
の酵素組合せを用いる必要がある。本発明の方法が特に
適する小麦澱粉加水分解物に適用する為には、L1、L2ま
たはＣ−活性を有するホスホリパーゼが必要であり、ホ
スホリパーゼL1またはL2が特に有利である。
解され易い。sn−１の位置にアシルエステルを分解する
ホスホリパーゼは、ホスホリパーゼA1と記され、そして
sn−２の位置で分解するものはホスホリパーゼA2と記さ
れる。グリセロール側でホスホ−ジエステル結合を分解
する酵素はホスホリパーゼＣと記され、そして極性側で
の分解酵素はホスホリパーゼＤである。リソ−リン脂質
（lysophospholipid）−即ち部分的に加水分解されたリ
ン脂質−の残りのアシル基を加水分解する酵素は、ホス
ホリパーゼA1またはA2と同じ種類の反応を実施しそして
ここではホスホリパーゼL1またはL2と記す。後者の酵素
類は一般にリソ−ホスホリパーゼと称される。分解する
場所を以下に図示する： 本発明の方法において有効なホスホリパーゼ酵素は、
A1、A2、L1、L2およびＣで表されるものである。若干の
A1およびA2酵素もそれぞれにL2およびL1活性を有してい
る。これらがそうでない場合には、A1＋L2またはA2＋L1
の酵素組合せを用いる必要がある。本発明の方法が特に
適する小麦澱粉加水分解物に適用する為には、L1、L2ま
たはＣ−活性を有するホスホリパーゼが必要であり、ホ
スホリパーゼL1またはL2が特に有利である。
インターナショナル・ユニオン・オブ・バイオケミスト
リー（International Union of Biochemistry）の酵素
委員会（1961）は、指定された条件−即ち温度、pH、基
質の性質−のもとで１分当たり１ミクロモルの特定の基
質を接触的に変換する量としてあらゆる酵素の標準単位
を規定している。与えられた酵素のサンプルのホスホリ
パーゼ含有量は、既知の量の酵素を含有する標準溶液に
おけるレシチンまたはリソ−レシチンの消失量をNMRで
確かめることによって決めることができる。他の測定方
法はこの明細書の後の方に記述してある。
リー（International Union of Biochemistry）の酵素
委員会（1961）は、指定された条件−即ち温度、pH、基
質の性質−のもとで１分当たり１ミクロモルの特定の基
質を接触的に変換する量としてあらゆる酵素の標準単位
を規定している。与えられた酵素のサンプルのホスホリ
パーゼ含有量は、既知の量の酵素を含有する標準溶液に
おけるレシチンまたはリソ−レシチンの消失量をNMRで
確かめることによって決めることができる。他の測定方
法はこの明細書の後の方に記述してある。
本発明の別の面は、本発明の方法で用いるのに適する酵
素組成物を提供することであり、このものは酵素組成物
の全蛋白質1g当たり少なくとも5,000単位の量で存在す
るホスホリパーゼを含み、そしてホスホリパーゼ酵素
と、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼ酵素のいずれ
か一方または双方との比が少なくとも0.05:1、殊に少な
くとも1:1、特に少なくとも5:1そして更に好ましくは少
なくとも10:1であるものである。
素組成物を提供することであり、このものは酵素組成物
の全蛋白質1g当たり少なくとも5,000単位の量で存在す
るホスホリパーゼを含み、そしてホスホリパーゼ酵素
と、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼ酵素のいずれ
か一方または双方との比が少なくとも0.05:1、殊に少な
くとも1:1、特に少なくとも5:1そして更に好ましくは少
なくとも10:1であるものである。
満足な酵素組成物は、ホスホリパーゼおよびキシラナー
ゼおよび／またはβ−グルカナーゼを含有し、その際ホ
スホリパーゼと、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼ
のいずれか一方または双方との比が0.05:1〜50:1、特に
1:1〜30:1の範囲にある。
ゼおよび／またはβ−グルカナーゼを含有し、その際ホ
スホリパーゼと、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼ
のいずれか一方または双方との比が0.05:1〜50:1、特に
1:1〜30:1の範囲にある。
酵素組成物が、1gの全蛋白質当たり少なくとも15000単
位、殊に少なくとも50,000単位、特に少なくとも100,00
0単位のホスホリパーゼを含有するのが特に有利であ
る。
位、殊に少なくとも50,000単位、特に少なくとも100,00
0単位のホスホリパーゼを含有するのが特に有利であ
る。
酵素組成物は微生物源の出であるのが有利でありそして
ホルホリパーゼＣ以上にホスホリパーゼA1、A2L1および
／またはL2を含有するものが特に有利である。本発明の
ホスホリパーゼ酵素組成物を形成するのに用いることの
できる微生物には、コウジカビ属（Aspergillus）、例
えばクロカビ（Aspergillus niger）、バチルス（Bacil
lus）、クルイフェロマイセス（Kluyveromyces）、カン
ジダ（Candida）、ムコール（Mucor）、ペニシリウム
（Penicillium）、リゾプス（Rhizopus）、サッカロマ
イセス（Saccharomyces）、スポロトリクム（Sporotric
hum）、トリコデルマ（Trichoderma）およびストレプト
マイセス（Streptomyces）が含まれる。
ホルホリパーゼＣ以上にホスホリパーゼA1、A2L1および
／またはL2を含有するものが特に有利である。本発明の
ホスホリパーゼ酵素組成物を形成するのに用いることの
できる微生物には、コウジカビ属（Aspergillus）、例
えばクロカビ（Aspergillus niger）、バチルス（Bacil
lus）、クルイフェロマイセス（Kluyveromyces）、カン
ジダ（Candida）、ムコール（Mucor）、ペニシリウム
（Penicillium）、リゾプス（Rhizopus）、サッカロマ
イセス（Saccharomyces）、スポロトリクム（Sporotric
hum）、トリコデルマ（Trichoderma）およびストレプト
マイセス（Streptomyces）が含まれる。
本発明の更に他の面は、実質的にリン脂質を含有してい
ない炭化水素源水溶液、殊に澱粉加水分解物、特に小麦
澱粉加水分解物の水溶液を提供することにある。
ない炭化水素源水溶液、殊に澱粉加水分解物、特に小麦
澱粉加水分解物の水溶液を提供することにある。
澱粉加水分解物は、加水分解物の濾過の時におよび／ま
たは瀘液の清澄さに問題がないならば他の澱粉の加水分
解物、例えばコーン、ワックス・コーン、ジャガイモ、
タピオカ、米、サトウモロコシまたはワックス・サトウ
モロコシの澱粉の加水分解物も用いることができるが、
特に小麦の澱粉から誘導される加水分解物が適してい
る。本発明の方法で処理することのできる澱粉加水分解
物は、例えば澱粉を酸またはα−アミラーゼで処理する
ことによって例えば10〜20DEシロップ（DE＝右旋糖当
量）なる加水分解度に加水分解物することによって製造
される。最初の澱粉加水分解を本発明の方法によって処
理してもよくそして同時にまたは次いで高地の種類の追
加的な酵素作用に委ねて、20〜100の範囲のDEの澱粉加
水分解物またはシロップの範囲のものを製造することが
できる。本発明の方法は、20〜110℃、特に50〜100℃の
温度で実施するのが有利である。澱粉加水分解物のpHは
８まで、特に3.5〜6.5の範囲に維持するのが有利であ
る。濾過速度および／または濾液の清澄さについての所
望の改善を達成するのに必要とされ時間は、酵素の使用
量、用いる基質の性質および所望の生成物に依存して１
時間〜５日間である。
たは瀘液の清澄さに問題がないならば他の澱粉の加水分
解物、例えばコーン、ワックス・コーン、ジャガイモ、
タピオカ、米、サトウモロコシまたはワックス・サトウ
モロコシの澱粉の加水分解物も用いることができるが、
特に小麦の澱粉から誘導される加水分解物が適してい
る。本発明の方法で処理することのできる澱粉加水分解
物は、例えば澱粉を酸またはα−アミラーゼで処理する
ことによって例えば10〜20DEシロップ（DE＝右旋糖当
量）なる加水分解度に加水分解物することによって製造
される。最初の澱粉加水分解を本発明の方法によって処
理してもよくそして同時にまたは次いで高地の種類の追
加的な酵素作用に委ねて、20〜100の範囲のDEの澱粉加
水分解物またはシロップの範囲のものを製造することが
できる。本発明の方法は、20〜110℃、特に50〜100℃の
温度で実施するのが有利である。澱粉加水分解物のpHは
８まで、特に3.5〜6.5の範囲に維持するのが有利であ
る。濾過速度および／または濾液の清澄さについての所
望の改善を達成するのに必要とされ時間は、酵素の使用
量、用いる基質の性質および所望の生成物に依存して１
時間〜５日間である。
本発明の方法は、澱粉加水分解物の濾過性および製造さ
れる濾液の清澄さの改善に加えて、加水分解物の泡立ち
を低下させそして別の精製段階、例えばイオン交換およ
びカーボンでの処理を更に受け入れ易い濾過液を形成す
る。
れる濾液の清澄さの改善に加えて、加水分解物の泡立ち
を低下させそして別の精製段階、例えばイオン交換およ
びカーボンでの処理を更に受け入れ易い濾過液を形成す
る。
本発明を、酵素測定が以下の方法によって行われている
以下の実施例によって更に詳細に説明する： ａ）ホスホリパーゼＬの定量 −リソ−レシチンの20ミリモル水溶液0.25ml（例えば、
商品番号L4129としてシグマ・カンパニー（Sigma Compa
ny）によって販売されている。約99％濃度且つ主として
パリミチン−およびステアリン酸を含有している）を、
0.25mlのアセテート緩衝液（pH4.5、0.02M）と混合しそ
して約５分間、55℃にサーモスタットで保持する。
以下の実施例によって更に詳細に説明する： ａ）ホスホリパーゼＬの定量 −リソ−レシチンの20ミリモル水溶液0.25ml（例えば、
商品番号L4129としてシグマ・カンパニー（Sigma Compa
ny）によって販売されている。約99％濃度且つ主として
パリミチン−およびステアリン酸を含有している）を、
0.25mlのアセテート緩衝液（pH4.5、0.02M）と混合しそ
して約５分間、55℃にサーモスタットで保持する。
−次いで、50マイクロリットルの酵素サンプル（水で適
当に希釈されている）を加える。
当に希釈されている）を加える。
−酵素の正確に添加１分後に25マイクロリットルの培養
混合物を0.25mlの“酵素試薬1"と混合しそして37℃で５
分間培養する。次いで0.5mlの“酵素試薬2"添加し、こ
れに続いて37℃で更に５分間培養する。
混合物を0.25mlの“酵素試薬1"と混合しそして37℃で５
分間培養する。次いで0.5mlの“酵素試薬2"添加し、こ
れに続いて37℃で更に５分間培養する。
−紫色に着色した溶液の光学濃度（O.D.）は555nmと読
める。
める。
−この試薬を、酵素および基質を１分間の代わりに10分
間培養して繰り返す。
間培養して繰り返す。
−二つのO.D.の間の相違を得る（一分間の培養時間と10
分間の培養時間との間の相違ΔO.D.）。ΔO.D.を９で割
ると一分間のΔO.D.が得られる。
分間の培養時間との間の相違ΔO.D.）。ΔO.D.を９で割
ると一分間のΔO.D.が得られる。
“酵素試薬1"および“酵素試薬2"は、市販の非エステル
化脂肪酸測定法（NEFA QUICK“BMY"）に属している（ベ
ーリンガー・マンハイム・山内株式会社（Boehringer M
annheim Yamanouchi K.K.）によって販売されてい
る）。
化脂肪酸測定法（NEFA QUICK“BMY"）に属している（ベ
ーリンガー・マンハイム・山内株式会社（Boehringer M
annheim Yamanouchi K.K.）によって販売されてい
る）。
遊離脂肪酸の評価数は、標準のオレイン酸溶液について
のNEFA QUICK BMY試験によって得られる基準化曲線を用
いて行う。
のNEFA QUICK BMY試験によって得られる基準化曲線を用
いて行う。
一分間に放出される遊離脂肪酸のマイクロモル数は、50
マイクロリットルの酵素サンプル中に存在するホスホリ
パーゼ単位数と同等である。次いで、酵素組成物中の蛋
白質1g当たりの単位数を算出する。
マイクロリットルの酵素サンプル中に存在するホスホリ
パーゼ単位数と同等である。次いで、酵素組成物中の蛋
白質1g当たりの単位数を算出する。
ｂ）ホスホリパーゼＣの定量 用いる方法は、レシチンの標準溶液を加水分解しそして
生じるグリセロールを場合によっては評価することを包
含するマンハイム・ベーリンガー（Mannheim Boehringe
r）（Cat No 15636）によって開示されている。
生じるグリセロールを場合によっては評価することを包
含するマンハイム・ベーリンガー（Mannheim Boehringe
r）（Cat No 15636）によって開示されている。
ｃ）キシラーゼおよびβ−グルカナーゼの定量 この試験は、試験条件下の酵素組成物が標準のキシラン
およびβ−グルカン溶液からそれぞれＤ−キシローゼお
よびＤ−グルコーゼを放出する速度を測定する。
およびβ−グルカン溶液からそれぞれＤ−キシローゼお
よびＤ−グルコーゼを放出する速度を測定する。
pH4.56のアセテート緩衝液にキシラン（１重量％のシグ
マ・カンパニーNo.X−3875）またはβ−グルカン（１重
量％のシグマ・カンパニーNo.G−6513）を溶解した1ml
の溶液を、水で適当に希釈した100マイクロリットルの
酵素溶液と試験条件下に混合物する。この混合の前に、
基質溶液を約10分間の間55℃にサーモスタットによって
保持する。酵素／基質−混合物の培養は55℃で実施す
る。５分および10分のそれぞれの後に0.5mlの培養混合
物を0.5mlのDN（ジニトロサリチル酸）試薬と混合して
サンプルを完成する。このサンプル（培養混合物＋DN
S）を10分間、沸騰水中で加熱し、2.5mlの水を添加しそ
して最終混合物を冷却する。光学濃度（O.D.）は室温で
540nmと測定される。
マ・カンパニーNo.X−3875）またはβ−グルカン（１重
量％のシグマ・カンパニーNo.G−6513）を溶解した1ml
の溶液を、水で適当に希釈した100マイクロリットルの
酵素溶液と試験条件下に混合物する。この混合の前に、
基質溶液を約10分間の間55℃にサーモスタットによって
保持する。酵素／基質−混合物の培養は55℃で実施す
る。５分および10分のそれぞれの後に0.5mlの培養混合
物を0.5mlのDN（ジニトロサリチル酸）試薬と混合して
サンプルを完成する。このサンプル（培養混合物＋DN
S）を10分間、沸騰水中で加熱し、2.5mlの水を添加しそ
して最終混合物を冷却する。光学濃度（O.D.）は室温で
540nmと測定される。
基質ブランク値を、1mlの基質を100マイクロリッタの水
と混合し、55℃で10分間培養し、この0.5mlの溶液を0.5
mlのDNS−試薬と混合しそして上記の試験操作を行う。
用いる希釈物では、酵素ブランク値は無視することがで
きる。
と混合し、55℃で10分間培養し、この0.5mlの溶液を0.5
mlのDNS−試薬と混合しそして上記の試験操作を行う。
用いる希釈物では、酵素ブランク値は無視することがで
きる。
時間に対する光学濃度のグラフの直線部分から一分当た
りの光学濃度の変化速度を算出する。上記の条件もとで
のＤ−キシローゼおよびＤ−グルコーゼについての確定
された測定曲線を、試験条件下に酵素組成物によって放
出されるＤ−キシローゼ/D−グルコーゼの量を測定する
為に用いる。
りの光学濃度の変化速度を算出する。上記の条件もとで
のＤ−キシローゼおよびＤ−グルコーゼについての確定
された測定曲線を、試験条件下に酵素組成物によって放
出されるＤ−キシローゼ/D−グルコーゼの量を測定する
為に用いる。
一単位のキシラナーゼおよびβ−グルカナーゼが上記の
条件下に一分間に１マイクロモルの生成物（Ｄ−キシロ
ーゼ/D−グルコーゼとして測定）を放出する酵素の量で
あるので、サンプル中の酵素の単位数を計算することが
できる。
条件下に一分間に１マイクロモルの生成物（Ｄ−キシロ
ーゼ/D−グルコーゼとして測定）を放出する酵素の量で
あるので、サンプル中の酵素の単位数を計算することが
できる。
ｄ）蛋白質の定量 用いる方法は、ローリー（Lowry）等のJ.Biol.Chem.19
3、第265〜275頁（1951）に記載されているものであ
る。
3、第265〜275頁（1951）に記載されているものであ
る。
実施例1:本発明に従う酵素組成物の調製 酵素組成物を、ノボ・インダストリー（Novo Industri
A/S）によって販売されている市販のβ−グルカナーゼ
調製物のFINIZYM 200 LバッチKZN0015で製造する。FINI
ZYM 200 Lはコウジカビ属の選択された変種の水性醗酵
によって製造される真菌のβ−グルカナーゼ調製物であ
る。この酵素組成物は大麦のβ−グルカン（1,4−β−
1,3−β−グルカン）をオリゴ糖類およびグルコースに
加水分解すると言われておりそして、濾過の困難を阻止
しそしてβ−グルカンの沈澱を防止する為に、ビールの
醗酵および貯蔵の間に用いることができることが判って
いる。
A/S）によって販売されている市販のβ−グルカナーゼ
調製物のFINIZYM 200 LバッチKZN0015で製造する。FINI
ZYM 200 Lはコウジカビ属の選択された変種の水性醗酵
によって製造される真菌のβ−グルカナーゼ調製物であ
る。この酵素組成物は大麦のβ−グルカン（1,4−β−
1,3−β−グルカン）をオリゴ糖類およびグルコースに
加水分解すると言われておりそして、濾過の困難を阻止
しそしてβ−グルカンの沈澱を防止する為に、ビールの
醗酵および貯蔵の間に用いることができることが判って
いる。
30mlのFINIZYM 200 LバッチKZN0015を30mlの蒸留水にて
希釈する。この混合物を、固体粒子を除く為に、3500回
転／分にて５分間遠心分離処理する。50mlの懸濁液を、
半分析用BIO−RAD−ポリアクリルアミドBio−gel Ｐ−
60（100〜200メッシュ）カラム（直径5cm、高さ23cm）
にてクロマトグラフィー分析により分離し、酢酸緩衝液
にpH5.2で溶離しそして10mlの分別物に集める。クロマ
トグラムは、蛋白質の吸収に相当する280nmの所に二つ
の異なるピークを有する。この二つのピークに相当する
分別物を、この明細書において前に記した如きリソレシ
チン基質を用いてのホスホリパーゼＬ−活性について検
査する。最初のピークに相当する分別物（16〜40）はホ
スホリパーゼＬ−活性を有しておりそして塊っている。
希釈する。この混合物を、固体粒子を除く為に、3500回
転／分にて５分間遠心分離処理する。50mlの懸濁液を、
半分析用BIO−RAD−ポリアクリルアミドBio−gel Ｐ−
60（100〜200メッシュ）カラム（直径5cm、高さ23cm）
にてクロマトグラフィー分析により分離し、酢酸緩衝液
にpH5.2で溶離しそして10mlの分別物に集める。クロマ
トグラムは、蛋白質の吸収に相当する280nmの所に二つ
の異なるピークを有する。この二つのピークに相当する
分別物を、この明細書において前に記した如きリソレシ
チン基質を用いてのホスホリパーゼＬ−活性について検
査する。最初のピークに相当する分別物（16〜40）はホ
スホリパーゼＬ−活性を有しておりそして塊っている。
塊っているこの分別物を次いでAMICON DIAFLO XM−50−
限外濾過器によって濃縮し、次いでこの濃縮物を半分析
用BIO−RAD−ポリアクリルアミドBio−ゲルＰ−150（50
〜150メッシュ）カラム（直径5cm、高さ90cm）にてクロ
マトグラフィーにより分析し、10mlの分別物中に酢酸緩
衝液にてpH5.2で溶離する。クロマトグラムは五つの異
なるピークを有しそしてこれらのピークに相当するそれ
らの分別物を上記の如きホスホリパーゼＬ−活性につい
て検査する。活性（59〜72）を示すこれらの分別物を塊
らせ、AMICON DIAFLO XM−50−限外濾過器によって濃縮
する。
限外濾過器によって濃縮し、次いでこの濃縮物を半分析
用BIO−RAD−ポリアクリルアミドBio−ゲルＰ−150（50
〜150メッシュ）カラム（直径5cm、高さ90cm）にてクロ
マトグラフィーにより分析し、10mlの分別物中に酢酸緩
衝液にてpH5.2で溶離する。クロマトグラムは五つの異
なるピークを有しそしてこれらのピークに相当するそれ
らの分別物を上記の如きホスホリパーゼＬ−活性につい
て検査する。活性（59〜72）を示すこれらの分別物を塊
らせ、AMICON DIAFLO XM−50−限外濾過器によって濃縮
する。
この濃縮物を、半分析溶PHARMACIA−急速流DEAE−Sepha
roseアニオン交換カラム（直径5cm、高さ33cm）にて順
々に分別し、塩化ナトリウム成分の直線的な増加を用い
そして10mlの分別物を取ってpH5.2にピペラジン−HCl緩
衝液で抽出する。クロマトグラムは五つの異なるピーク
を有する。ホスホリパーゼＬ−活性（55〜63）を有する
分別物を再び塊らせそしてAMICON DIAFLO XM−50−限外
濾過器によって濃縮し、次いでPHARMACIA Sephadex G−
25MカラムPD−10によって脱塩する。
roseアニオン交換カラム（直径5cm、高さ33cm）にて順
々に分別し、塩化ナトリウム成分の直線的な増加を用い
そして10mlの分別物を取ってpH5.2にピペラジン−HCl緩
衝液で抽出する。クロマトグラムは五つの異なるピーク
を有する。ホスホリパーゼＬ−活性（55〜63）を有する
分別物を再び塊らせそしてAMICON DIAFLO XM−50−限外
濾過器によって濃縮し、次いでPHARMACIA Sephadex G−
25MカラムPD−10によって脱塩する。
脱塩した濃縮物を次いで、分析用PHARMACIA MONO Q ア
ニオン交換カラム（直径5cm、高さ50cm）にて順々に分
別し、塩化ナトリウム成分の段階的な増加を用いそして
2mlの分別物を集めてpH9.4にジエタノールアミン緩衝液
で抽出する。クロマトグラムは七つの異なるピークを有
し、そしてこの二つのピークを示す分別物、即ち分別物
16〜19および21〜25は、ホスホリパーゼＬ活性を含有し
ていることが判っており、16〜19は塊った時に21〜25の
分別物よりも80倍以上の活性を有している。かゝる三回
の分離および16〜19の塊り処理の後に、AMICON MINICON
−Ｂ濃縮器で濃縮し、1gの蛋白質当たり422,000単位の
ホスホリパーゼＬ−活性および500:1より多いホスホリ
パーゼ：キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼ−比を有
する溶液を得る。
ニオン交換カラム（直径5cm、高さ50cm）にて順々に分
別し、塩化ナトリウム成分の段階的な増加を用いそして
2mlの分別物を集めてpH9.4にジエタノールアミン緩衝液
で抽出する。クロマトグラムは七つの異なるピークを有
し、そしてこの二つのピークを示す分別物、即ち分別物
16〜19および21〜25は、ホスホリパーゼＬ活性を含有し
ていることが判っており、16〜19は塊った時に21〜25の
分別物よりも80倍以上の活性を有している。かゝる三回
の分離および16〜19の塊り処理の後に、AMICON MINICON
−Ｂ濃縮器で濃縮し、1gの蛋白質当たり422,000単位の
ホスホリパーゼＬ−活性および500:1より多いホスホリ
パーゼ：キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼ−比を有
する溶液を得る。
実施例2:本発明に従う酵素組成物の調製 装置は、サーモスタットで30℃に保持されておりそして
１分・１の流体培養基当たり0.7の空気が圧縮空気
にて送り込まれている全容積２（作業容積1.4）の醗
酵器よりなる。
１分・１の流体培養基当たり0.7の空気が圧縮空気
にて送り込まれている全容積２（作業容積1.4）の醗
酵器よりなる。
醗酵媒体は20g/のPROFLO（綿実粉末）、20g/の市販
のコーンオイル、1g/の硫酸アンモニウム、1g/の燐
酸二水素カリウム、0.5g/の硫酸マグネシウム水和
物、0.5g/の塩化カリウム、5mg/の硫酸第一鉄水和
物、1.6mg/の硫酸マンガン水和物、1.4mg/の硫酸亜
鉛水和物および2mg/の塩化コバルト水和物より成り、
これらはフタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム（緩
衝液0.05Mのフタル酸水素カリウムpH＝５）に溶解され
ているかまたは懸濁されている。最終的媒体中のフタル
酸水素カリウムおよび水酸化ナトリウムの含有量はそれ
ぞれ9.5g/および1.15g/である。
のコーンオイル、1g/の硫酸アンモニウム、1g/の燐
酸二水素カリウム、0.5g/の硫酸マグネシウム水和
物、0.5g/の塩化カリウム、5mg/の硫酸第一鉄水和
物、1.6mg/の硫酸マンガン水和物、1.4mg/の硫酸亜
鉛水和物および2mg/の塩化コバルト水和物より成り、
これらはフタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム（緩
衝液0.05Mのフタル酸水素カリウムpH＝５）に溶解され
ているかまたは懸濁されている。最終的媒体中のフタル
酸水素カリウムおよび水酸化ナトリウムの含有量はそれ
ぞれ9.5g/および1.15g/である。
種菌の製造 種菌としてクロカビ（ATCC 13496）を、2g/のデキス
トローゼ、1g/の硫酸アンモニウム、1g/の燐酸二水
素カリウム、0.5g/の硫酸マグネシウム水和物、0.5g/
の硫酸マグネシウム水和物、0.5g/の塩化カリウ
ム、0.1g/の酵母抽出物、5mg/の硫酸第一鉄水和
物、1.6mg/の硫酸マンガン水和物、1.4mg/の硫酸亜
鉛水和物および2mg/の塩化コバルト水和物より成る媒
体において胞子から培養する。この種菌は四日の間、震
盪水浴中の500mlの震盪フラスコ中で全容量50mlの媒体
において30℃のもとで培養する。
トローゼ、1g/の硫酸アンモニウム、1g/の燐酸二水
素カリウム、0.5g/の硫酸マグネシウム水和物、0.5g/
の硫酸マグネシウム水和物、0.5g/の塩化カリウ
ム、0.1g/の酵母抽出物、5mg/の硫酸第一鉄水和
物、1.6mg/の硫酸マンガン水和物、1.4mg/の硫酸亜
鉛水和物および2mg/の塩化コバルト水和物より成る媒
体において胞子から培養する。この種菌は四日の間、震
盪水浴中の500mlの震盪フラスコ中で全容量50mlの媒体
において30℃のもとで培養する。
培養媒体に種菌100mlを接種する。温度は30℃でありそ
して空気を一定の状態で流す。撹拌羽の回転速度は最初
の48時間を間250回転／分でありそして次の24時間の間1
00回転／分増加する。六日後にこのそくどを750回転／
分に増加しそして醗酵が終了するまで一定のまゝに保持
する。醗酵期間は12日間である。このバイオマスは定量
化されておらず、pHは12日後にpH4.9に達するまで僅か
に低下する。細胞を除いた媒体中のホスホリパーゼＬ−
活性を前記のNEFA QUick−試験にて測定する。濾過によ
って菌糸体を除いた後に、800mlの液を回収する（醗酵
の間に、減少した体積は水分の蒸発に起因している）。
800mlの液体は1ml当たり137単位のホスホリパーゼＬ−
単位を含有している。それ故に全部で109600単位が限外
濾過によって醗酵物から回収される。
して空気を一定の状態で流す。撹拌羽の回転速度は最初
の48時間を間250回転／分でありそして次の24時間の間1
00回転／分増加する。六日後にこのそくどを750回転／
分に増加しそして醗酵が終了するまで一定のまゝに保持
する。醗酵期間は12日間である。このバイオマスは定量
化されておらず、pHは12日後にpH4.9に達するまで僅か
に低下する。細胞を除いた媒体中のホスホリパーゼＬ−
活性を前記のNEFA QUick−試験にて測定する。濾過によ
って菌糸体を除いた後に、800mlの液を回収する（醗酵
の間に、減少した体積は水分の蒸発に起因している）。
800mlの液体は1ml当たり137単位のホスホリパーゼＬ−
単位を含有している。それ故に全部で109600単位が限外
濾過によって醗酵物から回収される。
更に、醗酵溶液が1gの蛋白質当たり178195単位のホスホ
リパーゼＬ、8182単位のキシラナーゼおよび1489単位の
β−グルカナーゼを、ホスホリパーゼL:（キシラナーゼ
＋β−グルカナーゼ）＝18:1の比で含有していることが
分析で判った。
リパーゼＬ、8182単位のキシラナーゼおよび1489単位の
β−グルカナーゼを、ホスホリパーゼL:（キシラナーゼ
＋β−グルカナーゼ）＝18:1の比で含有していることが
分析で判った。
実施例3:小麦澱粉加水分解物の清澄化において実施例１
の生成物の評価 小麦“A"澱粉の水性スラリー35重量％を連続的に18DEの
マルトデキストリンに転化する。その際慣用のα−アミ
ラーゼ加水分解法を用いる。
の生成物の評価 小麦“A"澱粉の水性スラリー35重量％を連続的に18DEの
マルトデキストリンに転化する。その際慣用のα−アミ
ラーゼ加水分解法を用いる。
pHを4.8に調整しそして温度を55℃に調整した後に、乾
燥ベースで算出して0.15重量％の麦芽汁400゜Ｌ（β−
アミラーゼ）を18 DEマルトデキストリンの２バッチ
に加える。この混合物を20時間培養しそして、DEが42に
上昇した時にシロップの濾過速度を実験室用の減圧プレ
コートフィルター（pre−coat filter）を用いて測定す
る。このフィルターは工業用の回転式減圧プレコートフ
ィルターに関連した結果を得る為に用いる。この濾過
は、4.8にpHを調整した後に60℃のシロップ温度にて実
施する。
燥ベースで算出して0.15重量％の麦芽汁400゜Ｌ（β−
アミラーゼ）を18 DEマルトデキストリンの２バッチ
に加える。この混合物を20時間培養しそして、DEが42に
上昇した時にシロップの濾過速度を実験室用の減圧プレ
コートフィルター（pre−coat filter）を用いて測定す
る。このフィルターは工業用の回転式減圧プレコートフ
ィルターに関連した結果を得る為に用いる。この濾過
は、4.8にpHを調整した後に60℃のシロップ温度にて実
施する。
二つの培養を行う。最初の培養物は添加物を含有してお
らず、120・h-1・m-2の濾過速度が得られる。第二の
培養は、実施例１に記載の濃厚な16〜19の塊った分別物
0.1重量％（乾燥ベースで算出）を添加して実施する。
この場合の濾過速度は500・h-1・m-2である。
らず、120・h-1・m-2の濾過速度が得られる。第二の
培養は、実施例１に記載の濃厚な16〜19の塊った分別物
0.1重量％（乾燥ベースで算出）を添加して実施する。
この場合の濾過速度は500・h-1・m-2である。
実施例4:小麦澱粉加水分解物の製造時における実施例２
の生成物の評価 10〜20 DEのマルトデキストリンを、β−アミラーゼ酵
素を用いてpH5.2そして58℃で糖化することによって高
麦芽糖シロップとする。この生成物は104・h-1・m-2
の濾過速度を有しそして、カーボでの精製後には94単位
の清澄さおよび11.6単位の色を有する（この清澄さおよ
び色は光学濃度測定器によって得られる）。糖化生成物
を実施例２の酵素の0.5単位/g（マルトデキストリン）
にて前処理した場合、濾過速度は323・h-1・m-2であ
りそしてカーボン精製の後の清澄さおよび色はそれぞれ
100および0.8である。
の生成物の評価 10〜20 DEのマルトデキストリンを、β−アミラーゼ酵
素を用いてpH5.2そして58℃で糖化することによって高
麦芽糖シロップとする。この生成物は104・h-1・m-2
の濾過速度を有しそして、カーボでの精製後には94単位
の清澄さおよび11.6単位の色を有する（この清澄さおよ
び色は光学濃度測定器によって得られる）。糖化生成物
を実施例２の酵素の0.5単位/g（マルトデキストリン）
にて前処理した場合、濾過速度は323・h-1・m-2であ
りそしてカーボン精製の後の清澄さおよび色はそれぞれ
100および0.8である。
Claims (13)
- 【請求項１】不純物としてリン脂質を含む水性澱粉加水
分解物を、ろ過前に、それを、ホスホリパーゼ酵素と、
キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼ酵素のいずれか一
方または双方との比が0.05:1〜50:1であるホスホリパー
ゼ酵素を含有する酵素組成物と接触させることによって
処理することを特徴とする、清澄化された澱粉加水分解
物の製造方法。 - 【請求項２】酵素組成物がホスホリパーゼと、キシラナ
ーゼおよび／またはβ−グルカナーゼとを含有し、そし
てホスホリパーゼと、キシラナーゼおよびβ−グルカナ
ーゼのいずれか一方または双方との比が1:1〜30:1の範
囲にある特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】酵素組成物が全蛋白質1g当たり少なくとも
5000単位のホスホリパーゼを含有する特許請求の範囲第
１項または第２項記載の方法。 - 【請求項４】ホスホリパーゼ酵素がL1、L2またはＣ活性
を有する特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項５】澱粉加水分解物が、小麦澱粉加水分解物で
ある特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項６】20〜110℃の温度で実施される特許請求の
範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】pH値を８以下の値に維持する特許請求の範
囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】酵素組成物の全蛋白質1g当たり少なくとも
5,000単位の量で存在するホスホリパーゼを含み、そし
てホスホリパーゼ酵素と、キシラナーゼおよびβ−グル
カナーゼ酵素のいずれか一方または双方との比が0.05:1
〜50:1の範囲にあることを特徴とする、不純物としてリ
ン脂質を含む水性澱粉加水分解物を、ろ過前に、それ
を、酵素組成物と接触させることによって処理して清澄
化された澱粉加水分解物を製造する方法に用いるのに適
当な酵素組成物。 - 【請求項９】ホスホリパーゼと、キシラナーゼおよび／
またはβ−グルカナーゼとを含有し、そしてホスホリパ
ーゼと、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼのいずれ
か一方または双方との比が1:1〜30:1の範囲にある特許
請求の範囲第８項記載の酵素組成物。 - 【請求項１０】全蛋白質1g当たり少なくとも15,000単位
のホスホリパーゼを含有する特許請求の範囲第８項また
は第９項記載の酵素組成物。 - 【請求項１１】微生物源の出である特許請求の範囲第８
項〜第10項のいずれか１項に記載の酵素組成物。 - 【請求項１２】ホスホリパーゼＣ以上にホスホリパーゼ
A1、A2、L1および／またはL2を含有する特許請求の範囲
第８項〜第11項のいずれか１項に記載の酵素組成物。 - 【請求項１３】微生物がコウジカビ属（Aspergillu
s）、例えばクロカビ（Aspergillus niger）、バチルス
（Bacillus）、クルイフェロマイセス（Kluyveromyce
s）、カンジダ（Candida）、ムコール（Mucor）、ペニ
シリウム（Penicillium）、リゾプス（Rhizopus）、サ
ッカロマイセス（Saccharomyces）、スポロトリクム（S
porotrichum）、トリコデルマ（Trichoderma）およびス
トレプトマイセス（Streptomyces）である特許請求の範
囲第11項または第12項のいずれか１項に記載の酵素組成
物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8525012 | 1985-10-10 | ||
| GB858525012A GB8525012D0 (en) | 1985-10-10 | 1985-10-10 | Carbohydrate refining process |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62111695A JPS62111695A (ja) | 1987-05-22 |
| JPH0740952B2 true JPH0740952B2 (ja) | 1995-05-10 |
Family
ID=10586484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61240223A Expired - Lifetime JPH0740952B2 (ja) | 1985-10-10 | 1986-10-11 | 清澄化された澱粉加水分解物の製造方法およびそれに用いるのに適当な新規の酵素組成物 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4916064A (ja) |
| EP (1) | EP0219269B2 (ja) |
| JP (1) | JPH0740952B2 (ja) |
| AT (1) | ATE67247T1 (ja) |
| AU (1) | AU604216B2 (ja) |
| CA (1) | CA1293212C (ja) |
| DE (1) | DE3681396D1 (ja) |
| DK (1) | DK482286A (ja) |
| ES (1) | ES2023814T5 (ja) |
| FI (1) | FI92718B (ja) |
| GB (1) | GB8525012D0 (ja) |
| IE (1) | IE59003B1 (ja) |
| MX (1) | MX165746B (ja) |
| NZ (1) | NZ217551A (ja) |
| ZA (1) | ZA866933B (ja) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8915299D0 (en) * | 1989-07-04 | 1989-08-23 | Cerestar Holding Bv | Carbohydrate refining process and a supported enzyme for use therein |
| JP2858875B2 (ja) * | 1990-05-23 | 1999-02-17 | サントリー株式会社 | 酒類の製造方法 |
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